CN110540606A - 一种羰基化蛋白清除剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羰基化蛋白清除剂,由在葡聚糖的葡萄糖单元上进行酰肼修饰而成。本发明还提供了上述羰基化蛋白清除剂的制备方法,使葡聚糖经1,1’‑羰基二咪唑活化后与肼反应,得到所述羰基化蛋白清除剂。本发明的羰基化蛋白清除剂对丙烯醛以及羰基化蛋白具有极高的清除效率,并且结构简单、无生物毒性,安全性能高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种羰基化蛋白清除剂及其制备方法。
背景技术
由过量活性氧(ROS)、脂质过氧化终产物或晚期糖基化终产物(AGE)所产生的有害物质导致的氧化应激,与各种炎性疾病如动脉粥样硬化、炎性肠病、再灌注损伤等有关。自由基ROS的高反应性使它们易于与包括蛋白质,脂质和DNA在内的细胞成分发生反应并受到损害。当细胞膜被脂质过氧化(LPO)的自由基攻击时,磷脂发生氧化和断裂,产生低分子α,β-不饱和醛,如4-羟基壬烯醛(HNE),丙烯醛或二醛等。这可以最好地描述为连锁反应,其中单个基团的攻击可以导致产生一系列LPO产物。这样的产物,如α,β不饱和醛丙烯醛是剧毒,且对生物的亲核试剂具有反应性,如鸟嘌呤DNA或RNA,氨基酸和含巯基的残留在关键区域的核因素,蛋白酶和其他蛋白质。丙烯醛不仅由脂质过氧化产生,而且还在烟雾和空气污染中外源性地存在,将丙烯醛与呼吸道疾病:慢性阻塞性肺病(COPD)联系起来。丙烯醛被归类为亲电子试剂,因此它有两个潜在亲核试剂可以攻击的位点,1,4-迈克尔加成共轭双键导致羰基加合物或1,2加成羰基形成亚胺。蛋白质的修饰有时指羰基化,改变蛋白质结构并使它们对细胞有毒性。因此,蛋白质羰基水平已被用作损伤的标志物。例如,血浆中较高水平的羰基化蛋白质通常提示肾衰竭。
鉴于活性醛和羰基化蛋白质在广泛的病理状态中起关键作用,因此需要开发更简单且更易获得的方法来防止其产生或清除它们。为了防止氧化应激,抗氧化剂的研究成为人们关注的焦点。共轭醛的天然抗氧化剂是谷胱甘肽和肌肽,以前的研究重点是具有类似抗氧化特性的类似分子或药物,即所谓的醛清除剂。它们具有亲核中心并且与内源性羰基具有高反应性。药物氢丙嗪及其类似物(包括亲核肼基)也被研究为清除剂。大多数研究的共同点是它们主要关注清除低分子量醛而不是氧化应激的最终产物,例如羰基化蛋白质。并且现有的一些清除剂显示出一些毒性,并且只能在某些特定条件下使用。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供了一种结构简单、清除效率高、安全性高的羰基化蛋白清除剂以及其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种羰基化蛋白清除剂,由在葡聚糖的葡萄糖单元上进行酰肼修饰而成。
进一步,所述葡聚糖上酰肼的取代度为10%-30%。
本发明的有益效果是:本发明的羰基化蛋白清除剂对丙烯醛以及羰基化蛋白具有极高的清除效率,并且结构简单、无生物毒性,安全性能高。
本发明还提供了上述羰基化蛋白清除剂的制备方法,具体为:使葡聚糖经1,1’-羰基二咪唑活化后与肼反应,得到所述羰基化蛋白清除剂。
进一步,所述肼为水合肼。
进一步,具体的操作步骤为:将葡聚糖溶于二甲亚砜中,然后加入1,1’-羰基二咪唑搅拌2-48h,加入水合肼搅拌2-48h,透析分离产物并冻干得到的白色粉末即为所述羰基化蛋白清除剂。
进一步,所述葡聚糖溶于二甲亚砜的具体步骤为:将葡聚糖加入二甲亚砜中,60-90℃加热5-30min,使葡聚糖完全溶解,然后冷却至室温,所述葡聚糖的质量与所述二甲亚砜的体积比为1g:1-50mL。
进一步,以葡聚糖为基准,每1g葡聚糖分别加入1-2g1,1’-羧基二咪唑和3-9mL水合肼,所述水合肼的浓度为80%。
本发明的制备方法的有益效果是制备过程简单高效,成本低廉,经济效益好。
本发明还提供了一种清除羰基化蛋白的方法,具体为利用上述羰基化蛋白清除剂清除。
进一步,具体步骤为将羰基化蛋白清除剂与待处理样本混合,除去样本中的羰基化蛋白。
本发明的清除羰基化蛋白的方法的有益效果是对羰基化蛋白的清除效率高,且对生物样品的安全性高,无毒性。
附图说明
图1为本发明不同处理组对细胞活性的影响。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1羰基化蛋白清除剂的制备
向0.5g葡聚糖中加入20mL二甲亚砜,将混合物在80℃加热15分钟以完全溶解葡聚糖,冷却至室温后,加入1.5g1,1'-羰基二咪唑(CDI)并将混合物搅拌24小时。向混合物中加入4.5ml水合肼(80%),将其再搅拌24小时。将反应混合物用水稀释并透析三天,冷冻干燥后分离产物,得到的白色粉末,即为羰基化蛋白清除剂,通过基于酰肼基(肼基甲酸叔丁酯)标准曲线的TNBS测定葡聚糖上酰肼的取代度为30%,取代度(DS)定义为起始材料中每个葡萄糖单元的酰肼基团的数目,例如,DS0.2意味着20%的葡萄糖单元携带酰肼基团。
本实施例中的的葡聚糖的分子量分别选择40,000和100,000,制备得到的羰基化蛋白清除剂分别为L-1和H-1。
实施例2羰基化蛋白清除剂的制备
向0.5g葡聚糖中加入20mL二甲亚砜,将混合物在80℃加热15分钟以完全溶解葡聚糖,冷却至室温后,加入1g1,1'-羰基二咪唑(CDI)并将混合物搅拌2小时。向混合物中加入3.2ml水合肼(80%),将其再搅拌48小时。将反应混合物用水稀释并透析三天,冷冻干燥后分离产物,得到的白色粉末,即为羰基化蛋白清除剂,测定得到葡聚糖上酰肼的取代度为20%。本实施例中的葡聚糖分子量为100,000,制备得到的羰基化蛋白清除剂为H-2。
实施例3羰基化蛋白清除剂的制备
向0.5g葡聚糖中加入20mL二甲亚砜,将混合物在80℃加热15分钟以完全溶解葡聚糖,冷却至室温后,加入0.5g1,1'-羰基二咪唑(CDI)并将混合物搅拌48小时。向混合物中加入1.5ml水合肼(80%),将其再搅拌2小时。将反应混合物用水稀释并透析三天,冷冻干燥后分离产物,得到的白色粉末,即为羰基化蛋白清除剂,测定得到葡聚糖上酰肼的取代度为10%。本实施例中的葡聚糖分子量为100,000,制备得到的羰基化蛋白清除剂为H-3。
试验例
1、羰基化蛋白清除剂对丙烯醛的清除效果
分别将L-1、H-1、H-2和H-3溶解在PBS缓冲液中,并用0.2μm的过滤器过滤,然后分别取L-1、H-1、H-2和H-3溶液加入丙烯醛缓冲液(将丙烯醛溶于PBS缓冲液)中,得到四组混合溶液,每组混合溶液总体积为2mL,其中L-1、H-1、H-2和H-3的质量分别为2mg,丙烯醛的浓度为200μM,黑暗中孵育24h,然后使用紫外-可见分光光谱仪测量其在209.5nm处的吸光度,并根据丙烯醛的标准曲线计算得到剩余丙烯醛的质量,其中L-1、H-1、H-2和H-3分别清除了0.26μmol、0.29μmol、0.18μmol和0.23μmol的丙烯醛,其对丙烯醛的清除率分别为65%、72.5%、45%和57.5%。
在相同取代度情况下,葡聚糖的分子量越高,对丙烯酮的清除效果越好;葡聚糖分子量相同的情况下,酰肼基取代度越高,对丙烯酮的清除效果越好。
2、羰基化蛋白清除剂对氧化牛血清白蛋白(BSA)的清除
制备氧化的BSA溶液:将0.35gBSA溶于35mlPBS中,并加入1mM H2O2和1mM硫酸亚铁,将混合物温育20分钟,然后在4℃下用PBS缓冲液过夜透析,得到氧化的BSA溶液。
制备还原的BSA溶液:将1gBSA溶于100mlPBS中,并加入1g固体NaBH4。将混合物在室温下温育30分钟,然后缓慢加入HCl(2.5M)以中和反应混合物,然后在4℃下对PBS缓冲液进行过夜透析。
通过Bradford测定法测量氧化和还原的BSA溶液的蛋白质浓度,然后用PBS调节至6mg/ml并在使用前储存在-80℃。
将浓度为6mg/ml的氧化的BSA和还原的BSA溶液以1:1的体积比混合,得到50%氧化的BSA,取2ml、6mg/ml50%氧化的BSA溶液,对照加入20mg未修饰的葡聚糖,实验组分别加入20mgL-1、H-1、H-2和H-3,孵育24h,其中未修饰的葡聚糖对氧化BSA的清除效率为2%,而L-1、H-1、H-2和H-3对氧化BSA的清除率分别为49%、80%、40%和46%。
3、羰基化蛋白清除剂对丙烯醛处理的牛血清白蛋白(BSA)的清除
分别用浓度为100、200和500μM的丙烯醛处理浓度为6mg/ml的BSA,暗处理24h,得到不同浓度丙烯醛处理的BSA。
分别取20mgL-1、H-1、H-2和H-3加入2ml6mg/ml用500μM的丙烯醛处理过的BSA溶液中,分别可以清除6.86mg、8.41mg、5.04mg和5.99mg的BSA。以不同浓度的丙烯醛(200μM或100μM)处理BSA,用相同量的葡聚糖(20mg)和不同量的L-1清除BSA。结果表明,使用不同数量的丙烯醛会影响蛋白质中引入羰基的数量,酰肼基取代度越高,衍生物浓度越高,葡聚糖分子量越大,清除能力越强。
4、羰基化蛋白清除剂对血清中羰基化蛋白的清除
两例肾功能下降患者的血清样本被定义为样本P1和P2,采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)测定血清中羰基化蛋白质的水平,分别用10mg、20mg和40mgL-1处理含有12mg羰基化蛋白的血清样本P1,其对羰基化蛋白的清除量为2.97mg、5.17mg和6.90mg,观察到明显的剂量反应。用20mg的H-2可以清除7.42mg羰基化蛋白,而用40mg的L-1只能清除6.9mg羰基化蛋白。对于样本P2,20mgL-1可以清除4.55mg的羰基化蛋白。
5、细胞毒性实验验证
将小鼠成肌细胞(C2C12)在补充有10%胎牛血清(FBS)和0.1%青霉素-链霉素的细胞培养基中培养至接近80%的贴合。将细胞在37℃,5%CO2和90%湿度下保持24小时,然后接种于96孔板中,密度为每毫升8000个细胞。待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,分别定义为a、b、c、d、e、f、g组,然后分别对其进行处理,每组处理如下:
a组:2mg/ml的L-1,b组:30μM的丙烯醛,c组:30μM丙烯醛+2mg/ml未修饰的葡聚糖,d组:30μM丙烯醛+1mg/mlL-1,e组:30μM丙烯醛+2mgmlL-1,f组:30μM丙烯醛+5mg/mlL-1,g组:30μM丙烯醛+2mg/ml H-1,每孔中总共100μl培养基。
再培养24小时后,用PBS缓冲液洗涤细胞,并向每个孔中加入100μl1%阿拉玛蓝溶液。将板在37℃,5%CO2下孵育2小时。通过酶标仪在570nm处测量吸光度。将结果与对照孔进行比较以确定相对细胞活力,结果如图1所示,酰肼基修饰的葡聚糖分子没有明显毒性,因此接近100%的细胞在细胞培养基中与2mg/ml的L-1混合时代谢不受影响,然而,加入30μM丙烯醛后约89%的细胞死亡,表明丙烯醛的细胞毒性;当随后加入葡聚糖加入丙烯醛时,由于清除,细胞存活增加。细胞仅与30μM丙烯醛一起培养10分钟,以确保在加入清除剂之前丙烯醛不会诱导细胞死亡。向含有丙烯醛的细胞培养基中加入L-1,以1mg/ml保存40%的细胞,以5mg/ml保存92%。未修饰的葡聚糖(2mg/ml)的添加对细胞存活没有影响。当加入H-1时,87%的细胞以2mg/ml存活。结果显示明显的剂量反应,其中较高浓度的酰肼基具有较高的清除效果。与PBS中的清除实验类似,可以注意到高分子量葡聚糖(H-1)衍生物是比低分子量葡聚糖衍生物(L-1)更好的清除剂,表现为暴露于H-1的细胞的较高存活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种羰基化蛋白清除剂,其特征在于,由在葡聚糖的葡萄糖单元上进行酰肼修饰而成。
2.根据权利要求1所述的一种羰基化蛋白清除剂,其特征在于,所述葡聚糖上酰肼的取代度为10%-30%。
3.一种如权利要求1所述的羰基化蛋白清除剂的制备方法,其特征在于,使葡聚糖经1,1’-羰基二咪唑活化后与肼反应,得到所述羰基化蛋白清除剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述肼为水合肼。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,具体步骤为:将葡聚糖溶于二甲亚砜中,然后加入1,1’-羰基二咪唑搅拌2-48小时,加入水合肼搅拌2-48小时,透析分离产物并冻干得到的白色粉末即为所述羰基化蛋白清除剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述葡聚糖溶于二甲亚砜的具体步骤为:将葡聚糖加入二甲亚砜中,60-90℃加热5-30min,使葡聚糖完全溶解,然后冷却至室温,所述葡聚糖的质量与所述二甲亚砜的体积比为1g:10-50mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,以葡聚糖为基准,每1g葡聚糖分别加入1-2g1,1’-羰基二咪唑和3-9mL水合肼,所述水合肼的浓度为80%。
8.一种清除羰基化蛋白的方法,其特征在于,利用权利要求1所述的羰基化蛋白清除剂清除。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,将所述羰基化蛋白清除剂与待处理样本混合,除去所述样本中的羰基化蛋白。
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