JP6512681B2 - カイガラムシ由来のポリペプチド - Google Patents
カイガラムシ由来のポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP6512681B2 JP6512681B2 JP2014179175A JP2014179175A JP6512681B2 JP 6512681 B2 JP6512681 B2 JP 6512681B2 JP 2014179175 A JP2014179175 A JP 2014179175A JP 2014179175 A JP2014179175 A JP 2014179175A JP 6512681 B2 JP6512681 B2 JP 6512681B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- hemolytic
- present
- composition
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
[1]配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む、ツノロウムシ由来のポリペプチド。
[2]前記[1]に記載のポリペプチドを含む、溶血剤組成物。
[3]赤血球を含む液体試料に、前記[1]に記載のポリペプチドまたは前記[2]に記載の組成物を接触させることを含む、溶血方法。
[4]前記液体試料が血液を含む、[3]に記載の溶血方法。
[5]前記[1]に記載のポリペプチドを含む、細胞毒性組成物。
[6]前記[1]に記載のポリペプチドを含む、抗腫瘍組成物。
東洋大学板倉キャンパス(群馬県邑楽郡板倉町)内のユキヤナギに寄生しているツノロウカイガラムシを採取した。採取したツノロウカイガラムシのホモジナイズ液を調製するために、約3200匹(湿重量で約150 g)にPBS(リン酸緩衝食塩水、0.15 M NaCl、pH7.4)を加えながらホモジナイザーを用いてホモジナイズした。PBS懸濁液となった状態のホモジナイズ液の体積は約200 mlであった。このホモジナイズ液を遠心分離(4℃、8,000G、20分間)に掛けて、不溶性のロウ部分等を沈殿として分離除去した。上清(約120 ml)をセルロースチューブ(三光純薬株式会社)中に回収し、PBSに対して透析を行って低分子夾雑物等を除去した。透析済みサンプルは、500 ml 容量のガラス製ブフナ型濾過器(三商製)を用いて、陰イオンクロマトグラフィによる精製に付した。すなわち、上記濾過器に入れた強陰イオン交換樹脂(Q-Sepharose Fast Flow、GEヘルスケア社)をPBSで平衡化し、上記透析済みサンプルを静かにアプライした。PBS で溶出を行い、素通り画分を回収した。回収した素通り液に対して、スピンカラムチューブ(50 ml Macrosep、10K MWCO)を用いた遠心分離(4℃、5,000G、30分間)を行い、得られた上清を次工程のためのサンプルとした。このサンプルについて、限外濾過フィルター(NMWL:10,000、ミリポア社)が装着された限外濾過器を用いて限外濾過濃縮を行った。限外濾過濃縮後のサンプルを、HiLoad 16/60 Superdex 75 prep gradeカラム(0.5×0.5×60 cm、GEヘルスケア社)にアプライした。流速1.0 ml/分にて、バッファーはPBSを使用して、ゲル濾過クロマトグラフィを行った。試験管1本当たり2 ml分取して、96本の画分に分画し、60本目付近の画分を回収した。
図3に示すように、96ウェルプレートの各ウェルに、PBSで血球分2%(v/v)に希釈したヒツジの血液を入れ、同体積のゲル濾過クロマトグラフィ画分を、溶出順に従って左上から右下のウェルへと加えていった。ここでは、96ウェルプレートの横の並びを「行」と呼び、縦の並びを「列」と呼ぶ。
CC-IVサンプルの溶血活性についてのpH安定性を調べるために、以下の緩衝液を、各pHについて0.1 Mの濃度で調製した:クエン酸緩衝液(pH 4.0、5.0、5.8)、リン酸緩衝液(pH 5.7、6.0、7.0、8.0)、トリス緩衝液(pH 7.2、8.0、9.0)、グリシン緩衝液(pH 8.6、9.0、10.0、10.6、11.0、11.5)。これらの緩衝液をサンプルと等倍(緩衝液25μl:サンプル25μl)にし、2倍希釈系列で2%(v/v)ヒツジ血液に添加し、室温で1時間放置した。
CC-IVサンプルの溶血活性についての温度安定性を調べるために、0℃から70℃までの温度(10℃間隔)にて、2倍希釈のCC-IVサンプルを10分間放置した。それからすぐに4℃に置いた後、上記pH安定性試験と同様に、96ウェルUボトムプレート中にサンプル(25μl)を2倍希釈系列で調製し(希釈溶媒はPBS)、これに2%(v/v)赤血球浮遊液を同体積(25μl)添加し、プレートを振とう後、室温で1〜2時間静置した。その後、溶血状態を確認した。
ある種の生物由来のレクチン(糖結合タンパク質)は溶血活性を有することが知られている(非特許文献2)。そこで、CC-IVのポリペプチドがレクチンであるという仮説を検証するべく、糖による阻害実験を行った。結果を図7に示す。多様な単糖類、二糖類、および糖タンパク質を、図7の上部に示す異なる濃度で添加した(ただし、BSA(ウシ血清アルブミン)、フェチュイン、アシアロフェチュイン、ムチン、および卵アルブミンに関しては、一番左側のウェルが終濃度0.5 mg/mlによる添加であり、右側の各ウェルはその2倍ごとの段階希釈である)。しかしながら、いずれにおいても、糖によるCC-IVの溶血活性の阻害は検出されなかった(図7)。この結果は、CC-IVのポリペプチドはレクチンではないことを示唆するものである。
異なる動物種(ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ)の血液を用いて、CC-IVの溶血活性を調べた。2%(v/v)の血液希釈液に対して2倍希釈系列のCC-IV溶液を添加した点は上記の実験と同様である。図8に示すように、CC-IVポリペプチドは、いずれの動物種の血液に対しても溶血活性を示したが、動物種によって溶血の強さに違いがあることが確認された。これは、この溶血性ポリペプチドが、動物種間の細胞膜の構造の違いを認識している可能性を示唆するものである。
非特許文献2には、溶血活性を有するレクチンが、溶血活性と同様の機序を通じて、非赤血球細胞に対する細胞毒性をも有する例が記載されている。CC-IVポリペプチドが、赤血球以外の細胞に対して毒性を有する可能性を検証するべく、ベロ(Vero)細胞(1×104細胞/ウェル)を使用して、当業者に知られる標準的なMTTアッセイによって細胞毒性試験を行った。ベロ細胞は、アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞に由来する接着性の不死化細胞株であり、毒素のスクリーニングに一般的に用いられる。図9に細胞毒性試験の結果を示す。横軸は添加されたCC-IVポリペプチドの濃度、縦軸はベロ細胞の生存率を示す。プラス(+)はFBS(ウシ胎児血清)添加培地(すなわち、細胞培養用の通常の培地)を表し、マイナス(−)はFBS無添加培地を表す。例えばレクチンの細胞毒性を評価する際には、FBSに含まれる種々の糖成分等がアッセイに影響することが知られているため、FBSマイナスで試験することが一般的である。CC-IVポリペプチドの場合、FBSマイナス培地中のベロ細胞に対して、20μg/mlの濃度において細胞毒性が検出された。これは毒素として一般的な毒性である。
U937細胞(1×104細胞/ウェル)を用いて、上記ベロ細胞の実験と同様にして細胞毒性を調べた。U937細胞は、ヒト血球(リンパ系)由来の悪性腫瘍(がん)であり、浮遊性の細胞株である。図10に結果を示す。図9と同じく、横軸は添加されたCC-IVポリペプチドの濃度、縦軸はU937細胞の生存率を示す。U937細胞に対しては、ベロ細胞よりもさらに強い毒性が検出された。
図4に示した例と同様にCC-IVサンプルを電気泳動したSDS-PAGEのゲルから、バンドの部分を切り出して約14μgのポリペプチドを取得し、これをプロテインシーケンサーを用いたエドマン分解法に供して、N末端のアミノ酸配列決定を行った。その結果、GSGSVLVRNSGGYVATFSMA(配列番号1)という配列が得られた。
Claims (7)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列を含み10.9 kDaの分子量を有し溶血活性を有する、ツノロウムシ由来のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列をN末端に含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドを含む、溶血剤組成物。
- 赤血球を含む液体試料に、請求項1もしくは2に記載のポリペプチドまたは請求項3に記載の組成物を接触させることを含む、溶血方法。
- 前記液体試料が血液を含む、請求項4に記載の溶血方法。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドを含む、細胞毒性組成物。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドを含む、抗腫瘍組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014179175A JP6512681B2 (ja) | 2014-09-03 | 2014-09-03 | カイガラムシ由来のポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014179175A JP6512681B2 (ja) | 2014-09-03 | 2014-09-03 | カイガラムシ由来のポリペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016053003A JP2016053003A (ja) | 2016-04-14 |
JP6512681B2 true JP6512681B2 (ja) | 2019-05-15 |
Family
ID=55744170
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014179175A Active JP6512681B2 (ja) | 2014-09-03 | 2014-09-03 | カイガラムシ由来のポリペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6512681B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113287574B (zh) * | 2021-04-30 | 2022-07-19 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种扩繁蓝色长盾金小蜂的方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60209530A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-22 | Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd | 殺腫瘍性物質 |
JPH0778079B2 (ja) * | 1986-09-12 | 1995-08-23 | 三菱化学株式会社 | 制癌活性を有する蛋白 |
JPH05331194A (ja) * | 1992-06-03 | 1993-12-14 | Daicel Chem Ind Ltd | カリウドバチ由来の生物活性ペプチド |
JPH09143082A (ja) * | 1995-11-28 | 1997-06-03 | Terumo Corp | モンシロチョウ由来蛋白質 |
JP3579711B2 (ja) * | 2000-03-22 | 2004-10-20 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | ガン細胞増殖抑制剤 |
-
2014
- 2014-09-03 JP JP2014179175A patent/JP6512681B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016053003A (ja) | 2016-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Torrent et al. | Eosinophil cationic protein high-affinity binding to bacteria-wall lipopolysaccharides and peptidoglycans | |
Batista et al. | New insights into the structure and mode of action of Mo-CBP3, an antifungal chitin-binding protein of Moringa oleifera seeds | |
Zhang et al. | C-terminal domain of hemocyanin, a major antimicrobial protein from Litopenaeus vannamei: structural homology with immunoglobulins and molecular diversity | |
Gifoni et al. | A novel chitin‐binding protein from Moringa oleifera seed with potential for plant disease control | |
Tóth et al. | NFAP2, a novel cysteine-rich anti-yeast protein from Neosartorya fischeri NRRL 181: isolation and characterization | |
Grassi et al. | Proteomic profile of the hard corona of charged polystyrene nanoparticles exposed to sea urchin Paracentrotus lividus coelomic fluid highlights potential drivers of toxicity | |
de Melo et al. | HGA-2, a novel galactoside-binding lectin from the sea cucumber Holothuria grisea binds to bacterial cells | |
Santos et al. | Strategies to obtain lectins from distinct sources | |
Frazão et al. | Jellyfish bioactive compounds: Methods for wet-lab work | |
Jiang et al. | Separation of antioxidant peptides from pepsin hydrolysate of whey protein isolate by ATPS of EOPO co-polymer (UCON)/phosphate | |
Kim et al. | Purification and characterization of a lectin, bryohealin, involved in the protoplast formation of a marine green alga Bryopsis plumosa (Chlorophyta) 1 | |
Oyama et al. | Buwchitin: a ruminal peptide with antimicrobial potential against Enterococcus faecalis | |
Harm et al. | Blood compatibility—an important but often forgotten aspect of the characterization of antimicrobial peptides for clinical application | |
Rakitov et al. | Brochosomins and other novel proteins from brochosomes of leafhoppers (Insecta, Hemiptera, Cicadellidae) | |
Balciunaite et al. | Identification of Echinacea purpurea (L.) moench root LysM lectin with nephrotoxic properties | |
DE69933679T2 (de) | Darstellung des profils und katalogisierung von exprimierten proteinmarkern | |
Holch et al. | Respiratory ß-2-Microglobulin exerts pH dependent antimicrobial activity | |
Mao et al. | Large-scale plasma peptidomic profiling reveals a novel, nontoxic, Crassostrea hongkongensis-derived antimicrobial peptide against foodborne pathogens | |
CN103788190B (zh) | β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用 | |
Malafaia et al. | Selection of a protein solubilization method suitable for phytopathogenic bacteria: a proteomics approach | |
JP6512681B2 (ja) | カイガラムシ由来のポリペプチド | |
Shrestha et al. | A GLYCOPROTEIN NONCOVALENTLY ASSOCIATED WITH CELL‐WALL POLYSACCHARIDE OF THE RED MICROALGA PORPHYRIDIUM SP.(RHODOPHYTA) 1 | |
CN106632664B (zh) | 载脂蛋白ii/i及其制备方法、生物学功能及应用 | |
Lin et al. | Study on the structure-activity relationship of an antimicrobial peptide, Brevinin-2GUb, from the skin secretion of Hylarana guentheri | |
Songnaka et al. | Purification and characterization of novel anti-MRSA peptides produced by Brevibacillus sp. SPR-20 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170719 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180508 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180704 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181002 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181130 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190326 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190408 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6512681 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |