CN109922792A - 基于官能化多糖的水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从化妆品到手术和医学的许多领域的用至少一个部分接枝的官能化水凝胶网络。

Description

基于官能化多糖的水凝胶
技术领域
本发明涉及一种用于从化妆品到手术和医学的许多领域的用至少一个部分接枝的官能化水凝胶网络。
背景技术
与年龄相关的疾病的发病率不断增加以及人类供体材料替代患者体内功能失调细胞和受损组织的有限可用性，促使人们寻求可替代的移植疗法。具有三维(3D)结构的水凝胶可用作组织工程的支架以及递送细胞和药物的载体。封装细胞/组织的同种移植/异种移植可防止不良的免疫反应，同时允许氧气、营养物质和分泌因子的穿过。此外，细胞微囊化可以防止机械应力或环境恶化的影响。在温和的pH和温度条件下，水溶性的生物聚合物海藻酸钠(Na-alg)在一些二价阳离子存在的条件下自发形成水凝胶[1,2]。特别是，水凝胶海藻酸钙(Ca-alg)在包括细胞固定的几种生物和医学应用方面提供了有利的性能[3]。尽管人们已经针对用于治疗人类疾病的水凝胶微囊的开发进行了很有前景的研究，但是含有细胞的微囊的常规临床应用仍然存在挑战。对这种微囊材料有很多要求：与宿主组织和封闭细胞的生物相容性、机械强度和弹性的长期稳定性、维持细胞存活和代谢功能的有利环境、可重复的制造方案。
在一些应用中，通过与二价阳离子的离子交联制备的海藻酸基微球(MS)机械性能和稳定性不足，并且选择通透性差[4-7]。为了克服这些问题，人们致力于改进Ca-alg MS或用其他材料替代Ca-alg。该领域的代表性进展包括用诸如聚(L-赖氨酸)[8]、聚(L-鸟氨酸)[9]或聚(亚甲基胍)[10]及其衍生物的聚阳离子涂覆Ca-alg MS，以及使用诸如壳聚糖[11]、聚(乙二醇)(PEG)[12]、葡聚糖[13]和透明质酸[14]的其他聚合物。
然而，这些改性常常导致生物相容性降低，并意味着复杂的多步骤MS形成方法[15]。例如，在长波紫外光活化的光引发剂存在的情况下，通过光聚合由PEG二丙烯酸酯和葡聚糖制备水凝胶(WO2010/078036)。这种方法需要优化光引发剂的类型、它们的浓度和UV光强度，以实现水凝胶的最大机械性能。细胞相容性可能会因为长期暴露于具有细胞毒性的自由基从而导致与封装细胞的细胞毒性反应而受到影响[25]。此外，由于葡聚糖基水凝胶迅速恶化，使封装的化合物扩散释放，因此不能设想长期治疗。此外，在葡聚糖基水凝胶存在的条件下观察到炎症反应。
聚合物水凝胶的其他改性涉及加入生物活性分子以改善封装细胞的活性和功能，并在移植部位释放治疗载荷。小肽序列已与海藻酸分子偶联，以改善细胞在微囊中的扩散和生长，但是会导致在体内高度降解和纤维化[16]。
另一种方法是将所选药物和感兴趣的细胞共同封装在水凝胶微囊中，以减少在移植部位的不利的纤维化过度生长。特别是，大鼠胰岛和姜黄素在海藻酸水凝胶中的共同封装导致改善了体内的血糖控制并且还减少了体内囊周的过度生长[17]。另一种有前景的方法是提出了设计水凝胶MS，其将海藻酸的快速离子凝胶化和由PEG衍生物产生的共价交联(与海藻酸骨架共价连接，或为互穿网络的形式)相结合。根据这一概念，最近开发了两种类型的双组分MS，包括Ca-alg和由乙烯基砜封端的多臂PEG形成的互传的共价交联网[18-20]，或由用半胱胺官能化的Na-alg[21]，并且显示出有利于细胞微囊化的性能。此外，产生了由PEG接枝的海藻酸的离子型凝胶化和同时的共价交联相互作用产生的单组分MS，并且与纯Ca-alg MS相比，证明其具有改善的机械性能和渗透性[21]。
尽管如此，在免疫活性小鼠模型中，MS的体内稳定性不足，因此需要设计新的接枝方法，以用于将硫醇封端的PEG衍生物与海藻酸骨架的羟基官能团缀合，以产生具有稳定的生物相容性的MS，并且移植后无不良反应，并且对封装细胞无细胞毒性，并且具有用于抗炎剂的局部受控递送的潜力。
缩略术语表
Alg，海藻酸/海藻酸盐(alginate)；Na-Alg，海藻酸钠；Ca-Alg，海藻酸钙；Boc，叔丁氧基羰基；CDI，羰基二咪唑；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲基亚砜；EDCI，1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺；FITC，异硫氰酸荧光素；hr，小时；MOPS，3-(N-吗啉代)乙磺酸；MS，微球；MWCO，截留分子量；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；PE，石油醚；PEG，聚(乙二醇)；rt,室温；TBA，叔丁基铵；TCEP，三(2-羧乙基)膦；Ts，甲苯磺酸盐/酯。
发明内容
本发明涉及基于用至少一个部分接枝的多糖的官能化水凝胶网络，其中所述水凝胶是阴离子多糖，该部分是接枝在所述阴离子多糖的至少一个羟基上的合成的生物相容性聚合物。
本发明的另一方面涉及一种组合物，其中，该组合物包含与从细胞、蛋白质、核酸或其他分子中选择的至少一种第二元素组合的本发明的官能化水凝胶。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其中，该药物组合物包含本发明的组合物和药学上可接受的载体。
另一方面涉及一种制备官能化水凝胶网络的方法，该方法包括使阴离子多糖与部分反应，所述部分经官能化以使得在该多糖与该部分之间在该多糖的一个羟基上形成共价键。
另一方面涉及一种制备官能化海藻酸基水凝胶的方法，该方法包括：
i)将海藻酸的一个或多个羧酸官能团或海藻酸盐的一个或多个羧酸盐官能团转化为TBA羧化物，
ii)通过在羰基二咪唑存在的情况下使一个或多个羟基反应然后沉淀来改性所述海藻酸或其盐的一个或多个羟基，
iii)通过以下方式制备硫醇官能化的PEG衍生物(PEG I、PEGII和PEGⅢ)：
iii1)使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)与受保护的3-巯基丙酸反应，然后同时还原叠氮基和去保护硫醇官能团，以产生PEG I，或
iii2)将中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)与活化的硫辛酸缀合，然后在LiAlH4存在的条件下还原，以释放PEG II，作为硫辛酰基官能团的开放(还原)和封闭(氧化)形式的混合物，或
iii3)使用铜物质(copper species)催化的点击反应使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)1a和1b与三唑部分接触以产生PEG III，
iv)用PEG I、PEG II和/或PEG III接枝改性的海藻酸，以使在官能化的海藻酸和PEG I、PEG II和/或PEG III之间在所述海藻酸或其盐的一个或多个羟基上形成共价键，
v)通过透析和冷冻干燥纯化接枝到PEG的海藻酸。
另一方面涉及治疗人或动物患者的疾病或病症的方法，包括：将从细胞、蛋白质、核酸或其他分子中选择的材料植入或移植到人或动物患者体内，该材料固定化或微囊化在本发明的官能化水凝胶中。
另一方面涉及式I、II和/或III的异双官能PEG或其衍生物：
其中，n＝8-50；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自(CH2)pSH，其中，p＝2-10；其中，q＝2-5；以及其中，m＝2-10；
R3独立地选自
附图说明
图1是单轴压缩至初始MS直径的90％时的机械阻力的图，其中，用由TBA-Alg(x)得到的PEG接枝的海藻酸制备所有MS。
图2是对MS进行10次连续按压的阻力的图，其中，A是Alg-PEG-a I(3wt％)和Alg-PEG-b I(4wt％)的对比图；B是Alg-PEG-a II(3wt％)和Alg-PEG-b II(4wt％)的对比图；C是Alg-PEG-a I(3wt％)和Alg-PEG-a II(3wt％)和Alg-PEG-aⅢ(3wt％)的对比图；D是来自TBA-Alg(x)的Alg-PEG-a I(3wt％)和来自TBA-Alg(y)的Alg-PEG-a I(2wt％)的对比图；E是Alg-PEG-a I、Alg-PEG-a II和Na-Alg(所有配方均为3wt％)的对比图；F是Alg-PEG-b I、Alg-PEG-b II和Na-Alg(所有配方均为4wt％)的对比图。
图3是通过40kDa和150kDa的FITC-葡聚糖的进入扩散来评价Alg-PEG-a I(x)MS的渗透选择性的图。上清液的荧光。
图4是在来自Alg-PEG-a I和Alg-PEG-a II的MS(平均微球直径：500μm)中微囊化的MIN6细胞。A：微囊化和培养后的第3天和第10天的照片。上图，光学显微图；中间图，用荧光素二乙酸酯染色活细胞；下图，用碘化丙啶染色死细胞。对于来自AlG-PEG-a II的MS，在底部的图中示出囊材料随时间的分解。B：在第3天、第10天和第15天测量的细胞活性。用荧光素二乙酸酯(FDA)染色活细胞以及用碘化丙啶(PI)染色死细胞。
图5是未封装的MIN6细胞和在来自Alg-PEG-a I和Alg-PEG-a II的MS中微囊化的MIN6细胞的葡萄糖刺激的胰岛素释放。
图6是在来自Alg-PEG-a I的MS(微球直径约500μm)中微囊化的原代猪肝细胞：照片是从微囊化当天至后续培养后的第6天。上图，光学显微图；中间图，用荧光素二乙酸酯染色活细胞；下图，用碘化丙啶染色死细胞。
图7是来自Alg-PEG-a I的MS中的原代猪肝细胞的白蛋白合成图。通过每日更换培养基来评价每日合成。
图8是直接在制备后(显微镜检查，左图)和在小鼠腹膜内植入后30天时，来自Alg-PEG-a I和Alg-PEG-a II的空MS的图。一些MS用箭头表示。
图9是在pH＝3、pH＝7.4和pH＝11下通过LC-MS定量从MS中释放的酮洛芬。曲线显示酮洛芬随时间的受控释放。
具体实施方式
本发明报道的方法旨在产生用于包括细胞疗法在内的不同应用的微球形式的接枝有至少一个部分的官能化水凝胶网络，解决了以下问题：可调节的体内稳定性(即机械、物理和化学完整性)，移植后的最小副作用，宿主和细胞接受性，MS的可调渗透性和可恢复性。
必须注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“a(一)”、“an(一个)”和“该”包括复数指示物，除非内容中另有明确说明。
本发明涉及一种用至少一个部分接枝的官能化水凝胶，其中，聚合物是阴离子多糖，并且该部分接枝在所述阴离子多糖的至少一个羟基上。
优选地，多糖是从包括葡聚糖、海藻酸、透明质酸和半乳糖醛酸、所述多糖的衍生物或其盐的组中选择的阴离子多糖。它可以是天然的、合成的或改性的。还设想了两种或多种阴离子多糖的组合，例如海藻酸和透明质酸。
优选地，阴离子多糖衍生物或改性的阴离子多糖是多糖醚和多糖酯。它们可以有一个或多个取代基，最好是以下类型：羟乙基、羟丙基、羟丁基、甲基，乙基、丙基、二羟丙基、羧甲基、磺乙基、疏水性长链支链和非支链的烷基、疏水性长链支链和非支链的烷基芳基或芳基烷基、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、硝酸盐或硫酸盐，其中，诸如，例如羟乙基、羟丙基、羟丁基、二羟丙基和乳酸盐的一些基团能够形成接枝。或者，阴离子多糖衍生物或改性阴离子多糖可选自WO2012167223中描述的那些，通过引用将其全部内容结合于此。根据本发明的多糖的取代基不限于这些基团。
根据本发明的阴离子多糖的优选盐选自诸如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锶盐、钡盐、锰盐的单价或二价盐。最特别地，优选钠盐。
最优选地，阴离子多糖是海藻酸、其衍生物或其盐。甚至更优选地，阴离子多糖是海藻酸钠(海藻酸钠或Na-alg)。
羟基的存在允许多糖与水环境相互作用，并参与链内和链间的氢键合。根据本发明，将部分接枝到所述阴离子多糖的至少一个羟基上。
根据本发明，“接枝”是指阴离子多糖和该部分之间的共价连接。优选地，该部分通过酰胺键或醚键接枝到阴离子多糖上。可选地，通过阴离子多糖和该部分之间的间隔物部分将该部分接枝到阴离子多糖上。间隔物部分可选自亚烷基、环亚烷基、亚烯基，最后被一个或多个取代基取代。阴离子多糖和该部分都可以在同一碳原子上或不同的碳原子上与间隔物连接。
对于本发明的要求，并且如本说明书和权利要求书中所示，术语“官能化水凝胶”或“官能化水凝胶网络”应理解为意指在阴离子多糖的每个糖单体单元上必然存在至少一个羧酸盐基团或羧酸官能团。优选地，在多糖主链上存在1mol％至40mol％、更优选5mol％至40mol％、最优选5mol％至30mol％的改性羟基。
优选地，通过氨基甲酸酯键或碳酸酯键将该部分接枝在所述阴离子多糖的一个羟基上。
该部分可以是任何分子或化合物。通常，该部分是合成的生物相容性聚合物，任选地包含治疗分子。
因此，本发明还涉及基于接枝有至少一个部分的阴离子多糖的官能化水凝胶，其中，该部分是接枝在所述阴离子多糖的至少一个羟基上的合成的生物相容性聚合物。
如本文所用，术语“生物相容性”是指聚合物不具有毒性、不具有伤害性、也不具有生理反应性(例如，无炎症迹象)且不引起体内免疫排斥反应。
优选地，合成的生物相容性聚合物选自包括以下的组：线性聚乙二醇(PEG)(400至10000g·mol-1)、多臂PEG(4臂或8臂，3000至20000g·mol-1)、具有末端反应性官能团(例如胺、叠氮化物、羧酸、乙烯基砜、丙烯酸盐、马来酰亚胺、硫醇、二硫戊环、炔烃、肼、酰肼)的线性和多臂PEG的衍生物、聚乙烯亚胺、或这些聚合物中的一种或多种的衍生物。优选地，治疗分子通过包括酯、酰胺、硫-碳键、三唑的共价键缀合。
还优选地，该部分选自包括聚乙二醇(PEG)或其衍生物、和治疗分子的组。
在该部分是PEG或其衍生物的情况下，则所述PEG或其衍生物是式I、II和/或III的异双官能PEG。
其中，n＝8-50，更优选n＝15-45，甚至更优选n＝20-44，并且甚至更优选n＝22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40、41、42、43或44；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自(CH2)pSH，其中，p＝2-10；其中，q＝2-5；其中，m＝2-10，更优选m＝2-8，甚至更优选m＝3-8，并且甚至更优选n＝3、4、5、6、7或8；
R3独立地选自
优选地，所述C1-6烷基-CO2H是CH2CO2H。
根据本发明，PEG或其衍生物是衍生自平均值为约22(PEG-a)或约44(PEG-b)的线性聚(乙二醇)HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH的异双官能PEG。优选地，异双官能PEG选自包括以下的组：
其中，n在10至60之间，优选在20至50之间，并且更优选在22至44之间。
本发明的官能化水凝胶优选为微球形式。可以通过诸如例如喷雾干燥、乳化沉淀、油包水乳液溶剂扩散、乳化交联方法和液滴挤入凝胶浴的本领域已知的任何技术获得微球(MS)。优选地，通过挤出到凝胶浴中获得MS。
例如，通过将如Na-Alg-PEG聚合物的官能化水凝胶以所需浓度溶解在含有0.4％NaCl的100mM MOPS缓冲溶液(pH＝7.4)的溶液中来制备所述Na-Alg-PEG聚合物的微球。在完全溶解后，将聚合物溶液直接挤出，以在含有吐温80(1/10000)的凝胶浴(例如，在100mMMOPS缓冲溶液(pH＝7.4)中含100mM CaCl2)中凝胶化。将含有或不含有细胞的聚合物溶液挤出到10倍体积的在MOPS中含有CaCl2·2H2O(100mM)的凝胶浴中。使用同轴气流液滴发生器(诸如，例如Encapsulator B-395Pro,Büchi Labortechnik AG,Flawil,Switzerland)产生微球。通过过滤分离微球，用CaCl2储液洗涤两次，并且最后在4℃下储存在该溶液中，或在细胞微囊化的情况下储存在细胞培养基中(实施例1)。
在本发明中，通过简单挤出到含有二价阳离子的凝胶浴中，导致自发形成电子和共价相互作用，可以容易地并且在短时间内(约几分钟)产生MS。因此，通过挤出到凝胶浴中的方法具有使用单组分方法的优势，其不需要额外的交联剂和光聚合步骤(例如，UV光交联)，这些对用于MS封装的细胞具有细胞毒性。
如实施例3所示，在珠粒形成(第1天)之后和一周(第7天)之后，MS直径没有显著变化，表明MS形态具有良好的稳定性(表2和3)。
此外，在将其初始直径压缩90％时，由Alg-PEG I和Alg-PEG II形成的MS显示出增加的机械阻力(图1)并且在所述90％压缩步骤之后显示出良好的恢复性能(图2)。
本发明的一个方面还涉及包含与选自细胞、蛋白质、核酸或其他分子中的至少第二元素组合的本发明的官能化水凝胶的组合物。优选地，通过在封装之前将所述第二元素直接分散在多糖溶液中来将所述第二元素封装在由官能化聚合物形成的微球内。
本发明的官能化水凝胶可用于从化妆品到手术和医学的许多领域。例如，它们可以单独使用或与至少一种第二元素组合使用，在诸如眼科、皮肤科、耳鼻喉科、神经学、内科和心血管外科的各种医学领域中作为薄膜和膜，特别是作为组织替代物和使组织表面(诸如切断的神经)粘附或防止手术粘连或用于伤口敷料的药剂。
本发明的官能化水凝胶还可以有利地与来自人类、动物或植物来源的诸如例如角质细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、尿细胞、干细胞、内皮细胞、胰腺细胞、肝细胞和神经细胞的细胞组合。可以将封装细胞移植到需要其的患者中以治疗疾病或病症。在一些方面，封装细胞获自同一个种的遗传上不同的成员或来自遗传改性的细胞。在可选方面，封装细胞获自与患者不同的种。在优选方面，将分泌激素或蛋白质的细胞封装并移植到患者体内以治疗疾病或病症。
本发明的MS与多种细胞相容。例如，用小鼠胰岛素瘤细胞系MIN6(实施例4，图4)的细胞和原代猪肝细胞(实施例6，图6和7)观察MS中的细胞微囊化。
此外，本发明的MS有利地存在不同的硫醇官能化的PEG接枝单元(方案2：Alg-PEGa I、Alg-PEG a II、Alg-PEG a III、Alg-PEG b I和Alg-PEG b II)，可以根据其随时间的不同的完整性或耐久性进行选择。
如实施例4所示，水凝胶的耐久性取决于硫醇官能化的PEG接枝单元提供的共价键的性质。确认了来自Alg-PEG a I体系的MS一直到第15天的完整性。相反，来自Alg-PEG-aII体系的MS的完整性随着时间而下降，并且在第10天左右观察到细胞的向外扩散。因此，硫醇官能化的PEG接枝单元随着时间影响微球网络的完整性，并且通过选择硫醇官能化的PEG接枝单元的类型可以容易地调节耐久性。
如本文所用，“耐久性”是指MS的物理和机械特征，特别是形态、尺寸和弹性。
如本文所用，“稳定性”是指MS网络中涉及的化学相互作用，特别是静电相互作用和共价交联。
重要的是，本发明的MS具有生物相容性，没有炎症迹象。如实施例7所示，通过在免疫活性小鼠中移植由Alg-PEG-a I和Alg-PEG-a II体系形成的空MS来评价这两种体系对细胞移植的适宜性，并且没有炎症迹象，没有结缔组织形成，也没有纤维化，表明没有主要的宿主不相容性(图8)。
而且，如上所述，它们可以有利地用作诸如心脏瓣膜或血管的器官的涂层，或如泌尿导管的生物医学制品的涂层。这种类型的涂层在很大程度上改善了待接枝的制品的生物相容性，从而在生物学水平上改善了其性能。
特别地，本发明的官能化水凝胶可用作冠状动脉血管成形术后的血管的涂层，用于在解剖血管后进行修复，以及用于在自发脱离或损伤后将皮瓣附着在其壁上，以及用于密封动脉瘤。
在本文所述的本发明的一些方面，本发明的官能化水凝胶或其药学上可接受的盐与至少一种药学上可接受的载体一起存在于药物组合物中。药学上可接受的载体可以包括药学佐剂和/或其他赋形剂，并且只要其他成分与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害，则它们被视为是药学上可接受的。因此，本发明的药物组合物的目的是提供具有稳定、施用和递送多种活性成分和/或生物活性剂所需性能的官能化水凝胶。
如本文所用，术语“药物”是指经批准用于治疗干预的制剂。
如本文所用，术语“生物活性剂”是指已经报道了生物活性(对于酶、细胞、受体......)但尚未批准用于治疗干预的分子。
如本文所用，术语“活性成分”是指药物中具有治疗作用的分子。
根据所治疗的病症，可以配制药物组合物并且全身地或局部地施用药物组合物。在一个方面，本发明的目的在于提供用于稳定、施用和递送活性成分和/或生物活性剂的官能化多糖，其可以通过相对简单的方法制备，并且可以提供提高的调整相互作用性能的能力。因此，本发明这一方面的目的是提供具有稳定、施用和递送多种活性成分和/或生物活性剂所需性能的官能化多糖。
药物组合物的活性成分和/或生物活性剂可以通过非共价相互作用(例如静电相互作用)和/或共价相互作用与微球连接。
因此，根据与活性成分、药物和/或生物活性剂相互作用的性质，可以控制活性成分、药物和/或生物活性剂随时间的释放动力学。
例如，本文报道的药物组合物可以用作用于在移植后受控递送分子货物(药物、肽序列)的载体。几种抗炎药(例如，姜黄素和酮洛芬)被衍生化，用于通过与海藻酸的羟基部分偶联或与接枝的PEG链共价连接进一步缀合至Alg-PEG微球，如下所示：
如实施例8所示，使用抗炎活性成分酮洛芬(方案3)制备了官能化的聚(乙二醇)衍生物，还制备了显示出良好稳定性的MS(方案4和5)。用酮洛芬官能化的MS稳定14天。
此外，作为载体的本发明的MS呈现出分子货物的受控递送，所述受控递送可通过选择pH来进行调节。如实施例8所示，在碱性pH下观察到酮洛芬的快速释放，在生理或酸性pH下观察到较慢的释放(图9)。
本发明还提供了制备本发明的官能化水凝胶的方法。
通常，制备官能化水凝胶的方法包括使阴离子多糖与部分反应，所述部分经官能化以使得在所述多糖的至少一个羟基上在所述多糖和所述部分之间形成共价键。
优选地，所述多糖是包含一个或多个羧酸官能团的阴离子多糖。优选地，该阴离子多糖选自包括葡聚糖、海藻酸、透明质酸和半乳糖醛酸、所述多糖的衍生物或其盐的组。它可以是天然的、合成的或改性的。还设想了两种或多种阴离子多糖例如海藻酸和透明质酸的组合。
通常，该部分选自包括聚乙二醇(PEG)或其衍生物、和治疗分子的组。
如果所述部分是PEG或其衍生物，则所述PEG或其衍生物是式I、Ⅱ和/或Ⅲ的异双官能PEG。
其中，n＝8-50；更优选n＝15-45，甚至更优选n＝20-44，并且甚至更优选n＝22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40、41、42、43或44；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自(CH2)pSH，其中，p＝2-10；
其中，q＝2-5；
其中，m＝2-10，更优选m＝2-8，甚至更优选m＝3-8，并且甚至更优选n＝3、4、5、6、7或8；
R3独立地选自
优选地，所述C1-6烷基-CO2H是CH2CO2H。
根据本发明，PEG或其衍生物是衍生自平均n值为22(PEG-a)或44(PEG-b)的线性聚(乙二醇)HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH的异双官能PEG。
优选地，异双官能PEG选自包括以下的组：
其中，n包括在22和44之间。
本发明的一个具体方面涉及一种制备官能化海藻酸基水凝胶的方法，该方法包括：
i)将海藻酸的一个或多个羧酸官能团或海藻酸盐的一个或多个羧酸盐官能团转化为TBA羧化物，
ii)通过在羰基二咪唑存在的情况下使一个或多个羟基反应然后沉淀来改性所述海藻酸或其盐的一个或多个羟基，
iii)通过以下方式制备硫醇官能化的PEG衍生物(PEG I、PEGII和PEGⅢ)：
iii1)使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)与受保护的3-巯基丙酸反应，然后同时进行叠氮基的还原和硫醇官能团的去保护，以产生PEG I，或
iii2)将中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)与活化的硫辛酸缀合，然后在LiAlH4存在的条件下还原，以释放作为硫辛酰基官能团的开放(还原)和封闭(氧化)形式的混合物的PEG II，或
iii3)使用铜物质(copper species)催化的点击反应使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)1a和1b与三唑部分接触以产生PEG III，
iv)用PEG I、PEG II和/或PEG III接枝官能化的海藻酸，以允许在所述海藻酸或其盐的一个羟基上在官能化的海藻酸和PEGI、PEG II和/或PEG III之间形成共价键，以及
v)通过透析和冷冻干燥纯化PEG接枝的海藻酸。
本文介绍了制备官能化海藻酸基水凝胶的上述方法，从而用于利用含硫醇的聚(乙二醇)单元官能化生物聚合物海藻酸。可以调整合成途径的第一步(包括对Na-alg的非均相酸化)以提供不同摩尔质量的中间体TBA-alg(实施例2，方案2)。从这些中间体中，通过以咪唑阴离子(imidazolide)形式活化羟基部分，然后与异型(heterocheletic)PEG衍生物形成共价氨基甲酸酯键，获得Alg-PEG衍生物。分子质量较高的TBA-alg中间体导致生成的Alg-PEG体系的粘性更强。
采用二价阳离子(诸如钙离子Ca2+或钡离子Ba2+)的离子胶凝化和硫醇部分的共价自交联的组合导致MS表现出适合细胞移植应用的机械性能和渗透选择性。优选地，二价阳离子是钙离子。
如实施例中所示，通过改变PEG长度和官能团、接枝度和alg-PEG浓度，实现了对MS性能(例如耐久性和稳定性)的微调。此外，通过略微修改接枝方案可以强制或避免海藻酸链降解。
本发明还设想了治疗和/或预防人类或动物患者的疾病或病症的方法，包括：将从封装在本发明的官能化水凝胶中的细胞、蛋白质、核酸或其他分子中选择的材料植入或移植到人类或动物患者中。
体外和体内研究证明了本发明的官能化水凝胶对细胞微囊化的相容性及其用于细胞移植的潜力。根据目标应用，可以调整这些官能化水凝胶的性能，以实现长期的体内耐久性或随时间降解。
还设想了用于治疗和/或预防人类或动物患者疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物包含与从细胞、蛋白质、核酸或其他分子中选择的至少一种第二元素组合的本发明的官能化水凝胶、和药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种用于治疗和/或预防人类或动物患者的疾病或病症的方法，包括施用药物组合物，其中，该药物组合物包含与从细胞、蛋白质、核酸或其他分子中选择的至少一种第二元素组合的本发明的官能化水凝胶、以及药学上可接受的载体。
另一方面还涉及本发明的官能化水凝胶在制备用于治疗和/或预防人类或动物患者疾病或病症的药品或药物或治疗产品中的应用。
本发明还包括适于在其两个末端正交官能化的式I、Ⅱ和/或Ⅲ的异双官能PEG低聚物、或其衍生物：
其中，n＝8-50，更优选n＝15-45，甚至更优选n＝20-44，并且甚至更优选n＝22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40、41、42、43或44；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自(CH2)pSH，其中，p＝2-10；
其中，q＝2-5；
其中，m＝2-10，更优选m＝2至8，甚至更优选m＝3至8，并且甚至更优选n＝3、4、5、6、7或8；
R3独立地选自
优选地，所述C1-6烷基-CO2H是CH2CO2H。
根据本发明，所述PEG或其衍生物是衍生自平均值为22(PEG-a)或44(PEG-b)的线性聚(乙二醇)HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH的异双官能PEG。优选地，异双官能PEG选自包括以下的组：
其中，n包括在22至44之间。
实施例
1.材料和方法
化学合成-一般条件
Na-alg Kelton HV(批号61650A，[η]＝0.1M NaCl中813mL·g-1，T＝25℃，G/M＝0.6)获自Kelco(San Diego，USA，CA)。线性PEG(MM＝1000g·mol-1或2000g·mol-1)获自Sigma(Buchs，Switzerland)。其他商业试剂(Fluka,Sigma,Switzerland；TCI Europe,Zwijndrecht,Belgium)无需进一步纯化即可使用。除非特别提及，否则所有反应均在氩气气氛(1atm)下进行。通过过滤(Innovative Technology，Oldham，UK)获得无水溶剂。通过TLC(Merck硅胶60F254板，Merck，Darmstadt，Germany)监测反应。通过紫外线、KMnO4，茚三酮或I2实施检测。通过在硅胶上(Merck N°9385硅胶60，240～400目)进行快速色谱来实施纯化。在Perkin-Elmer-1420光谱仪(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)上记录红外光谱。在Bruker ARX-400光谱仪(400MHz)(Bruker，Billerica，MA，USA)上记录1H-NMR光谱。在Bruker ARX-400光谱仪(100.6MHz)上记录13C-NMR光谱。以百万分之一(ppm)表示化学位移，以赫兹表示耦合常数(j)。用于NMR光谱的溶剂是氘代氯仿(CDCl3，Acros)和氘代甲醇(CD3OD，Acros)。在具有化学电离(NH3)和模式m/z(amu)[％相对基峰(100％)]的Nermag R-10-10C光谱仪(Nermag，Santa Clara，CA，USA)上获得质谱。
单组分微球的形成
根据以下配方制备Na-Alg-PEG聚合物的溶液：将所需浓度的Na-alg-PEG溶解在含0.4％NaCl的100mM MOPS缓冲溶液(pH＝7.4)的溶液中。在完全溶解后，将聚合物溶液直接挤出，以在含有吐温80(1/10000)的凝胶浴(含100mM CaCl2的100mM MOPS缓冲溶液(pH＝7.4))中凝胶化。使用同轴气流液滴发生器(Encapsulator B-395Pro,Büchi LabortechnikAG,Flawil,Switzerland)产生MS。在聚合物与细胞一起使用的情况下，通过过滤将聚合物溶液灭菌。将含有或不含有细胞的聚合物溶液挤出到10倍体积的含有CaCl2·2H2O(100mM)的MOPS的凝胶浴中。通过过滤收集MS，用CaCl2储液洗涤两次，并且最后在4℃下储存在该溶液中，或在细胞微囊化的情况下储存在细胞培养基中。
微球的物理表征
在配备有Olympus DP70彩色数码相机的Olympus AX70显微镜上测量平均直径。使用配备有力传感器(1mN分辨率)的纹理分析仪(TA-XT2i，软件纹理指数32，稳定微系统，Godalming，UK)分析初始MS直径90％压缩的机械阻力。将单个MS放置在探头下方，将其恒定速度设置为0.5mm·s-1。分析中包括每批30个MS。通过测量FITC-葡聚糖标准品(40,150kg·mol-1)的进入扩散来研究MS的渗透性。测量前，在凝胶浴中平衡MS。将通过过滤收集并在纸上轻轻干燥的700mg MS在1mL FITC-葡聚糖溶液(1mg·mL-1，在100mMCaCl2溶液中)中孵育。在1分钟后(t＝0)以规定的时间间隔抽取40μL上清液，并在600μL的凝胶浴中稀释。荧光光谱仪(MultiplateReader Safire-II Tecan，Maennedorf，Switzerland)用于监测FITC-葡聚糖浓度。
MIN6细胞的微囊化
在补充有1mM丙酮酸钠、71μMβ-巯基乙醇、15％去补体胎牛血清、25mM葡萄糖、青霉素和链霉素的Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM)(DMEM完全培养基)中培养MIN6细胞。将10×106个MIN6细胞轻轻混合在1mL Na-alg-PEG溶液中。使用与上述用于形成单组分MS的相同方法制备MS。
如人前所述(Meier RP,et al,PloS one,2014)，将封装的和游离的MIN6细胞在DMEM完全培养基中培养长达10天或15天，并通过FDA/PI染色和葡萄糖刺激的胰岛素释放实验分析其活性和功能。
将MS移植到小鼠中
动物研究是根据日内瓦州兽医局(许可证GE/34/13)进行的。通过小的腹部切口将1mL空的MS转移到麻醉免疫活性C57/BL6小鼠的腹膜中。30天后，处死小鼠以对腹膜中的纤维化反应进行宏观评价。
2.合成方案
化合物的名称是指方案1和方案2中所示的化学结构。
开发了一种合成方案，以利用含有用于共价交联的末端硫醇(I或III)或1,2-二硫戊环(II)官能团的异双官能PEG衍生物官能化生物聚合物海藻酸钠的羟基的合成路线。
化合物2的制备(方案1)
向含有3-巯基丙酸(1当量，94.2mmol，10g)的H2O:THF(1:1，180mL)的溶液中加入Boc2O(1.2当量，113.04mmol，24.7g)和Et3N(2当量，188.4mmol，19.07g，25.43mL)，并且在室温下将反应混合物搅拌12小时。真空蒸发THF，并加入1M HCl(50mL)。用DCM(3×100mL)萃取产物。将合并的有机层干燥(MgSO4)并真空浓缩。通过FCC在硅胶(PE/EtOAc 8：1)上纯化产物，得到2(43.3mmol，8.92g，46％)，为透明油状物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ11.01(s，1H，COOH)、3.01(t，J＝7.0Hz，2H，CH2-S)、2.74(t，J＝7.0Hz，2H，CH2-COOH)、1.48(s，9H，3×CH3)。
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ178.2(COOH)、168.9(CO)、85.3(Cq)、34.8(CH2),28.3(CH3)、25.7(CH2)。
IR(neat)：1710、1370、1245、1205、1125、825cm-1。
HRMS-ESI：C8H14O4S的计算值:205.0535；实测值:205.0535。
化合物3a的制备(方案1)
向含1a(1当量，1.88mmol，2g)和2(2当量，3.77mmol，778mg)的DCM(20mL)的溶液中加入EDCI(3当量，5.64mmol，875.6mg)和Et3N(3当量，5.64mmol，570.7mg)。在室温下将反应混合物搅拌24小时，并且随后用饱和的NH4Cl溶液(2×20ml)和饱和的NaHCO3溶液(2×20ml)洗涤。将有机相干燥(MgSO4)，真空浓缩。通过FCC在硅胶(DCM/MeOH 20：1至10：1)上纯化产物，得到3a(1.74mmol，1.94g，93％)，为淡黄色油状物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ6.30(s，1H，NH)，3.69-3.63(m，80H，40×CH2-O-CH2)，3.60-3.54(m，2H，CH2-O)，3.47(t，J＝5.2Hz，2H，CH2-NH),3.42-3.38(m，2H，CH2-N3),3.05(t，J＝7.1Hz，2H，CH2-CO)，2.53(t，J＝7.2Hz，2H，CH2-S)，1.48(s，9H，3×CH3)。
13C NMR(100MHz，CDCl3):δ170.8(CO)，169.2(CO)，84.9(Cq)，70.7(CH2)，70.7(CH2)，70.6(CH2)，70.6(CH2)，70.2(CH2)，70.0(CH2)，69.8(CH2)，50.8(CH2)，39.3(CH2)，36.6(CH2)，28.2(3×CH3)，26.7(CH2)。
IR(neat):2860，2110，1700，1670，1545，1465，1345，1290，1250，1205，1110，1030，945，840cm-1。
HRMS-ESI:C52H102N4O24SNa的计算值:1221.6503；实测值：1221.6501。
PEG-a I的制备(方案1)
向含化合物3a(1当量，1.46mmol，1.5g)的甲苯(7.5mL)溶液中加入PPh3(1.8当量，2.70mmol，708mg)并且在室温下将反应搅拌30分钟。然后，加入1M HCl(19.7mL)并将反应系在室温下搅拌48小时。分离两相，并且用1M HCl(2×20mL)洗涤有机相。在真空浓缩之前，用DCM(10mL)洗涤合并的水层。在与甲苯(3×10mL)共蒸发后，获得纯化合物PEG-aⅠ(3.37μmol，3.32g，95％)，为黄色无定形固体。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：7.64(s，1H，NH2)，3.78(m，2H，CH2-CH2-NH2)，3.63-3.54(m，80H，CH2-O-CH2)，3.41(m，2H，CH2-N3)，3.10(m，2H，CH2-NH2)，2.78(m，2H，CH2-SH)，2.64(m，2H，CH2-CO)，1.68(s，1H，SH)。
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ172.3(CO)，70.3(CH2)，70.2(CH2)，70.2(CH2)，70.1(CH2)，70.0(CH2)，69.8(CH2)，69.1(CH2)，66.7(CH2)，40.1(CH2)，39.6(CH2)，39.2(CH2)，20.7(CH2)。
IR(neat):2860，1660，1555，1465，1340，1300，1250，1095，1035，950，845，730cm-1。
HRMS-ESI:C47H96N2O22S的计算值:1073.6254；实测值：1073.6285。
化合物4的制备(方案1)
向含硫辛酸(1当量，48mmol，10g)的DMF(30mL)溶液中加入EDCI(1.5当量，72mmol，11.17g)和NHS(1.5当量，72mmol，8.36g)。在室温下将反应混合物搅拌12小时并真空浓缩。将粗产物溶于DCM中，并且用H2O和盐水洗涤三次。将有机相干燥(MgSO4)并真空浓缩。通过FCC在硅胶(EtOAc/PE 1：1)上纯化产物，得到4(22.42mmol，6.79g，46％)，为黄色固体。
1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ3.65-3.49(m，1H，CH-S)，3.24-3.05(m，2H，CH2-S)，2.83(s，4H，2×CH2-CO)，2.62(t，J＝7.3Hz，2H，CH2-CO)，2.53-2.39(m，1H，H-CH-CH2-S)，1.98-1.86(m，1H，H-CH-CH2-S)，1.85-1.65(m，4H，CH2-CH-S，CH2-CH2-CO)，1.63-1.49(m，2H，CH2-CH2-CH2-CO)。
13C NMR(100MHz，CDCl3):δ169.3(2×CO)，168.5(CO)，56.2(CH)，40.3(CH2)，38.6(CH2)，34.5(CH2)，30.9(CH2)，28.4(CH2)，25.7(CH2)，24.5(CH2)。
IR(neat):2940，1810，1780，1460，1420，1410，1375，1360，1205，1070，900，880，810，730cm-1。
HRMS-ESI:C12H17NO4S2Na的计算值：326.0497；实测值：326.0497。
化合物5a的制备(方案1)
向含化合物1a(1当量，4.72mmol，5g)和4(2当量，9.44mmol，2.86g)的DMF(35mL)溶液中加入Et3N(1当量，4.72mmol，477mg)。在真空蒸发溶剂之前，在室温下将反应混合物搅拌48小时。将粗品溶于DCM(100mL)中并用饱和的NH4Cl(2×40mL)洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并真空浓缩。通过FCC在硅胶(DCM/MeOH 17：1)上纯化产物，得到5a(3.71mmol，4.63g，78％)，为淡黄色无定形固体。
1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ6.23(s，1H，NH)，3.70-3.58(m，80H，40×CH2-O-CH2)，3.65-3.49(m，1H，CH-S)，3.56-3.51(m，2H，CH2-O)，3.42(q，J＝5.1Hz，2H，CH2-NH)，3.37(t，J＝4.2Hz，2H，CH2-N3)，3.23-3.04(m，2H，CH2-S)，2.44(m，1H，H-CH-CH2-S)，2.17(t，J＝7.5Hz，1H，CH2-CO)，1.97-1.82(m，1H，H-CH-CH2-S)，1.75-1.59(m，4H，CH2-CH-S，CH2-CH2-CO)，1.51-1.37(m，1H，CH2-CH2-CH2-CO)。
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ172.8(CO)，77.4(CH2)，77.1(CH2)，76.7(CH2)，70.7(CH2)，70.6(CH2)，70.6(CH2)，70.2(CH2)，70.0(CH2)，69.9(CH2)，56.4(CH)，50.7(CH2)，40.2(CH2)，39.2(CH2)，38.5(CH2)，36.3(CH2)，34.7(CH2)，28.9(CH2)，25.4(CH2)。
IR(neat):2870，2100，1635，1555，1465，1345，1280，1250，1105，960，850cm-1。
HRMS-ESI:C52H102N4O22S2Na的计算值:1221.6324；实测值：1221.6367。
化合物PEG-a II的制备(方案1)
在氩气气氛下，将化合物5a(1当量，866μmol，1g)溶解在无水THF(5mL)中。分批加入LiAlH4(2当量，1.73mmol，66mg)并且在室温下将反应系搅拌40分钟。逐滴加入EtOAc(2mL)、然后加入H2O淬灭反应，并用DCM(3×30mL)萃取产物。将合并的有机层干燥(MgSO4)并真空浓缩，得到PEG-a II(791μmol，895g，91％)，为白色无定形固体。
IR(neat):2885，1640，1555，1465，1360，1345，1280，1240，1105，960，845cm-1。
HRMS-ESI:C52H106N2O22S2的计算值:1175.6757；实测值:1175.6735；C52H104N2O22S2Na的计算值:1173.6600；实测值:1173.6677。
化合物6的制备(方案1)
将吡啶(3当量，282.6mmol，22.3g，22.8mL)滴加到3-巯基丙酸(1当量，94.2mmol，10g，8.2mL)和乙酸酐(3当量，282.6mmol，28.8g，26.5mL)的混合物中。在室温下将反应溶液搅拌16小时并真空浓缩。将粗产物溶于DCM中，并用KHSO4洗涤三次。将有机相干燥(MgSO4)，真空浓缩，通过FCC在硅胶(DCM/MeOH 10：1)上纯化产物，得到所需中间体，为淡黄色油状物(53mmol，7.85g，56％)。将EDCI(1.5当量，79.4mmol，15.2g)和NHS(2当量，106mmol，12.2g)加入到含中间体(1当量，53mmol，7.85g)的DMF(50mL)溶液中。在室温下将反应混合物搅拌16小时并真空浓缩。将粗产物溶于DCM中，并用H2O和盐水洗涤三次。将有机相干燥(MgSO4)，真空浓缩。通过FCC在硅胶(EtOAc/PE 7：8)上纯化产物，得到期望的NHS酯，为白色固体(37.3mmol，9.14g，70％)。将NHS酯(1当量，16.3mmol，4g)溶于DCM(15mL)和Et3N(1.2当量，19.6mmol，1.98g，2.73mL)中，并且逐滴加入炔丙基胺(1当量，16.3mmol，98毫克，1.1毫升)。在室温下将反应溶液搅拌16小时，并且随后用H2O(2×20ml)、饱和的NaHCO3(2×20ml)和0.6m HCl(2×20ml)洗涤DCM层。将有机相干燥(MgSO4)，真空浓缩。通过FCC在硅胶(EtOAc/PE 1：1)上纯化产物，得到6(10.54mmol，1.95g，63％)，为白色固体。
1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ6.00(s，1H，NH)，4.04(dd，3J＝5.2，4J＝2.6Hz，2H，CH2-NH)，3.12(t，3J＝7.0Hz，2H，CH2-S)，2.50(t，3J＝7.0Hz，2H，CH2-CO)，2.32(s，3H，CH3)，2.23(t，4J＝2.6Hz，1H，HCC)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3):δ196.3(CO)，170.4(CO)，79.5(Cq)，71.8(CH)，36.1(CH2)，30.7(CH3)，29.3(CH2)，24.8(CH2)。
IR(neat):3260，3060，2920，1740，1680，1660，1645，1540，1420，1355，1255，1210，1140，1115，965cm-1。
HRMS-ESI:C8H11NO2SNa的计算值:208.0408；实测值:208.0409。
化合物7a的制备(方案1)
将化合物1a(1当量，1.33mmol，1.5g)和6(1.15当量，1.53mmol，283mg)溶于1：1的DMF：H2O(20mL)的混合物中。加入催化量的CuSO4(1mg)和抗坏血酸钠(1mg)，并在室温下将反应混合物搅拌2小时。加入DCM(50mL)，并且用H2O(20mL)和1％NH3水溶液(2×20mL)洗涤有机相。将有机相干燥(MgSO4)，真空浓缩。通过FCC在硅胶上(DCM/MeOH 11：1至4：1)纯化产物，得到7a(1.09mmol，1.44g，83％)，为淡黄色油状物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ7.71(s，1H，CH)，6.53(s，1H，NH)，5.05(s，1H，NH)，4.49(m，4H，CH2-CH2-N，CCH2-NH)，3.85(m，2H，CH2-CH2-N)，3.68-3.55(m，80H，40×CH2-O-CH2)，3.51(t，3J＝5.1Hz，2H，CH2-CH2-NH)，3.28(m，2H，CH2-NH)，3.11(t，3J＝7.0Hz，2H，CH2-S)，2.48(t，3J＝7.0Hz，2H，CH2-CO)，2.29(s，3H，CH3)，1.42(s，9H，3×CH3)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3):δ185.9(CO)，170.7(CO)，156.1(CO)，144.5(Cq),123.4(CH)，79.2(Cq)，70.6(CH2)，70.3(CH2)，69.5(CH2)，50.4(CH2)，40.4(CH2)，36.0(CH2)，35.2(CH2)，30.7(CH3)，28.5(3×CH3)，24.9(CH2)。
IR(neat):3335，2865，1690，1730，1530，1460，1350，1250，1100，950，845cm-1。
HRMS-ESI:C57H109N5O25SNa的计算值：1318.7030；实测值：1318.7072。
化合物PEG-a III的制备
将含有4M HCl的二噁烷溶液(13mL)加入化合物7a(1当量，0.97mmol，1.3g)中并且在室温下将反应混合物搅拌2小时。除去二噁烷，以定量产率得到酰化中间体(0.97mmol，1.23mg)，为淡黄色油状物。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.92(s，2H，NH2)，7.77(s，1H CCH-N)，6.94(s，1H，NH)，4.48(m，4H，CH2-CH2-N，CCH2-NH)，3.84(m，4H，CH2CH2-N，CH2-NH2)，3.73-3.51(m，80H CH2-O-CH2)，3.15(m，2H，CH2-CH2-NH2)，3.09(t，3J＝7.0Hz，2H，CH2-S)，2.48(t，3J＝7.0Hz，2H，CH2-CO)，2.27(s，3H，CH3)。
13C NMR(100MHz，CDCl3):δ195.9(CO)，170.9(CO)，144.3(Cq)，123.7(CH)，77.4(CH2)，70.8-69.6(CH2)，69.4(CH2)，66.8(CH2)，50.5(CH2)，40.4(CH2)，40.1(CH2)，35.8(CH2)，34.9(CH2)，30.6(CH3)，24.8(CH2)，20.5(CH2)。
IR(neat):2870，1670，1540，1460，1350，1300，1250，1100，950，845，730cm-1。
HRMS-ESI:C52H101N5O23S的计算值：1196.6686；实测值：1196.6713。
将10％HCl溶液加入到酰化中间体(1当量，836μmol，420mg)中并将反应系在30℃下搅拌5小时。将反应混合物真空干燥，得到PEG-a III(736μmol，850mg，88％)，为黄色油状物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3):δ7.92(s，3H，CCH-N，NH2)，7.08(s，1H，NH)，4.54(m，4H，CH2-N-N＝N，CCH2-NHCO)，3.85(m，4H，CH2CH2-N，CH2-NH2)，3.63-3.56(m，80H，CH2-O-CH2)，3.14(m，2H，CH2-CH2-NH2)，2.75(m，2H，CH2-SH)，2.51(t，3J＝6.5Hz,，2H，CH2-CO)，1.60(t，3J＝8.3Hz，2H，SH)。
13C NMR(100MHz，CDCl3):δ171.1(CO)，144.5(Cq)，123.9(CH)，70.8-69.6(CH2)，69.1(CH2)，66.7(CH2)，50.4(CH2)，40.1(CH2)，39.8(CH2)，34.5(CH2)，20.3(CH2)。
IR(neat):3675，2870，1670，1540，1455，1350，1300，1250，1100，950，845cm-1。
HRMS-ESI:C50H99N5O22S的计算值：1154.6581；实测值：1154.6603。
TBA-alg的制备(方案2)
制备TBA-alg(x)的一般方法
为了将Na-alg转化为海藻酸，将Kelton HV(2g)加入到含水HCl(30mL，0.6N)和乙醇(30mL)的混合溶液中，并将溶液在4℃下搅拌过夜。通过真空过滤分离所得固体，用乙醇和丙酮洗涤，并在40℃的真空条件下快速干燥。将干燥的海藻酸分散在水(100mL)中，并加入TBAOH(5mL，40％水溶液)。将溶液透析(8倍于蒸馏水)，并且最后冷冻干燥，得到TBA-alg(a)，为白色固体。
制备TBA-alg(y)的一般方法
为了将Na-alg转化为海藻酸，将Kelton HV(2g)溶解在蒸馏水(200mL)中。加入20％甲酸水溶液(220mL)并将溶液在0℃搅拌过夜。加入EtOH(200mL)，并且通过真空过滤分离所得固体，用H2O：EtOH(1：1，3×200mL)和EtOH(200mL)丙酮(200mL)洗涤，并在40℃下在真空下快速干燥。将干燥的海藻酸分散在水(200mL)中，加入TBAOH(0.5当量，3.4mL，40％水溶液)，搅拌溶液直至完全分散。不进行透析，将溶液直接冷冻干燥，得到TBA-alg(b)，为白色固体。
Alg-PEG衍生物的制备
官能化TBA-Alg的一般方法(方案2)
将TBA-alg(1当量，2.39mmol，1g)溶解在DMSO(200mL)中并将溶液搅拌12小时以确保高度均匀性。将之前溶解在最小体积(1mL)的DMSO中的CDI(1当量，2.39mmol，387mg)加入到该溶液中，并将反应系在室温(rt)下搅拌30分钟。将丙酮(400mL)加入到反应混合物中，并且过滤所得沉淀物并用丙酮(3×100mL)洗涤。将沉淀物转移到圆底烧瓶中并加入蒸馏水(100mL)。溶解后，加入溶解在最小体积(1mL)的水中的氨基-PEG衍生物(0.2当量，479μmol)并将反应混合物搅拌2小时。通过加入0.05M NaOH溶液(50mL)淬灭反应，并将反应混合物直接倒入透析膜中并用蒸馏水透析。一天内换三次水透析。在透析管中加入柠檬酸钠溶液(0.1M，2mL)3次，再用蒸馏水透析。然后在透析管中加入TCEP(0.1M，2mL)3次，再用蒸馏水进行透析。然后，在添加0.05M NaOH(30ml)调整pH值以达到pH＝7之前，将水透析更换5次。将溶液过滤(70μm)并冷冻干燥，得到所需产物，为白色固体。
异双官能PEG衍生物的制备(方案1)
用于医学应用的PEG接枝的alg材料的开发需要获得各种异型(heterocheletic)PEG低聚物。根据之前关于叠氮基和氨基硅烷化PEG分子的产生的报道[22，23]，开发了直接的合成途径以产生几种硫醇官能化的PEG衍生物。从线性PEG(HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH，n的平均值为22或44，定义为PEG-a或PEG-b)开始，以良好的总收率获得关键中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)1a和1b。通过与受保护的3-巯基丙酸(2)的偶联反应，然后同时进行叠氮基的还原和硫醇官能团的去保护，来获得PEG I低聚物。可选地，与活化的硫辛酸缀合，然后在LiAlH4存在下进行还原，获得了PEG II，作为硫辛酰官能团的开放(还原)和封闭(氧化)形式的混合物。最后，通过使用由铜物质催化的点击反应引入三唑部分以产生PEG III，可以降低PEG链的刚性。
方案1.用于官能化海藻酸的异双官能PEG衍生物的制备利用PEG衍生物官能化Na-Alg(方案2)
为了使Na-alg的所有羧基可用于离子交联，我们专注于羟基的改性。首先将Na-alg(Kelton HV)转化为TBA-alg以增加在DMSO中的溶解度，用于进一步的化学衍生化(方案2)。Na-alg的非均相酸化是在乙醇-HCl水溶液或甲酸水溶液中进行的[24]，然后用TBAOH处理以得到TBA-alg聚合物(TBA-alg(x)；TBA-alg(y))。在羰基二咪唑存在下将羟基活化0.5小时，并随后沉淀，得到了活化的咪唑阴离子(imidazolide)。与PEG衍生物I-III缩合，然后通过透析和冷冻干燥进行纯化，得到PEG-接枝的Na-alg，用于形成MS。
方案2.利用PEG衍生物官能化Na-alg
通过NMR分析，确定中间体TBA-alg和PEG接枝的海藻酸的化学结构。测量含有不同浓度的聚合物的溶液的粘度，以优化用于形成MS的条件(表1)。
表1.中间体TBA-alg和PEG接枝的海藻酸的性质
1用1H-NMR测定；2用1H-NMR测定；x：利用乙醇-HCl对Na-alg进行初始处理；y；利用甲酸对Na-alg进行初始处理。
3.由PEG接枝的海藻酸衍生物形成微球
将表1中所示浓度的Alg-PEG溶液挤出到含有CaCl2作为离子交联剂的凝胶浴中产生单组分MS，评价其尺寸、对压缩的机械阻力、弹性和渗透性。
3.1尺寸和形态
在表2和3中记录MS的尺寸和形态。
表2.MS的尺寸和形态
1对TBA-alg(x)进行PEG衍生物接枝；2在25℃下将MS保持在MOPS(10mM，pH＝7.4)中；3配备有Olympus DP70彩色数码相机的Olympus AX70显微镜
对于每种PEG衍生物，接枝的链的长度的增加导致珠粒直径的增加(配方1对2；3对4)。在珠粒形成(第1天)之后和一周(第7天)之后评价MS直径，没有显示出MS的显著变化。相比之下，Na-Alg MS在第1天显示直径为997±127μm2，并且在第7天显示直径为986±81μm2。
表3.从TBA-alg(y)制备的Alg-PEG-a I的MS的尺寸和形态
产物 第3天的直径(μm)<sup>2</sup> 第7天的直径(μm)<sup>2</sup>
Alg-PEG-a I<sup>1</sup> 757.53±73.47 737.8±79.03
1对TBA-alg(y)进行PEG衍生物接枝；2在25℃下将MS保持在MOPS(10mM，pH＝7.4)中；3配备有Olympus DP70彩色数码相机的Olympus AX70显微镜
然后评价MS对于压缩的机械阻力和渗透性。
3.2对于压缩的机械阻力
在共价交联完成后测量对单轴压缩的机械阻力。在压缩至其初始直径的40-50％时，所有MS显示出最小的机械阻力。从70％观察到机械阻力的增加，并且该阻力呈指数变化一直到90％。图1给出了对表2和表3中列出的单组分MS的90％压缩的机械阻力。
通过对以初始MS直径的90％反复压缩评价形状的恢复性能来进一步评价MS的机械性能(图2)。Ca-alg MS的物理性质的缺点之一是它们的弹性差。由Alg-PEG I和Alg-PEGII形成的MS显示出良好的恢复性能。
3.3渗透性评价
对于渗透性评价，MWCO为150kg·mol-1是阈值，高于该阈值，用于细胞微囊化和进一步移植的MS应排除任何化合物。通过40kg·mol-1和150kg·mol-1的FITC-葡聚糖标准品的进入扩散来进行该评价。有趣的是，由PEG接枝的海藻酸衍生物形成的所有MS允许40kg·mol-1的FITC-葡聚糖的扩散，但排除了150kg·mol-1的FITC-葡聚糖，表明它们的MWCO适合于细胞微囊化应用。Ca-alg MS难以实现这种选择渗透性要求。图3给出了通过FITC-葡聚糖对Alg-PEG-a I体系的进入扩散来评价渗透性的代表性实施例。
3.4MS在4周的稳定性
因此，接枝度为15-20％的Alg-PEG I水凝胶产生能在25mM柠檬酸钠溶液中保持稳定超过4周的微球。在相同条件下，Ca-Alg微球在48小时内溶解。这些结果突出了共价交联对增强微球网络的稳定性的重要性。
4.评价用于细胞微囊化的PEG接枝的海藻酸基水凝胶
MS的细胞活力
通过在含有CaCl2的凝胶浴中挤出，在生理条件下进行Alg-PEG-a I或Alg-PEG-aII对MIN6细胞的封装。该一步法提供了平均直径在500-600μm的MS。通过FDA/PI染色评价细胞活力(图4A)。
观察到两种MS类型内的均匀细胞分布，并且在周围培养基中未检测到游离细胞。
在第3天、第10天和第15天测量细胞活力(图4B)。确定微囊化后15天里的细胞活力。在培养基中未发现游离细胞，证实了来自Alg-PEG a I体系的MS的完整性。来自Alg-PEG-a II体系的MS的完整性随着时间的推移而下降，并且在第10天左右观察到细胞的向外扩散。在光学显微镜下，微球显示出一种明亮的外观。因此，可以通过PEG-Alg水凝胶的化学成分来调节MS的稳定性。
该观察结果表明，在用于细胞培养的生理条件下，由1,2-二硫戊环部分产生的共价交联是可逆的。改变安装在PEG链上的用于共价交联的官能团似乎具有调节产生的MS的稳定性的潜力，从而可以根据预期的应用类型来选择海藻酸盐衍生物的官能化。
由于与二价阳离子的静电相互作用以及共价交联(二硫键桥和二硫键簇)的结合，因此可以根据目标应用调整Alg-PEG水凝胶的体外和体内耐久性。
5.葡萄糖刺激的胰岛素释放实验
在静态条件下，在微囊化后的第3天和第6天，针对两种MS对游离的未封装的MIN6细胞和微囊化的MIN6细胞进行葡萄糖刺激的胰岛素释放实验。以葡萄糖浓度16.7M进行刺激，并且相对于基础浓度2.8M的葡萄糖计算胰岛素浓度的增加倍数，并对培养期间胰岛素的总水平(图5)进行校正。无论使用Alg-PEG-a I MS类型还是Alg-PEG-a II MS类型，游离的MIN6细胞和微囊化的MIN6细胞的检测结果相同。因此，官能化的海藻酸基水凝胶适用于维持微囊化细胞的胰岛素分泌能力。
6.原代猪肝细胞的微囊化
对Alg-PEG-a I体系用于原代猪肝细胞的微囊化进行了进一步的评价。从10kg的猪中分离肝细胞。微囊化的原代肝细胞在长达10天的培养期间保持存活(图6)。图6显示了培养至第6天。
每天测量微囊化的肝细胞产生的白蛋白，每天更换培养基(图7)。在微囊化时白蛋白的分泌能力得到保持，但是随着时间的推移呈下降趋势。
7.MS在免疫活性小鼠中的移植
通过在免疫活性小鼠中移植由Alg-PEG-a I和Alg-PEG-a II形成的空MS，评价这两种系统对细胞移植的相容性，随访期为30天。然后，对MS进行宏观检查和检索(图8)。在宏观检查中，MS是可见的。没有炎症迹象，没有结缔组织形成或纤维化，这表明采用Alg-PEG-aI或Alg-PEG-a II的MS具有宿主相容性。
8.活性成分-生物活性剂
PEG-接枝的海藻酸的生产提供了用活性成分和/或生物活性剂进一步官能化所得水凝胶、以改善用于细胞移植的微球的生物相容性的机会。使用抗炎活性成分酮洛芬(KT)生成官能化的聚(乙二醇)衍生物，使用酯键或酰胺键，以便可以通过共价键的性质调节体内的释放动力学(方案3)。
根据合成部分和方案4中所述的接枝方法，这些衍生物进一步用于海藻酸的官能化。通过提供与酮洛芬官能化的PEG衍生物的共价缀合的证据的DOSY NMR实验探测接枝。
进一步处理这些海藻酸衍生物以产生微球，并突出以下方面：
(1)Alg-PEG-酯-KT和Alg-PEG-酰胺-KT聚合物均可用于胰岛素生成细胞的微囊化(MIN6细胞用作模型)。
(2)在体外，可在2周内观察到从Alg-PEG-酯-KT微球释放酮洛芬。
此外，由Alg-PEG-酯-KT和Alg-PEG I聚合物的混合物制备微球，以制备呈现以下特征的球形基质：i)静电相互作用；ii)共价二硫键连接；iii)表面酮洛芬官能化(方案5)。
这些实验证明了本发明提出的合成方法的多功能性，为利用活性成分和/或生物活性剂进一步官能化的混合的静电-共价微球以减少移植后的炎症和纤维化提供了途径。
实验结果
用先前通过酰胺键或酯键与酮洛芬缀合的PEG接枝Na-alg(方案3和4)。由Na-alg和这些官能化的海藻酸衍生物的混合物形成MS。在37℃下酮洛芬官能化的MS在补充有FCS和抗生素(链霉素/青霉素)的DMEM中稳定14天。在pH＝3、pH＝7.4和pH＝11下通过LC-MS定量从MS释放的酮洛芬(图9)。曲线显示酮洛芬随时间的受控释放取决于培养基的pH。由于在碱性条件下酯的水解是一个快速的过程，因此在碱性pH下观察到快速释放。在MS形成后释放大量的活性成分和/或活性剂。在生理pH(7.4)下，动力学较慢并且允许少量活性成分和/或活性剂在较长时间内从MS扩散出来。在酸性pH下，释放速度甚至更慢。这与同活性剂(酯)的化学键的性质一致。
因此，胰岛素生产细胞MIN6是活的并且一旦封装在这些体系中就生产胰岛素(在第7天进行控制)。
方案3.PEG-酮洛芬缀合物的制备
方案4.用抗炎剂官能化海藻酸
方案5.混合的官能化的微球的制备
参考文献
1.Lee,K.Y.；Mooney,D.J.Alginate:Properties and biomedical applications.Prog.Polym.Sci.2012,37,106-126.
2.Goh,C.H.；Heng,P.W.S.；Chan,L.W.Alginates as a useful natural polymerfor microencapsulation and therapeutic applications.Carbohydr.Polym.2012,88,1-12.
3.Nedovic,V.；Willaert,R.Applications of Cell ImmobilizationBiotechnology；Springer:Dordrecht,2005.
4.O’Sullivan,E.S.；Vegas,A.；Anderson,D.G.；Weir,G.C.Islets transplantedin immunoisolation devices:A review of the progress and the challenges thatremain.Endocr.Rev.2011,32,827-844.
5.Basta,G.；Calafiore,R.Immunoisolation of pancreatic islet graftswith no recipient’s immunosuppression:Actual and futureperspectives.Curr.Diabetes Rep.2011,11,384-391.
6.Drury,J.L.；Dennis,R.G.；Mooney,D.J.The tensile properties ofalginate hydrogels.Biomaterials 2004,25,3187-3199.
7.Moya,M.L.；Morley,M.；Khanna,O.；Opara,E.C.；Brey,E.M.Stability ofalginate microbead properties in vitro.J.Mater.Sci.:Mater.Med.2012,23,903-912.
8.King,A.；Strand,B.；Rokstad,A.M.；Kulseng,B.；Andersson,A.；G.；Sandler,S.Improvement of the biocompatibility of alginate/poly-L-lysine/alginate microcapsules by the use of epimerized alginate as acoating.J.Biomed.Mater.Res.,Part A 2003,64,533-539.
9.Chen,A.Z.；Bai,Y.；Wang,S.B.；Liu,Y.G.；Chen,Z.X.Molecularbiocompatibility evaluation of poly-L-ornithine-coated alginate microcapsulesby investigating mRNA expression of proinflammatory cytokines.J.BiomimeticsBiomater.Tissue Eng.2012,14,53-64.
10.Wandrey,C.；Espinosa,D.；Rehor,A.；Hunkeler,D.Influence of alginatecharacteristics on the properties of multi-component microcapsules.J.Microencapsulation 2003,20,597-611.
11.Hu,X.；Li,D.；Gao,C.Chemically crosslinked chitosan hydrogel loadedwith gelatin for chondrocyte encapsulation.Biotechnol.J.2011,6,1388-1396.
12.Fu,Y.；Xu,K.；Zheng,X.；Giacomin,A.J.；Mix,A.W.；Kao,W.J.3D cellentrapment in crosslinked thiolated gelatin-poly(ethylene glycol)diacrylatehydrogels.Biomaterials 2012,33,48-58.
13.Brunsen,A.；Ritz,U.；Mateescu,A.；I.；Frank,P.；Menges,B.；Hofmann,A.；Rommens,P.M.；Knoll,W.；Jonas,U.Photocrosslinkable dextran hydrogelfilms as substrates for osteoblast and endothelial cellgrowth.J.Mater.Chem.2012,22,19590-19604.
14.Bian,L.；Hou,C.；Tous,E.The influence of hyaluronic acid hydrogelcrosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSCchondrogenesis and hypertrophy.Biomaterials 2013,34,413-421.
15.Rockstad,A.M.；Brekke,O.L.；Steinkjer,B.；Ryan,L.；Kolláriková,G.；Strand,B.L.；-Braek,G.；Lambris,J.D.；Lacík,I.；Mollnes,T.E.；Espevik,T.Theinduction of cytokines by polycation containing microspheres by a complementdependent mechanism.Biomaterials 2013,34,621-630.
16.Vériter,S.；Mergen,J.；Goebbels,R.-M.；Aouassar,N.；Grégoire,C.；Jordan,B.；Levêque,P.；Gallez,B.；Gianello,P.；Dufrane,D.in vivo selection ofbiocompatible alginates for islet encapsulation and subcutaneoustransplantation.Tissue Eng.:Part A,2010,16,1503-1513.
17.Dang,T.T.；Thai,A.V.；Cohen,J.；Slosberg,J.E.；Siniakowicz,K.；Doloff,J.C.；Ma,M.；Hollister-Lock,J.；Tang,K.M.；Gu,Z.；Cheng,H.；Weir,G.C.；Langer,R.；Anderson,D.G.Enhanced function of immuno-isolated islets in diabetes therapyby co-encapsulation with an anti-inflammatory drug.Biomaterials 2013,34,5792-5801.
18.Mahou,R.；Wandrey,C.Alginate-poly(ethylene glycol)hybridmicrospheres with adjustable physical properties.Macromolecules 2010,43,1371-1378.
19.Mahou,R.；Kolláriková,G.；Gonelle-Gispert,C.；Meier,R.P.H.；Schmitt,F.；Tran,N.M.；Dufresne,M.；Altimar,I.；Lacík,I.；Bühler,L.；Juillerat-Jeanneret,L；Legallais,C.；Wandrey,C.Combined electrostatic and covalent polymer networkfor cell microencapsulation.Macromol.Symp.2013,329,49-57.
20.Mahou,R.；Kolláriková,G.；Gonelle-Gispert,C.；Meier,R.P.H.；Schmitt,F.；tran,N.M.；Dufresne,M.；Altimar,I.；Lacík,I.；Bühler,L.；Juillerat-Jeanneret,L；Legallais,C.；Wandrey,C.Combined electrostatic and covalent polymer networkfor cell microencapsulation.Macromol.Symp.2013,329,49-57.
21.Mahou,R.；Borcard,F.；Crivelli,V.；Montanari,E.；Passemard,S.；Noverraz,F.；Gerber-Lemaire,S.；Bühler,L.；Wandrey,C.Tuning the Properties ofHydrogel Microspheres by Adding Chemical Crosslinking Functionality to SodiumAlginate.Chem.Mater.2015,27,4380-4389.
22.Mahou,R.；Wandrey,C.Versatile Route to SynthesizeHeterobifunctional Poly(ethylene glycol)of Variable Functionality forSubsequent Pegylation.Polymers 2012,4,561-589.
23.Passemard,S.；Staedler,D.；L.；Schneiter,G.S.；Kong,P.；Bonacina,L.；Juillerat-Jeanneret,L.；Gerber-Lemaire,S.Convenient synthesis ofbifunctional azido and amino-silanized poly(ethylene glycol)suitable for thefunctionalization of iron oxide nanoparticles for biomedical applications.Bioorg.Med.Chem.Lett.2013,23,5006-5010.
24.Schleeh,T.；Madau,M.；Roessner,D.Synthesis enhancements forgenerating highly soluble tetrabutylammonium alginates in organicsolvents.Carbohydr.Polym.2014,114,493-499.
25.Mironi-Harpaz.I.；Wang,D.Y.；Venkatraman,S.；Seliktar,D.Photopolymerization of cell-encapsulating hydrogels:crosslinking efficiencyversus cytotoxicity.Acta Biomater.2012,8,1838-1848.

Claims (17)

1.一种基于用至少一个部分接枝的阴离子多糖的官能化水凝胶，其中，所述部分是接枝在所述阴离子多糖的至少一个羟基上的合成的生物相容性聚合物。
2.根据权利要求1所述的官能化水凝胶，其中，所述阴离子多糖包含一个或多个羧酸官能团。
3.根据前述权利要求任一项所述的官能化水凝胶，其中，所述阴离子多糖选自包括海藻酸、透明质酸和半乳糖醛酸、或其盐的组。
4.根据前述权利要求任一项所述的官能化水凝胶，其中，所述部分通过氨基甲酸酯键接枝到所述阴离子多糖的羟基上，其中接枝度包括在5mol％和30mol％之间。
5.根据前述权利要求任一项所述的官能化水凝胶，其中，所述合成的生物相容性聚合物选自包括以下的组：线性聚乙二醇(PEG)(400至10000g·mol-1)、多臂PEG(4-臂或8-臂,3000至20000g·mol-1)、具有末端反应性官能团(例如胺、叠氮化物、羧酸、乙烯砜、丙烯酸盐、马来酰亚胺、硫醇、二硫戊环、炔烃、肼、酰肼)的线性和多臂PEG的衍生物、聚乙烯亚胺、或这些聚合物中的一种或多种的衍生物，以及治疗分子。
6.根据权利要求5所述的官能化水凝胶，其中，所述PEG或其衍生物是式I、II和/或III的异双官能PEG，
其中，n＝8-50；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自：(CH2)pSH，其中，p＝2-10；
其中，q＝2-5；
其中，m＝2-10；
R3独立地选自
7.根据前述权利要求任一项所述的官能化水凝胶，其中，所述水凝胶为微球形式。
8.一种组合物，包含与选自细胞、蛋白质、核酸或其他分子中的至少一种第二元素组合的权利要求1-7中任一项所述的官能化水凝胶。
9.一种药物组合物，包含权利要求8所述的组合物和药学上可接受的载体。
10.一种制备官能化水凝胶的方法，所述方法包括：使阴离子多糖与部分反应，所述部分官能化以使得在所述多糖与所述部分之间在所述多糖的至少一个羟基上形成共价键。
11.根据权利要求10的方法，其中，所述阴离子多糖包含一个或多个羧酸官能团。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中，所述阴离子多糖选自包括葡聚糖、海藻酸、透明质酸和半乳糖醛酸、或其盐的组。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，所述官能化的部分是式I、式II和/或式III的异双官能PEG或其衍生物：
其中，n＝8-50；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自：(CH2)pSH，其中，p＝2-10；
其中，q＝2-5；
其中，m＝2-10；
R3独立地选自
14.一种制备官能化海藻酸基水凝胶的方法，所述方法包括：
ⅰ)将海藻酸的一个或多个羧酸官能团或海藻酸盐的一个或多个羧酸盐官能团转化为TBA羧化物，
ⅱ)通过在羰基二咪唑存在下使一个或多个羟基反应，然后沉淀，来改性所述海藻酸或其盐的一个或多个羟基，
ⅲ)通过以下方式制备硫醇官能化的PEG衍生物(PEG I、PEG II和PEG III)：
ⅲ1)使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)与受保护的3-巯基丙酸反应，然后同时进行叠氮基的还原和硫醇官能团的去保护，以产生PEG I，或
iii2)使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)与活化的硫辛酸缀合，然后在LiAlH4存在下进行还原，以产生作为硫辛酰官能团的开放(还原)和封闭(氧化)形式的混合物的PEGII，或
iii3)使用由铜物质催化的点击反应使中间体α-氨基-ω-叠氮基聚(乙二醇)1a和1b与三唑部分接触以产生PEG III，
iv)用PEG I、PEG II和/或PEG III接枝改性的海藻酸，以允许在官能化的海藻酸和PEGI、PEG II和/或PEG III之间在所述海藻酸或其盐的一个羟基上的形成共价键，
v)通过透析和冷冻干燥纯化接枝到PEG上的海藻酸。
15.一种式I、式II和/或式III的异双官能PEG或其衍生物：
其中，n＝8-50；
R1独立地选自NH2、N3、OH、C1-6烷基-CO2H；
R2独立地选自：(CH2)pSH，其中，p＝2-10；
其中，q＝2-5；
以及其中，m＝2-10；
R3独立地选自
16.一种治疗和/或预防人类或动物患者的疾病或病症的方法，包括将从封装在权利要求1-7中任一项所述的官能化水凝胶中的细胞、蛋白质、核酸或其他分子中选择的材料植入或移植到人类或动物患者体内。
17.一种治疗和/或预防人类或动物患者的疾病或病症的方法，包括施用权利要求9所述的药物组合物。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110201234A (zh) * 2019-06-26 2019-09-06 山东百多安医疗器械有限公司 一种组织工程用前列腺细胞微囊及其制备方法
CN110540606A (zh) * 2019-08-19 2019-12-06 广西医科大学 一种羰基化蛋白清除剂及其制备方法
CN110624422A (zh) * 2019-08-19 2019-12-31 广西医科大学 一种用于清除羰基化蛋白的透析膜及其制备方法
CN112154158A (zh) * 2018-03-22 2020-12-29 持田制药株式会社 连接有非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物
CN114302749A (zh) * 2019-06-28 2022-04-08 持田制药株式会社 使用了化学交联海藻酸的移植用器件

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996037519A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-28 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. A polysaccharide hydrogel material, a process for its preparation and its use in medicine, surgery, cosmetics and for the preparation of health care products
WO2010078036A2 (en) * 2008-12-17 2010-07-08 The Johns Hopkins University Biocompatible polysaccharide-based hydrogels
WO2012167223A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy
WO2014171842A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Living Cell Technologies New Zealand Limited Biocompatible encapsulation system
US20150290327A1 (en) * 2012-11-07 2015-10-15 Eth Zurich Sulfated alginate hydrogels for cell culture and therapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1806367A3 (en) * 1996-09-19 2007-11-28 The Regents Of The University Of Michigan Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates
IL140844A0 (en) 2001-01-10 2002-02-10 Polygene Ltd Cationic polysaccharide compositions
AU2006239154A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Ventana Medical Systems, Inc Nanoparticle conjugates
WO2008154332A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Becton, Dickinson And Company Near-infrared dyes as surface enhanced raman scattering reporters
JP5714456B2 (ja) * 2011-09-07 2015-05-07 株式会社シード 重合性ヒアルロン酸誘導体、ならびにその重合体を含むヒアルロン酸ヒドロゲルおよびコンタクトレンズ
EP3125960B1 (en) 2014-04-04 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Click-crosslinked hydrogels and methods of use
WO2016073488A1 (en) 2014-11-04 2016-05-12 The Regents Of The University Of California Targeted delivery platform for delivery of therapeutics

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996037519A1 (en) * 1995-05-22 1996-11-28 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. A polysaccharide hydrogel material, a process for its preparation and its use in medicine, surgery, cosmetics and for the preparation of health care products
WO2010078036A2 (en) * 2008-12-17 2010-07-08 The Johns Hopkins University Biocompatible polysaccharide-based hydrogels
WO2012167223A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy
US20150290327A1 (en) * 2012-11-07 2015-10-15 Eth Zurich Sulfated alginate hydrogels for cell culture and therapy
WO2014171842A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Living Cell Technologies New Zealand Limited Biocompatible encapsulation system

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REDOUAN MAHOU等: "Alginate-Poly(ethylene glycol) Hybrid Microspheres with Adjustable Physical Properties", 《MACROMOLECULES》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112154158A (zh) * 2018-03-22 2020-12-29 持田制药株式会社 连接有非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物
CN110201234A (zh) * 2019-06-26 2019-09-06 山东百多安医疗器械有限公司 一种组织工程用前列腺细胞微囊及其制备方法
CN114302749A (zh) * 2019-06-28 2022-04-08 持田制药株式会社 使用了化学交联海藻酸的移植用器件
CN110540606A (zh) * 2019-08-19 2019-12-06 广西医科大学 一种羰基化蛋白清除剂及其制备方法
CN110624422A (zh) * 2019-08-19 2019-12-31 广西医科大学 一种用于清除羰基化蛋白的透析膜及其制备方法

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