DE69933679T2

DE69933679T2 - Darstellung des profils und katalogisierung von exprimierten proteinmarkern

Info

Publication number: DE69933679T2
Application number: DE69933679T
Authority: DE
Inventors: M. Roman Belmont CHICZ; Lynne Mary Lexington HEDLEY; Charles San Francisco HSU; G. Robert Lexington URBAN
Original assignee: Zycos Inc
Current assignee: Eisai Inc
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: EP1105731A2; EP1105731A4; ATE343132T1; WO2000009654A3; AU771262B2; CA2339817A1; DE69933679D1; EP1105731B1; AU5336799A; JP2002522779A; WO2000009654A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Charakterisierung des Proteinrepertoires einer Zelle und die Speicherung und Manipulation dieser Information in einer Computerdatenbank.
Hintergrund der Erfindung
Im Wesentlichen enthält jede Zelle innerhalb eines Organismus die gesamte und identische genetische Information von diesem Organismus, aber jede Zelle exprimiert nur die kleine Untergruppe an Genen, die für diesen bestimmten Zelltyp benötigt wird. Zum Beispiel wird vom menschlichen Genom, das insgesamt aus drei Milliarden Nucleotiden besteht, angenommen, dass es 100.000 Gene enthält. Jede einzelne Zelle exprimiert jedoch nur ungefähr 2.000 bis etwa 4.000 unterschiedliche Proteine, was nur –2% bis etwa 4% der Gesamtzahl an Genen entspricht. Es ist die gemeinsame Aktivität der in einer bestimmten Zelle exprimierten Proteine, welche all die benötigten Aktivitäten dirigiert, die jeden bestimmten Zelltyp bei einem gewissen Entwicklungs-, Stoffwechsel- oder Erkrankungsstadium definieren.
In den vergangenen Jahrzehnten ist klar geworden, dass die Entwicklung und die Pathologie von vielen Erkrankungen Unterschiede in der Genexpression umfassen. In der Tat können gesunde(s) und erkrankte(s) Gewebe oder Gewebetypen oft durch Unterschiede in der Genexpression unterschieden werden. Zum Beispiel können sich normale Zellen durch Aktivierung bestimmter Wachstumsinduzierender Gene, z.B. Oncogene, oder durch die Inaktivierung von bestimmten Wachstums-Inhibitorischen Genen, z.B. Tumor-Suppressoren oder Apoptose-Aktivatoren, zu hoch invasiven und metastatischen Krebszellen entwickeln. Levine, 1997, Cell 88:323-331; Hunter, 1997, Cell 88:333-346; Jacobson, 1997, Cell 88:347-354; Nagata, 1997, Cell 88:355-365; Fraser et al., 1996, Cell 85:781-784. Veränderte Expression von solchen Genen, z.B. Wachstumsaktivatoren und Wachstumssuppressoren, beeinflussen wiederum die Expression von anderen Genen. Siehe The National Cancer Institute, „The Nation's Investment In Cancer Research: A Budget Proposal For Fiscal Years 1997/98", zusammengestellt durch den Direktor des National Cancer Institute, Seiten 55-77.
Pathologische Genexpressionsunterschiede sind nicht auf Krebs beschränkt. Von Autoimmunerkrankungen, vielen neurodegenerativen Erkrankungen, entzündlichen Erkrankungen, Restenose, Atherosklerose, vielen Stoffwechselerkrankungen und zahlreichen anderen wird angenommen, dass sie mit abnormaler Expression eines bestimmten Gens einhergehen. Naparstek et al., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11:79-104; Sercarz et al., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11:729-766. Als Folge ist die derzeitige Herausforderung in der medizinischen Forschung, die Rolle zu verstehen, welche jedes Gen oder sein codiertes Protein in der Beibehaltung normaler zellulärer Homeostase spielt, und dieses erhöhte Verständnis bei der Verbesserung unserer Fähigkeit zu nutzen, Erkrankungen zu behandeln und/oder Prädispositionen für Erkrankungen in Stadien zu erkennen, wenn vielversprechendere Behandlungs- oder Präventionsverfahren vorhanden sind. Insbesondere wäre ein wirksames Verfahren, das die Bewertung der exprimierten Proteine in einer/m bestimmten Zelle, Gewebe oder Organtyp ermöglicht, sowie die Wiederfindung der genetischen Information, die differenziell exprimierte Proteine codiert, ein höchst wertvolles Instrument für genetische und medizinische Forschung.
Signifikante Ressourcen sind in den letzten Jahren aufgewandt worden, um relevante Gene für die Entwicklung von Krankheiten zu identifizien und zu isolieren. Ein durchgeführter Ansatz ist, die einzelnen, durch die Chromosomen einer Art codierten Gene zu katalogisieren. Im Falle von Menschen hat das NIH 1990 das Menschliche Genomprojekt mit dem Ziel initiiert, das gesamte menschliche Genom bis zum Jahre 2005 zu sequenzieren. Stephens et al., 1990, Science 250:237; Cantor, 1990, Science 248:49-51. Um dieses Ziel innerhalb des geplanten Zeitrahmens von 15 Jahren zu erreichen, müssen jeden einzelnen Tag 550.000 Nucleotide an menschlicher DNA sequenziert und bestätigt werden. Einmal abgeschlossen, werden die Sequenzen all der mutmaßlichen Gene und ihrer mutmaßlichen Expressionsprodukte, d.h. Proteine, für Wissenschafter weltweit verfügbar sein und werden ohne Zweifel eine dramatischen Einfluss auf das Verständnis der molekularen Basis der Humanbiologie haben.
Die enorme Informationsmenge, die durch das Menschliche Genomprojekt verfügbar gemacht werden wird, wird jedoch noch immer nicht ausreichend sein, um die Rätsel hinter den meisten Krankheitsprozessen zu lösen, da die zelluläre Funktion oder Störung aus der gemeinsamen Interaktion und differenziellen Expression von Proteinen resultiert. In der Tat wird die aus dem Genomprojekt resultierende Information gar keine Information darüber bereitstellen, wann, wo und wie viel eines bestimmten Gens exprimiert wird.
In einem Versuch, eine aussagekräftigere Information bezüglich des Expressionsprofils der Gene in den verschiedenen Zell- oder Gewebearten zu erhalten, sind mehrere Ansätze entwickelt worden, welche die Mengen an mRNA untersuchen, die innerhalb von verschiedenen Zelltypen vorhanden sind. Okubo et al., 1992, Nat. Genet. 2:173-179; Velculescu et al., 1995, Science 270:484-487; Liang und Pardee, 1995, Curr. Opin. Immunol. 7:274-280; Augenlicht et al., 1987, Cancer Res. 47:6017-6021; Fodor et al., 1993, Nature 364:555-556; Schena et al., 1995, Science 270:467-470. Theoretisch würde die Mehrzahl der innerhalb einer Zelle exprimierten mRNAs in Proteine translatiert werden; wenn man das Repertoire von exprimierten mRNAs katalogisieren könnte, könnte man daraus schließen, welche Proteine auch exprimiert werden. In der Tat hat der Vergleich der Expressionsmengen von spezifischen Transkripten zwischen unterschiedlichen Zell- oder Gewebearten, Geweben oder Zellen, die von unterschiedlichen Erkrankungs- oder Entwicklungsstadien stammen, oder von Zellen, die unterschiedlichen Stimuli ausgeliefert sind, im Hinblick auf die Funktionen bestimmter Gene oder deren Rollen in der Entwicklung einer Krankheit aussagekräftige Information bereitgestellt. Ansätze, basierend auf der Bestimmung der Unterschiede in den Expressionsprofilen der Gene auf dem mRNA-Niveau, haben die Identifizierung von neuen Genen erleichtert, die Proteine mit einer Funktion von Interesse codieren. Solche Ansätze haben die Identifizierung von mehreren Genen erlaubt, zum Beispiel von T-Zell-Rezeptorgenen (Yanagi et al., 1984, Nature 308:145-149) und von etlichen Tumor-Suppressorgenen, einschließlich p21 (el-Deiry et al., 1993, Cell 75:817-825; Noda et al., 1994, Exp. Cell. Res. 211:90-98). Vergleichende Bewertung der relativen Mengen an Nucleinsäuren hat weiterhin das Potential, einen nützlichen Parameter für die Organisation von Sequenzinformation bereitzustellen, die während Sequenzierungsansätzen im Großmaßstab erhalten wurden.
Andere haben einen so genannten Proteomik-Ansatz zum Verständnis des Expressionsprofils von Genen in Zellen gewählt. Bei der Proteomik werden die exprimierten Gene selbst untersucht, z.B. durch zweidimensionale Acrylamidgelelektrophorese (2-DGE) von zellulären Extrakten. Anderson und Anderson, 1994, Electrophoresis 17:443-453; Anderson et al., 1982, Trends in Analytical Chem. 1:131-135; Anderson und Seilhamer, 1997, Electrophoresis 18:533-537. In letzter Zeit ist klar geworden, dass vor der Umwandlung der Proteinkette in einzelne Aminosäuren oder funktionelle Proteinmoleküle stabile Zwischenprodukte während des normalen Abbaus und der Biosynthese von allen Proteinen innerhalb aller Zellen gebildet werden. Larsen und Finley, 1997, Cell 91:431-434; Gottesman et al., 1997, Cell 91:435-438; Coux et al., 1996, Annu. Rev. Biochem. 65:801-847; Baumeister et al., 1998, Cell 92:367-380.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Profile von Liganden, welche die Eigenschaft teilen, dass sie im Stande sind, an einen bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse spezifisch binden zu können. Im Allgemeinen werden diese Liganden zuerst durch Extraktion aus einem Liganden/Rezeptor-Komplex erhalten, dann weiter charakterisiert und in einem Profil offenbart oder katalogisiert. Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung der Erfinder, dass bestimmte Liganden-Bindungssysteme innerhalb einer Zelle verwendet werden können, um in dieser Zelle exprimierte Proteine zu identifizieren. Jedes System umfasst eine oder mehrere Arten von Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die spezifisch an zelluläre Komponenten, die in einer bestimmten Zelle vorhanden sind, z.B. Peptide oder Proteine, in einer höchst reproduzierbaren Weise binden, und als solches reflektiert die Ligandengruppe, die an solche Multi-Ligandenbindungsrezeptoren gebunden ist, weitgehend die Gruppe an Proteinen, die in dieser Zelle exprimiert werden.
Insbesondere wird die Stärke der Multi-Ligandenbindungs-Rezeptorsysteme der Zelle, einschließlich der MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II-Rezeptorsystemen, nutzbar gemacht, um native Liganden, z.B. Proteine oder stabile Peptid- Zwischenprodukte des Proteinabbaus oder der Biosynthese, zu isolieren und identifizieren, die in der Zelle von Interesse exprimiert werden. Die auf diese Weise identifizierten Liganden können verwendet werden, um die Proteine zu katalogisieren, die in einer Zelle für jeden spezifischen Zelltyp, jedes spezifische Stoffwechselstadium usw., exprimiert und umgesetzt werden. Ein charakteristisches/r Profil oder Fingerprint von Polypeptidliganden kann für einen bestimmten Zelltyp, für erkrankte im Vergleich mit normalen Zellen, für unterschiedliche Stoffwechsel- oder Entwicklungsstadien einer Zelle usw. erzeugt werden. Geeignete Profilvergleiche können verwendet werden, um zelluläre Ziele zu identifizieren, die in Diagnostik, Arzneistoff-Durchmusterung und Entwicklung und Entwicklung von therapeutischen Behandlungsschemata nützlich sind. Da die Polypeptidliganden für die Proteingruppe repräsentativ sind, die durch eine bestimmte Zellart exprimiert werden, können sie, begrifflich ähnlich zu auf Nucleinsäure basierenden ESTs (exprimierte Sequenz-Marker, „expressed sequence tags"), als „exprimierte Proteinmarker" oder „EPTs" („expressed protein tags") bezeichnet werden.
Genauer gesagt basiert die Erfindung teilweise auf der Entdeckung der Erfinder, dass Multi-Ligandenrezeptoren an etlichen zellulären Stoffwechsel- und anabolischen Systemen beteiligt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, des Proteasomenwegs, Ubiquitinwegs, Cytosol/ER-Transports, Antigen-Prozessierungswegs, der Proteinfaltung, Proteinentfaltung und des Protein-Trafficking, dass sie Proteine und stabile Zwischenprodukte spezifisch erkennen und binden und als solche verwendet werden können, um Liganden, d.h. Proteine und stabile Zwischenprodukte davon aus einer bestimmten Zelle von Interesse, zu extrahieren und identifizieren. Die Erfindung betrifft weiters Verfahren zur Erzeugung solcher Ligandenprofile. Die Verfahren umfassen die Isolation eines oder einer Vielzahl an Multi-Ligandenrezeptoren aus einer Zelle von Interesse, Extraktion der Liganden, die an den (die) isolierten Rezeptor(en) gebunden sind, und Charakterisierung der auf diese Weise isolierten Liganden gemäß etlichen ausgewählten chemischen oder physikalischen Parametern, einschließlich Molekulargewicht, Aminosäuresequenz und/oder chemischer Natur wie zum Beispiel Ladung oder Hydrophobie.
Es wird hierin auch eine gespeicherte Datenbank beschrieben, die drei Datenkategorien umfasst, die (a) Ligandenprofile, (b) Zellquellen bzw. (c) Multi- Ligandenbindungsrezeptor-Typen (hierin abgekürzt als „Rezeptortypen" bezeichnet) darstellt. In der Datenbank gibt es unter den Fällen der drei Datenkategorien Assoziationen. Die Datenbank konfiguriert einen Computer, um das Finden von Datenbeispielen aus einer der Kategorien zu ermöglichen, die auf ihrer Assoziation mit Datenbeispielen einer anderen Kategorie basiert.
Speziell können die Zellquellen auf Zelltypen, Zellzuständen, besonderen Individuen, Störungszuständen, Entwicklungsstadien oder anderen Kriterien basieren. Die Ligandenprofile umfassen Information, die Proteinfragmente einzigartig identifiziert, z.B. Massenspektraldaten. Die Datenbank kann abgefragt werden (z.B. unter Verwendung einer ausgewählten Zellquelle, welche einen ausgewählten Zellzustand aufweist), um eine Beispiel von Ligandenprofilen zu finden, das mit einem oder mehreren ausgewählten Beispielen an Zellquellen und einem oder mehreren ausgewählten Beispielen der Rezeptortypen assoziiert ist. Die festgestellten Beispiele können zwei Ligandenprofile umfassen, die verglichen werden, um einen Unterschied zwischen ihnen zu bestimmen.
Hierin beschriebene Verfahren umfassen Durchführen eines Experiments an Zellen, Identifizieren eines Ligandenprofils, das mit diesen Zellen assoziiert ist, und basierend auf dem Ligandenprofil Abfragen einer Datenbank, die mindesten zwei Datenkategorien umfasst, einschließlich Ligandenprofilen und Zellquellen, um eine Zellquelle oder ein Ligandenprofil und eine damit in Zusammenhang stehende Zellquelle zu erlangen.
Das Experiment kann eine Vielzahl an Merkmalen aufweisen. Zum Beispiel kann das Merkmal des Experiments die Behandlung der Zellen unter Verwendung eines Kandidaten-Arzneistoffbehandlungsplans umfassen und eine Zellquelle, die als ein Ergebnis der Abfrage identifiziert wurde, kann eine unterschiedliche Behandlung der Zellen darstellen (z.B. ein unterschiedliches Arzneistoff oder Verwendung des Kandidatenarzneistoffs in einer unterschiedlichen Weise).
Das Merkmal des Experiments kann die Behandlung eines Tieres unter Verwendung eines Testverbindungsbehandlungsplans umfassen. Das bestimmte Ligandenprofil kann mit einem bestimmten Organ des Tiers in Zusammenhang stehen. Eine Zellquelle, die als ein Ergebnis der Abfrage identifiziert wurde, kann ein unterschiedliches Organ eines Tiers, das der Behandlung unter Verwendung der Testverbindung unterzogen wurde, oder das gleiche Organ vor der Behandlung darstellen.
Das Merkmal des Experiments kann kontrollierte Zellentwicklung umfassen und das bestimmte Ligandenprofil kann mit der Entwicklung der Zelle in Zusammenhang stehen. Eine Zellquelle, die als Ergebnis der Abfrage identifiziert wurde, kann sich entwicklungsmäßig von der Zellquelle der Zellen des Experiments unterscheiden.
Das Merkmal des Experiments kann Einführen eines Expressionsvektors in Zellen einer Zellquelle umfassen und das bestimmte Ligandenprofil kann mit dem Effekt des Expressionsvektors auf die Zellen assoziiert werden.
Das Merkmal des Experiments kann die Reaktion der Zellen auf pharmakologische Verbindungen umfassen und das bestimmte Ligandenprofil kann mit Empfindlichkeit und der Unempfindlichkeit auf die Verbindung in Zusammenhang stehen. Die als ein Ergebnis der Abfrage identifizierte Zellquelle kann sich phänotypisch von der Zellquelle der Zellen des Experiments unterscheiden.
In einem anderen hierin offenbarten Verfahren wird eine Zellquelle, ein Rezeptortyp oder ein Ligandenprofil von Interesse identifiziert. Basierend auf der/m identifizierten Zellquelle, Rezeptortyp oder Ligandenprofil wird eine Abfrage an eine Datenbank gerichtet, die die drei assoziierten Datenkategorien enthält, um Information über Zellquellen, Rezeptortypen oder Ligandenprofile zu erhalten, die mit der Zellquelle, dem Rezeptortyp oder dem Ligandenprofil von Interesse in Zusammenhang stehen.
In einem anderen hierin offenbarten Verfahren werden die Zellen einer Zellquelle bereitgestellt, ein Ligandenprofil wird von den Zellen erzeugt und eine Abfrage wird an eine Datenbank gerichtet, welche die drei assoziierten Kategorien enthält, um Information über Zellquellen, Rezeptortypen oder Ligandenprofile zu erhalten, die mit der bereitgestellten Zellquelle und dem erzeugten Ligandenprofil in Zusammenhang stehen.
Die Erfindung gestattet einen leistungsstarken Ansatz für die Charakterisierung von zellulären Proteinen und anderen zellulären Bestandteilen und kann als ein Instrument in einer Vielzahl von Situationen eingesetzt werden, einschließlich Charakterisierung einer Zellart, Analysieren des Stoffwechsel- oder Entwicklungsstadiums einer Zelle, Charakterisieren von erkrankten im Vergleich zu normalen Zellen und Identifizieren von zellulären Zielen, die in die Krankheitsprozesse verwickelt sind. Außerdem können die Verfahren verwendet werden, um in der Genomkartierung und in funktioneller Genomik zu helfen.
Hierin verwendete Begriffe sind, falls nicht anders angegeben, im Allgemeinen, wie sie üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden. Von den folgenden Begriffen wird beabsichtigt, dass sie die folgenden allgemeinen Bedeutungen haben:
Ein „Ligandenprofil" ist eine künstliche (d.h. durch den Menschen erzeugte) Darstellung einer Ligandengruppe, wobei jeder Ligand getrennt in einer Weise dargestellt wird, welche Information über eine oder mehrere physikalische oder chemische Eigenschaften übermittelt, die in Kombination ausreichend sind, um ihn von anderen Liganden der Gruppe zu unterscheiden. Der Begriff umfasst daher eine einfache Ligandenliste, die durch Aminosäuresequenz, durch eine oder eine Reihe von anderen physikalischen oder chemischen Eigenschaften oder durch einen Codenamen identifiziert wird, wobei dieser Codename decodiert werden kann, um die unterscheidenden physikalische(n) oder chemische(n) Eigenschaft(en) zu kennzeichnen. Der Begriff umfasst auch komplexere, multi-dimensionale Darstellungen wie zum Beispiel die nachstehend definierten „Fingerprints" und umfasst Darstellungen, die einzig in Maschinen-lesbarer Form bestehen, sowie jene in einem visualisierbaren Format. Ein Profil wird als eine reproduzierbare Eigenschaft einer Zelle angesehen, wenn zwei identische Experimente unter Verwendung von identischen Zellen im Wesentlichen das gleiche Profil ergeben.
Ein „Fingerprint" ist eine Art des Ligandenprofils, das weiter als ein multi-dimensionaler Plot einer bestimmten Ligandengruppe charakterisiert ist, wobei jede Achse des Plots eine Art von quantifizierbarem physikalischem oder chemischem Kennzeichen der Liganden darstellt (z.B. Ladung, Hydrophobie, Größe usw.).
Ein „Multi-Ligandenbindungsrezeptor" ist ein Polypeptidmolekül (oder Komplex an Polypeptidmolekülen) das keine Nucleinsäure enthält und das reproduzierbar an eine bestimmte Gruppe von mindestens zehn unterschiedlichen Proteinen oder Peptiden in oder stammend aus einer bestimmten tierischen Zelle bindet, wobei die Bindung nicht kovalent ist. Die Bindungsaffinität ist vorzugsweise geringer als etwa 10 μM. Bindungsspezifität basiert üblicherweise auf strukturellen, chemischen oder physikalischen Merkmalen wie zum Beispiel Ladung, Länge, Hydrophobie oder Hydrophilie der Seitenketten, Aminosäurezusammensetzung, Länge der Seitenketten, Größe, dreidimensionaler Struktur usw. Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die für die Anwendung dieser Erfindung geeignet sind, binden üblicherweise mit einem Spezifitätsniveau und einem Stabilitätsniveau an ein Ligandenrepertoire, das die Isolierung von Rezeptor/Liganden-Komplexen in einer reproduzierbaren Weise ermöglicht. Spezifische Rezeptoren, die verwendet werden können, umfassen Antikörper, Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse-I-Rezeptoren; MHC-Klasse-II-Rezeptoren; Rezeptoren, die an der Faltung und/oder Entfaltung von Proteinen beteiligt sind, wie zum Beispiel Hitzeschockproteine (Bukau et al., 1998, Cell 92:351-366), Chaperonine und Chaperone (z.B. hsp100, hsp90, hsp70, hsp65, Calnexin, Calreticutin, BIP, grp96 und grp94 (Sallusto et al., 1995, J. Exp. Med. 182:389-400; Sandoval et al., 1994, Trends Cell. Biol. 4:282-297)); Mannosidase; und N-Glycanase (Pfeffer et al., 1987, Ann. Rev. Biochem. 56:829-852), sind aber nicht auf sie beschränkt. Andere Rezeptoren sind Peptidtransporter wie zum Beispiel TAP, das 26S- oder 20S-Proteasom oder seine Komponenten und Rezeptoren, die am Ubiquitinweg beteiligt sind, wie zum Beispiel E2-Trägerproteine, E3-Ubiquitin-Ligasen und Entfaltungsenzyme; Trafficking- oder Rückhalteproteine wie zum Beispiel der KDEL-Rezeptor (Munro et al., 1987, Cell 48:899); und der Mannoserezeptor (Sallusto et al., 1995, J. Exp. Med. 182:389-400; Sandoval et al., 1994, Trends Cell. Biol. 4:282-297). Jeder dieser Rezeptoren erkennt eine Vielzahl an verschiedenen Proteinen oder von stabilen Peptidzwischenprodukten davon; die gebundenen Polypeptide reflektieren daher einen Teil der Proteine, die innerhalb der Zelle exprimiert werden. Der Begriff Multi-Ligandenbindungsrezeptor, wie er hierin verwendet wird, ist vorgesehen, um irgendein Rezeptorfragment einzuschließen, das eine Multi-Ligandenbindungsdomäne von irgendeinem der vorstehend bezeichneten Rezeptoren oder Rezeptorkomplexen umfasst und welches daher in den Verfahren der Erfindung wie ein Multi-Ligandenbindungsrezeptor wirken kann. Er umfasst auch Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon, wenn die Antikörper im Stande sind, an eine Vielzahl (typischerweise mindestens 10, und vorzugsweise mindestens 50) an Proteinen oder Peptiden zu binden, die durch eine bestimmte Zelle erzeugt werden.
Ein „Ligand", wie der Begriff hierin verwendet wird, ist ein Polypeptid von mindestens 4 Aminosäuren Länge, welches nicht kovalent an einen wie vorstehend definierten Multi-Ligandenbindungsrezeptor mit einer Affinität bindet, die es einem Rezeptor/Ligandenkomplex ermöglicht, aus dem Zelllysat isoliert zu werden und dann dissoziiert zu werden, sodass der Ligand analysiert werden kann. Das bedeutet üblicherweise eine Affinität von weniger als etwa 10 μM und vorzugsweise weniger als etwa 1 μM. Der Ligand kann ein intaktes Protein oder ein Proteinfragment darstellen. Das Fragment kann zum Beispiel ein Zwischenprodukt in der Biosynthese oder dem Abbau des Proteins sein. Vorzugsweise wird der Ligand mindestens 5 Aminosäuren lang sein, stärker bevorzugt mindestens 6, z.B. mindestens 7, und am meisten bevorzugt mindestens 8. Der Begriff „Protein" umfasst Glycoproteine.
Der Begriff „Liganden, die ausgeprägte Kernpeptide aufweisen" bezieht sich auf Liganden, von welchen keine zwei mehr als sechs aufeinander folgende Aminosäuren gemeinsam haben. Der Begriff deckt daher eine Gruppe von zwei (oder mehr) Liganden ab, die unterschiedliche Proteine darstellen oder von unterschiedlichen Proteinen abstammen oder von nicht oder wenig überlappenden Teilen des gleichen Proteins stammen, solange die Sequenzen der Liganden nicht mit mehr als sechs aufeinander folgenden Aminosäuren überlappen.
Der Begriff „Zellquelle" bezieht sich auf Zellen, die eine bestimmte Eigenschaft oder Eigenschaften aufweisen. Die Eigenschaften können im Hinblick auf Zelltyp, Zellzustand (z.B. normal oder erkrankt), bestimmte Personen, von welchen die Zellen stammten, Zustand von Störung, Entwicklungsstadium, Stoffwechselstadium oder anderen Kriterien ausgedrückt werden.
Kurze Beschreiung der Figuren
1A und 1B sind ein Paar von Chromatogrammen, welche eine schnelle und reproduzierbare Rezeptor:EPT-Komplexreinigung von HLA-A*0201 und HLA-DR*0401/1301 aus 20 g (1A) und 22 g (1B) der menschlichen lymphoblastoiden B-Zellline JY unter Verwendung einer automatisierten Immunaffinitätschromatographie-Reinigungsstrategie darstellen. Die Chromatogramme stellen den Proteingehalt, wie er durch UV-Absorption bei 280 nm nachgewiesen wird, auf der y-Achse dar und die Zeit in Minuten auf der x-Achse.
2 ist eine Photographie einer SDS-PAGE-Reinheitsanalyse der Rezeptor:EPT-Komplexe, die, wie in 1A und 1B gezeigt, aus den menschlichen B-Lymphoblastoid-Zelllinen LG-2 und JY gereinigt wurden.
3 ist ein Paar an überlagerten Umkehrphasen-Auftrennungschromatogrammen von zwei unabhängigen HLA-A*0201:EPT-Erzeugungen, wie in 1A und 1B beschrieben. Die zwei Chromatogramme stellen des EPT-Repertoire dar, wie es durch UV-Absorption bei 210 nm nachgewiesen wurde, und sind überlagert, um die Reproduzierbarkeit der Auftrennung zu zeigen, die für EPT-Profilvergleiche notwendig ist.
4A und 4B sind Analysen von Massenspektren von einzelnen isolierten Fraktionen aus zwei Rezeptor:EPT-Erzeugungen. Rezeptor:EPT-Isolierung und EPT-Auftrennung durch Umkehrphasenchromatographie wurden für HLA-A*0201 und HLA-DR*0401 aus den menschlichen Zelllinien JY und Priess durchgeführt. Repräsentative Massenanalysen für zwei EPT-enthaltende Fraktionen werden in 4A bzw. 4B dargestellt. Die Spektren stellen die Ionisierung einer komplexen Mischung an individuellen EPTs dar, die in Fraktion 56 der JY-Zellerzeugung (4A) und 37 der Priesszellpräparation (4B) enthalten sind. Die y-Achse stellt die relative Ionisierung von jedem EPT dar und die x-Achse zeigt das Verhältnis von Masse-zu-Ladung (m/z) für jede geladene Art.
5A ist ein Post-Quellenzerfall/Kollisions-induziertes Dissoziationspektrum eines einzelnen EPT aus der Analyse, die in 4B dargestellt ist (m/z = 1957.8). 5B ist eine Tabelle, die eine Sequenzanalyse von diesem EPT darstellt, basierend auf der Elternionenmasse, den Tochter-Ionenfragmenten und der Immoniumionen-Zusammensetzung. 5C ist ein Ausdruck der Ergebnisse einer Suche nach der besten Datenbank unter Verwendung der TBLASTN-Funktion aus dem National Library of Medicine Genebankserver, um einen entsprechenden EST in der Datenbank zu finden.
6 ist ein zweidimensionaler EPT-Fingerprint für eine menschliche lymphoblastoide B-Zelle, der aus dem menschlichen Rezeptor HLA-DR*1501 extrahierte EPTs illustriert. Die y-Achse stellt das Verhältnis von Masse-zu-Ladung (m/z) dar, während die x-Achse die relative Hydrophobie darstellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen einen neuen Ansatz, um Polypeptidmoleküle, die in einer bestimmten Zelle von Interesse vorhanden sind, zu identifizieren, sortieren, katalogisieren und/oder ein Profil davon zu erstellen. Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung der Erfinder, dass interne Systeme, die in jeder Zelle vorhanden sind, als ein Instrument zur Identifizierung und Darstellung der Proteine verwendet werden können, die in einer bestimmten Zelle exprimiert werden. Genauer gesagt haben die Erfinder herausgefunden, dass promiskuitive Rezeptoren, die als Multi-Ligandenbindungsrezeptoren bezeichnet werden, die im Wesentlichen innerhalb jeder Art von eukaryontischer oder prokaryontischer Zelle vorhanden sind und die mit hoher Spezifität und hoher Affinität an ein Ligandenrepertoire in einer nicht-kovalenten Weise binden, als ein Instrument für die Extraktion von Liganden verwendet werden können, die von einer bestimmten Zelle von Interesse das Proteinrepertoire oder eine Untergruppe davon darstellen. Jede Zelle weist zahlreiche verschiedene Typen von Multi-Ligandenbindungsrezeptoren auf, von denen jeder Liganden entsprechend Rezeptor-spezifischen Kriterien bindet. Das Isolieren eines spezifischen Multi-Bindungsrezeptors aus einer Zelle von Interesse unter Bedingungen, welche die Assoziation des Rezeptors mit seinem Liganden beibehält, ermöglicht die Identifizierung einer Untergruppe an Polypeptiden, die für diese bestimmte Zelle spezifisch ist. Nachdem unterschiedliche Multi-Ligandenbindungsrezeptoren unterschiedliche Untergruppen von Polypeptiden binden, können multiple Untergruppen an Polypeptiden durch Isolieren von unterschiedlichen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren aus der gleichen Zelle erhalten werden. Die Liganden können anschließend aus den Multi-Ligandenbindungsrezeptoren extrahiert werden, um eine Ligandengruppe zu bilden, die weiter charakterisiert werden kann.
In Übereinstimmung mit der Erfindung können etliche Verfahren und Instrumente für die Katalogisierung der isolierten Liganden entsprechend spezifischen Parametern verwendet werden, welche die Zuordnung einer spezifischen Identität zu jedem Liganden ermöglichen. Solche Parameter umfassen, sind aber nicht limitiert auf, HPLC-Profile, z.B. Anionenaustausch, Kationenaustausch, Umkehrphase, normale Phase oder hydrophobe Interaktionschromatographie; kapillare Elektrophoreseprofile, z.B. CE, AEC-CE, CZE oder CEC-CE; und Massenspektrometrieprofile, z.B. MALDI-TOF/MS, FTMS, ESI-TOF, MALDI-ITMS, ESI-Quadropol-MS, ESI-Quadropol/TOF-MS; ES-Sektor-MS, FAB-MS, oder ESI-ITMS. Als solches ermöglicht die vorliegende Erfindung die Erzeugung von Zell-spezifischen Ligandenprofilen, die spezifisch an einen ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor binden, der für die Ausführung dieser Erfindung nützlich ist. Die Profile von unterschiedlichen/m Zellen, Gewebe oder Organtypen von Interesse können verglichen werden und Liganden können identifiziert werden, die differentiell dargestellt werden, z.B. vorhanden in einem Zelltyp/Gewebe/Organ, aber nicht vorhanden in einem anderen oder exprimiert mit unterschiedlicher Häufigkeit. Darüber hinaus können „differenzielle Profile" von Liganden erzeugt werden, die Liganden darstellen, die in zwei Zelltypen differentiell vorhanden sind.
Peptid- und Proteinliganden, die in den Profilen der Erfindung dargestellt sind, werden als „exprimierte Protein-Marker" („EPTs") bezeichnet.
Die Erfindung umfasst daher ein Ligandenprofil, das für eine bestimmte Zelle charakteristisch ist; das Ligandenprofil enthält eine Repräsentation von mindestens zehn unterschiedlichen Polypeptidliganden, von welchen alle an einen einzelnen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ binden, wobei die Repräsentation entweder (1) jede einzelnen Liganden basierend auf mindestens drei physikalischen oder chemischen Eigenschaften charakterisiert; oder (2) jeden einzelnen Liganden basierend auf mindestens zwei physikalischen oder chemischen Eigenschaften charakterisiert, wobei mindestens eine dieser zwei Eigenschaften Masse oder das Verhältnis von Masse-zu-Ladung darstellt (mit dem Verhältnis von Masse-zu-Ladung definiert als eine einzelne Eigenschaft); vorausgesetzt dass, wenn der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I oder Klasse II-Rezeptor ist, mindestens 500 Polypeptidliganden in dem Ligandenprofil dargestellt sind; und weiters vorausgesetzt, dass das Ligandenprofil eine reproduzierbare Eigenschaft der Zelle ist.
Alternativ umfasst das Ligandenprofil eine Repräsentation von mindestens zehn unterschiedlichen Polypeptidliganden, von denen alle an einen einzelnen Multi- Ligandenbindungsrezeptor-Typ binden, wobei die Repräsentation jeden einzelnen Liganden basierend auf mindestens einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft charakterisiert, diese mindestens eine physikalische oder chemische Eigenschaft eine Aminosäuresequenz umfasst; vorausgesetzt dass, wenn der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I oder Klasse-II-Rezeptor ist, mindestens 50 Polypeptidliganden in dem Ligandenprofil repräsentiert sind; und ferner vorausgesetzt, dass das Ligandenprofil ein reproduzierbares Merkmal der Zelle ist.
Ebenfalls innerhalb der Erfindung liegt ein Ligandenprofil, das für eine bestimmte Zelle charakteristisch ist; das Ligandenprofil umfasst Ionen-Fragmentationsmuster für mindestens zehn unterschiedliche Polypeptidliganden, wobei alle dieser Polypeptidliganden an einen einzelnen Multi-Ligandenbindungsrezeptortyp binden; vorausgesetzt dass, wenn der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I oder Klasse-II-Rezeptor ist, zumindest 100 Polypeptidliganden in dem Ligandenprofil vertreten sind; und ferner vorausgesetzt, dass das Ligandenprofil eine reproduzierbare Eigenschaft der Zelle ist.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Ligandenprofil, das für eine bestimmte Zelle charakteristisch ist, wobei das Ligandenprofil Aminosäuresequenzen von mindestens zehn verschiedenen Polypeptidliganden umfasst, die unterschiedliche Kernpeptide aufweisen, wobei alle Liganden an einen einzelnen Typ von Multi-Ligandenbindungsrezeptor binden, vorausgesetzt dass, wenn der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I oder Klasse-II-Rezeptor ist, mindestens 100 Polypeptidliganden (und vorzugsweise 150, 200, 300 oder 500) im Ligandenprofil vertreten sind; und ferner vorausgesetzt, dass das Ligandenprofil eine reproduzierbare Eigenschaft der Zelle ist.
In jedem der vorstehenden Aspekte der Erfindung kann der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I oder MHC-Klasse-II-Rezeptor sein oder er kann ein Protein oder Multi-Protein-Komplex sein, der keinen MHC-Klasse-I oder MHC-Klasse-II-Rezeptor darstellt: z.B. ein Chaperone, ein Chaperonin, ein Calnexin, ein Calreticutin, eine Mannosidase, eine N-Glycanase, ein BIP, ein grp94, ein grp96, ein hsp60, hsp65, hsp70, hsp90, hsp25, ein E2-Ubiquitin-Trägerprotein, eine E3-Ubiquitin-Ligase, ein Entfaltungsenzym, hsp100, ein Proteasom, ein Trafficking-Protein oder ein Rückhalteprotein. Die Zelle kann eine blutbildende Zelle sein (z.B. aus Blut oder Knochenmark stammend) wie zum Beispiel eine B-Zelle, oder irgendeine andere Zellart als eine B-Zelle. Nützliche physikalische oder chemische Eigenschaften umfassen Ladung, Verhältnis von Masse-zu-Ladung, Größe, Hydrophobie und Aminosäuresequenz. Wenn die Eigenschaften Hydrophobie und das Verhältnis zwischen Masse und Ladung einschließen, werden sie üblicherweise unter Verwendung von Massenspektroskopie bestimmt. Das Ligandenprofil kann mit einem zweiten Ligandenprofil kombiniert werden; das zweite Ligandenprofil stellt (a) auch eine reproduzierbare Eigenschaft einer bestimmten Zelle dar und (b) enthält eine Repräsentation von mindestens zehn zusätzlichen Polypeptidliganden, von welchen alle an einen zweiten Typ von Multi-Ligandenbindungsrezeptor binden, der sich vom ersten Rezeptortyp unterscheidet. Falls gewünscht, können diese mit jeder beliebigen Zahl von anderen solchen Ligandenprofilen kombiniert werden, die reproduzierbare Eigenschaften einer bestimmten Zelle darstellen, alle abstammend von unterschiedlichen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen, um eine vollständigere und genauere Information über die Proteingruppe zu geben, die durch eine bestimmte Zelle exprimiert wird.
Auch innerhalb der Erfindung liegt ein Verfahren der Erzeugung eines reproduzierbaren Ligandenprofils für eine bestimmte Zellart, wobei die Zellart einen ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst; das Verfahren schließt die folgenden Schritte ein (mit den Schritten (f)-(k) für den Zweck der Bestätigung der Reproduzierbarkeit des in den Schritten (a)-(e) erzeugten Profils):

(a) Bereitstellen einer ersten Probe der bestimmten Zellart, wobei die erste Probe eine erste Vielfalt an Polypeptidliganden umfasst, die an den ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebunden ist;
(b) Isolieren des ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs aus der ersten Probe;
(c) Abtrennen der ersten Ligandenvielfalt von dem ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ;
(d) Fraktionieren der ersten Ligandenvielzahl;
(e) Erzeugen eines ersten Profils, das auf der Basis von mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unter der ersten Ligandenvielzahl unterscheidet;
(f) Bereitstellen einer zweiten Probe der bestimmten Zellart, wobei die zweite Probe im Wesentlichen identisch zu der ersten Probe ist, wobei die zweite Probe eine zweite Vielzahl an Polypeptidliganden enthält, die an den ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebunden ist;
(g) Isolieren des ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs aus der zweiten Probe;
(h) Abtrennen der zweiten Ligandenvielzahl von dem ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ;
(i) Fraktionieren der zweiten Ligandenvielzahl;
(j) Erzeugung eines zweiten Profils, das unter der zweiten Ligandenvielzahl auf der Basis von mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; und
(k) Bestätigung, dass das erste Profil und das zweite Profil im Wesentlichen identisch sind und gemeinsam ein reproduzierbares Ligandenprofil für die bestimmte Zellart darstellen.

In einem solchen Verfahren wie in den ähnlichen nachstehend beschriebenen Verfahren kann auch eine zweite, dritte oder zusätzliche chemische oder physikalische Eigenschaft von jedem Liganden nach den Fraktionierungsschritten bestimmt werden und dann in den Profilen repräsentiert sein. Die Isolierungs- und Abtrennungsschritte für alle der offenbarten Verfahren können bequem unter Verwendung von geeigneten Säulen, angeordnet in einem in-Reihe-System, erzielt werden. In einem solchen in-Reihe-HPLC-System werden chromatographische Säulen in Reihen angeordnet, um einen fortlaufenden Durchfluss der mobilen Phase von einer Säule in die nächste, ohne Entfernen aus dem System zwischen den Säulen, zu ermöglichen. Falls gewünscht können Immunaffinitätssäulen, Ionenaustausch-Chromatographiesäulen und/oder ConA-Chromatographiesäulen für die Isolierungsschritte verwendet werden, während der nächste Schritt (z.B. Umkehrphasen-Chromatographie) für die Fraktionierungsschritte verwendet werden kann, wobei jedes Profil die relative Zeit der Elution von jedem Liganden aus der ausgewählten chromatographischen Säule widerspiegelt. Zum Beispiel kann das Profil für jeden Liganden einen Plot der Elutionszeit aus dem Substrat gegen das Verhältnis von Masse zu Ladung umfassen.
Weitere Information kann erhalten werden, wenn das Verfahren ein Profil oder eine Profilgruppe erzeugt, die Liganden repräsentiert, die aus zwei oder mehreren Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen in der bestimmten Zellart stammen, z.B. durch Ausführung der folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen einer Lysatprobe der bestimmten Zellart, wobei die Probe eine erste Vielzahl an Polypeptidliganden, die an einen ersten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebunden sind, und eine zweite Vielzahl an Polypeptidliganden umfasst, die an einen zweiten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebunden sind;
(b) Isolieren des ersten und zweiten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs aus der Probe;
(c) Abtrennen der ersten Ligandenvielzahl von dem ersten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ und der zweiten Ligandenvielzahl von dem zweiten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ;
(d) Fraktionieren der ersten Ligandenvielzahl und der zweiten Ligandenvielzahl; und
(e) Erzeugung eines ersten Profils, das zwischen der ersten Ligandenvielzahl auf

Die Techniken können verwendet werden, um eine Zellerzeugung mit einer anderen durch Erzeugung eines Substraktionsprofils von Polypeptidliganden zu vergleichen, umfassend:

(a) Erzeugen eines ersten Ligandenprofils durch ein Verfahren, umfassend:
(i) Bereitstellen einer ersten Probe, umfassend eine erste Zelle von Interesse, wobei die erste Zelle von Interesse einen bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst, der an eine erste Gruppe von Polypeptidliganden gebunden ist;
(ii) Isolieren des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs und der ersten Ligandengruppe aus der ersten Probe;
(iii) Abtrennen der ersten Ligandengruppe von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ;
(iv) Erzeugung eines ersten Profils, das unter der ersten Ligandengruppe auf der Basis von mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet;
(b) Erzeugung eines zweiten Ligandenprofils durch ein Verfahren, umfassend:
(i) Bereitstellen einer zweiten Probe, umfassend eine zweite Zelle von Interesse, wobei die zweite Zelle von Interesse den beistimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst, der an eine zweite Gruppe von Polypeptidliganden gebunden ist;
(ii) Isolieren des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs und der ersten Ligandengruppe aus der zweiten Probe;
(iii) Abtrennen der zweiten Ligandengruppe von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ;
(iv) Erzeugung eines zweiten Profils, das unter der zweiten Ligandengruppe auf der Basis von mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet;
(c) Vergleichen des ersten Profils und des zweiten Profils, um differentiell exprimierte Liganden zu identifizieren und dabei ein Substraktionsprofil der Liganden zu bilden. Die erste Zellprobe und die zweite Zellprobe können aus unterschiedlichen biologischen Gewebearten (z.B. Vergleichen von glattem Muskelgewebe mit Skelettmuskelgewebe), unterschiedlichen Zelltypen (z.B. endotheliale Zellen und epitheliale Zellen), unterschiedlichen Organsystemen (z.B. Pankreas und Lunge), oder dem gleichen Organsystem, aber Zellen mit unterschiedlichem Status (z.B. terminal differenzierten im Vergleich zu embryonischen oder gesunden im Vergleich mit erkrankten oder für eine Krankheit anfälligen) erhalten werden. Alternativ können die Verfahren transfizierte Zellen vergleichen, die eine bestimmte rekombinante Nucleinsäure exprimieren, im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen oder transfizierten Zellen, welche die rekombinante Nucleinsäure gegenwärtig nicht exprimieren. Die Verfahren könnten auch Zellen vergleichen, die auf eine besondere Weise behandelt wurden (entweder in vivo oder in vitro), im Vergleich zu Zellen, die auf eine andere Weise behandelt wurden oder nicht behandelt wurden. Zum Beispiel kann die Behandlung die Verabreichung einer Testsubstanz oder eines Arzneistoffkandidaten wie zum Beispiel eines Wachstumsfaktors, eines Hormons, eines Cytokins, eines kleinen Moleküls, eines Polypeptids, einer Nucleinsäure, eines Kohlenhydrats oder eines Lipids umfassen. Alternativ kann die Behandlung das Inkontaktbringen der Zellen mit Stressbedingungen wie zum Beispiel Trauma, Hypoxie, Glucoseentzug, Entzug einer Aminosäure, Entzug eines Nährstoffes, Anwesenheit eines Toxins oder niedrige oder hohe Temperatur. Die Zellen für jedes dieser Verfahren sind vorzugsweise Vertebratenzellen (z.B. aus einem Vogel oder Fisch) und stärker bevorzugt Säugerzellen, z.B., aus einem Menschen oder aus einem nicht-menschlichen Tier, wie zum Beispiel einem nicht-menschlichen Primaten, einer Maus, Ratte, einem Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen, Hund, einer Katze, Kuh, einem Pferd, Schwein, Schaf oder einer Ziege. Durch Hinzufügen einer anderen Reihe an Schritten, ähnlich zu (a) (i)-(iv), unter Verwendung einer dritten Zellprobe, könnte man drei unterschiedliche Zellproben vergleichen oder die erste Probe mit der zweiten und der dritten vergleichen. Zum Beispiel könnte die zweite Zellprobe eine positive Kontrolle sein und die dritte Zellprobe eine negative Kontrolle, oder die dritte Zellprobe könnte drei unterschiedliche Behandlungsschemata darstellen.

In einer Variation des Vorstehenden kann man Proteine, die in einer ersten Zellprobe exprimiert werden, einfach, wie folgt, mit jenen vergleichen, die in einer Referenz-Zellprobe exprimiert werden, indem ein Ligandenprofil erzeugt wird, das mit einem geeigneten Referenz-Ligandenprofil verglichen wird:

(a) Herstellen eines ersten Ligandenprofils durch ein Verfahren, umfassend:
(i) Bereitstellen einer ersten Zellprobe, umfassend einen bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ, der an eine erste Gruppe von Polypeptidliganden gebunden ist;
(ii) Isolieren des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs und der ersten Ligandengruppe aus der ersten Zellprobe;
(iii) Abtrennen der ersten Ligandengruppe von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ;
(iv) Erzeugung eines ersten Ligandenprofils, das unter der ersten Ligandengruppe auf der Basis von mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet;
(b) Bereitstellen eines Referenz-Ligandenprofils, das eine zweite Gruppe an Polypeptidliganden darstellt, extrahiert aus dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ einer Referenz-Zellprobe (z.B. eine Probe, die erkrankte Zellen eines Tiers enthält, oder Zellen, die mit einer bestimmten Verbindung behandelt oder nicht behandelt wurden), wobei das Referenz-Ligandenprofil unter der zweiten Gruppe von Polypeptidliganden auf der Basis von mindesten einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; und
(c) Vergleichen des ersten Ligandenprofils mit dem Referenz-Ligandenprofil, um die Unterschiede oder Ähnlichkeiten zwischen der ersten Zellprobe und der Referenz-Zellprobe zu identifizieren. Dieses und die anderen vorstehend beschriebenen Vergleichsverfahren können verwendet werden, um zum Beispiel Zellen, die in der Anwesenheit einer Testsubstanz gezüchtet wurden, mit Zellen, die nicht in der Anwesenheit der Testsubstanz gezüchtet wurden; oder Zellen aus einem Tier, das mit einer Testsubstanz behandelt wurde, mit Zellen (1) aus dem gleichen Tier vor der Behandlung oder (2) aus einem zweiten nicht behandelten Tier zu vergleichen.

Auch innerhalb der Erfindung liegt eine Gruppe an Ligandenprofilen, wobei die Gruppe umfasst

(a) ein erstes Ligandenprofil, umfassend eine erste Repräsentation einer ersten Vielzahl an Polypeptidliganden, von welchen alle an mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer ersten Zelle binden, wobei die erste Repräsentation unter den Mitgliedern der ersten Ligandenvielzahl basierend auf mindestens einem physikalischen oder chemischen Merkmal unterscheidet; und
(b) ein zweites Ligandenprofil, umfassend eine zweite Repräsentation einer zweiten Vielzahl an Polypeptidliganden, von welchen alle an mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor von einer zweiten Zelle binden, wobei die zweite Repräsentation unter der zweiten Ligandenvielzahl basierend auf mindestens einem physikalischen oder chemischen Merkmal unterscheidet; vorausgesetzt dass (i) sich die erste Zelle von der zweiten Zelle in einem Parameter unterscheidet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus genetischem Hintergrund, Kulturbedingungen, genetischem Hintergrund und Kulturbedingungen, in vivo-Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz und genetischem Hintergrund und in vivo-Inkontaktbringen einer Testsubstanz; und (ii) jeder wesentliche Unterschied zwischen dem ersten und dem zweiten Ligandenprofil zu diesem Parameter zuordnungsbar ist. Eine solche Gruppe kann natürlich zusätzliche Profile umfassen, die sich von den vorstehenden ersten und zweiten Profilen unterscheiden, indem sie aus anderen Zellquellen stammen. Außerdem kann die Gruppe andere Profile umfassen, die Liganden repräsentieren, die aus den gleichen Zellquellen wie vorstehend extrahiert wurden, wobei aber ein unterschiedlicher Multi-Ligandenbindungsrezeptor verwendet wird, um vollständigere Information über die Proteine zu geben, die in den Zellen exprimiert werden.

Die Erfindung kann in einem Verfahren zum Nachweis eines Unterschieds zwischen der in einer ersten Zelle exprimierten Proteingruppe und der in einer zweiten Zelle exprimierten Proteingruppe verwendet werden, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen eines ersten Ligandenprofils, erzeugt durch ein Verfahren, das die Schritte umfasst von:
(i) Bereitstellen einer ersten Zelle, die mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst, der an eine erste Gruppe von Polypeptidliganden gebunden ist;
(ii) Isolieren des mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs, der an die erste Ligandengruppe gebunden ist, aus der ersten Zelle;
(iii) Abtrennen der ersten Ligandengruppe von dem mindestes einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; und
(iv) Erzeugen eines ersten Ligandenprofils, das zwischen den Mitgliedern der ersten Ligandengruppe auf der Basis von mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet;
(b) Bereitstellen eines zweiten Ligandenprofils, erzeugt durch ein Verfahren, das die Schritte umfasst von:
(i) Bereitstellen einer zweiten Zelle, umfassend mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ, der an eine zweite Gruppe von Polypeptidliganden gebunden ist;
(ii) Isolieren des mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs, der an die zweite Ligandengruppe gebunden ist, aus der zweiten Zelle;
(iii) Abtrennen der zweiten Ligandengruppe von dem mindestens einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; und
(iv) Erzeugen eines zweiten Ligandenprofils, das zwischen den Mitgliedern der zweiten Ligandengruppe auf der Basis der mindestens einen chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet;
(c) Vergleichen des ersten Ligandenprofils mit dem zweiten Ligandenprofil, um jeden Unterschied zwischen dem ersten und zweiten Profil zu identifizieren, wobei ein solcher Unterschied ein Hinweis auf einen Unterschied zwischen der Proteingruppe ist, die in der ersten Zelle exprimiert wird, und der Proteingruppe, die in der zweiten Gruppe exprimiert wird. Wenn erwünscht, kann einer der beiden oder beide der folgenden zusätzlichen Schritte durchgeführt werden:
(i) Auswählen eines Liganden, der in einem Profil repräsentiert ist, aber nicht in dem anderen, und Identifizieren der Aminosäuresequenz des Liganden; und/oder
(ii) Erzeugen eines differentiellen Profils, das zumindest einige der Unterschiede zwischen der in der ersten Zelle exprimierten Proteingruppe und der in der zweiten Zelle exprimierten Proteingruppe darlegt. Ein solches differentielles Profil wird auch als innerhalb der Erfindung liegend erachtet.

Sobald zumindest ein Teil der Aminosäuresequenz eines Liganden bestimmt ist, kann die Sequenz des gesamten Proteins bestimmt werden (entweder durch Suche nach einer Übereinstimmung in einer Sequenzdatenbank oder durch Verwendung von degenerierten Sonden, um eine cDNA zu clonieren, die das gesamte Protein codiert). Falls erwünscht kann dann ein das Protein codierender Expressionsvektor erzeugt und verwendet werden, um die Rolle des exprimierten Proteins in der Zelle zu untersuchen, z.B. als ein Ziel für Arzneistoffentwicklung.
Nachdem die meisten Zellarten MHC-Klasse-I konstitutiv exprimieren und die Expression von MHC-Klasse-II-Rezeptoren in vielen Zellarten mit Cytokinen wie zum Beispiel Gamma-Interferon induziert werden kann, sind sie beide ausgezeichnete Kandidaten für die Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die in den Verfahren und Profilen der Erfindung genützt werden.
Basierend auf dem Vorstehenden betrifft die Erfindung in spezifischeren Ausführungsformen einen einzigartigen Ansatz zur Erzeugung von Banken und Profilen von EPTs, die verwendet werden können, um die meisten oder alle innerhalb einer Zelle bei irgendeiner/m bestimmten Zellart, Stoffwechsel- oder Entwicklungsstadium und Krankheits- im Vergleich zu normalem Stadium oder in Antwort auf eine Testsubstanz wie zum Beispiel ein/eine/einen bestimmte/s/n Hormon, Wachstumsfaktor, Transkriptionsfaktor, Cytokin, kleines Molekül, Polypeptid, Nucleinsäure, Kohlenhydrat oder Lipid, exprimierten Proteine zu identifizieren, katalogisieren und zu charakterisieren. Dieser Ansatz kann auch Unterschiede zwischen transgenen im Vergleich zu nicht-transgenen Zellen oder transfizierten im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen identifizieren. Als solches betrifft die Erfindung die Identifizierung von „Ligandenprofilen" von einer Zellart von Interesse. Diese Profile können verwendet werden, um zelluläre Proteine für „Proteomik"-Analyse vorzusortieren, den Durchmusterungsaufwand stark zu reduzieren und die Effizienz der Identifizierung zellulärer Proteinen, die in Entwicklungs- und Stoffwechselerkrankungsprozessen beteiligt sind, zu erhöhen. Geeignete Profilvergleiche können verwendet werden, um die zellulären Ziele zu identifizieren, die in der Diagnose, Arzneistoffdurchmusterung und -Entwicklung und für die Entwicklung von therapeutischen Behandlungspläne nützlich sind.
Kurz gesagt stellt die Erfindung durch die Erzeugung von EPT-Profilen einen „Schnappschuss" der exprimierten und innerhalb einer bestimmten Zelle umgesetzten Proteine bereit sowie die Katalogisierung, Identifizierung und Isolierung von Proteinen, die in zwei oder mehreren Zellpopulationen differenziell exprimiert werden; solche Daten werden die Identifizierung von Proteinen erleichtern, die biologische Bedeutung für ein bestimmtes zelluläres Stadium aufweisen, z.B. im Stoffwechsel, in der Reifung, Entwicklung, Erkrankung oder Behandlung.
Im Allgemeinen ist jeder Multi-Ligandenbindungsrezeptor, der in einer Zelle vorliegt, welche spezifische Polypeptide erkennt, die durch diese Zelle erzeugt werden, und bestimmte nachstehend angeführte Anforderungen erfüllt, dafür gedacht, innerhalb des Geltungsbereiches dieser Erfindung zu liegen. Zahlreiche Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die Polypeptidkomponenten binden, die durch eine bestimmte Zelle spezifisch produziert wurden, werden Einblick in Zell-spezifische Proteinexpression; Entwicklungs-, anabolische oder Stoffwechselprozesse oder andere Aspekte der Biologie und Physiologie einer bestimmten Zelle, Gewebeart, oder Organsystem geben. Multi-Ligandenbindungsrezeptoren innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung und nützlich für die Ausübung der Erfindung umfassen, sind aber nicht limitiert auf Rezeptoren, die an verschiedenen Protein-Biosynthese- und Abbauwegen beteiligt sind. Sie binden üblicherweise mit hoher Spezifität und in einer höchst diskriminierenden Weise an ihr Ligandenrepertoire. Üblicherweise sind die Liganden z.B. zelluläre Proteine oder Zwischenprodukte der Proteinbiosynthese oder des Abbaus (d.h. Peptide). Für die Ausübung der Erfindung ist es entscheidend, dass (1) das Ligandenrepertoire mit hoher Spezifität und Affinität gebunden wird, und (2) der Rezeptor/Ligandenkomplex ausreichend stabil ist, damit die gebundenen Liganden reproduzierbar mit dem Rezeptor assoziiert bleiben, wenn der Rezeptor isoliert wird. Vorzugsweise weist der zur Erzeugung von Banken und Profilen der vorliegenden Erfindung als ein Instrument verwendete Multi-Ligandenbindungsrezeptor eine Rezeptor/Ligandenaffinität von weniger als etwa 10 μM auf, stärker bevorzugt weniger als etwa 1 μM und am meisten bevorzugt weniger als etwa 100 nM. Darüber hinaus erkennt jeder Rezeptor ein Signal auf dem Liganden, das auf strukturellen, chemischen oder physikalischen Merkmalen wie zum Beispiel Ladung, Länge, Hydrophobie oder Hydrophilie der Seitenketten; Aminosäurezusammensetzung oder -Sequenz; Größe; oder dreidimensionaler Struktur basieren kann.
Es ist gut bekannt, dass zelluläre Proteinbiosynthese enzymatische Modifikationen umfasst, welche die Bindung der Zwischenprodukte an Rezeptoren benötigen. Zum Beispiel sind Chaperone eine Klasse an Proteinzwischenprodukt-Bindungsrezeptoren, die ihre Substrate basierend auf ihrem Faltungsstadium während der Proteinreifung erkennen und binden. Im Allgemeinen sind Chaperone in jedem zellulären Kompartiment vorhanden, in dem sich Proteine falten müssen, d.h. dem Cytosol, dem Kern, den Mitochondrien, Chloroplasten, Lysosomen und dem endoplasmatischen Retikulum (ER). Für einen Überblick siehe Melnick und Argon, 1995, Immunology Today 16:243-250. Beispiel für Chaperone schließen BiP (für Bindungsprotein), auch bekannt als GRP78, das im Lumen des ER vorhanden ist und ein Mitglied der Hitzeschockprotein 70-Familie von Stressproteinen ist (Nakaki et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2233-2238; GRP96 (für Glucose-reguliertes Protein 96); GRP94 (für Glucose-reguliertes Protein 94), auch bekannt als ERp99; Endoplasmin; gp96; hsp100, ein ER-Mitglied der hsp90-Familie von Stressproteinen (Lee, 1993, Trends Biochem. Sci. 12:20-23; Mazarella und Green, 1987, J. Biol. Chem. 262:8875-8883; Koch et al., 1986, J. Cell Science 86:217-232; Li und Srivastave, 1993, EMBO J. 12:3143-3151; Sargan et al., 1986, Biochemistry 25:6252-6258); Calnexin, auch bekannt als p88; IP90, ein Ca²⁺-bindendes Phosphoprotein, das mit der ER-Translokationsmaschinerie in Verbindung steht und mit Calreticulin verwandt ist (Ou et al., 1993, Nature 364:771-776) und Calreticulin (Degen et al., 1992, J. Exp. Med. 175:1653-1661) ein.
Eine andere Gruppe an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die an den Protein-Biosynthesewegen beteiligt ist, umfasst etliche Cytosolrezeptoren, die an der Translokation und Faltung von naszierenden Proteinen beteiligt sind. Neupert und Lill, 1994, Nature 370:421-422; Fryman et al., 1994, Nature 370:111-117; Bukau und Horwich, 1998, Cell 92:351-366. Zum Beispiel wird von hsps für Hitzeschockproteine angenommen, dass sie etliche neu synthetisierte Proteine erkennen, mit ihnen interagieren und ihre Reifung erleichtern. Für eine Zusammenfassung siehe Welch, 1992, Physiological Reviews 72:1063-1081. Es folgt daraus, dass hsps etliche, vorher ausgewählte Proteine in einer Zelle erkennen und binden und als solches ein starkes Instrument für die Ausübung dieser Erfindung liefern. Spezifische Beispiele solcher Multi-Ligandenbindungsrezeptoren des Cytosols umfassen eine andere Gruppe von Chaperonen, einschließlich hsp70s (Flynn et al., 1991, Nature 353:726-730; Landry et al., 1992, Nature 355:455-457; Blond-Elguindi et al., 1993, Cell 75:717-728; Lewis und Pelham, 1985, EMBO J. 4:3137-3142; Flynn et al., 1989, Science 245:385-390), von welchen angenommen wird, dass sie vorzeitige Faltung und Aggregation von Polypeptiden während der Membrantranslokation und Translation verhindern; hsp60s oder Chaperonine (Hemmingsen et al., 1988, Nature 333:330-334), die große oligomere Komplexe darstellen, welche die Faltung von Polypeptidketten in einer ATP-abhängigen Reaktion vermitteln (Goloubinooff et al., 1989, Nature 342:884-889; Martin et al., 1991, Nature 352:36-42); CCT/TRiC (Horwich und Willison, 1993, Phil. Trans. R. Soc. 339:313-325); und hsp40 (Neupert und Lill, vorstehend).
Eine andere Gruppe an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die an Protein-Biosynthesewegen beteiligt ist, umfasst etliche post-translationale Modifikationsenzyme wie zum Beispiel die im ER und im cis-Golgi ansässigen Mannosidase und N-Glycosidasen (Pfeffer et al., 1987, Ann. Rev. Biochem. 56:829-852) und Trafficking- oder Rückhalteproteine wie zum Beispiel den KDEL-Rezeptor (Munro et al., 1987, Cell 48:899) und den Mannoserezeptor (Sallusto et al., 1995, J. Exp. Med. 182:389-400; Sandoval et al., 1994, Trends Cell. Biol. 4:282-297).
Eine zweite allgemeine Kategorie von Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die für die Ausübung dieser Erfindung nützlich ist, umfasst Rezeptoren, die an zellulären Abbauwegen von Proteinen beteiligt sind (Hochstrasser, 1996, Cell 84:813-815; Hasselgren und Fischer, 1997, Ann. Surg. 225:307-316). Es ist gut bekannt, dass einmal synthetisierte intrazelluläre Proteine kontinuierlich zurück auf ihre Aminosäurenkomponenten abgebaut werden. In den letzten Jahren ist ein klareres Bild der Abbauwege und der daran beteiligten proteolytischen Maschinerie und ihrer biologischen Bedeutung aufgeklärt worden. Es ist nun bekannt, dass die meisten zellulären Proteine durch ein lösliches ATP-abhängiges System hydrolysiert werden, das sowohl im Nucleus als auch im Cytosol vorhanden ist (Ciechanover, 1994, Cell 79:13-21). Oft werden Proteinsubstrate zuerst für den Abbau durch kovalente Konjugation an mehrfache Moleküle eines kleinen Proteins, Ubiquitin, vorgemerkt. (Ciechanover, 1994, vorstehend). Dieser Prozess umfasst die Aktivierung von Ubiquitin durch die Bildung eines Thiol-Esters an seinem Carboxylterminus, der dann auf die ε-Aminogruppe auf einem Lysinrest auf dem Protein übertragen wird. Andere Ubiquitinmoleküle werden schrittweise mit dem ersten verbunden und bilden lange Ubiquitinketten auf dem Subrat. Das löst die rasche Hydrolyse des Proteinsubstrats durch einen sehr großen ATP-abhängigen proteolytischen Komplex aus, der als das 26S-Proteasom bezeichnet wird. Siehe zum Beispiel Goldberg, 1995, Science 268:522-523; Peters, 1994, Trends Biochem. Sci. 19:377-382; Rubin und Finley, 1995, Curr. Biol. 3:854-858; Goldberg und Rock, 1992, Nature 357:375-379; Goldberg et al., 1995, Current Biology 2:503-508; Rock et al., 1994, Cell 78:761-771; Fenteany et al., 1995, Science 268:726-730; Read et al., 1995, Immunity 2:493-506. Es wird angenommen, dass die physiologische Rolle des Proteasoms zumindest eine dreifache ist. Erstens hat das Proteasom eine wichtige Funktion im Abbau von defekten oder mutierten zellulären Proteinen. Bukau und Horwich, 1998, Cell 92:351-366. Zweitens scheint das Proteasom eine wesentliche Rolle beim Abbau von verschiedenen regulatorischen Proteinen zu spielen (Ciechanover, 1994, vorstehend). Die rasche Entfernung von solchen Proteinen ist notwendig, um das Zellwachstum und den Stoffwechsel zu kontrollieren. Zum Beispiel benötigt der ordnungsgemäße Ablauf von Zellen durch den mitotischen oder meiotischen Zyklus die programmierte Ubiquitinierung und Zerstörung der verschiedenen Cycline über CDC34 oder den Cyclosomenweg (King et al., 1996, Science 274:1652-1659; Glotzer, 1991, Nature 349:132-138; Scheffner et al., 1993, Cell 75:495-505; Cehn et al., 1996, Biochemistry 35:3227-3237). Drittens ist gezeigt worden, dass das Proteasom eine eindeutige Rolle in der Prozessierung von Antigenen für die Präsentation gegenüber T-Lymphocyten spielt.
Genauer gesagt sind bestimmte Bindungs- und Erkennungsproteine des Proteasomenwegs als Multi-Ligandenbindungsrezeptoren für den Zweck dieser Erfindung nützlich. Besonders nützliche Instrumente für diesen Ansatz sind etliche unterschiedliche Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen, die im Ubiquitin-Proteasomenweg für den Proteinabbau vorhanden sind. (Scheffner et al., 1993, Cell 75:495-505; Chen et al., 1995, Genes and Development 9:1586-1597; Hochwasser, 1996, Cell 84:813-815). Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) (Jentsch et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1089:127-139; Quin et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15549-15554), einschließlich, aber nicht beschränkt auf CDC34; und Ubiquitin-Proteinligasen (E3s) (Hershko und Ciechanover, 1992, Annu. Rev. Biochem. 61:761-807), einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Cyclosom und seine Bestandteile (King et al., 1996, Science 274:1652); G1/SKP1/Cullin/F-Box-Komplex (King et al., 1996, vorstehend); E3α (Hershko und Ciechanover, 1992, vorstehend); Hectdomänenproteine (Kumar et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:13548-13554; Plant et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32329-32336; Huibregtse et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3656) oder Ligandenbindungs-Komponenten davon ; Entfaltungsenzyme (Lupaset et al., 1993, Enz. Prot. 47:252-273); den 26S-Proteasomenkomplex (Rechsteiner et al., 1993, J. Biol Chem. 268:6065-6068; Peters et al., 1993, J. Mol. Biol. 234:932-937) oder Ligandenbindungs-Komoponenten davon; den 20S-Proteasomenkomplex (Peters et al., 1993, vorstehend) oder Ligandenbindungs-Komponenten davon; und die im ER befindlichen UBC6 und UBC7 (Ubiquitinierungs-Abbauenzyme) (Sommer und Jentsch, 1993, Nature 365:175-179; Jentsch, 1992, Annu. Rev. Genet. 26:179-207).
Andere MLRs umfassen Hitzeschockproteine (hsp), die an der Durchführung einer Zellantwort auf Stressbedingungen beteiligt sind, wie zum Beispiel Veränderungen in ihrer normalen Wachstumstemperatur, Störung des Stoffwechsels, verschiedene Schwermetalle, Mittel, die Sulfhydryle verändern, verschiedene Ionophoren und etliche andere Stoffwechselmittel.
Eine Vielzahl an unterschiedlichen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren kann daher für die Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Abhängig von der involvierten, spezifischen, experimentellen Frage kann ein bestimmtes Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System bevorzugt werden. Zum Beispiel wenn es erwünscht ist, ein Profil des durch eine spezifische Zelle oder Zellart exprimierten Proteinrepertoires zu identifizieren, wird üblicherweise ein Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System (oder eine Kombination von mehreren Systemen) eingesetzt werden, das eine große Ligandenanordnung einfängt, die so viele der exprimierten zellulären Proteine wie möglich reflektiert. Geeignete Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Systeme für diese Art von Aufgabe umfassen MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Rezeptoren (besonders bevorzugt eine Kombination von mehreren Allotypen), von welchen angenommen wird, dass sie Peptide präsentieren, die praktisch von jedem zellulären Protein stammen. (Kourilsky et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3400-3404; Claverie und Kourilsky, 1986, Ann. Inst. Pasteur Immunol. 137D(3):425-442; Kourilsky und Claverie, 1986, Ann. Inst. Pasteur Immunol. 137D(1):3-21). Wenn es andererseits erwünscht ist, zu bestimmen, ob eine bestimmte Ligandengruppe zum Beispiel nach der Behandlung mit einer bestimmten Substanz von Interesse differentiell exprimiert wird, z.B. anwesend oder abwesend in einer Zelle oder Gewebeart ist, kann ein Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System eingesetzt werden, das diese Ligandengruppe spezifisch erkennt. Wenn die Frage zum Beispiel umfasst, wie eine chemische Verbindung den Zellzyklus beeinflusst, kann das ausgewählte Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System das Cyclosom oder eine Komponente davon darstellen. Oder als ein anderes Beispiel, wenn es erwünscht ist, Liganden zu isolieren und/oder ein Ligandenprofil von sekretorischen monomeren Glycoproteinen zu erzeugen, die in einer bestimmten Zelle exprimiert werden, wäre Calnexin der Multi-Ligandenbindungsrezeptor der Wahl (Ou et al., 1993, Nature 364:771-776). Der Fachmann wird in der Lage sein, zu bestimmen, welche/s Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System oder Kombination von mehreren Rezeptorsystemen für eine bestimmte Anwendung am geeignetsten ist. Die folgende Beschreibung wird sich hauptsächlich auf Multi-Ligandenbindungsrezeptoren konzentrieren und sie näher ausführen, die Teile oder Helfer der MHC-Rezeptorsysteme sind, die für die Erzeugung von EPT-Profilen einer Zelle von Interesse besonders gut geeignet scheinen, da mit wenigen Ausnahmen von jedem einzelnen Protein einer bestimmten Zelle angenommen wird, dass es durch MHC-Rezeptoren erkannt wird. Es ist aber nicht vorgesehen, dass die Erfindung auf solches beschränkt sein soll; der Fachmann wird in der Lage sein, die beschriebenen Protokolle für die Anwendung der Erfindung mit jedem anderen geeigneten Multi-Ligandenbindungsrezeptor innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung zu adaptieren. Siehe vorstehend.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die verwendeten Multiplen-Ligandenbindungsrezeptoren MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Rezeptoren. In Menschen werden sie als HLA-Rezeptoren bezeichnet und in Mäusen werden sie als H-2-Rezeptoren bezeichnet; die homologen Systeme von anderen Arten können durch andere Terminologie bezeichnet werden (z.B. BoLA als das Rinder-MHC-Homolog, siehe Gaddum et al., 1996, Immunogenetics 43:238-239; DLA als das Homolog aus Hunden, siehe Wagner et al., Tissue Antigens 48:549-553). MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Rezeptoren sind besonders attraktiv für die Anwendung der Erfindung, da von ihnen angenommen wird, dass sie neben ihren mehreren Isotypen an stabile Peptidzwischenprodukte der meisten in einer bestimmten Zelle vorhandenen Proteine binden. Forscher im Gebiet der Immunolgie haben früher einige der an die Mitglieder der MHC-Familie von Rezeptoren gebundene Peptide isoliert und charakterisiert (Harris et al., 1993, The Journal of Immunology 151:5966-5974; Chicz et al., 1993, J. Exp. Med. 178:27-47; Chicz et al., J. Immunol. 159:4935-4942; Chicz et al., 1994, International Immunology 6:1639-1649; Chicz et al., 1992, Nature 358:764-768; Davenport et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6567-6571; Urban et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1543-1538). Menschliche Klasse-I- und Klasse-II-MHC-Moleküle umfassen mindestens neun Haupt-Unterarten, d.h. HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F und HLA-G für MHC-Klasse-I und HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP für MHC-Klasse-II (Urban et al., 1993, Chem. Immunol. 57:197-234; Trowsdale et al., 1991, Immunology Today 12:443). Multiple Allele sind für jeden Isotyp beschrieben worden, mit HLA-DR kategorisiert als der polymorphste (mindestens zwei DRα und mindestens 221 DRβ-Allele), gefolgt von HLA-DQ (mindestens 18 DQα1 und mindestens 31 DQβ1-Allele) und HLA-DP (mindestens 10 DPα1 und 77 DPβ1-Allele). Bodmer et al., 1996, Tissue Antigens 49:297. Klasse-I-Allele bestehen aus einem nicht-polymorphen β2-Mikroglobulin (leichte Kette), verbunden mit einer polymorphen schweren Kette. Von HLA-A ist beschrieben worden, dass es mindestens 83 Allotypen umfasst, von HLA-B ist beschrieben worden, dass es mindestens 186 Allotypen umfasst, und von HLA-C ist beschrieben worden, dass es mindestens 42 Allotypen umfasst. Bodmer et al., 1997, Tissue Antigens 49:297-321.
Von den unterschiedlichen Isotypen und Allelen wurde gezeigt, dass sie verschiedene, aber überlappende Peptidgruppen binden. Chicz et al., 1993, J. Exp. Med. 178:27-47. So gut wie jede Säugerzelle exprimiert MHC-Isotypen, die verschiedene Peptide präsentieren, welche den Proteingehalt der Zelle auf der Zelloberfläche widerspiegeln. Sowohl extrazelluläre „fremde" Antigene, die von der Zelle durch Phagocytose aufgenommen werden, als auch intrazelluläre „Eigen-" Proteine werden durch den Proteasomenweg abgebaut und aus dem Cytosol zum TAP1/TAP2-Transporter transportiert (Rock et al., 1994, Cell 78:761-771; Goldberg und Rock, 1992, Nature 357:375-379; Momburg et al., 1996, in MHC Molecules: Expression, Assembly and Function, herausgegeben von: Urban und Chicz, 1996, R.G. Landes Company, Austin, TX). Proteinabbau durch das Proteasom resultiert allgemein in Oligopeptiden von etwa sieben bis neun Aminosäuren in Länge, kann aber variieren von etwa drei bis etwa 30 Aminosäuren Länge (Baumeister et al., 1998, Cell 92:367-380). Im ER binden diese Proteine an neu synthetisierte MHC-Klasse-I-Rezeptoren, die zu der Plasmamembran transportiert werden und auf der Zelloberfläche präsentiert werden.
In dem MHC-Klasse-II-Weg der Antigenpräsentation wird ein Protein oder Organismus oder fremdes Objekt zuerst durch Endocytose oder Phagocytose aufgenommen und wird anschließend durch endosomale oder lysosomale Enzyme wie zum Beispiel Cathepsine in Peptide von unterschiedlicher Länge zerlegt. Endogene Proteine, die in Endosomen-ähnlichen Vesikeln festgestellt werden, werden auch in Peptidfragmente zerlegt. Tatsächlich stellen sie die Mehrzahl der Klasse-II-Liganden dar. Stabile Abbau-Zwischenprodukte (Peptide) werden auf MHC-Klasse-II-Rezeptoren geladen, durch den MHC-Klasse-II-Peptidladungs-Unterstützer HLA-DM vorangetrieben (Roche, 1995, Immunology 3:259-262; Germain et al., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11:403-450; Tulp et al., 1994, Nature 369:120-126). MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Rezeptoren scheinen daher ein universelles Instrument für die Katalogisierung, Profilerstellung und Charakterisierung der meisten und möglicherweise aller in einer bestimmten Zelle vorhandenen Proteine bereitzustellen.
Zum Zwecke der Klarheit bezieht sich die folgende Beschreibung hauptsächlich auf die Verwendung von MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Rezeptoren als Instrumente zur Anwendung der Erfindung. Jeder andere zelluläre Multi-Ligandenbindungsrezeptor, wie er hierin definiert und vorstehend beschrieben wird, ist jedoch vorgesehen, innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung zu liegen. Der Fachmann würde wissen, wie er die Erfindung mit den verschiedenen, unterschiedlichen Arten an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren als Instrumente ausüben muss.
Verwendung von zellulären Multi-Liganden-Bindungsrezeptoren als Instrumente zur Katalogisierung, Profilerstellung und Charakterisierung von Liganden.
Wie dem Fachmann klar sein wird, ist es für die Ausübung der vorliegenden Erfindung wesentlich, die Rezeptor/Ligandenkomplexe bis zu einem Reinheitsgrad, der reproduzierbare Ergebnisse ermöglicht, sowie in einer solchen Weise zu isolieren und zu reinigen, dass das gebundene Ligandenrepertoire während des Prozesses mit dem Rezeptor verbunden bleibt. Es ist ferner wichtig, das gebundene Ligandenrepertoire anschließend mit einem Grad an Spezifität und Effizienz zu extrahieren, der für die Durchführung der anschließenden Charakterisierungsschritte ausreichend ist. Üblicherweise wird der Extraktionsprozess ausreichend effizient sein, um jeden einzelnen Liganden bei Femtomol- bis Picomolmengen zu gewinnen. Etliche Ansätze können verwendet werden, um diese Ziele zu erreichen, und der Fachmann wird im Stande sein, die Verfahren und Instrumente, die für solche Ansätze geeignet sind, zu identifizieren und auszuüben und die stöchiometrische Ligandenmenge zu bestimmen, der aus der quantifizierten Rezeptorpräparation gereinigt wurde (Chicz et al., 1992, Nature 359:764-768; Chicz et al., 1993, J. Exp. Med. 178:27-47; Chicz et al., 1994, Int. Immunol. 6:1939-1949; Chicz und Urban, 1994, Immunology Today 15:155-160).
Im Folgenden wird ein Beispiel zur Ausübung der Erfindung mit MHC-Klasse-I-Rezeptoren beschrieben. Die Ausübung der vorliegenden Erfindung wird nicht als auf MHC-Rezeptoren beschränkt betrachtet, sondern umfasst die Verwendung irgendeines Multi-Ligandenbindungsrezeptors gemäß der vorstehend definierten Kriterien. Da von MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Rezeptoren jedoch bekannt ist, dass sie ein sehr komplexes Ligandenrepertoire binden, könnte die Durchführung der Erfindung mit MHC-Rezeptoren jedoch am herausforderndsten sein. Mit der hierin bereitgestellten Anleitung wird der Fachmann daher in der Lage sein, die Erfindung mit jedem anderen geeigneten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System durchzuführen. Natürlich werden Veränderungen des im Folgenden beschriebenen, sehr spezifischen Protokolls notwendig sein, wenn die Reinigung, Extraktion und Charakterisierungsprozesse auf andere Multi-Ligandenbindungsrezeptoren angewandt werden. Darüber hinaus müssen für manche Multi-Ligandenbindungsrezeptoren zusätzliche Überlegungen in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel weisen manche Multi-Ligandenbindungsrezeptoren wie zum Beispiel Chaperone, Chaperonine und hsps-ATPase-Bindungsdomänen auf und binden die Liganden nur in einer stabilen Weise, wenn ATP an die Domäne gebunden ist, während die Hydrolyse des ATPs die Freisetzung des Liganden fördert (Kassenbrock und Kelly, 1989, EMBO J. 8:1461-1467; Blond-Elguindi et al., 1993, Cell 75:717-728). In solchen Fällen wird die Reinigung des Rezeptors daher in einer solchen Weise durchgeführt werden, dass das ATP stabil an die ATPase-Bindungsdomäne gebunden bleibt und die Liganden anschließend freigesetzt werden können (z.B. durch Induktion der ATP-Hydrolyse). Siehe Beispiel 7.
Isolierung und Charakterisierung von EPTs unter Verwendung von MHC-Rezeptoren als Multi-Ligandenbindungsrezeptoren
Allgemeine Erwägungen. Das folgende Verfahren ist ein spezifisches Beispiel der Immunaffinitätsreinigung von Klasse-I-HLA-Molekülen, gefolgt von Säureextraktion des EPT-Repertoires aus den HLA-Molekülen, Umkehrphasen-HPLC einer Teilfraktion der EPTs und MALDI-TOF/MS-Analyse. Nachdem die Erfindung nicht auf die Verwendung von MHC-Rezeptoren beschränkt ist, ist sie ebenso nicht dazu gedacht, auf die spezifisch beschriebenen Protokolle beschränkt zu sein. Wie der Fachmann verstehen wird, liegen zahlreiche Veränderungen innerhalb des Fachwissens. Zum Beispiel könnten verschiedene andere Proteinreinigungs-, Peptidauftrennungs- und Peptid-Analyseverfahren für die spezifisch beschriebenen Verfahren eingetauscht werden.
Klasse-I-HLA-Rezeptoren werden auf fast allen Zellen mit Zellkern exprimiert und zeigen ihr Repertoire von nicht-kovalent gebundenen EPTs auf der Zelloberfläche (Chicz und Urban, 1994, Immunology Today 15:155-159). Zellwachstums, Erntebedingungen und relative Protein/Ligandenausbeute wird experimentell bestimmt, abhängig von der in Frage kommenden Zelllinie oder Gewebequelle. Der Fachmann wird im Stande sein, die Bedingungen für jede bestimmte, für die Verwendung gewünschte Zelllinie oder Gewebequelle zu bestimmen. Siehe z.B. Beispiel 1. In einem Fall, in dem die öffentlich erhältlichen menschlichen B-Lympholastoid Zelllinien LG-2 (Chicz et al., 1993, JEM 178:27-47), JY, (Chicz et al., 1993, JEM 178:27-47) und Priess (Chicz et al., 1993, JEM 178:27-47) verwendet worden sind, können zum Beispiel 3-22 Gramm von jeder Zellart in 10 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreit (DTT), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH-Wert 8,0 bei 4°C resuspendiert und in einem Homogenisiergerät lysiert werden. Die Zellkerne können durch Sedimentation bei 4.000 × g für 5 Minuten entfernt werden und die Pellets gewaschen und nochmals pelletiert werden, bis die Überstände klar sind. Alle Überstände können vereinigt werden und die Membranfraktion kann durch Sedimentation bei 175.000 × g für 40 Minuten geerntet werden. Die Pellets können dann in 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1-4% Nonidet P-40 (NP-40) resuspendiert werden. Das nicht solubilisierte Membranmaterial kann durch Sedimentation bei 175.000 × g für 2 Stunden entfernt werden und die NP-40-lösliche Überstandsfraktion für anschließende Rezeptor-Ligandenreinigung verwendet werden.
Historisch hat die präparative Immunaffinitätsreinigung von Membran-gebundenen Glycoproteinen Weichgel-Polysaccharide als die chromatographischen Medien verwendet (Cellulose, Agarose und quervernetzte Dextrane). Diese Träger haben jedoch die mechanische Stärke vermindert, wobei die Verwendung von hohen Durchflussraten ausgeschlossen wurde, und ihre durchschnittliche Partikelgröße hat den Effekt, die Auflösung zu vermindern und die Auftrennungszeit zu erhöhen. Modernisierung dieses Protokolls durch Einbau von in-Reihe stattfindender Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Auftrennung während des gesamten Reinigungsschemas verbessert die Proteinausbeute, vermindert die Zahl der Manipulationen und eliminiert, dass Rezeptor-Ligandenprozesse umfangreicher Dialyse ausgesetzt werden müssen. Darüber hinaus kann durch Automatisierung des Reinigungssystems die zur Reinigung der Protein/Ligandenkomplexe benötigte Zeit von etwa 7 bis 8 Tagen bis auf etwa 3 bis 4 Stunden pro HLA-Molekül verringert werden. Diese Zeitreduktion ist wichtig, da, obwohl Protein/Liganden-Komplexe relativ stabil sind, die Interaktion nicht kovalent ist und Peptide im Laufe der Zeit freigesetzt werden können. Außerdem kann diese Strategie bequem mit der Verwendung von anderen chromatographischen Trägern gekoppelt werden, einschließlich mikrokapillarer Umkehrphasen-Chromatographie (RRC) für die Auftrennung von extrahierten EPTs, gefolgt von Massen-Spektrometrieanalysen. Zum Beispiel kann für den Zweck der Erfindung die Protein/Ligandenreinigung basierend auf dem Immunaffinitäts-Chromatographieverfahren von Gorga et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:16087-16094 verändert werden, um dem erhöhten Gegendruck standzuhalten, der mit hohen, mechanisch erzeugten Durchflussraten einer mobile Phase aus den Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Instrumenten in Zusammenhang steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein System für die Isolierung und Charakterisierung der EPTs verwendet, das hierin als „Trident"-System bezeichnet wird. Das Trident-System ist ein automatisiertes, in-Reihe geschaltetes Protein/Peptidreinigungs- und Analysesystem. Dieses System kann in drei Teile aufgeteilt werden. Trident I umfasst die Reinigung von Protein/Ligandenkomplexen direkt aus der solubilisierten Membranpräparation eines zellulären Lysats. Trident II fokussiert auf die EPT-Extraktion und die Auftrennung von Komponenten. Schließlich erzielt Trident III sowohl EPT-Massenanalyse und Sequenzidentifizierung. Der Fachmann wird wissen, wie die Instrumentation von jeder Phase des Trident-Systems optimiert werden muss, um die Zeit und den Aufwand zu optimieren, die nötig sind, um aus gewebespezifisch exprimierten Proteinen stammende EPTs für irgendeinen bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor zu identifizieren.
Trident I: Immunreinigung von HLA-Klasse-I-Rezeptoren als Beispiele eines Multi-Ligandenbindungsrezeptors
Etliche wichtige Besonderheiten sind in Trident I eingeführt worden. Hochdruckpumpen mit Zweifachkolben mit verstellbarer Geschwindigkeit von 10 μl Schlagvolumen (10 μl/min bis 9,99 ml/min roten Bereich) sind eingesetzt worden, um einen dynamischen Bereich zu erzielen, der im Stande ist, sowohl Protein- als auch Peptidauftrennungen von hoher Auflösung zu erzeugen. Das ermöglicht Trident, alle Protein-Immunaffinitäts-Chromatographieverfahren (Durchflussraten reichen von 0,25-9,99 ml/Minuten) sowie auch Mikroporen- und Mikrokapillar-Umkehrphasenchromatographie (RPC)-Auftrennungen von Peptiden bei Durchflussraten zwischen 3 und 50 μl/Minuten in-Reihe mit andauerndem Durchfluss der mobilen Phase durchzuführen. Als Nächstes werden multiple Hochdruck-Umschaltungsventile mit 10 Anschlüssen genutzt, um geeignete Durchflusswege für automatisierte Säulenbeladung und eine serielle Elution von bis zu fünf einzelnen mAk-spezifischen Immunaffinitätssäulen zu ermöglichen. Diese Veränderungen befähigen eine einzelne HPLC-Einheit, automatisch bis zu fünf Allotyp-spezifische HLA-Moleküle aus einer einzelnen Lysatpräparation ohne Manipulation der Abflüsse oder nochmaliges Aufladen der gesammelten Fraktionen zu reinigen. Zwei Hochdruck-Umschaltungsventile mit 7 Anschlüssen können hinzugefügt werden, um die Anzahl der einzelnen Säulen zu erhöhen, die eluiert werden sollen.
Multimodale Proteinreinigung unter Verwendung von HPLC-Säulen wird durch Verbinden der chromatographischen Verfahren in Serie mit automatisierten Umschalteventilen erzielt, die den Protein/Liganden-enthaltenden Abfluss zu anschließenden Säulen in der Sequenz leiten. Jeder Säulenabfluss kann bei mehrfachen UV-Wellenlängen, Druck und pH-Wert überwacht werden. Perfusions-Sorptionsmittel mit großen Durchflussporen und großer Stärke (Polystyrol; 6000-8000 Å-Durchflussporen und 500-100 Å-Diffusionsporen, 50 μm), die mit einer hydrophilen stationären Phase beschichtet und quervernetzt sind, an welche Protein A kovalent gebunden ist (POROS A^TM; Perseptive Biosystems, Framingham, MA) können genutzt werden, um schnelle Durchflussraten zu ermöglichen (bis zu 20 ml/min). Der gewünschte HLA-spezifische mAk kann wie folgt an das POROS A^TM-Harz angelagert werden: Gereinigter mAk wird zuerst gegen 100 mM Boratpuffer, pH-Wert 8,2, dialysiert und dann bis >10 mg/ml konzentriert. POROS A^TM-Harz (PerSeptive Biosystems) wird für das Verbinden durch Waschen mit 10 Säulenvolumina von 100 mM Boratpuffer, pH-Wert 8,2, vorbereitet. Der Überstand wird entfernt und die mAk-Lösung zu dem Harz hinzugefügt und für 30-45 Minuten gemischt. Zehn Säulenvolumina von frisch erzeugtem Quervernetzer (40 mM Dimethylpimelimidat/200 mM Triethanolamin, pH-Wert 8,2) werden dann zu dem Harz hinzugefügt und die Umsetzung wird bei Raumtemperatur für 35-45 Minuten ermöglicht. Danach wird das Harz sedimentiert und der Überstand entfernt. Um allen verbleibenden Quervernetzer abzufangen, wird das Harz als Nächstes in 10 Säulenvolumina von 20 mM Ethanolamin, pH-Wert 8,2, für 10 Minuten (dieser Schritt wird zweimal wiederholt) suspendiert. Zu diesem Zeitpunkt kann das Harz in die Säulenapparatur gepackt werden und aller nicht quervernetzter mAk durch Waschen bei niedrigem pH-Wert entfernt werden. Sobald sie charakterisiert wurden, sind die Immunaffinitätssäulen verwendbar.
Nachdem die solubilisierte Membranpräparation auf die Säulen geladen wurde, werden die Säulen unter Verwendung von 50 Säulenvolumina von 20 mM MOPS/140 mM NaCl/0,1 % DOC/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 8,0 ausgiebig gewaschen, gefolgt von 100 Säulenvolumina von 10 mM Tris/0,1% DOC/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 8,0. Als Nächstes wird der Protein-Ligandenkomplex aus dem Immunaffinitätsträger unter Verwendung von 3,5 Säulenvolumina von 50 mM Carbonat/0,1% DOC/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 11,5 eluiert.
Die Perfusions-Sorptionsmittel weisen idealerweise große Durchflussporen auf, die Durchflussraten von hoher Geschwindigkeit ermöglichen und auch die Reinigungs/Regenerierung der Säulen nach der Ablagerung von Protein/Lipid erleichtern. Die Verwendung dieses Systems ermöglicht reproduzierbare chromatographische Analysen und die Reinigung von Protein/Liganden-Komplexen aus einer spezifischen Immunaffinitätssäule in etwa drei bis vier Stunden.
In Trident I wird die vorstehend beschriebene solubilisierte Membranpräparation durch Vorreinigungssäulen gepumpt (chromatographische Matrix und normale Maus-Serummatrix), bevor der Protein/Liganden-enthaltende Abfluss unter Verwendung von 50 Säulenvolumina an 10 mM Tris/0,1 % NP-40/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 7,8 zu einer einzelnen (oder einer Serie von) spezifischen Immunaffinitätssäule geleitet wird. Die Immunaffinitätssäulen werden dann ausgiebig unter Verwendung von 50 Säulenvolumina von 20 mM MOPS/140 mM NaCl/0,1% DOC/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 8,0 gewaschen, gefolgt von 100 Säulenvolumina von 10 mM Tris/0,1% DOC/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 8,0. Als Nächstes wird der Protein/Ligandenkomplex unter Verwendung von 3,5 Säulenvolumina von 50 mM Carbonat/0,1% DOC/0,05% NaN₃ bei pH-Wert 11,5 aus dem Immunaffinitätsträger eluiert.
Die Ausbeute für das gesamte Klasse-I-Protein aus einer bestimmten Zelllinie wird variieren. Die durchschnittliche Anzahl an HLA-Klasse-I-Molekülen, die auf der Oberfläche einer bestimmten Zelle exprimiert wird, variiert von 2 × 10⁴ bis 5 × 10⁴ für nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen, bis 7 × 10⁴ bis 7 × 10⁵ für professionelle antigenpräsentierende Zellen (z.B. B-Zellen und Makrophagen). Tabelle I (nachstehend) stellt experimentell bestimmte Ausbeuten bereit, die unter Verwendung des Trident-Systems erzielt wurden, sowie jene, die unter Verwendung von herkömmlicher Chromatographie für mehrere Zelllinien erzielt wurden (siehe Referenzquellen). TABELLE I

¹ wie hierin offenbart
² Tsomides et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11276
³ Harris et al., 1994, Tissue Antigen. 44:65
⁴ Gorga et al., 1986, J. Biol. Chem. 262:16087-1694
⁵ Urban et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1534-1538

Die Ausbeuten an EPTs werden nicht nur mit der Zahl der pro Zelle exprimierten Multi-Ligandenbindungsrezeptoren variieren, sondern auch mit der Rate der Proteinumsetzung in einer/m bestimmten Zelle, Gewebe oder Organtyp. Wenn die Menge an Proteinumsetzung hoch ist und eine Zelle eine große Menge an Proteinsynthese aufweist, kann man erwarten, dass die Zahl der EPTs höher ist. Im Falle von HLAs hat das normale Repertoire an mit HLA assoziierten Peptiden eine Besetzungshöhe von 0,1–1% für jedes bestimmte Peptid, basierend auf einer 1:1-Stöchiometrie von EPT und HLA-Rezeptor. Die Ausbeute an EPTs aus HLA-Rezeptoren wird daher ein experimentell bestimmter Wert sein, basierend auf der Expressionsmenge des Volllängen-EPT-Quellenproteins und der Anzahl der aus der Zielzelllinie erhaltenen HLA-Rezeptoren.
Trident II: Isolierung und Auftrennung des EPT-Repertoire
Die Isolierung und Auftrennung des EPT-Repertoires der Zelle wird in der Trident-Phase II erreicht. Nach basischer Elution der HLA/ET-Komplexe aus den Immunaffinitätsträgern wird das HLA-gebundene EPT-Repertoir aus den Komplexen durch Festphasenextraktion durch eine Reihe von multi-modalen Chromatographie-Sorptionsmitteln extrahiert. Ein Anionen-Austausch-Chromatographie (AEC)-Träger (POROS 20 HQ/M^TM (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), 6000-8000 Å-Durchflussporen und 500-1000 Å-Diffusionsporen, 15-25 μm) wird als das erste Sorptionsmittel im Trident II-Festphasen-Extraktionsprotokoll angewandt. Die AEC-Säule wirkt, indem sie den intakten Protein/Ligandenkomplex einfängt, während er aus der Immunaffinitätssäule eluiert wird. Als Nächstes wird die AEC-Säule gewaschen, zum Beispiel mit 20 Säulenvolumina an 50 mM Carbonat bei pH-Wert 11,5, um die Detergenskomponente vom Abfluss der immunaffinitätsmobilen Phase zu entfernen. Ein Säulenvolumen von 10% TFA/H₂O und eine Temperaturerhöhung auf 70°C wird als nächstes an der AEC-Säule angewandt, um den adsorbierten Protein/Ligandenkomplex zu protonieren und das gebundene EPT-Repertoire zu eluieren. Aufgrund der relativ hohen sauren Ladungsverteilung auf der Oberfläche des HLA-Proteins, beeinflussen die sauren Bedingungen die elektrostatischen Interaktionen zwischen Protein und der geladenen AEC-Säule nicht. Es wird daher nur den Peptidliganden erlaubt, durch die Säule zu wanden, während die jetzt denaturierten Proteine am AEC-Träger adsorbiert bleiben. Der Abfluss aus der AEC-Säule wird in ein polymeres Polystyrolröhrchen geleitet, das mit einer Divinylbenzol-Umkehrphasen-Chromatographie (RPC)-Säule verbunden ist (POROS R2/H^TM, 6000-8000 Å-Durchflussporen und 500-1000 Å-Diffusionsporen, 8-10 μm), die als eine Peptidfängersäule (PCC) agiert. Sobald das EPT-Repertoire auf dem PCC-Träger adsorbiert ist, wird z.B. mit einer Spülung mit 20 Säulenvolumina unter Verwendung von 0,1 %TFA/1 % Acetonitril/H₂O ein mobiler Phasenaustausch erzielt. EPT-Isolierung ist bei diesem Stadium abgeschlossen. Eine zweite Umkehrphasenauftrennung wird als nächstes genutzt, um das isolierte EPT-Repertoire zu fraktionieren. Die einzelnen Peptidliganden werden unter Verwendung einer zweiten RPC-Säule, eines auf Kieselsäure basierenden C₁₈-Trägers (300 Å, 5 μm; Vydac, Hesperia, California), basierend auf der relativen Hydrophobie aufgetrennt. Das EPT-Repertoire wird aus dem PCC-Träger unter Verwendung eines nicht-linearen Gradienten von Puffer A/Puffer B bei einer konstanten Durchflussrate von 5-50 μl/min, abhängig von den Ausmaßen der RPC-Säule, eluiert: 0-63 Minuten 5%-33% Puffer B; 63-95 Minuten 33%-60% Puffer B; 95-105 Minuten 60%-80% Puffer B; wobei Puffer A 0,06% TFA/5% Acetonitril/H₂O und Puffer B 0,055% TFA/5% Acetonitril/H₂O darstellen. Die chromatographische Analyse wird durch UV-Absorption bei mehrfachen Wellenlängen (210, 254, 277, 292 nm) überwacht, um Peptidbindungen sowie EPTs zu identifizieren, die konjugierte delokalisierte π-Elektronen enthalten (aromatische Aminosäuren). Die hydrophoberen einzelnen Liganden eluieren später im Gradienten mit zunehmenden Prozentsätzen an organischem Modifikator. Der Durchflussstrom ist 50:1-Mikrofraktions-MALDI-TOF/MS-Proben-Plattensammler angeschlossen, der geteilt ist, um gleichzeitige Probensammlung und MALDI-TOF/MS-Probenerzeugung zu ermöglichen. Auf diese Weise werden 2% der gesammelten Probe sofort für Massenanalyse präpariert (Trident III), während die verbleibenden 98% jeder aufgetrennten EPT-Fraktion gesammelt und für spätere Durchmusterung gelagert werden. Der Output von Trident II ist eine Sammlung von Fraktionen, wobei jede multiple EPTs enthält, wobei die Fraktionsauftrennung auf der relativen Hydrophobie, einer Funktion von Aminosäurezusammensetzung und Sequenz, basiert.
Als ein alternativer Ansatz zu der vorstehend beschriebenen Festphasenextraktion kann eine saure Extraktion nach dem Batch-Verfahren verwendet werden, um EPTs aus gereinigten HLA-Molekülen zu isolieren. In diesem Verfahren wird bei der Lösung, welche die gereinigten, in Detergens löslichen Protein/Ligandenkomplexe enthält, zuerst der Puffer ausgetauscht und in eine mobile Phase mit geringerem Volumen (etwa 1/15 bis 1/30 des ursprünglichen Volumens) und mit neutralerem pH-Wert konzentriert, z.B. 20 mM MOPS, 140 mM NaCl, 0,1% DOC, bei pH-Wert 8,0. (Z.B. wo das gesammelte Probenvolumen 10-15 ml darstellt, wird es zuerst auf 0,5-1 ml konzentriert und dann auf 50-100 μl mit einer Ultra-Filtrationsvorrichtung). Nach der Verdünnung auf 1 ml mit 10% Essigsäure wird die die Komplexe enthaltende Lösung für 15 Minuten auf 70°C erhitzt, um dadurch die EPTs aus den HLA-Molekülen zu dissoziieren. Das EPT-Repertoire wird dann unter Verwendung von Ultrafiltrationsvorrichtungen mit einem 3-10 kDa Molekulargewichtsausschluß von den nun leeren schweren und leichten HLA-Ketten durch Größenausschluß (Unterschiede im Stokesradius) getrennt. Die Lösung, welche das Gemisch der EPTs enthält, kann dann, wie vorstehend beschrieben, zur Fraktionierung auf die RPC-Säule geladen werden.
Trident II: Massen- und Sequenzanalyse der isolierten EPTs
Die Endphase von Trident spricht speziell die Massen- und Sequenzanalyse der isolierten EPT-Gemische an. Der entscheidenste Schritt in der Analyse von Proteinen und Peptiden durch Massen-Spektrometrie ist ein akzeptables Verfahren, um geladene molekulare Arten zu erzeugen (Ionisierung). Fortschritte in Proben-Ionisierungsverfahren haben die Massen-Spektrometrie von einer Randtechnik in eine zentrale Komponente der Protein- und Peptidcharakterisierung vorangetrieben. Insbesondere neue Entwicklungen in der Elektronenspray-Ionisierung (ESI-MS) und der Matrix-unterstützten Laser-Desorptionsionisierungs-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) stellen jetzt konsistente und Routine Massen- und Sequenzanalysen dar. Fortschritte in MALDI-TOF/MS haben diese Technologie zu einem besonders attraktiven analytischen Instrument für die Massen- und Sequenzanalyse von komplexen Gemischen von Peptiden mit geringer Häufigkeit gemacht. Vier herausragende Merkmale von MALDI-TOF/MS machen diesen Ansatz für die Analyse von EPTs überlegen. Erstens tendieren MALDI-TOF/MS-Spektren dazu, weniger kompliziert als jene zu sein, die unter Verwendung von Elektronenspray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI/MS) gesammelt werden, da der Ionisierungsprozess eher die Bildung von einzelnen (1+) Ionen fördert als von mehrfach geladenen Ionen (1+, 2+, 3+, usw.). Das ist eine wichtige Erwägung, wenn Spektren von Proben mit mehrfachen Komponenten verglichen werden. Zweitens verwendet diese Technik minimale Mengen an Probe: Sub-Femtomol-Mengen für Massenanalysen und Sub-Picomol-Mengen für Sequenzanalysen. Drittens sind durch Verwendung der meisten alternativen Massen-Spektrometrietechniken die hohe Massengenauigkeit und überlegene Massenauflösung, die durch Verwendung dieser Technik erreicht werden, nicht erzielbar. Schließlich kann die Primärsequenzinformation unter Verwendung von zwei komplementären Arten der Tochterionenfragmentierung erzeugt werden.
Überlegene Massengenauigkeits- und Auflösungsdaten sind entscheidend, um Fraktionen ordentlich für die EPT-Analyse zu durchmustern. Die Fraktionen werden zuerst unter Verwendung des linearen Modus der MALDI-TOF/MS-Analyse mit niedriger Auflösung auf Komplexität und relative Häufigkeit durchmustert. Die gesammelten Spektren stellen eine genaue Schätzung der Zahl der einzelnen vorhandenen Peptide und der relativen Ionisierung jedes einzelnen bereit. Da jede Fraktion aus der primären RPC-Auftrennung so viel wie 50-150 einzelne EPTs enthalten kann, ist derzeit hohe Auflösung kombiniert mit hoher Massengenauigkeit das verlässlichste Verfahren, um die Fraktionen für die vollständige Peptidcharakterisierung zu durchmustern (Vestal et al., 1995, Rapid Communication in Mass Spectormetry 9:1044-1050). Zum Beispiel sind Techniken mit geringerer Auflösungsstärke (beim momentanen Stand der Technik), d.h. Ionenfallen oder Dreifach-Vierfach-Massenspektrometer, die mit Elektronenspray-Ionisierungsquellen ausgestattet sind und eine normale Auflösung von 1.000-2.000 im m/z = 1.000-2.000-Bereich bei Femtomol-Sensitivität im vollen Durchmusterungsmodus aufweisen, weniger verlässlich für die Charakterisierung von Peptiden mit Massenunterschieden von 1-3 Dalton oder weniger. Die Schwierigkeit besteht hauptsächlich aufgrund der Unfähigkeit dieser alternativen Techniken, die Isotopenverteilung eines einzelnen Peptids ordentlich aufzulösen. Natürlich können solche Techniken im Laufe der technischen Entwicklung verbessert werden und als Folge besser für die Zwecke der Erfindung geeignet sein.
MALDI-TOF/MS-Instrumente mit verlängerten Flugwegen und verzögerten Extraktions-Ionsierungsfeldern kann überlegene Massengenauigkeit und Auflösung erzielen. Die herausragende Leistung dieser Geräteausstattung ermöglicht die verlässliche Sammlung eines Multi-Komponentenspektrums, während es die mathematische Subtraktion eines Spektrums von einem anderen erlaubt. Darüber hinaus erlaubt die hohe Auflösung und Massengenauigkeit eine genauere Bestimmung der Gesamtzahl der einzelnen Massen in einer bestimmten Probenfraktion. Gekoppelt mit den hoch reproduzierbaren chromatographischen Auftrennungen, die mit den Trident-Phasen I und II erzielt werden, wird die EPT-Analyse von Proben, die aus unterschiedlichen Quellen von Interesse isoliert werden, z.B. aus mit Krankheit und nicht mit Krankheit in Verbindung stehenden Geweben, unterschiedlichen Organ- oder Gewebetypen, unterschiedlichen Entwicklungs- oder Stoffwechselstadien einer Zelle, eines Gewebes oder Organs usw., unter Verwendung eines Subtraktions-Algorithmus zur Identifizierung von neuen Liganden möglich, die entweder von einzigartigen oder sogar mutierten Quellenproteinen, die in dem mit der Krankheit verbundenen Gewebe exprimiert werden, stammten. Die einzelnen EPT-Massen aus der normalen Zelle können von dem EPT-Repertoire der mit der Erkrankung assoziierten Zelle subtrahiert werden und nur jene EPTs zurücklassen, die entweder mit neuen oder mutierten Proteinen assoziiert sind. Sobald sie als neue EPT-Ziele identifiziert wurden, werden diese EPTs dann zur vollständigen Identifizierung sequenziert, siehe nachstehend.
Ein anderer Vorteil der Verwendung von MALDI-TOF/MS (beim derzeitigen Stand der Technik) betrifft seine Fähigkeit, strukturelle Information für Sequenzbestimmung von Biomolekülen zu erzeugen. Fragment-Ionen können in MALDI-TOF/MS durch ein Phänomen erzeugt werden, das als Post-Source-Decay (PSD) beschrieben wird. Kurz gesagt durchlaufen die Proben-Analytionen „verzögerte" Fragmentierungs-/Neutralisierungsreaktionen während des Flugs, die aus mehrfachen Kollisionen mit Matrixmolekülen während der Gasphasen-Dampfausdehnung und Ionenbeschleunigung stammen. MALDI-TOF-MS ist in der Bildung von vorher angeregten Vorläuferionen, die sich mit einer ziemlich hohen kinetischen Energie über eine weite Distanz bewegen, einzigartig, wobei sie unimolekularen Zerfall mit oder ohne weitere Kollisionsaktivierung durchlaufen. Unter Verwendung von PSD-Analyse kann eine vollständige Sequenzinformation aus den Tochterionen-Fragmentierungsmustern erzeugt werden. Die Fragmentierungsmuster unterscheiden sich von jenen, die unter Verwendung von Hochenergie-Vier-Sektor-Instrumenten oder anderen Tandem-Massenspektrometern wie zum Beispiel Elektrospray-Dreifach-Vierfach-Instrumenten beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Sensitivität von MALDI-TOF/MS mindestens zwei Größenordnungen besser als die zuvor erwähnten Massenspektrometrieansätze aufgrund der hohen Gesamtausbeute von Fragmentionen und der hohen Ionentransmission, die den TOF-Instrumenten inhärent ist. Um jedoch die PSD-Analyse sogar noch weiter zu verbessern, kann eine Kollisionszelle in das System eingeführt werden. Mit einer Kollisionszelle etabliert können durch hohe Energiekollision induzierte Dissoziations (CID)-spektren gesammelt werden, die, verglichen mit den PSD-Spektren, komplementäre Fragmentierungsmuster erzeugen. Die vereinigten Datengruppen erzeugen zusätzliche strukturelle Informationen für die Sequenzbestimmung von unbekannten Peptiden.
Eine komplementäre Technik zu MALDI-TOF/MS für die Sequenzanalyse von niedrigen Femtomolmengen an Peptiden ist die Ionenfallen-Massenspektrometrie. Erstens ist der Massenbereich von Ionenfallen-Instrumenten vor kurzem ausgeweitet worden, um lineare Massenkalibrierung und Ionenfragmentierung für Peptide zu umfassen. Mit diesen etablierten Vorteilen sind nun mehrere, im Handel erhältliche Ionenfallen-Instrumente erhältlich. Kurz gesagt ist die Stärke der Ionenfallen-Technologie die Fähigkeit, ein bestimmtes Ion zu isolieren, während alle nicht ausgewählten Ionen aus dem Instrument ausgestoßen werden, daher der Name Ionenfalle. Das wird durch die Verwendung von nicht-linearen multiplen Feldern, fortgeschrittener Resonanz-Frequenzelektronik und optimierter Ring- und Endkappenbauart in der Falle erreicht, welche die Ionenausstoß-Geschwindigkeit erhöhen und die nützlichen Massenbereiche des Instruments ausdrehen. Das Endergebnis ist die Fähigkeit, mehrfache Fragmentierungsexperimente bei einem bestimmten Ion (bekannt als MS⁽ⁿ⁾ durchzuführen, was die Menge der aus der Peptidfragmentierung gesammelten Information erweitert. Diese Technologie ermöglicht auch den fortlaufenden Durchfluss von der Probe in die Falle, wobei nur das Zielion zu einem Grad zurückbehalten wird, der für die effiziente Fragmentierung des Zielliganden nötig ist. Auf diese Weise kann eine Probe mit geringer Häufigkeit innerhalb des Instruments konzentriert werden, um das Sequenzexperiment durchzuführen. Die Sequenzierung wird durch Durchführen eines ZoomScans oder eines limitierten Massenbereich-Scans bei einer bekannten Masse durchgeführt. In dieser Einstellung kann das Instrument bei hoher Sensitivität und Auflösung arbeiten, aber für den Preis, dass nur ein limitierter Massenbereich durchmustert werden kann. Die verringerte Sensitivität und Auflösung umfasst den Nachweis der meisten Ionen in komplexen Gemischen. Aus diesem Grund kann die Kombination von MALDI-TOF/MS mit Ionenfallen-MS zu schnellerer Sequenzidentifizierung von EPTs führen.
Massenspektren, die unter Verwendung von Reflektor-MALDI-TOF/MS-Analyse gesammelt werden, haben normalerweise eine Massengenauigkeit nahe 0,01 % unter Verwendung von externer Kalibrierung und können eine Massengenauigkeit innerhalb von 10-50 ppm unter Verwendung von interner Kalibrierung erreichen. Das ist ausreichend für die Verwendung in Massen-Abgleich-Protokollen, wo theoretische Massenwerte von Peptiden mit einer linearen Sequenz aus einem Zielprotein verglichen werden. Neue Massenwerte, die durch den subtraktiven Algorithmus erhalten werden, werden verwendet, um alle möglichen Massenabgleiche innerhalb der Aminosäuresequenz des Zielproteins herauszufinden. Post-translationelle Modifikationen können während dieser Analysen in Erwägung gezogen werden. Diese voraussichtlichen Peptidmassen, die mögliche Stränge innerhalb des Zielproteins abgleichen (innerhalb einer Toleranz von 0,01 % unter Verwendung von monoisotopischen Massenwerten) werden weiter analysiert. Massenabgleich ist nützlich, da er, im Gegensatz zur Bestimmung von vollständig unbekannter Sequenz, die darauf folgende Analyse auf Sequenzverifizierung konzentriert. Nachdem das vorstehend beschriebene Massenabgleichprotokoll die lineare Peptidsequenz mit dem experimentell berichteten Massenwert abgleicht, können die Fragmentierungsmuster, einschließlich aller Ionentypen (b-, y-, a-, d-, w-Reihen), Immonium-Reihen und desamidierter und dehydratisierter Formen, mathematisch vorhergesagt werden. Peptidmassen, die durch Massenabgleich ausgewählt wurden, können daher sequenziert werden und die experimentell bestimmen PSD- und CID-Spektren (gesammelt entweder durch MALDI-TOF/MS oder Ionenfallen-MS) werden mit den theoretisch vorhergesagten Spektren verglichen, um den Massenabgleich durch Sequenzanalyse zu bestätigen. Sobald ein Kandidatenpeptid ordentlich identifiziert wurde, kann man als eine Kontrolle synthetische Peptidanaloge erzeugen und HPLC-Rückhalteanalysen, Massenanalysen und am wichtigsten PSD- und CID-Fragmentierungsmuster erzeugen, um sie mit jenen zu vergleichen, die ursprünglich zur Bestimmung der Sequenz verwendet wurden, um die unbekannte Probenbestimmung zu bestätigen.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren können die EPT-Sequenzen sowohl aus neuen Proteinen bestimmt werden als auch aus Proteinen, die in einer öffentlichen Datenbank schon durch Sequenzdaten repräsentiert sind. Die Datenprofile, die für jede Probe zusammengetragen werden, sind in einem multi dimensionalen Raum dargestellt. Üblicherweise hat jedes Peptid ein Profil, das mindestens zweidimensional ist, mit einer ersten dimensionalen Koordinate, die seine Masse darstellt, und einer zweiten Koordinate, welche die Elutionszeit darstellt, d.h. Fraktionierung. Abhängig von den ausgewählten Auftrennungsverfahren kann die Position eines Liganden auf der Fraktionierungskoordinate seiner relativen Hydrophobie (d.h. % an Elutionspuffer, z.B. für die Elution benötigtes Acetonitril oder Isopropanol), seiner Ladung (gemessen durch Ionenaustausch, d.h. relative, für die Elution benötigte Salzkonzentration, z.B. NaCl; z.B. AEC trennt gemäß negativer Ladung auf und CEC trennt gemäß positiver Ladung auf), seiner Hydrophilie (gemessen durch Normalphasen-Chromatographie), seiner Hydrophobie und H₂O-Hydration (gemessen durch hydrophobe Chromatographie), seine Affinität für Metallchelatliganden wie zum Beispiel Cu²⁺, Ni⁺² und Fe⁺³ (gemessen durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie oder IMAC) oder seiner Mobilität entsprechen (gemessen durch Kapillar-Elektrophorese, d.h. die Zeit, die ein Peptid benötigt, um aus einer Kapillare, basierend auf elektrischem Feld, herauszukommen). Siehe Alpert, 1988, J. of Chromatography 444:269-274; Crimmins et al., 1988, J. of Chromatography 443:63-71; Dizdaroglu, 1982, J. of Chromatography 237:417-428; Nakawaga et al., 1988, Analytical Biochemistry 168:75-81; Alpert, 1990, J. of Chromatography 499:177-196; Tomlinson et al., 1997, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8:15-24; Tomlinson et al., 1996, J. of Chromatography 744:273-278; Colovai et al., 1994, Tissue Antigens 44:65-72; und Tsomides et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11276-11280. Jeder Ligand kann weiter durch eine dritte Koordinate charakterisiert werden, die seine Ionisationsintensität darstellt (entsprechend seiner individuellen Aminosäuresequenz im Falle eines EPT-Liganden).
In anderen Ausführungsformen kann der Ligand in noch weiteren Dimensionen charakterisiert werden, z.B. durch Bestimmen von mehr als einem Auftrennungsparameter des Liganden (oder Pools von Liganden). Zum Beispiel kann eine Koordinate die Mobilität des Liganden darstellen, wie sie durch kapillare Elektrophorese bestimmt wird, und eine andere Koordinate kann die Hydrophobie eines Liganden darstellen, wie sie zum Beispiel durch Umkehr-HPLC bestimmt wird. Eine Koordinate kann hinzugefügt werden oder eine der vorstehenden ersetzen, welche die Ladung des Liganden darstellt, wie bestimmt zum Beispiel durch Ionenaustausch-Chromatographie (z.B. AEC gemäß negativer Ladung und CEC gemäß positiver Ladung). Eine andere Koordinate kann hinzugefügt werden oder irgendeine der vorstehenden ersetzen, welche die Hydrophilie des Liganden darstellt, wie zum Beispiel bestimmt durch Normalphase-Chromatographie. Eine andere Koordinate kann hinzugefügt werden oder irgendeine der vorstehenden ersetzten, welche Hydrophobie eines Liganden und H₂O-Hydration darstellt, wie zum Beispiel bestimmt durch hydrophobe Chromatographie. Noch eine andere Koordinate kann hinzugefügt werden oder kann irgendeine der vorstehenden ersetzen, welche Modifikationen eines Liganden darstellt, wie zum Beispiel Acetylierung oder Gehalt an schwerem H₂O. Der Fachmann wird in der Lage sein, alle anderen Parameter zu bestimmen, die hinzugefügt oder durch irgendwelche der vorstehend ersetzt werden können, um das Profil eines Liganden oder einer Pluralität an Liganden zu charakterisieren.
Die Sensitivität der auf Massen-Spekrometer basierenden Analyse von EPTs ist von den einzelnen Proben abhängig (im Bezug auf Ionisierung), fällt aber derzeit in den Bereich von etwa 10^–16 bis etwa 10^–15 Mol für einfache Massenanalyse und von etwa 10^–15 bis etwa 50 × 10^–15 Mol für Sequenzidentifizierung. Wie dem Fachmann daher klar sein wird, muss ausreichend Probe für diese Art der Analyse vorhanden sein, um eine aussagekräftige Information bereitzustellen.
Amplifizierung der Zahl an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren, die durch die Zelle von Interesse exprimiert werden
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, Maßnahmen zu ergreifen, welche die Zahl der Multi-Ligandenbindungsrezeptoren vor ihrer Isolierung erhöhen. Amplifikationsprotokolle umfassen, sind aber nicht limitiert auf (a) Konstruktion von rekombinanten löslichen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren in die Zelllinie von Interesse; (b) einen Zellfusionsansatz zur Immortalisierung von primären Zellen, indem sie mit immortalisierten Zelllinien fusioniert werden, z.B. primäre Zellen, die eine bestimmte Gruppe an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren exprimieren, werden mit Tumorzellen fusionert, die manipuliert wurden, um lösliche Multi-Ligandenbindungsrezeptoren zu exprimieren; (c) Einführen von immortalisierten Vektoren in die Zelle von Interesse; (d) Versorgung der Zellen mit Substanzen, welche die Expression eines bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptors erhöhen; oder (e) Züchten der Zellen in athymischen oder SCID-Mäusen (z.B. im Falle von Tumorzellen oder anderen primären Zellen, die nicht in vitro wachsen).
Betreffend (a), rekombinante Vektoren, die entworfen werden, um die Expression von einem oder mehreren Multi-Ligandenbindungsrezeptoren anzutreiben, können durch Verfahren erzeugt werden, die allgemein im Fachgebiet bekannt sind. Kurz gesagt wird DNA-Clonierung verwendet, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der die Codierungsequenz eines bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptors und entsprechende transkriptionelle-/translationelle Kontrollelemente aufweist. Diese Verfahren umfassen rekombinante in vitro-Techniken, synthetische Techniken und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination. Siehe zum Beispiel die in Sambrook et al., vorstehend; und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Intersience, N.Y. (derzeitige Ausgabe) beschriebenen Techniken. Der Vektor kann ein Virus oder ein Plasmid sein.
In Fällen, wo sich die Zellen von Interesse in Kultur vermehren können, wie es z.B. für Nieren-, Leber-, Lunge-, Thymus-, Dünndarm-, Dickdarm-, Nervenzellen, mesenchymale Zellen, Stammzellen usw., der Fall ist, kann die rekombinante DNA in vitro in die Zellen eingeführt werden. Zahlreiche Techniken sind im Fachgebiet bekannt, um rekombinante DNA in vitro d.h. in gezüchtete Zellen, stabil oder transient einzuführen und zu exprimieren. Siehe Sambrook et al., 1989, vorstehend; Ausubel et al., vorstehend. In Fällen, wo die Zellen von Interesse nicht in Kultur gezüchtet werden können, müssen Verfahren und Instrumente ausgewählt werden, welche die Einführung der rekombinanten DNA ermöglichen. Zum Beispiel in Säugerzellen können etliche auf Viren basierende Expressionssysteme genutzt werden, z.B. verpackt in intakte Viruspartikel. In Fällen, wo ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, kann die den Multi-Ligandenbindungsrezeptor codierende Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z.B. an den späten Promotor oder die Tripartit-Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirusgenom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination inseriert werden. Die Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, das lebensfähig und im Stande ist, das den Rezeptor codierende Gen im infizierten Wirt zu exprimieren. Siehe zum Beispiel Logan und Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659. Alternativ kann der Vaccinia-7,5 K-Promotor verwendet werden. Siehe zum Beispiel Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931. Andere geeignete virale Systeme umfassen auf SV-40-basierende virale Systeme, auf Pockenvirus-basierende virale Systeme auf EBV basierende virale Systeme, lentivirale Systeme, auf HSV-basierende virale Systeme, und retrovirale Systeme, sind aber nicht auf sie beschränkt. Siehe z.B. Kriegler, M., Vectors, in: Gene Transfer and Expression, Hrg. Kriegler, M. WH Freeman und Company, NY 1990.
Geeignete Promotorsysteme für die Expression der Multi-Ligandenbindungsrezeptoren umfassen sowohl konstitutive Promotoren, virale Promotoren wie zum Beispiel CMV, SV40, T7, Adenovirus als auch induzierbare Promotoren wie zum Beispiel das tet-System, das auf Glucocorticoid reagierende Element, den Metallothioneinpromotor, Interferon- oder Prostaglandin-Rezeptorelemente. Geeignete Promotorsysteme, sowohl für in vitro- als auch für in vivo-Expression der Multi-Ligandenbindungsrezeptoren in Zellen von Interesse, können in Kriegler, M., Vectors, in: Gene Transfer and Expression, Hrg. Kriegler, M. WH Freeman und Company, NY 1990, gefunden werden.
Betreffend (b) vorstehend, können die Zellen von Interesse mit jeder Art an immortalisierten Zellen fusioniert werden, die den geeigneten Multi-Ligandenbindungsrezeptor exprimeren, der zum Beispiel unter Verwendung von Hybridom-Techniken für die spezielle experimentelle Aufgabe ausgewählt wurde. Siehe Harlow und Lane, vorstehend. Wenn zum Beispiel die Einführung von MHC-Klasse-I- oder Klasse-II-Rezeptoren in die Zelle von Interesse gewünscht wird, können die Zellen z.B. mit einer immortalisierten B-Zelllinie fusioniert werden. Der Fachmann wird im Stande sein zu bestimmen, welche immortalisierte Zelllinie besonders nützlich für die Einführung eines ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor in die Zelle von Interesse sein kann, indem er allgemein bekannte Techniken, die aber nicht auf mRNA-Hybridisierungstechniken limitiert sind unter Verwendung von Nucleinsäureproben verwendet, die spezifisch für verschiedene Multi-Ligandenbindungsrezeptoren sind, wie zum Beispiel Northern-Blots, in situ-Hybridisierung, Dot-Blots, RT-PCR, RNase-Kartierung oder S1-Nuclease-Kartierung oder immunhistologische Techniken unter Verwendung von Antikörpern, die für das Bindeprotein des Multi-Ligandenrezeptors spezifisch sind, wie zum Beispiel Western-Blots, ELISA, FACS-Analyse, Immunpräzipitation oder in situ-Immunfärbung. Siehe unter anderem Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Current Opinion in Molecular Biology, vorstehend; Harlow und Lane, 1988, vorstehend.
Darüber hinaus können die Zellen von Interesse mit immortalisierten Zellen fusioniert werden, die konstruiert wurden, um einen löslichen Multi-Ligandenbindungsrezeptor zu exprimieren, sodass der Rezeptor aus der Fusionszelle abgesondert wird und bequem aus dem Medium (im Falle von gezüchteten Zellen) oder Körper oder Gewebeflüssigkeit (wobei die fusionierten Zellen in einen Wirt implantiert werden) gesammelt und gereinigt werden kann. Geeignete Verfahren zur Erzeugung solcher rekombinanter immortalisierter Zellen können in Sambrook et al., 1989, vorstehend; Ausubel et al., vorstehend, gefunden werden. Verfahren zum Fusionieren von Zellen können in Harlow und Lane, 1988, vorstehend, gefunden werden.
Betreffend (c), vorstehend, umfassen geeignete immortalisierte Vektoren auf EBV-Virus-basierende Vektoren (vorzugsweise wenn es das Ziel ist, B-Zellen zu transformieren), auf SV40-basierende Vektoren, auf dem großen T-Antigen von Polyoma basierende Vektoren, BPV, CMV basierende Vektoren und jeden anderen Vektor, der geeignete virale oder retrovirale Elemente enthält, sind aber nicht auf sie beschränkt. Darüber hinaus können die Zellen durch retrovirale Infektion oder Infektion mit anderen Virusarten immortalisiert werden, üblicherweise wenn ein Virus mit einer MOI verwendet wird, wo die meisten Zellen transduziert werden. Ein allgemeiner Überblick über geeignete immortalisierende Vektoren wird in Kriegler, M., Vectors, in: Gene Transfer and Expression, Hrsg. Kriegler, M. WH Freeman und Company, NY, 1990, gefunden.
Bezüglich (d), kann die Expression von bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptoren durch Inkontaktbringen der Zellen mit z.B. Cytokinen gesteigert werden. Zum Beispiel kann die Expression von HLA durch Inkontaktbringen der Zellen mit γ-Interferon gesteigert werden.
Bezüglich (e), wachsen viele Tumorzellen, die nicht in vitro wachsen, in abwehrgeschwächten Mäusen wie zum Beispiel SCID oder nackten Mäusen. Verfahren zum Züchten von Tumorzellen in solchen Mäusen sind im Fachgebiet gut etabliert. Bumpers et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:2153-2157; Bumpers et al., 1996, J. Surg. Res. 96:282-288; WO 97/8300-A2.
Erzeugung von Profilen, die Liganden darstellen, die aus einem Multi-Ligandenbindungsrezeptor aus einer Zelle von Interesse isoliert wurden.
In einer Ausführungsfrom stellt die Erfindung Profile bereit, welche eine Vielzahl an Liganden repräsentieren, die aus mindestens einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse extrahiert wurden. Die Erfindung stellt ferner Verfahren und Instrumente zur Erzeugung solcher Profile bereit.
Im Allgemeinen können die Profile der Erfindung Liganden repräsentieren, die aus jedem Multi-Ligandenbindungsrezeptor innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung extrahiert werden. Vorzugsweise sind die Liganden Peptide oder Proteine. Im Allgemeinen kann das Profil Liganden repräsentieren, die aus (einem) vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) extrahiert werden, der aus irgendeiner Zellart von Interesse isoliert wurde. In einer Ausführungsform repräsentiert das Profil eine Vielzahl von Liganden, die aus einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse extrahiert werden, welche keine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist. In einer alternativen Ausführungsform werden die Liganden aus einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse extrahiert, welche keine B-Zelle ist. In einer anderen Ausführungsform werden die Liganden aus einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse extrahiert, welche kein Makrophage ist. In noch einer anderen Ausführungsform sind die Liganden aus einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse extrahiert worden, die eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist, d.h. eine B-Zelle, ein Makrophage oder eine dentritische Zelle. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Profil eine Repräsentation von jedem einer Vielzahl an definierten Liganden, die aus mindestens zwei vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptoren einer Zelle von Interesse extrahiert wurden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der Ligand ein Protein oder sogar noch stärker bevorzugt ein Peptid. Üblicherweise stammen solche Peptid- oder Proteinliganden aus Proteinen, die innerhalb der Zelle exprimiert werden, und spiegeln daher eine Untergruppe der innerhalb der Zelle exprimerten Proteine wider. Im Allgemeinen repräsentiert das Profil Peptid- oder Proteinliganden, die aus einem Multi-ligandenbindungsrezeptor extrahiert wurden und, wie vorstehend definiert, mindestens zehn unterschiedliche Kernpeptide aufweisen. Wenn der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I- oder ein MHC-Klasse-II-Rezeptor ist und die in dem Profil repräsentierten Liganden aus einem einzelnen Allotyp extrahiert worden sind, repräsentiert das Profil mindestens 40 (z.B. mindestens 50) Liganden, die verschiedene Kernpeptide aufweisen. Stärker bevorzugt repräsentiert das Profil mindestens 70 Liganden, welche verschiedene Kernpeptide aufweisen: zum Beispiel mindestens 100, mindestens 200 oder am meisten bevorzugt mindestens 500. Wenn das Profil eine Repräsentation von mindestens 70 Liganden umfasst, die verschiedene Kernproteine aufweisen, können solche Liganden aus einem oder mehreren verschiedenen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren extrahiert werden.
Die Gesamtzahl an verschiedenen, durch das Profil repräsentierten Liganden ist üblicherweise mindestens 50, vorzugsweise mindestens 500 und stärker bevorzugt mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt mindestens 2.000 bis 10.000. Diese Zahlen umfassen Peptid- oder Proteinmitglieder mit oder ohne überlappende Aminosäuresequenz, d.h. sie müssen keine verschiedenen Kernpeptide aufweisen.
Die in dem Profil repräsentierten Liganden können mindestens 10% der Proteine darstellen, die in der Zelle von Interesse exprimiert werden, zum Beispiel mindestens 20%, 50% oder sogar 80%. Wie dem Fachmann klar sein wird, wird die Komplexität des Profils großenteils von dem (den) Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) und/oder dem bestimmten für die Profilproduktion ausgewählten Zelltyp abhängen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I- oder ein MHC-Klasse-II-Rezptor. In alternativen Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Chaperon, z.B. Calnexin, Calreticulin, BIP, grp96 und/oder grp94. In alternativen Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Chaperonin oder ein hsp, z.B. hsp60, hsp65, hsp70, hsp90 und hsp25. Alternativ ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Proteasomen-Komplex oder eine Bindungskomponente davon oder eine andere Komponente des Ubiquitinwegs, z. B. ein E2-Ubiquitin-Trägerprotein (z.B. CDC34), eine E3-Ubiquitinligase (z.B. Cyclosom oder Komponenten davon, G1/SKP1/Cullin/F- Box-Komplex, E3α, Hectdomänen-Protein), ein Auffaltungsenzym oder ein hsp100. Andere Möglichkeiten sind Mannosidase, eine N-Glycanase, der Mannoserezeptor oder ein Trafficking- oder Rückhalteprotein, z.B. der KDEL-Rezeptor. Profile können natürlich durch Extraktion von Liganden aus jeder möglichen Kombination einer Vielzahl an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren innerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung erzeugt werden.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor eine allele Variante eines MHC-Rezeptors, z.B. eines H-2-Rezeptors oder eines HLA-Rezeptors wie zum Beispiel eines HLA-Klasse-II-Rezeptors, z.B. HLA-DR, HLA-DQ oder HLA-DP, oder eines HLA Klasse-I-Rezeptors, z.B. HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, oder ein HLA-G-Rezeptors oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon. In einer spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-A Allotyp
extrahiert wurden, aber nicht aus einem A-0101, A-0201, A-0202, A-0203, A-0204, A-0205, A-0206, A-0207, A-0214, A-0301, A-0302, A-1101, A-2402, A-2601, A-2901, A-3101, A-3201, A-3302, A-6801, oder A-6901.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-A-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem A-0101, A-0201, A-0204, A-0205, A-0206, A-0207, A-0214, A-0301, A-1101, A-2402, A-2901, A-3101, A-3302, A-6801, oder
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-B-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem B-0702, B-0801, B-1401, B-1402, B-1501, B-1502, B-1508, B-1509, B-1513, B-1516, B-1517, B-1801, B-2701, B-2702, B-2703, B-2704, B-2705, B-2706, B-3501, B-3503, B-3701, B-3801, B-39011, B-3902, B-4001, B-40012, B-4006, B-4401, B-4402, B-4403, B-4601, B-5101, B-5102, B-5103, B-5201, B-5301, B-5401, B-5501, B-5502, B-5601, B-5701, B-5702, B-5801, B-5802, B-6701, B-7301, oder B-7801.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-B-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem B-0702, B-0703, B-0705, B-0801, B-1402, B-1501, B-1502, B-1508, B-1509, B-1513, B-1516, B-1517, B-1801, B-2701, B-2702, B-2703, B-2704, B-2705, B-2706, B-3501, B-3503, B-3701, B-3801, B-39011, B-3902, B-4001, B-40012, B-4006, B-4402, B-4403, B-4601, B-5105, B-5102, B-5103, B-5201, B-5301, B-5401, B-5501, B-5601, B-5701, B-5702, B-5801, B-5802, B-6701, B-7301, oder B-7801.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-C-Allotyp extrahiert wurden,
aber kein C-0101, C-0102, C-0301, C-0304, C-0401, C-0602, C-0702, oder C-1601.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-E-Allotyp extrahiert wurden, aber nicht aus einem E-101.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-G-Allotyp extrahiert wurden, aber nicht aus einem G-01012.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-DR-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem DR-B1*0101, DR-B1*1501, DR-B1*1502, DR-B1*1503, DR-B5*0101, DR-B5*0201, DR-B1*0301, DR-B1*1601, DR-B1*0401, DR-B1*0402, DR-B1*0403, DR-B1*0404, DR-B1*0405, DR-B1*0406, DR-B1*0408, DR-B1*0701, DR-B1*0801, DR-B1*09011, DR-B1*09012, DR-B1*1001, DR-B1*1101, DR-H1*1104, DR-B1*1111, DR-B1*1201, DR-B1*1301, DR-B1*1302, DR-B3*0101, DR-B3*0202, DR-B3*0301, oder DR-B5*0101.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-DR-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem DR-B1*0101, DR-B1*0102, DR-B1*0301, DR-B1*0401, DR-B1*0402, DR-B1*0404, DR-B1*0405, DR-B1*0407, DR-B1*0701, DR-B1*0801, DR-B1*09011, DR-B1*1101, DR-B1*1104, DR-B1*1201, DR-B1*1301, DR-B1*1302, DR-B1*1501, DR-B3*0202, DR-B3*0301, oder DR-B5*0101.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-DQ-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem DQ-A1*0101/B1*0501, DQ-A1*0102/B1*0502, DQ-A1*0201/B1*0201, DQ-A1*0501/B1*0201, DQ-A1*0301/B1*0401, DQ-A1*0401/B1*0402, DQ-A1*05012/B1*0301, DQ-A1*0102/B1*0602, DQ-A1*0301/B1*0301, DQ-A1*0301/B1*0302, oder DQ-A1*0301/B1*0303.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-DQ-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem DQ-A1*0101/B1*0501, kein DQ-A1*0201/B1*0201, kein DQ-A1*0301/B1*0301, kein DQ-A1*0301/B1*0302, oder kein DQ-A1*0501/B1*0201.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-DP-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem DP-A1*0102/B1*0201, DP-A1*/B1*0202, DP-A1*0101/B1*0301, DP-A1*0101/B1*0401, DP-A1*0201/B1*0401, DP-A1*0101/B1*0402, DP-A1*0201/B1*0902, oder DP-A1*/B1*1401.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform besteht das Profil aus Repräsentationen von Liganden, die aus einem HLA-DP-Allotyp extrahiert wurden,
aber nicht aus einem DP-A1*0102/B1*0201, A1*0201/B1*0401, oder A1*0101/B1*0301.
Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung solcher Profile bereit. Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren die Isolierung von einem oder mehreren Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen aus einer Zelle von Interesse unter Bedingungen, welche die Assoziation der gebundenen Liganden beibehalten, die anschließende Extraktion der an den Rezeptor gebundenen Liganden und die Charakterisierung der Liganden gemäß ausgewählten chemischen und physikalischen Parametern, wie zum Beispiel den HPLC-Profilen (Anionen-Austausch, Kationen-Austausch, Umkehrphase, normale Phase, hydrophobe Chromatographie), kapillarer Elektrophoreseprofile (CE, AEC-CE, CZE oder CEC-CE) und Massen-Spektrometrieprofile (MALDI-TOF/MS, FTMS, ESI-TOF, MALDI-ITMS, ESI-Quadropol-MS, ESI-Quadropol/TOF-MS, ESI-Sektor-MS, FAB-MS oder ESI-ITMS) oder Intensität der Ionisierung, und die resultierenden Eigenschaften. Abhängig von dem Verfahren der Ligandentrennung kann eine einzigartige physikalische Charakterisierung erlangt werden. Zum Beispiel trennt Umkehrphasen-Chromatographie einzelne Peptide auf der Basis ihrer Hydrophobie. In diesem Fall werden die Liganden entsprechend ihrer relativen Hydrophobie charakterisiert. Ionenaustausch-Chromatographie unterscheidet auf der Basis von Ladung, d.h. AEC gemäß negativer Ladung und CEC gemäß positiver Ladung. In diesem Fall werden die Liganden daher gemäß ihrer relativen Ladung charakterisiert. Normale-Phasen-Chromatographie unterscheidet auf der Basis von relativer Hydrophilie. In diesem Fall werden die Liganden daher gemäß ihrer relativen Hydrophilie charakterisiert. Hydrohobe Chromatographie unterscheidet auf der Basis von Hydrophobie und H₂O-Hydration. Demgemäß werden die Liganden basierend auf ihrer relativen Hydrophobie und H₂O-Hydration charakterisiert. Kapillare Elektrophorese unterscheidet auf der Basis von Ladung, in Abhängigkeit davon, welche polymere Beschichtung auf die Kapillare aufgetragen wird. In diesem Fall werden die Liganden daher gemäß ihrer relativen Ladung charakterisiert. Massenspektrometrie-Verfahren (MALDI-TOF/MS, FTMS, ESI-TOF, MALDI-ITMS, ESI-Quadropol-MS, ESI-Quadropol/TOF-MS, ESI-Sektor-MS, FAB-MS, oder ESI-ITMSI) charakterisieren die Liganden gemäß ihrer Masse. Massenspektren von Peptid-Fragmentierungsmustern sind ein Weg, um die Aminosäurezusammensetzung und/oder -sequenz eines Peptids oder eines Proteins zu bestimmen. Andere, allgemein im Fachgebiet bekannte Verfahren von Aminosäurezusammensetzungs- und/oder -sequenzbestimmung können auch eingesetzt werden. Im Allgemeinen wird ein Fachmann wissen, welche Liganden-Trennungsverfahren geeignet und sachgemäß sind, um die Liganden auf eine aussagekräftige Weise und auf der Basis von ausgewählten chemischen und physikalischen Parametern zu charakterisieren.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Bank oder eines Profils bereit, das Repräsentationen von mindestens 40 Liganden (vorzugsweise mindestens 70, stärker bevorzugt mindestens 100 und am meisten bevorzugt mindestens 500) umfasst, welche verschiedene chemische und/oder physikalische Eigenschaften aufweisen. In einer anderen Ausführungsform ist das Verfahren für die Erzeugung eines Profils, das eine Vielzahl an Liganden repräsentiert, die aus einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor einer Zelle von Interesse extrahiert worden sind, die keine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist. In einer alternativen Ausführungsform werden die Liganden aus einem vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor aus einer Zelle von Interesse ausgewählt, der nicht von einer B-Zelle oder einem Makrophagen stammt. In noch einer weiteren Ausführungsform ermöglicht das Verfahren die Erzeugung eines Profils, umfassend Repräsentationen einer Vielzahl von definierten Liganden, die aus mindestens zwei vorher ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptoren einer Zelle von Interesse extrahiert wurden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der Ligand ein Protein oder ein stabiles Peptid-Zwischenprodukt seiner Biosynthese oder seines Abbaus. Üblicherweise stammen solche Peptid- oder Proteinliganden aus Proteinen, die innerhalb der Zelle exprimiert werden und daher eine Untergruppe der in der Zelle exprimierten Proteine widerspiegeln. Im Allgemeinen ermöglicht das Verfahren die Erzeugung eines Profils, das mehrere Peptide repräsentiert, von welchen mindestens zehn (und vorzugsweise mindestens 20 oder sogar 30) verschiedene Kernpeptide aufweisen. Falls der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I- oder ein MHC-Klasse-II-Rezeptor ist und die Liganden aus einem einzelnen Allotyp extrahiert worden sind, werden mindestens 40 der Liganden in dem Profil vorzugsweise verschiedene Kernpeptide aufweisen und stärker bevorzugt mindestens 50 (z.B. mindestens 70 oder mindestens 100). Sogar noch mehr bevorzugt ermöglicht das Verfahren der Erfindung die Erzeugung eines Profils, das mindestens 200 Liganden umfasst, die verschiedene Kernpeptide aufweisen, und am meisten bevorzugt mindestens 500. Wenn das Profil mindestens 70 Liganden umfasst, die verschiedene Kernpeptide aufweisen, können solche Liganden aus einem oder mehreren unterschiedlichen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren extrahiert werden. In vielen Fällen wird das Profil Liganden repräsentieren, die aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren extrahiert wurden.
In bevorzugten Ausführungsformen repräsentierten die Pofile insgesamt mindestens 50, vorzugsweise 500, stärker bevorzugt 1.000 und am meisten bevorzugt 5.000 bis 10.000 Liganden. Diese Zahlen umfassen Peptid- oder Proteinmitglieder mit überlappender Aminosäuresequenz, d.h. die nicht notwendigerweise verschiedenene Kernpeptide aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen repräsentieren die Liganden mindestens 10% der Proteine, die in der Zelle von Interesse exprimiert werden; in stärker bevorzugten Ausführungsformen repräsentieren die Liganden mindestens 20%, zum Beispiel mindesten 30%, mindestens 50% oder sogar mindestens 80% der in der Zelle exprimierten Proteine.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I- oder ein MHC-Klasse-II-Rezeptor oder eine Multi-Ligandenbindungsdomäne davon. In alternativen Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Chaperon, z.B. Calnexin, Calreticulin, BIP, grp96 und/oder grp94, oder eine Multi-Ligandenbindungsdomäne davon. In alternativen Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Chaperonin oder ein hsp, z.B. hsp60, hsp65, hsp70, hsp90 und hsp25, oder eine Multi-Ligandenbindungskomponente oder Domäne davon. In noch einer alternativen Ausführungsform ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Proteasomen-Komplex oder eine Multi-Ligandenbindungsdomäne davon. In wieder einer alternativen Ausführungsform ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor eine andere Komponente des Ubiquitinwegs, z.B. ein E2-Ubiquitin-Trägerprotein (z.B., CDC34), eine E3-Ubiquitin-Ligase (z.B., Cyclosom oder Komponenten davon, G1/SKP1/Cullin/F-Box-Komplex, E3α, Hectdomänenprotein), ein Auffaltungsenzym, ein hsp100, oder eine Multi-Ligandenbindungsdomäne von irgendeinem der vorstehend erwähnten. In noch einer alternativen Ausführungsform ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor eine Mannosidase oder eine N-Glycanase oder eine Multi-Ligandenbindgsdomäne davon. In noch einer alternativen Ausführungsform ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Trafficking- oder Rückhalteprotein, z.B. der KDEL-Rezeptor, der Mannose-Rezeptor, oder eine Multi-Ligandenbindungsdomäne davon. In wieder anderen Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor kein MHC-Klasse-I- oder Klasse-II-Rezeptor. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Multi-Ligandenbindungsrezeptor eine allele Variante eines H-2-Rezeptors oder eines HLA-Rezeptors, wie zum Beispiel HLA-Klasse-II, z.B. HLA-DR, HLA-DQ oder HLA-DP, oder HLA-Klasse-I, z.B., HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F oder HLA-G-Rezeptor, oder eine Multi-Ligandenbindungsdomäne davon, oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon.
Die Multi-Ligandenbindungsrezeptoren werden unter Verwendung von Techniken isoliert, die allgemein im Fachgebiet bekannt sind. Ein wichtiger Aspekt für die Wahl des für die Isolierung und Reinigung des (der) Multi-Ligandenbindungrezeptor(en)s eingesetzten Verfahrens ist, dass dieser Schritt unter solchen Bedingungen und in einer solchen Weise durchgeführt wird, dass das gebundene Peptidrepertoire während des Prozesses mit dem Rezeptor assoziiert bleibt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Multi-Ligandenbindungsrezeptoren durch Immunaffinitätsreinigung isoliert. Abhängig vom Multi-Ligandenbindungsrezeptor, der isoliert werden soll, werden monoclonale oder polyclonale Antikörper eingesetzt, die gegen geeignete Domänen des Multi-Ligandenbindungsrezeptors gerichtet sind. Üblicherweise ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper. Weiters hat der Antikörper eine Affinität und Spezifitzät für den jeweiligen Multi-Ligandenbindungsrezeptor, was die Reinigung des Multi-Ligandenbindungsrezeptors unter funktionellen Bedingungen ermöglicht (Smith et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5557-5561; Gorga et al., 1986, J. Biol. Chem. 262:16087-16094). Geeignete Antikörper umfassen jene, die gegen einen MHC-Klasse-I-Rezeptor-Allotyp, einen MHC-Klasse-II-Rezeptor-Allotyp, ein Chaperonin, ein Calnexin, ein Calreticutin, eine Mannosidase, eine N-Glycanase, ein BIP, ein grp96, ein grp94, hsp60, hsp65, hsp70, hsp90 oder hsp25 ein E2-Ubiquitin-Trägerprotein, CDC34, eine E3-Ubiquitin-Ligase, ein Cyclosom, einen G1/SKP1/Cullin/F-Box-Komplex oder einzelne Komponenten von solchen, ein E3α, ein Hectdomänenprotein, ein Auffaltungsenzym, hsp100, einen 26S-Proteasomenkomplex, einen 20S-Proteasomenkomplex oder ein Trafficking- oder Rückhalteprotein gerichtet sind.
Alternativ wird (werden) der (die) Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) unter Verwendung von ConA-Sepharose oder N-Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Ein solches Reinigungsverfahren wurde von Blachere et al., erfolgreich verwendet, um Hitzeschockprotein-Peptidkomplexe zu reinigen. Blachere et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1315-1322. In wieder einer anderen alternativen Ausführungsform wird (werden) der (die) Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) unter Verwendung einer Reihe von unterschiedlichen Reinigungsschritten isoliert, zum Beispiel einem Immunaffinitäts-Reinigungsschritt, gefolgt von oder vorangehend einem oder mehreren herkömmlichen Reinigungsschritten. Der Fachmann wird wissen, welche Schrittfolgen angewandt werden müssen, um die Multi-Ligandenbindungsrezeptoren mit einem ausreichenden Reinheitsgrad zu isolieren. Im Allgemeinen wird (werden) der (die) Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) zu einem Reinheitsgrad isoliert und gereinigt, der ausreichend ist, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Dem Fachmann wird klar sein, welche Bedingungen und Techniken es dem gebundenen Ligandenrepertoire gestatten, während des Prozesses mit dem Rezeptor assoziiert zu bleiben.
Nachdem der Multi-Ligandenbindungsrezeptor gereinigt ist, wird das gebundene Ligandenrepertoire von dem Rezeptor freigesetzt und unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, aufgetrennt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Ligandenrepertoire unter Verwendung von HPLC, zum Beispiel, Anionenaustausch-Chromatographie, Kationenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Normalphasen-Chromatographie oder hydrophober Chromatographie isoliert und aufgetrennt. Alternativ kann das Ligandenrepertoire unter Verwendung von kapillarer Elektrophorese-Peptidtrennung, zum Beispiel CE, AEC-CE, CZE oder CEC-CE, isoliert und aufgetrennt werden.
Die in diesem Profil repräsentierten, isolierten Liganden können gemäß etlichen verschiedenen, physikalischen oder chemischen Parametern, einschließlich Elutionszeit, tatsächliche Masse, relativer Ionisierung oder chemischer Struktur oder Sequenz, charakterisiert werden. Die Parameter können sich bezüglich der angewandten Liganden-Trennungstechnik unterscheiden. Siehe vorstehend. Kurz gesagt kann, abhängig von der angewandten Auftrennungstechnik, das physikalische Auftrennungsprofil gemäß der relativen Ladung, Hydrophobie, Hydrophilie, Masse oder Hydration des Liganden sein.
Im Allgemeinen können die Profile der Erfindung aus jedem Zelltyp von Interesse erzeugt werden, der einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor exprimiert. Zellen, die für die Erzeugung der Profile der Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Zellen die aus Organsystemen von Interesse einschließlich Herz, Niere, Lunge, Milz, Gehirn, Blut, Haut, Leber, Thymus, Dünndarm oder Dickdarm stammen. Die Zellen können aus verschiedenen Gewebearten von Interesse stammen, einschließlich Muskelgewebe, Nervengewebe, Epithelium, Endothelium, Fettgewebe, Ovarialgewebe, Hodengewebe, Skelettgewebe, Knochenmarksgewebe, Herzgewebe oder Brustgewebe. Zellen, die für die Erzeugung des Profile geeignet sind, können aus dem blutbildenden System stammen, wie zum Beispiel pluripotente Stammzellen, T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, dentritische Zellen, PMNS, Mastzellen, Eosinophile, Megakaryocyten, oder allen anderen Primärzellen (z.B. Epithel- oder Endothelzellen), die von einer Testperson stammen, z.B. einem erkrankten oder gesunden Menschen oder Tier oder anderem Organismus; oder jeder Zelllinie von Interesse.
Üblicherweise wird das Profil aus einer Probe von isotypischen Zellen, d.h. Zellen von identischem/r Ursprung und/oder Behandlung erzeugt. Am idealsten werden die Zellen vor der Erzeugung des Profils bis zu erheblicher Reinheit aufgetrennt, d.h. wesentlich frei von irgendwelchen anderen „kontaminierenden" Zellarten. Die Zellen von Interesse können von allen kontaminierenden Zellarten unter Verwendung von Verfahren abgetrennt werden, die allgemein im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich Immunreinigung unter Verwendung von Antikörpern gegen Zelloberflächenproteine, die spezifisch für die bestimmten Zellart von Interesse sind, Magnetperlen, Komplementlyse, Anhaftung an bestimmte Materialien wie Glas oder Plastik, Diskriminierung nach Größe, Zelldichte, FACS-Sortierung oder Clonieren. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Probe Zellen von Interesse mit einer Reinheit, die mindestens 95%, stärker bevorzugt mindestens 98% oder sogar noch mehr bevorzugt mindestens 99% und am meisten bevorzugt 99,9% frei von anderen Zellarten ist. In Fällen, wo es unpraktisch ist, die Zellen von Interesse mit erheblicher Reinheit zu isolieren, oder wo es aus anderen Gründen bevorzugt wird, kann das Profil natürlich aus einer definierten Sammlung von Zellen erzeugt werden, einschließlich der Zellen, Gewebe oder Organe von besonderem Interesse.
Die für die Isolierung von Liganden verwendete Auswahl an Multi-Ligandenbindungsrezeptoren hängt großenteils von der bestimmten Zelle von Interesse ab, aus der das Profil erzeugt werden soll, sowie der experimentellen Fragestellung. Für die Erzeugung eines Profils, welches Liganden repräsentiert, die einen wesentlichen Teil von allen in einer B-Zelle oder einem Makrophagen exprimierten Proteinen widerspiegeln (z.B. alle oder so nahe an „allen" Proteinen, die in der Zelle exprimiert werden, wie möglich), umfassen geeignete Multi-Ligandenbindungsrezeptoren zum Beispiel Allotypen von MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Rezeptoren oder eine Kombination davon. Für die Erzeugung solcher komplexer Profile für eine nicht-professionelle antigenpräsentierende Zelle werden MHC-Klasse-I-Rezeptoren allgemein eine gute Wahl sein, da die meisten Zellen mit Zellkern MHC-Klasse-I-Rezeptoren exprimieren. Die Expression von MHC-Klasse-II-Rezeptoren kann in vielen Zellen, die sie normalerweise nicht exprimieren, induziert werden, indem die Zellen mit γ-Interferon oder anderen Mitteln, die Fachleuten der Immunologie bekannt sind, behandelt werden. In Fällen, wo es das experimentelle Ziel ist, ein Profil zu erzeugen, das einer spezifischeren Ligandengruppe entspricht, können andere Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen bevorzugt werden. Wo es das Ziel ist, ein Profil zu erzeugen, das Zellzykluskomponenten widerspiegelt, die in einer Zelle oder einer Gewebeart von Interesse vorhanden sind, kann zum Beispiel ein Multi-Ligandenbindungsrezeptor, der spezifisch an Zellzykluskomponenten bindet, die Wahl sein. Dem Fachmann wird klar sein, wie er bestimmt, was der (die) geeignete(n) Multi-Ligandenbindungrezeptor(en) für die Isolierung von vorbestimmten Liganden, d.h. Liganden, die gemäß einer spezifischen Parametergruppe, von einem bestimmten Zelltyp von Interesse ausgewählt wurden, sein würde(n).
Die Expression und/oder Anwesenheit der unterschiedlichen Multi-Ligandenbindungsrezeptoren in einer Zellart kann unter Verwendung von Verfahren bestimmt werden, die allgemein im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mRNA-Hybridisierungstechniken unter Verwendung von Nucleinsäuresonden, die für verschiedene Multi-Ligandenbindungsrezeptoren spezifisch sind, wie zum Beispiel Northern Blots, in situ-Hybridisierung, Dot-Blots, Rnase-Kartierung, S1-Nuclease-Kartierung oder RT-PCR oder immunhistologische Techniken unter Verwendung von Antikörpern, die für das Bindeprotein des Multi- Ligandenbindungsrezeptors spezifisch sind, wie zum Beispiel Western Blots, FACS-Analyse, Immunpräzipitation, ELISA oder in situ-Immunfärbung. Siehe z.B. Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (derzeitige Ausgabe); Harlow und Lane (Harlow, E. und Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Erzeugung von Ligandenprofilen, die in zwei oder mehreren unterschiedlichen Zellen von Interesse differentiell vorhanden sind
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines differentiellen oder „Substraktions"-Profils von Liganden, die in zwei oder mehreren unterschiedlichen Zellen von Interesse differentiell vorhanden sind. Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren die Erzeugung eines ersten Pools an Liganden, der aus einer ersten Probe extrahiert wurde, und eines zweiten Pools an Liganden, der aus einer zweiten Probe extrahiert wurde, und die Identifikation der Liganden, die in diesem ersten Ligandenpool vorhanden sind und nicht in diesem zweiten Ligandenpool vorhanden sind oder umgekehrt, um ein differentielles Ligandenprofil zu bilden. Der erste Ligandenpool und der zweite Ligandenpool werden im Wesentlichen durch die gleichen Verfahren, wie vorstehend beschrieben, erzeugt. Siehe vorstehend. Kurz gesagt werden ein erster und ein zweiter Ligandenpool durch Isolieren von einem oder mehreren Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen aus einer ersten Zelle von Interesse bzw. einer zweiten Zelle von Interesse unter Bedingungen, welche die Assoziation der gebundenen Liganden erhalten; Extrahieren der an den (die) Rezeptor(en) gebundenen Liganden; und Charakterisieren der Liganden gemäß ausgewählter Parameter erzeugt, wie zum Beispiel Aminosäuresequenz, HPLC-Profile (Anionenaustausch, Kationenaustausch, Umkehrphase, Normalphase, hydrophobe Chromatographie), kapillare Elektrophoreseprofile (CE, AEC-CE, CZE oder CEC-CE) und Massenspektrometrieprofile (MALDI-TOF/MS, FTMS, ESI-TOF, MALDI-ITMS, ESI-Quadropol-MS, ESI-Quadropol/TOF-MS, ESI-Sektor-MS, FAB-MS oder ESI-ITMS) und resultierende Eigenschaften. Anschließend werden jene Liganden, die im ersten Ligandenpool vorhanden sind und nicht im zweiten Ligandenpool vorhanden sind, oder umgekehrt, gemäß irgendeines der für die Charakterisierung der Liganden des ersten und zweiten Pools angewandten Parameter identifiziert und/oder isoliert.
Im Allgemeinen kann die erste und die zweite Probe jede Zelle, jedes Gewebe oder jeder Organtyp von Interesse umfassen. In einer Ausführungsform umfasst die Probe Zellen, die keine professionellen antigenpräsentierenden Zellen sind. In einer spezifischen Ausführungsform sind die Zellen keine B-Zellen. In einer anderen spezifischen Ausführungsform sind die Zellen keine Makrophagen. In einer alternativen Ausführungsform sind die Zellen professionelle Antigenpräsentierende Zellen.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die in den differentiellen Profilen repräsentierten Liganden in dem ersten Ligandenpool vorhanden, aber nicht in dem zweiten Ligandenpool, oder umgekehrt. In anderen Ausführungsformen sind die in den differentiellen Profilen repräsentierten Liganden bei nachweisbaren Mengen im ersten Ligandenpool häufiger als im zweiten Ligandenpool, oder umgekehrt.
In Übereinstimmung mit den vorstehend umrissenen Verfahren und Abläufen besteht ein differentielles Profil der Erfindung aus einer Ligandenuntergruppe, die in zwei (oder mehreren) verschiedenen Zellarten, Krankheitsstadien, Entwicklungsstadien, Stoffwechselstadien, Zellzyklusstadien, Behandlungsschemata von Interesse usw., differentiell vorhanden ist. Als solches stellen die differentiellen Profile ein Ligandenrepertoire dar, das direkt oder indirekt an den unterschiedlichen zellulären Phänotypen oder Verhalten beteiligt sein kann. Infolgedessen stellen die differenziellen Profile ein nützliches Instrument für die Charakterisierung von Zellart- und/oder Phänotyp-spezifischer Proteinexpression und für die Identifizierung und/oder die Isolierung von bekannten oder neuen Genprodukten und ihrer jeweiligen Codierungssequenzen bereit, die möglicherweise an biologischen Prozessen wie Entwicklungsprozesse, Etablierung und Fortschreiten von Krankheit, Präsdisposition für eine Krankheit, Organentwicklung, Signalübertragung, Differenzierung, Neurogenese usw., oder an der Reaktion auf Umweltfaktoren oder Behandlungen beteiligt sind.
Charakterisierung von Zell-spezifischer Proteinexpression
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Liganden, insbesondere Peptid- oder Proteinliganden, die in zwei oder mehreren unterschiedlichen Zellquellen differenziell exprimiert werden, identifiziert und isoliert. Die Polypeptidliganden, die als differentiell exprimiert identifiziert wurden, können weiter durch Bestimmung ihrer chemischen Struktur charakterisiert werden: d.h. Sequenz. Die vorliegende Technik gewährleistet daher die Charakterisierung von differentieller Expression, z.B. der Anwesenheit oder Abwesenheit von Genprodukten, die durch bekannte Gene und/oder ESTs mit unbekannter Funktion codiert werden. Die Verfahren und Instrumente der vorliegenden Erfindung stellen daher einen leichten und effizienten Weg bereit, um vorher identifizierten Genen oder Genprodukten eine mutmaßlichen Funktion und/oder Beteiligung an oder Assoziation mit einem bestimmten Entwicklungsweg, Stoffwechselweg oder Krankheitsstadium zuzuordnen. Mit dieser Information können neue Ziele für die Entwicklung von Gentherapieansätzen und Arzneistoffentwicklung schneller identifiziert werden.
Wenn die Nucleinsäuresequenz oder ein Fragment davon, z.B. in Form von einem EST, nicht in irgendeiner der verfügbaren Datenbanken gefunden werden kann, kann die Sequenz des das Protein von Interesse codierenden Gens unter Verwendung von Standard-Techniken identifiziert werden.
Identifizierung von neuen Genen
In einer Ausführungsform werden die Verfahren und Instrumente der vorliegenden Erfindung für die Identifizierung neuer Proteine und der Gene benützt, die sie codieren. Insbesondere wenn die Nucleinsäuresequenz, die ein bestimmtes Protein oder Peptid von Interesse codiert, (oder die Peptidsequenz selbst) mit keiner der bekannten Sequenzen in bestehenden Datenbanken übereinstimmt, kann das entsprechende Gen unter Verwendung von degenerierten Primern cloniert werden, die aus der EPT-Sequenz stammen.
Dem Fachmann wird klar sein, dass im Fachgebiet etliche Verfahren zum Identifizieren und Isolieren von Genen oder cDNAs unter Verwendung von Aminosäureinformation bekannt sind, und er wird wissen, wie solche Verfahren identifiziert und ausgeübt werden können. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (derzeitige Ausgabe).
Datenbankerzeugung von EPT-Profilen
Die wie vorstehend beschriebene Erzeugung von Profilen ermöglicht die Bildung eines hochspezifischen „Fingerprints" von EPTs in einer bestimmten Zelle von Interesse. Wie vorstehend besprochen, können die Peptidprofile abhängig von der Zahl der ausgewählten Parameter in multi-dimensionalen Koordinaten in multi-dimensionalem Raum gezeigt werden. Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist es, Datenbanken bereitzustellen, um multi-dimensionale Informationen bezüglich der Masse/Ladung, Hydrophobie, Hydrophilie, relativer Intensität, relativer Ionisierug, Struktur, Sequenz, Funktion, zellulärer Lage des Kompartiments usw. zu manifestieren, speichern und aufzuzeigen. Siehe zum Beispiel 6.
Die Datenbanken der Erfindung werden für etliche Anwendungen verwendet. Erstens werden sie als ein Referenzpunkt für eine Probe eines menschlichen Patienten oder eines Tieres für die Diagnose von Krankheiten, Fortschreiten von Krankheiten und Prädisposition für eine Krankheit verwendet. Wenn eine Erkrankung mit Veränderungen in der Proteinzusammensetzung in bestimmten Zellen, Zellorganen, Zellquellen oder Gewebetypen in Zusammenhang steht, kann zum Beispiel eine geeignete Patientenprobe verwendet werden, um ein Proteinprofil gemäß den Verfahren der Erfindung zu erzeugen und mit den Profilen von entsprechenden Proben aus normalem (nicht-erkrankten) und/oder erkranktem Ursprung verglichen werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von, das Fortschreiten von und/oder die Prädisposition für die bestimmte fragliche Erkrankung zu bewerten. Eine große Anzahl an Erkrankungen kann auf diese Weise diagnostiziert werden, einschließlich Erkrankungen, für die bestimmte Abweichungen in der Proteinexpression bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Stoffwechselerkrankungen, die mit einem Fehlen von bestimmten Enzymen in Zusammenhang stehen, proliferativen Erkrankungen, die mit abweichender Expression von z.B. Oncogenen oder Tumor-Suppressoren in Zusammenhang stehen, Entwicklungserkrankungen, die mit abweichender Genexpression in Zusammenhang stehen, etc.. Darüber hinaus ermöglichen die Verfahren und Instrumente der Erfindung die Diagnose von Erkrankungen oder anderen Abweichungen einfach basierend auf vorbestimmten Unterschieden in EPT-Profilen. Wenn es daher vorbestimmt ist, dass ein bestimmte Erkrankung von Interesse mit bestimmten Veränderungen des EPT-Profils einer/s bestimmten Zellart, Gewebes, Zellquelle oder Organsystems in Zusammenhang steht, kann ein menschlicher Patient oder ein Tier einfach basierend auf seinem individuellen Profil diagnostiziert werden, wenn es mit den Profilen verglichen wird, die durch Datenbanken in Übereinstimmung mit der Erfindung bereitgestellt werden.
Zweitens kann die in den Datenbanken der Erfindung gespeicherte Information verwendet werden, um neue oder bekannte Gene und ihre Produkte zu identifizieren, die an der Manifestation von, dem Fortschreiten von oder der Prädisposition für irgendeine Erkrankung von Interesse und mit der Entwicklung von Symptomen einer bestimmten Erkrankung beteiligt sind. Zum Beispiel können EPT-Profile eines erkrankten Organs, Gewebes oder Zelltyps erzeugt werden und mit dem entsprechenden Profil-Gegenstück aus einer nicht erkrankten Probe verglichen werden. Unterschiede in dem Profil können identifiziert werden und einzelne EPTs, die differenziell in der erkrankten im Vergleich zu nicht-erkrankten Probe vorhanden sind, können identifiziert und für weitere Analyse isoliert werden. Siehe vorstehend. Die identifizierten Unterschiede in den EPT-Profilen sind für eine zukünftige Diagnose der Erkrankung oder Abweichungen nützlich. Die erhaltene Information kann ferner verwendet werden, um das (die) differentiell exprimierte(n) Gen(e) zu identifizieren und isolieren, die wiederum für die Entwicklung von zielgerichteter Behandlung der Erkrankung nützlich sein kann (können).
Die Datenbank könnte drei Datenkategorien speichern, die (a) Ligandenprofile, (b) Zellquellen bzw. (c) Rezeptortypen darstellen. Die Ligandenprofil-Information könnte eine Vielzahl an „multidimensionalen" Daten enthalten, einschließlich der vorher besprochenen Arten an Information. Die Ligandenprofile würden üblicherweise Information einschließen, die Proteinfragmente einzigartig identifiziert, z.B. Massenspektraldaten oder Proteinsequenzen. Die Information über Rezeptortypen könnte gleichfalls in einer Vielzahl an Formen vorliegen, z.B. Name, Sequenz oder biochemische Eigenschaften. Eigenschaften von unterschiedlichen Zellquellen, die in der Datenbank gespeichert werden könnten, sind in der Definition von Zellquellen vorstehend angegeben.
Beispiele (z.B. Werte) von jeder dieser Informationskategorien würden zum Speichern von Aufzeichnungen in der Datenbank verwendet werden. Ein Beispiel könnte zum Beispiel ein bestimmtes Ligandenprofil oder eine bestimmte Zellquelle oder ein bestimmter Rezeptortyp sein.
Jede der Informationskategorien könnte in Unterkategorien zerlegt werden. Eine Zellquelle kann in Unter-Zellquellen zerlegt werden. Zum Beispiel könnte eine Zellquelle für erkrankte Zellen in Unterquellen von kanzerösen und erkrankten, aber nicht kanzerösen Zellen zerlegt werden, oder in unterschiedliche Stadien der Krebsentwicklung und so weiter.
In manchen Arten von Datenbanken könnten die Kategorien als Felder innerhalb von Tabellen realisiert werden und Beispiele könnten Werte in Aufzeichnungen darstellen, die zu den Tabellen gehören.
Auf jeden Fall würde die Datenbank Assoziationen unter Beispielen der drei Kategorien von Daten definieren. Zum Beispiel könnte die Datenbank ein spezifisches Beispiel eines Ligandenprofils mit einem Beispiel eines Rezeptortyps und mit einem Beispiel einer bestimmten Zellquelle in Zusammenhang bringen.
Die Assoziierungen ermöglichen das Auffinden von Datenbeispielen von irgendeiner oder mehreren der Kategorien, die auf ihren Assoziationen von Datenbeispielen von einer anderen oder mehreren Kategorien beruhen. Zum Beispiel könnte ein bekannter Rezeptortyp verwendet werden, um ein/e oder mehrere Ligandenprofile oder Zellquellen zu finden. Eine große Vielzahl an Abfragestrategien würde durch die gespeicherte Information möglich gemacht werden.
Die Zellquellen können Zellarten, Zellzustände, genetischer Hintergrund, Identitäten von Individuen, aus denen die Zellen stammen, Zustände der Störung oder Entwicklungsstadien sein. Mit „Zustand" meinen wir Variable wie Kulturbedingungen, allgemeine Gesundheit oder Alter des Tieres, aus welchem die Zellen stammen, transgen im Vergleich zu nicht-transgen, transfiziert verglichen mit nicht-transfiziert, Virus oder Prion-infiziert im Vergleich zu nicht-infiziert, usw. Mit „Störung" meinen wir experimentelle Manipulation der Zellen, wie zum Beispiel Behandlung mit einer bestimmten Verbindung verglichen mit keiner Behandlung oder Behandlung mit einer unterschiedlichen Dosierung. Die gespeicherte Information über Ligandenprofile kann Massenspektraldaten umfassen.
Eine Verwendung der Datenbank wäre, Ligandenprofile zu finden, die mit ausgewählten Zellquellen und Rezeptortypen assoziiert sind. Eine andere Verwendung wäre, zwei Ligandenprofile zu finden und einen Unterschied zwischen ihnen zu bestimmen.
Allgemeiner gesagt könnte die Datenbank verwendet werden, um eine große Vielzahl an Experimenten zu unterstützen, in welchen ein mit Zellen assoziiertes Ligandenprofil identifiziert wird. Basierend auf dem Ligandenprofil wird eine Abfrage an die Datenbank gerichtet, um eine Zellquelle oder ein Ligandenprofil und eine damit assoziierte Zellquelle zu erlangen. Mehrere Beispiele solcher Experimente folgen.
Zellen können unter Verwendung eines Kandidaten-Arzneistoff-Behandlungsplans behandelt werden und die Datenbank kann für eine Zellquelle abgefragt werden, die eine unterschiedliche Behandlung von ähnlichen Zellen darstellt (z.B. ein unterschiedlicher Arzneistoff oder kein Arzneistoff oder der in einer anderen Art verwendete Arzneistoff). Der Kandidaten-Arzneistoff kann spezifisch an ein bestimmtes Protein binden und die Isolierung von Zellen ermöglichen, die das Protein exprimieren; die Abfrage kann Information über Zellquellen erlangen, die das bestimmte Protein exprimieren.
Ein Tier kann unter Verwendung eines Testverbindungs-Behandlungsplans behandelt werden und ein Ligandenprofil kann bestimmt werden. Die Datenbank wird dann nach einer Zellquelle, die Zellen des gleichen Tieres, aber vor der Behandlung mit der Testverbindung darstellt, oder nach einer Zellquelle abgefragt, die Zellen von einem anderen Tier, vor oder nach Behandlung mit der gleichen oder einer anderen Testverbindung repräsentiert.
Die Zellentwicklung kann kontrolliert werden und das bestimmte Ligandenprofil kann mit der Entwicklung der Zelle assoziiert werden. Die Datenbank kann nach einer Zellquelle abgefragt werden, die ein Entwicklungsstadium repräsentiert, das unterschiedlich zu jenem der Zellquelle der Zellen des Experiments ist.
Ein Expressionsvektor kann in Zellen einer Zellquelle eingeführt werden und das bestimmte Ligandenprofil kann mit den Effekten des Expressionsvektors assoziiert werden. Die Datenbank kann nach einer Zellquelle abgefragt werden, welcher der in dem Experiment verwendete Expressionsvektor fehlt.
Die Antwort von Zellen auf pharmakologischen Verbindungen kann beobachtet werden und das bestimmte Ligandenprofil kann mit Reaktivität oder nicht-Reaktivität auf die Verbindung assoziiert werden. Die Datenbank wird auf eine Zellquelle abgefragt, die sich phänotypisch von der Zellquelle der Zellen des Experiments unterscheidet (z.B. die gleichen Zellen, aber nicht mit der pharmakologischen Verbindung behandelt).
Für die Verwendung in dieser und anderen Experimentarten kann die Datenbank auf ein Medium wie eine CD-ROM übertragen werden oder könnte durch eine Online-Verbindung von einem Forscher von dem Ort abgefragt werden, wo die Datenbank gespeichert und erhalten wird. Die Datenbank könnte am World-Wide-Web bereitgestellt werden, um Online-Suche unter Verwendung von Web-Browsern zu ermöglichen. Die durch Abfragen der Datenbank erzeugte Information könnte die Basis von Leistungen bilden, die von einem Besitzer oder Verwender der Datenbank für dritte Personen bereitgestellt wird.
Zum Beispiel würden in einer Art von Leistung eine Zellquelle, ein Rezeptortyp oder ein Ligandenprofil von Interesse identifiziert werden. Basierend auf der/m identifizierten Zellquelle, Rezeptortyp oder Ligandenprofil würde die Datenbank abgefragt werden, um die Information über Zellquellen, Rezeptortypen oder Ligandenprofile zu erlangen, die sich auf die Zellquelle, den Rezeptortyp oder das Ligandenprofil von Interesse beziehen.
In einem anderen Leistungsansatz würde ein Anbieter Zellen einer Zellquelle von einem Kunden erhalten. Der Anbieter würde ein Ligandenprofil von den Zellen erzeugen. Basierend auf dem Ligandenprofil und der Zellquelle würde der Anbieter eine Datenbank abfragen, um Information über Zellequellen, Rezeptortypen oder Ligandenprofile zu erlangen, die mit der erhaltenen Zellquelle und dem erzeugten Ligandenprofil in Beziehung stehen. Der Anbieter könnte die Leistung aus einer durch den Anbieter kontrollierten Datenbank bereitstellen, der eine Datenbank verwenden könnte, die von einer dritten Person erhältlich ist.
Anwendungen von EPT-Profilen
Erzeugung von EPT-Profilen für unterschiedliche Entwicklungs-, Stoffwechsel- oder Krankheitsstadien eines bestimmten Zelltyps
Ligandenprofile für Zellen von unterschiedlichen Entwicklungs-, Stoffwechsel- oder Erkrankungsstadien werden erzeugt und verglichen, um Unterschiede in Protein- oder Genexpression zu identifizieren.
In einer spezifischen Ausführungsform werden Ligandenprofile von erkrankten im Vergleich zu normalen Zellarten erzeugt. Zum Beispiel können die Profile von einer Krebszelle und einer nicht-kanzerösen Zelle von dem gleichen, genetisch übereinstimmenden Gewebe erzeugt und verglichen werden. Proteine, die in erkrankten und nicht erkrankten Zellen differentiell exprimiert werden, können bequem identifiziert werden und ihre Beteiligung an der Krankheitsentwicklung und dem Fortschreiten durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren analysiert werden. Auf diese Weise werden neue Ziele für die Behandlung der Krankheit effizient identifiziert.
Alternativ werden Ligandenprofile der Zellen von unterschiedlichen Entwicklungsstadien erzeugt und verglichen. Zum Beispiel können Profile von embryonischen Zellen und erwachsenen Zellen, abgeleitet aus genetisch übereinstimmenden Gewebe, erzeugt und verglichen werden, um Gene und ihre Produkte zu identifizieren, die in Entwicklungsprozessen eine Rolle spielen und die für die Entwicklung von z.B. neuen Gentherapie- oder anderen therapeutischen Ansätzen für die Behandlung von Entwicklungsstörungen nützlich sein können.
In anderen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung werden EPT-Profile von (a) Zellen, die mit einem ausgewählten Pathogen infiziert sind, z.B. Mikroorganismus, Virus, Retrovirus oder Prion, und (b) entsprechenden nicht-infizierten Zellen erzeugt und verglichen, um Gene und Genprodukte zu identifizieren, die als Antwort auf die Infektion an- oder abgeschalten werden. Anstatt infiziert zu werden, kann die erste Zelle alternativ dazu gebracht werden, ein Fremdprotein oder eine immunogene Substanz usw. aufzunehmen. Dieser Ansatz ermöglicht einem, z.B. Faktoren zu identifizieren, die durch die Zellen in Reaktion auf eine Infektion oder Einführung der Fremdsubstanz erzeugt werden, die für therapeutische Zwecke nützlich sein könnte.
In einem anderen Beispiel werden Ligandenprofile aus Zellen erzeugt und verglichen, die von Individuen, die eine ausgewählte genetische Erkrankung aufweisen, und von Individuen stammen, die keine solche Erkrankung aufweisen. Vorzugsweise werden Proben aus betroffenen und nicht-betroffenen Familienmitgliedern für die Erzeugung der Profile verwendet. Abhängig von der ausgewählten, bestimmten genetischen Erkrankung werden Zell- oder Gewebearten untersucht, von denen bekannt ist, dass sie durch die bestimmte genetische Erkrankung betroffen sind. Im vielen Fällen werden Profile und verschiedene Zell- und/oder Gewebearten erzeugt und verglichen. Diese Ausführungsform der Erfindung ermöglicht es, Gene und Proteine zu identifizieren, die mit einer genetischen Erkrankung assoziiert sind. Die erhaltene Information kann für die Entwicklung von Gentherapie- und anderen therapeutischen Ansätzen und für die Entwicklung von gezielt angewendeten Arzneistoffen nützlich sein, die mit der Expression von Genen oder Aktivität oder Stabilität von Genprodukten interferieren, die an den Symptomen der genetischen Erkrankung beteiligt sind. Darüber hinaus ermöglicht diese Ausführungsform der Erfindung die Auswahl von diagnostischen Zielen für die Identifizierung von Individuen, die für bestimmte Krankheitsarten oder Krankheitssymptome prädisponiert sind.
Erzeugung von EPT-Profilen, die mit der Reaktion eines bestimmten Zelltyps auf externe Faktoren korreliert sind
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein EPT-Profil einer bestimmten mit einem externen Faktor behandelten Zellart erzeugt und mit einem Profil von Zellen der gleichen Art verglichen, die nicht so behandelt worden sind, um Unterschiede in der Proteinexpression zu identifizieren. Die Zellen können rekombinant oder nativ, eine Zelllinie oder nicht-transformierte Zellen oder direkt aus einem Tier, bevor und nach der Behandlung des Tieres mit der Verbindung isoliert sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden EPT-Profile von Zellen eines/r ausgewählten Ursprungs oder Natur, die nicht mit einem Wachstumsfaktor, Cytokin oder Hormon in Kontakt gebracht wurden, und Zellen erzeugt und verglichen, die nicht mit der Substanz in Kontakt gebracht wurden, aber sonst auf die gleiche Art behandelt wurden. Das erlaubt die Identifizierung von Genen und Genprodukten, die in Reaktion auf Wachstumsfaktor, Cytokin oder Hormon angeschalten oder abgeschalten werden, was z.B. eine wertvolle Einsicht in zelluläre Signaltransduktionswege und Regulation der Zellexpression ergeben wird.
Auf ähnliche Weise werden Ligandenprofile von Zellen, die behandelt wurden mit oder in Kontakt gebracht wurden mit einem Polypeptid, einem kleinen Molekül, Chemokin oder Nucleinsäurearzneistoff oder Arzneistoffkandidat, und Zellen erzeugt und verglichen, die mit der Substanz nicht behandelt wurden oder in Kontakt gebracht wurden, aber sonst auf die gleiche Weise behandelt wurden. Das ermöglicht es, die Effekte der ausgewählten Substanz auf die Proteinexpression in der Zelle zu identifizieren und ist zum Beispiel ein ausgezeichnetes Instrument für die Gültigkeitserklärung von bestimmten Arzneistoffen oder die Identifizierung von Arzneistoffen, die mit der Expression eines ausgewählten Gens oder Genproduktes assoziiert sind.
In einem anderen Beispiel werden Ligandenprofile von Zellen, die mit einer ausgewählten Verbindungsart in Kontakt gebracht wurden, z.B. einem/r ausgewählten Kohlenhydrat oder einer Gruppe von Kohlenhydraten, Lipid oder Gruppe von Lipiden, Aminosäure oder Aminosäuregruppe, Nucleotid oder Nucleosid oder einer Gruppe von einem der beiden oder einem Vitamin oder einer Gruppe von Vitaminen, und Zellen erzeugt und verglichen, die nicht mit der Verbindung behandelt worden sind, aber sonst auf die gleiche Art behandelt worden sind. Das ermöglicht, die Effekte der ausgewählten Verbindung auf das Gen und die Proteinexpression der Zelle zu identifizieren und wird wertvolle Einblicke in die Stoffwechselprozesse geben.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Ligandenprofile der Zellen, die behandelt wurden mit einer ausgewählten Nucleinsäure, z.B. ein ausgewähltes Antisense-Oligonucleotid, ein Ribozym, ein Expressionsvektor, ein Plasmid, eine RNA oder eine DNA, und der Zellen erzeugt und verglichen, die nicht mit der Nucleinsäure behandelt wurden, aber sonst auf die gleiche Weisen behandelt wurden. Das ermöglicht, die Effekte des Antisense-Oligonucleotids oder anderer Nucleinsäuren auf die Proteinexpression in der Zelle zu identifizieren und erlaubt einem als solches, die Wirksamkeit oder den Effekt des Antisense-Oligonucleotids oder der Nucleinsäure zu bewerten.
Schließlich werden Ligandenprofile von Zellen, die einer ausgewählten Stressbedingung unterzogen wurden, wie zum Beispiel hoher Temperatur, Hypoxia, Entzug von Nährstoffen wie zum Beispiel Glucose, Aminosäuren oder anderen wesentlichen Faktoren oder der Anwesenheit eines Toxins erzeugt und mit einem EPT-Profil verglichen, das in nicht-behandelten Kontrollen erzeugt wurde. Differenziell exprimierte Genprodukte werden identifiziert, um wertvollen Einblick in Faktoren zu gewähren, die an zelluläre Stressreaktionen beteiligt sind. Dieser Aspekt der Erfindung gewährt einen sehr wertvollen und effizienten Weg zur Bestimmung und/oder Bewertung des Effekts einer ausgewählten Verbindung auf die Proteinexpression in der Zelle. Die Technik kann darüber hinaus nützlich sein, um einen gewünschten Abbruch von bestimmten enzymatischen Aktivitäten zu bestätigen, z.B. durch Unterscheiden zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten oder glycosylierten und nicht-glycosylierten Peptiden und/oder Proteinen. Sie kann auch verwendet werden, um bei pharmakologischer und/oder toxikologischer Bewertung von möglichen neuen Arzneistoffen und bei der Durchmusterung auf solche Arzneistoffe zu helfen.
Erzeugung von EPT-Profilen für unterschiedliche Organsysteme
Ligandenprofile von Zellen, die aus unterschiedlichen Organen oder Organsystemen stammen, können erzeugt und verglichen werden, um Unterschiede in Protein- oder Genexpression zu identifizieren. Zum Beispiel können Ligandenprofile von Zellen erzeugt und verglichen werden, die aus der Lunge, Leber, Herz, Milz, Haut, Gehirn, Niere, Schilddrüse, Dünndarm und/oder Dickdarm stammen. Differenziell exprimierte Gene und Proteine werden daher identifiziert. Dieser Aspekt der Erfindung ist nützlich, um Proteine zu identifizieren, die an einer bestimmten physiologischen Funktion eines Organs beteiligt sind.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden EPT-Profile von ausgewählten Gewebe- oder Zellarten erzeugt und verglichen und differentiell exprimierte Proteine identifiziert, z.B. Muskel-, Endothel-, Epithel-, Nerven-, Fett-, Ovarial-, Hoden-, Blut-, Knochemark- und/oder Brustgewebe usw. Das wird wertvolle Einblicke in die Beteiligung eines Proteins an den physiologischen Funktionen einer Gewebe- oder eine Zellart geben.
Erzeugung von EPT-Profilen für Expressionsstudien in Standard-Zelllinien
Ligandenprofile von Zellen, die aus differenziell konstruierten Standard-Zelllinien stammen, können erzeugt und verglichen werden, um Unterschiede in der Proteinexpression zu identifizieren.
Zum Beispiel wurden EPT-Profile von Standard-Zelllinien, die konstruiert wurden, um eine oder mehrere, ausgewählte rekombinante Gene zu exprimieren/überexprimieren, z.B. Gene, die einen ausgewählten Wachstumsfaktorrezeptor oder andere Signaltransduktionskomponenten, Transkriptionsfaktor, Onkogen, Apoptose-induzierendes Gen usw. codieren, erzeugt und mit EPT-Proteinen verglichen, die aus einer Referenz-Zelllinie des gleichen Ursprungs erzeugt wurden, die aber das ausgewählte rekombinante Gen nicht trägt und exprimiert. Differentiell exprimierte Gene und Genprodukte werden identifiziert. Das wird es ermöglichen, die Wirkung des überexprimierten Gens auf die Expression von anderen Polypeptiden in der Zelle zu identifizieren.
Die Verwendung von Ligandenprofilen, um die Expressionsmuster in transgenen und Knockout-Tieren zu charakterisieren
Ein Ligandenprofil von einer ausgewählten Zell- oder Gewebeart, die aus einem transgenen oder Knockout-Tier stammt, wird erzeugt und mit einem Profil des gleichen Zell- oder Gewebetyps von einem isogenen, aber nicht transgenen Tier verglichen, um Unterschiede in Protein- oder Genexpression zu identifizieren. Dieser Aspekt der Erfindung ist ein wertvolles Instrument für die Untersuchung und die Bestätigung von tatsächlichen Gen-Knockouts und die Untersuchung von Gewinn und Verlust der Proteinexpression in transgenen Nieren. Dieser Aspekt ermöglicht es, ferner den Effekt des Verlusts oder Gewinns einer Genfunktion auf die Expressionsmuster im Allgemeinen zu charakterisieren.
Die Verwendung von EPTs, um in positionellen Clonierungsbemühungen zu helfen
EPT-Profile können auch verwendet werden, um bei positionellen Clonierungsbemühungen zu helfen. Zum Beispiel können EPT-Profile von YACs und PACs, Minichromosomen oder Cosmiden oder anderen Vehikeln, die große Teile von unbekannten Nucleinsäuren umfassen, erzeugt werden, um Clone zu identifizieren, die ein Protein von Interesse codieren.
In einem Aspekt wird eine Nucleinsäure, die ein oder mehrere ausgewählte Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) codiert, oder eine lösliche Form des Rezeptors, der funktionsfähig mit Nucleinsäureelementen verbunden ist, welche die Transkription und Translation steuern, in ein Minichromosom, YAC, PAC, Cosmid oder anderes Vehikel cloniert, das einen Teil des Genoms einer Tierart oder eines anderen Organismus von Interesse enthält. Das YAC, PAC, Minichromosom, Cosmid oder ein anderes Vehikel wird dann in geeignete Zellen eingeführt und exprimiert. Die ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptoren der Zellen werden gereinigt und die Peptid- oder Proteinliganden werden, wie vorstehend beschrieben, extrahiert, aufgetrennt und charakterisiert. Genprodukte von Interesse, die durch die Nucleinsäure codiert werden, werden identifiziert. Allgemeine Protokolle für die Bildung von YACs, Minichromosomen und Cosmiden und für die Erzeugung von Zellen, die dieses exprimieren, usw. kann in Ausubel et al., vorstehend gefunden werden. Zusätzliche Information über YACs kann in Montanaro et al., 1991, Am. J. Hum. Genet. 48:183-194; Somerville, 1991, Mol. Gen. Genet. 226:484-490; Coulson et al. 1988, Nature 335:184-186; Green und Olson, 1990, Science 250:94-98; Kai et al., 1990, FEBS Letters 275:77-82: Imai und Olson, 1990, Genomics 8:297-303; Okazaki und Hayashizaki, 1997, Methods 13:359-377; Parimoo, 1997, Mol. Biotechnol. 8:255-268; Forster und Rabbitts, 1993, Oncogene 8:3157-3160; Feingold et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8637-8641 gefunden werden.
In einem alternativen Aspekt werden große Stücke von nicht-charakterisierter DNA (Minichromosomen, Cosmide, PCAs, YACs usw.) in Zellen eingeführt, die einen oder mehrere ausgewählte Multi-Ligandenbindungsrezeptoren exprimieren, um EPT-Profile der Genprodukte zu erzeugen, die durch das nicht-charakterisierte DNA-Stück exprimiert werden. Vergleich der Ligandenprofile aus einem bestimmten Multi-Ligandenrezeptor mit dem entsprechenden Profil aus einer Zelle, die das große Stück an nicht-charakterisierter DNA nicht exprimiert, ergibt Information darüber was auf dem transfizierten DNA-Segment exprimiert wird. Zu dem Ausmaß, zu dem die Expression von jedem bestimmten Gen auf der nicht-charakterisierten DNA zellspezifisch ist, kann die Durchführung dieses Verfahrens unter Verwendung einer Vielzahl an Zellarten eine zusätzliche Information über die Identität der Gene auf der nicht-charakterisierten DNA ergeben. Für allgemeine Protokolle und Referenzen siehe vorstehend.
Die Verwendung des Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Systems, um exogene Proteine zu sortieren
Das Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System kann auch verwendet werden, um exogene Proteine oder Peptide in vitro zu sortieren und isolieren und/oder um die EPTs-Bindungseigenschaften des Multi-Ligandenbindungsrezeptors zu bestimmen.
Zum Beispiel werden rekombinante oder gereinigte Multi-Ligandenbindungsrezeptoren eingesetzt, um das EPT-Profil von einem spezifischen Zell-, Gewebe- oder Organtyp von Interesse zu bestimmen. Zum Beispiel werden rekombinante und/oder gereinigte Multi-Ligandenbindungrezeptoren von einer ausgewählten Art oder einer Artenkombination mit Proteinen oder Peptiden (als zufällige oder vorbestimmte Abbauprodukte von solchen Proteinen) in Kontakt gebracht, stammend aus z.B. einer Expressionsbank von einer Quelle von Interesse. Zum Beispiel kann mRNA, die aus einem Zell-, Gewebe- oder Organtyp aus Interesse stammt, isoliert und revers in cDNA transkribiert werden. Die cDNA, welche das Repertoire der Nucleinsäuren repräsentiert, die als Proteine in dieser bestimmten Zell-, Gewebe- oder Organart von Interesse exprimiert werden könnten, wird dann entweder durch Erzeugung einer Expressionsbank (Sambrook et al., 1989, vorstehend; Ausubel et al., vorstehend) oder durch direkte in vitro-Transkription und -Translation (Sambrook et al., 1989, vorstehend; Ausubel et al., vorstehend) als ein entsprechendes Proteinrepertoire exprimiert. Abhängig von dem verwendeten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-System können die Proteine mit dem Multi-Ligandenbindungsrezeptor direkt inkubiert werden oder können in Peptide von einer Größe, von der bekannt ist, dass sie der bevorzugte Bindungspartner des Multi-Ligandenbindungsrezeptors ist, fragmentiert werden, z.B. durch proteolytische Spaltung, und dann mit den gleichen unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen inkubiert werden. Die Rezeptor/Ligandenkomplexe werden dann isoliert und die Liganden, wie vorstehend beschrieben, extrahiert, aufgetrennt und charakterisiert. Dieser Ansatz kann in Fällen besonders bevorzugt sein, wo die Zelle, das Gewebe oder Organ von Interesse den (die) ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor(en) nicht in ausreichenden Mengen exprimiert. Gehirngewebe scheint zum Beispiel nur kleine Mengen an MHC-Klasse-I- und II-Rezeptormolekülen zu exprimieren; mit diesem in vitro-Ansatz können diese Rezeptoren noch immer eingesetzt werden, um komplexe EPT-Profile von Gehirngewebe oder Gehirnzellen zu erzeugen.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform wird dieser in vitro-Ansatz verwendet, um die Bindungsspezifität eines ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptors von Interesse zu bestimmen. Zum Beispiel werden rekombinante oder gereinigte Multi-Ligandenbindungsrezeptoren von Interesse unter geeigneten Bedingungen, um die Bindung der Liganden zu erleichtern, mit Peptidbanken in Kontakt gebracht. Die Rezeptoren werden isoliert und gereinigt und das damit assoziierte Repertoire von Peptiden wird extrahiert und charakterisiert. Das ermöglicht es, das Ligandenrepertoir zu identifizieren, isolieren und charakterisieren, das an einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor von Interesse bindet, um einen künstlichen „Fingerprint" des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptors zu erhalten. Identifizieren der Sequenz von jedem Mitglied des künstlichen Fingerprints ermöglicht es, den potentiellen Ligandenpool, der an einen Multi-Ligandenbindungsrezeptor von Interesse bindet, zu kartieren. Jede Peptidart oder Proteinbank kann für die Ausübung dieser Ausführungsform der Erfindung verwendet werden; sehr komplexe synthetische Peptidbanken werden jedoch bevorzugt.
Die nachstehenden Beispiele erklären die Erfindung genauer. Die folgenden Präparationen und Beispiele werden gegeben, um Fachleuten zu ermöglichen, die Erfindung klarer zu verstehen und auszuüben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Reinigung von Multi-Ligandenbindungsrezeptor/Ligandenkomplexen in einer raschen und reproduzierbaren Weise
Das folgende Experiment zeigt ein Beispiel einer raschen und reproduzierbaren Reinigung von Multi-Ligandenbindungsrezeptor/Liganden-Komplexen gemäß der Erfindung. Genauer gesagt sind EPT-Komplexe von HLA-A*0201 und HLA-DR*0401/1301 von 20 g (1A) und 22g (1B) aus der menschlichen lymphoblastoiden B-Zelllinie, JY, unter Verwendung einer automatisierten Immunaffinitätschromatographie-Reinigungsstrategie in Reihe gereinigt worden. Die Chromatogramme stellen den Proteingehalt, wie nachgewiesen durch UV-Absorption bei 280 nm, auf der y-Achse und die Zeit in Minuten auf der x-Achse dar.
VERFAHREN. Die menschliche Zelllinie JY wurde bis zu einer endgültigen zellulären Dichte von ~10⁶/ml gezüchtet. Die Zellen wurden durch Sedimentation geerntet und die Pellets ohne Überstand wurden gewogen, um die vorhandene zelluläre Masse zu bestimmen, dann bei –80°C bis gerade vor der Lyse eingefroren. Das Zellpellet wurde in 10 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreit (DTT), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH-Wert 8,0 bei 4°C resuspendiert und in einem Homogenisator lysiert. Die Kerne wurden durch Sedimentation bei 4.000 × g für 5 Minuten entfernt und die Pellets gewaschen und nochmals pelletiert, bis die Überstände klar waren. Alle Überstände wurden vereinigt und die Membranfraktion wurde durch Sedimentation bei 175.000 × g für 40 Minuten geerntet. Die Pellets wurden dann in 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 4% Nonidet P-40 (NP-40) resuspendiert. Das nicht solubilisierte Membranmaterial wurde durch Sedimentation bei 175.000 × g für 2 Stunden entfernt und die NP-40-lösliche Überstandsfraktion wurde für anschließende Rezeptor:EPT-Reinigung verwendet. Multi-modale Proteinreinigung unter Verwendung von HPLC-Säulen wurde durch Koppelung der chromatographischen Sorptionsmittel in Serie mit automatisierten Umschalteventilen erzielt, welche den Protein:EPT-Komplex enthaltenden Abfluss zu anschließenden Säulen in der Sequenz leiten. Die ersten drei verbundenen Säulen wurden direkt in Folge verbunden und wirkten gemeinsam als eine einzelne vorklärende Säule unter Verwendung von Perfusions-Sorptionsmittel mit großen Durchflussporen von hoher Stärke (6000-8000 Å-Durchflussporen und 500-1000 Å-Diffusionsporen, 50 μm), beschichtet und quervernetzt mit einer hydrophilen stationären Phase, die kovalent mit Protein A verbunden war (POROS A^TM Sorptionsmittel). Diese Säulen wurden entworfen, um alle Proteine zu entfernen, die unspezifisch an das Basis-Sorptionsmittel oder an die konstante Domäne der murinen monclonalen Antikörper adsorbierten. Säule 1 war ein nicht-modifiziertes Protein A-Sorptionsmittel, Säule 2 war Protein A, konjugiert mit normalem Mausserum, und Säule 3 war Protein A, konjugiert mit Rinderserum. Die Vorreinigungs-Säulen wurden in Serie durch drei unabhängige Immunaffinitätssäulen von Protein A gefolgt, die mit spezifischen monoclonalen Antikörpern verbunden waren: anti-HLA-A2 (mAk BB7.2: Parham und Brodsky, Hum. Immunol. 3:277-299, 1981); anti-HLA-A/-B/-C (mAk W6/32: erhältlich durch die American Type Culture Collection (ATCC)); und anti-HLA-DR (mAk LB3.1: Knudson und Strominger, Hum. Immunol. 15:150-163, 1986). Die Immunaffinitässäulen wurden dann ausgiebig unter Verwendung von 50 Säulenvolumina von 20 mM MOPS/140 mM NaCl/0,1 % DOC/0,05% NaH₃ bei pH-Wert 8,0 gewaschen, gefolgt von 100 Säulenvolumina an 10 mM Tris/0,1 % DOC/0,05% NaH₃ bei pH-Wert 8,0. Die Rezeptor:EPT-Komplexe wurden unabhängig von jedem Immunaffinitätsträger unter Verwendung von 3,5 Säulenvolumina von 50 mM Carbonat/0,1% DOC/0,05% NaH₃ bei pH-Wert 11,5 eluiert. Der in jeder der 1A und 1B mit 1 markierte Peak repräsentiert das HLA-A*0201:EPT-Komplex-Elutionsprofil, während der mit 2 markierte Peak das HLA-DR*0401/1301:EPT-Komplex-Elutionsprofil repräsentiert.
Beispiel 2: Reinheitsanalyse von Multi-Ligandenbindungsrezeptor/Ligandenkomplexen
Das folgende Beispiel ist eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese-Reinheitsanalyse der Rezeptor/EPT-Komplexe, die aus den menschlichen B-lymphoblastoiden Zelllinien LG-2 und JY unter Verwendung von in Beispiel 1 beschriebenen Techniken gereinigt wurden.
VERFAHREN. Aliquots von mit Vakuum dialysierten Rezeptor-EPT-Komplexmaterial, isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und zwischen 2 und 5 μg Protein entsprechend, wurden für 5 Minuten gekocht, auf einem 12% Polyacrylamidgel aufgetrennt und unter Verwendung von Coomassie Blau gefärbt. Proben, die in den Spuren 2-4 liefen, wurden aus der menschlichen Zelllinie LG-2 gereinigt, wohingegen Spuren 5-7 aus der menschlichen Zelllinie JY gereinigt wurden. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt, in welcher die Proben wie folgt markiert waren: Spur 1: Molekulargewichtsmarker; Spur 2: HLA-A*0201; Spur 3: HLA-B*2701 und HLA-Cw1; Spur 4: HLA-DR*0101; Spur 5: HLA-A*0201; Spur 6: HLA-B*0702 und HLA-C*0701; Spur 7: HLA-DR*0401 und HLA-DR*1301.
Beispiel 3: Umkehrphasen-Auftrennungsprofile von zwei unabhängigen HLA-A*0201:EPT-Erzeugungen
Das folgende Beispiel stellt die Erzeugung von Umkehrphasen-Auftrennungsprofilen von zwei, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhaltenen, unabhängigen HLA-A*0201:EPT-Erzeugungen dar. Die zwei in 3 gezeigten, überlagerten Chromatogramme stellen das EPT-Repertoire dar, wie es durch UV-Absorption bei 210 nm nachgewiesen wurde. Sie sind überlagert, um die Reproduzierbarkeit der Auftrennung zu zeigen, die für den EPT-Profilvergleich nötig ist.
VERFAHREN. Gereinigte HLA-A*0201:EPT-Komplexe (310 μg bzw. 340 μg) wurden unter Verwendung von 10% Essigsäure säureextrahiert und für 5 Minuten auf 70°C erhitzt. Die freigesetzten EPT-Repertoires wurden aus dem denaturierten Protein durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 10 kDa-Filtrationsvorrichtung aufgetrennt. Die isolierten EPT-Repertoires wurden basierend auf relativer Hydrophobie unter Verwendung eines auf Kieselsäure basierenden C₁₈-Trägers (300 A, 5 μm) fraktioniert. Das EPT-Repertoire wurde unter Verwendung eines nicht linearen Puffers A/Puffer B-Gradientenprotokolls bei einer konstanten Durchflussrate von 50 μl/min: 0-63 Minuten 5%-33% Puffer B; 63-95 Minuten 33%-60% Puffer B; 95-105 Minuten 60%-80% Puffer B, wobei Puffer A 0,06% TFA/5% Acetonitril/H₂O und Puffer B 0,055% TFA/5% H₂O/Acetonitril ist, eluiert. Die chromatographische Analyse wurde durch UV-Absorption bei multiplen Wellenlängen (210 und 277 nm) überwacht, um Peptidbrücken und EPTs zu identifizieren, die konjugierte delokalisierte π-Elektronen (aromatische Aminosäuren) enthalten. Die hydrophoberen, einzelnen Liganden eluieren später im Gradienten, mit erhöhten Prozentsätzen von organischem Modifikator. Die Ergebnisse werden in 3 dargestellt.
Der Durchflussstrom wurde an einen 50:1-Mikrofraktions-MALDI-TOF/MS Probenplatten-Sammler angeschlossen, der geteilt war, um gleichzeitige Probensammlung und MALDI-TOF/MS Probenerzeugung zu ermöglichen. In dieser Weise wurden 2% von jeder Fraktion sofort für die Massenanalyse erzeugt, während die verbleibenden 98% von jeder Fraktion gesammelt und für die spätere Durchmusterung gelagert wurden.
Beispiel 4: Massenanalyse von einzelnen isolierten Fraktionen aus zwei Rezeptor:EPT-Präparationen
Das folgende Beispiel beschreibt Massenanalyse von einzelnen isolierten Fraktionen aus zwei Rezeptor:EPT-Präparationen. Rezeptor:EPT-Isolierung und EPT-Auftrennung wurde für HLA-A*0201 und HLA-A*0401 aus den menschlichen Zelllinien JY bzw. Priess unter Verwendung von in Beispiel 1 und Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erzielt. Repräsentative Massenanalysen für ausgewählte RP-HPLC-Fraktionen sind in 4A bzw. 4B dargestellt. 4A ist das Massen-Analysespektrum für das komplexe Gemisch von einzelnen EPTs, die in Umkehrphasen-HPLC-Fraktion 56 gefunden wurden, extrahiert aus dem HLA-A*0201 der Zelllinie JY. 4B ist das Massenanalysespektrum für die EPTs, die in der Umkehr-HPLC-Fraktion 37 gefunden wurden, extrahiert aus dem HLA-DR*0401 der Zelllinie Priess. Die y-Achse zeigt die relative Ionisierung von jedem EPT, und die x-Achse zeigt das Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) für die einzelne, geladene Art.
VERFAHREN. Die, wie in Beispiel 3 beschrieben, isolierten Proben wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, automatisch auf MALDI-TOF/MS-Probenplatten gesammelt. Zu jeder Fraktion wurden 0,5 μl UV-absorbierende Matrix hinzugefügt und unter Umgebungsbedingungen das Kristallisieren ermöglicht. Die Proben wurden dann auf einem MALDI-TOF-Massenspektrometer, Forschungsgrad, im Reflektron-Betriebsmodus analysiert. Massenspektren wurden unter einer beschleunigenden 20 kV-Spannung, 100 ns-Verzögerungszeit (verzögerte Extraktion) und einen Stickstofflaser bei 337 nm mit optimalen Laserintensitäten unter Mittelung der Ionensignale von 80 einzelnen Laserschüssen gesammelt.
Beispiel 5: Bestimmung des zellulären Quellenproteins, das durch einzelne EPTs repräsentiert wird
Das folgende Beispiel stellt die Identifizierung des zellulären Quellenproteins dar, das durch einzelne EPTs repräsentiert wird. Insbesondere kann das zelluläre Quellenprotein von jedem EPT durch Fragmentierung des EPT-Ions und anschließende Sequenzanalyse, gefolgt durch Vergleich einer ähnlichen EST- Sequenz oder einer anderen Sequenzdatenbank bestimmt werden. 5A stellt das Post-Quellenabbau/Kollisions-induzierte Dissoziationspektrum eines einzelnen EPT aus der in 4B (m/z = 1957,8) gezeigten Fraktionierung dar. 5B zeigt eine Sequenzanalyse basierend auf der Eltern-Ionenmasse, den Tochterionenfragmenten und der Immonium-Ionenzusammensetzung. 5C stellt die Identifizierung von verwandten EST-Sequenzen dar. Die in 5B bestimmte Aminosäuresequenz wurde verwendet, um eine Blastin-Suche der nicht-redundanten GENBANK+EMBL+DDBJ-EST-Abteilungen unter Verwendung der auf dem Internet basierenden Suchmaschine der NCBI National Library of Medicine durchzuführen. Die sich daraus ergebenden EST-Treffer und translatierten Leserahmen-Übereinstimmungen und Alignments werden gezeigt. Dieses Beispiel zeigt die Leichtigkeit, mit der ein Querverweis zwischen EPT-Daten und einer EST-Datengruppe möglich ist.
VERFAHREN. Post-Quellenabbau (PSD) der Zusammensetzung und Kollisions-induzierte Dissoziations-(CID) MS/MS-Spektren wurden auf einem Einzelstufen-Reflektor-Flugzeit-Massenspektrometer (PerSeptive Biosystems Voyager Elite XL, Framingham, MA) unter Nutzung von zeitlich festgelegter Ionenauswahl (das zeitlich festgelegte Ionen-Gate wurde für ein m/z = 1957,7 eingestellt) und einer beschleunigende 20 kV-Spannung. Die relevanten, fokussierten Fragment-Ionen wurden erhalten, indem das Verhältnis der beschleunigenden Spannung des Elternionen-Reflektorspiegels zur Quelle schrittweise von 1.00-0,11 reduziert wurde. Das Spektrum der Zusammensetzung wurde dann analysiert und die einzelnen Fragment-Ionen wurden zusammen der Elternionenmasse wurden verwendet, um die nicht-redundante Genpep-Datenbank auf möglich Peptidübereinstimmungen zu durchsuchen. Wie in 5B angezeigt, ist das zelluläre Wirtsprotein, aus dem der HLA-DR*0401:R4A3F37m1957-EPT stammt, HLA-A*0201.
Beispiel 6: Zweidimensionale Darstellung eines menschlichen lymphoblastoiden B-Zell-EPT-Fingerprints, extrahiert aus dem menschlichen Rezeptor HLA-DR*1501
Das folgende Beispiel beschreibt eine zweidimensionale Repräsentation eines menschlichen lymphoblastoiden B-Zell-EPT-Fingerprints, extrahiert aus dem menschlichen Rezeptor HLA-DR*1501. Die Ergebnisse werden in 6 dargestellt.
VERFAHREN. MALDI-TOF/MS-Analyse, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde für das gesamte EPT-Repertoire fertig gestellt, das aus der menschlichen lymphoblastoiden B-Zelllinie H0104 isoliert wurde. Die genauen EPT-Massen (m/z) von jedem Spektrum wurden dann aufgezeichnet und gegen die relative Elutionszeit aus der in Beispiel 3 beschriebenen Umkehrphasenauftrennung aufgetragen. Der sich ergebende „Fingerprint" wurde dann als relative Hydrophobie (x-Achse) gegen m/z oder Größe (y-Achse) aufgetragen, um in dem EPT-Profil von 6 zu resultieren.
Beispiel 7: Erzeugung von BiP-spezifischen Ligandenprofilen
Das Folgende beschreibt, wie Liganden von BiP, einem Multi-Ligandenbindungsrezeptor, isoliert werden würden, der mit Proteinen im ER interagiert.
Es gibt Hinweise, dass BiP mit Proteinen interagieren kann, um Proteinfaltung zu fördern. Ursprüngliche Versuche, BiP durch Gelfiltrationschromatographie zu reinigen, deuten darauf hin, dass BiP mit verschiedenen Proteinen im ER interagiert. (Shin und Pastan, 1979, Biochem. Biophys. Acta 576:141). Die richtige Faltung vieler Proteine, die durch die ER-Membran transloziert werden, benötigt die Bildung von Disulfidbrücken. BiP wird für die korrekte Disulfidbrückenbildung des Hämagglutininproteins von Influenza benötigt (Braakman et al., 1992, Nature 356:260-262) und interagiert mit Disulfid gebundenen Faltungszwischenprodukten von Prolactin (Kassenbrock et al., 1988, Nature 333:90-93). Darüber hinaus kann die Immunpräzipitation von T-Zell-Rezeptorproteinen, schweren Immunglobulin-Ketten und schweren MHC-Klasse-I-Ketten BiP präzipitieren (Suzuki et al., 1991, J. Biol. Chem. 114:189-204; Bole et al., 1986, J. Biol. Chem. 102:1558). Es wird daher angenommen, dass BiP ein nützlicher Multi-Ligandenbindungsrezeptor für die Isolierung von Liganden wäre, die im ER vorhanden sind.
ATP-Bindung führt zur Freisetzung von Peptiden oder Proteinen durch BiP (Munro und Pelham, 1986, Cell 46:291; Kassenbrock und Kelly, 1989, EMBO J. 8:1461). Es wurde vorgeschlagen, dass BiP mit nicht ordnungsgemäß gefalteten Proteinen interagiert und sie durch langsame Assoziation und Dissoziation, getrieben durch seine schwache ATPase-Aktivität, dazu induziert, sich ordnungsgemäß zu falten. ATP-Hydrolyse kann eine Konformationsänderung in BiP fördern, die auf das Substrat übertragen wird und in Substratfreisetzung resultiert und mit der Zeit in ordentlicher Substratfaltung. Eine Rolle für ATP in der Faltung und Entfaltung des Influenza-HA innerhalb des ER wurde durch ATP-Entzug aus den Zellen gezeigt (Braakman et al., 1992, vorstehend). Um BiP gemeinsam mit Proteinfaltungs-Zwischenprodukten oder -Peptiden zu isolieren, werden die Zellen bis zu einer geeigneten Dichte gezüchtet und dann das ATP durch Behandlung mit Apyrase (Kassenbrock et al., 1988, vorstehend) oder Inkubation in konditioniertem Medium (Braakman et al., 1992, vorstehend) entzogen. Von der Anwesenheit von Ca²⁺ wurde auch gezeigt, dass sie die Substratbindung an BiP erhöht und die Fähigkeit, BiP/Substratkomplexe zu isolieren, steigert (Kassenbrock und Kelly, 1989, vorstehend; Suzuki et al., 1991, vorstehend).
BiP-exprimierende Zellen (entweder natürlich oder rekombinant) werden unter Bedingungen gezüchtet, die BiP/Proteinkomplexe fördern. (HeLa-Zellen sind ein Beispiel solcher Zellen). Zellen werden zweimal in PBS gewaschen (13,7 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 80,9 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,4) und dann durch das Hinzufügen von Lysepuffer lysiert (50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 1% Triton X-100, 200 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, jeweils 5 μg/ml Aprotinin und Leupeptin). Die Zelllysate werden durch Vorreinigungssäulen geschickt, die in Reihe mit einer Immunaffinitätssäule verbunden sind, die anti-BiP-Antikörper enthält. Die Säule wird gewaschen und die BiP-Liganden werden durch das Entfernen von Ca²⁺ oder das Hinzufügen von überschüssigem ATP freigesetzt. Diese Liganden werden zuerst durch Größenausschluß-Chromatographie (SEC) aufgetrennt, um die kleineren Peptide von den größeren Proteinen zu trennen, von welchen bekannt ist, dass sie mit BiP interagieren. Die von BiP isolierten Peptide werden weiter durch Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) sofort nach SEC-Fraktionierung und der Massenanalyse und Sequenzidentifizierung aufgetrennt. Die durch SEC isolierten Proteine werden weiter durch Ionenaustausch gereinigt. Die auf diese Weise isolierten Proteine werden unter Verwendung von Trypsin gespalten und die anschließenden Spaltungsprodukte werden durch RPC aufgetrennt und durch Massenkartierung oder Sequenzidentifizierung unter Verwendung von Massenspektrometrie identifiziert.
Beispiel 8: Erzeugung von Calnexin-spezifischen Ligandenprofilen
Das folgende Beispiel beschreibt die Erzeugung von Calnexin-spezifischen Proteinprofilen. Nachdem Calnexin ein ER-spezifisches Transmembranprotein ist, das in einer transienten Weise selektiv mit neu synthetisierten monomeren Glycoproteinen assoziiert, insbesondere mit sekretorischen Proteinen (Ou et al., 1993, Nature 364:771) ist es ein leistungsfähiger Multi-Ligandenbindungsrezeptor für die selektive Profilerstellung von Glycoproteinen in jeder bestimmten Zelle, die Calnexin entweder natürlich oder rekombinant exprimiert.
Calnexin exprimierende Zellen von Interesse (z.B. HepG2-Zellen (menschliche hepatozelluläres Karzinom, ATCC-Nummer HB-8065) (US-Patentnummer 4.393.133)) werden in DMEM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist, bei 37°C und 5% CO₂ gezüchtet. Wenn die Zellen konfluent sind, werden sie mit Azetidin-2-carbonsäure (Azc) für 60 Minuten in Kontakt gebracht, um die Isolierung von mit Calnexin-assoziierten Proteinen zu erhöhen (Ou et al., 1993, vorstehend). Nach dieser Inkubationsdauer werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen (13,7 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 80,9 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,4) und dann durch das Hinzufügen von Lysepuffer lysiert (50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 2% Natrium-Desoxycholat, 200 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, jeweils 5 μg/ml Aprotinin und Leupeptin). Um die Isolierung von Calnexin-bindenen Liganden zu erhöhen, kann man 1 % Digitonin oder 0,5% Triton X-100 für das Natrium-Desoxycholat eintauschen (Hochstenbach et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4734). Die Zelllysate werden durch Vorreinigungs-Säulen geschickt, die in Reihe mit einer Immunaffinitäts-Säule verbunden sind, die anti-Calnexin-Antikörper enthält. Die Säule wird gewaschen und die Calnexin-Liganden durch die Entfernung von Ca²⁺ (mit einem Chelator wie zum Beispiel EGTA) oder dem Hinzufügen von überschüssigem ATP freigesetzt. Diese Liganden werden zuerst durch Größen-Ausschlußchromatographie (SEC) fraktioniert, um die kleineren Peptide von den größeren Proteinen zu trennen, von denen bekannt ist, dass sie mit Calnexin interagieren. Die von Calnexin isolierten Peptide werden weiter durch Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) gleich nach der SEC-Fraktionierung und vor der Massenanalyse und Sequenzidentifizierung aufgetrennt. Die durch SEC isolierten Proteine werden wahlweise durch Ionenaustausch weiter gereinigt. Die auf diese Weise isolierten Proteine werden dann unter Verwendung von Trypsin gespalten, wobei die folgenden Spaltungsprodukte durch RPC aufgetrennt und durch Massenkartierung oder Sequenzidentifizierung unter Verwendung von Massen-Spektrometrie identifiziert werden.
Andere Chaperone, Chaperonine und hsps mit Eigenschaften, die ähnlich jenen von BiP und Calnexin sind, können, wie vorstehend beschrieben, isoliert werden. Zum Beispiel wird p72/74, ein anderes Mitglied der Proteine der Hitzeschockfamilie (VanBusKirk et al., 1989, J. Exp. Med. 170:1799), im Lumen des ER gefunden (VanBusKirk et al., 1991, J. Immuno. 146:500); es bindet an Peptide und ATP und setzt Peptide nach der ATP-Bindung frei (Lakey et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1659; DeNagel et al., 1992, Immun. Today 13:86).
Beispiel 9: Erzeugung von GP96/GRP94-EPT-Profilen
Das folgende Beispiel beschreibt die Erzeugung von GP96/GRP94-EPT-Profilen. Nachdem GP96/GRP94 ein Mitglied der HSP90-Familie von Stressproteinen ist, die im endoplasmatischen Retikulum vorhanden sind, ist es für die selektive Profilerstellung von EPT-Banken ein leistungsfähiger Multi-Ligandenbindungsrezeptor.
GP96/GRP94 wird, wie beschrieben, aus Leberzellen gereinigt (Blachere et al. 1997, J. Exp. Med. 186:1315; Nieland et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6135). Kurz gesagt werden Leberzellen in 40 ml hypotonischem Puffer homogenisiert (30 mM NaHCO₃, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH-Wert 7,1) und ein 100.000 × g-Überstand wird erhalten. Der Überstand wird durch 50-70% Ammoniumsulfatausfällung fraktioniert und diese Fraktion wird auf eine Concanavalin A-Affinitätssäule aufgetragen. Die Proteinelution wird mit 10% α-Methylmannosid erzielt. Das Eluat wird als nächstes auf eine Anionen-Austauschsäule geladen, die mit 0,3 M NaCl äquilibriert wurde; GP96/GRP94 wird mit 0,7 M NaCl eluiert. EPT-Liganden können aus dem gereinigten GP96/GRP94-Multi-Ligandenbindungsrezeptoren unter Verwendung von saurer Elution, wie vorstehend für MHC-assoziierte EPT-Profile beschrieben, extrahiert werden. Sobald die EPTs extrahiert sind, ist die Erzeugung der EPT-Profile identisch zu den Verfahren, die für MHC-assoziierte EPT-Profile beschrieben wurden.
Beispiel 10: Erzeugung von hsp 70-EPT-Profilen
Das folgende Beispiel beschreibt die Erzeugung von hsp 70-EPT-Profilen. Hsp 70 ist ein Mitglied der HSP Familie von Stressproteinen, das in verschiedenen zellulären Kompartimenten vorhanden ist. Es ist ein leistungsstarker Multi-Ligandenbindungsrezeptor für die selektive Profilerstellung von EPT-Banken von Zellen, in welchen hsp70 exprimiert wird (z.B. Leberzellen).
Hsp70 wird, wie beschrieben (Peng, 1997, J. Immunol. Methods 204:13), aus Leberzellen gereinigt. Kurz gesagt werden Leberzellen in 40 ml hypotonischen Puffer (30 mM NaHCO₃, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH-Wert 7,1) homogenisiert und es wird ein 100.000 × g-Überstand erhalten. Der Probenpuffer wird zu 20 mM Tris-acetat, 20 mM NaCl, 15 mM β-Mercaptoethanol, 3 mM MgCl₂, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH-Wert 7,5 unter Verwendung einer PD-10-Säule (Sephadex G-25) geändert. Die Probe wird direkt auf eine ADP-Affinitätssäule aufgetragen, die mit dem gleichen, vorstehend beschriebenen Puffer äquilibriert worden ist. Die Elution von hsp 70 wird unter Verwendung von 3 mM ADP bei Raumtemperatur erreicht. Das hsp 70 wird als Nächstes unter Verwendung einer starken Anionenaustauschsäule (Mono Q) gereinigt, und mit einem 20-600 mM NaCl-Gradienten eluiert. EPT-Liganden können aus dem hsp 70-Multi-Ligandenbindungsrezeptors unter Verwendung von saurer Elution, wie vorstehend für MHC-assoziierte EPT-Profile beschrieben, extrahiert werden. Sobald die EPTs extrahiert sind, ist die Erzeugung des EPT-Profils identisch zu den für MHC-assoziierte EPT-Profile beschriebenen Verfahren.

Claims

Verfahren zur Charakterisierung einer bestimmten Zellart, wobei die Zellart einen ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst, durch das Erstellen eines reproduzierbaren Ligandenprofils der Zellart, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer ersten Probe der bestimmten Zellart, wobei die erste Probe eine erste Vielzahl von Polypeptidliganden gebunden an den ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst; (b) Isolieren des ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs von der ersten Probe; (c) Abtrennen der ersten Vielzahl von Liganden von dem ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; (d) Fraktionieren der ersten Vielzahl von Liganden; (e) Erstellen eines ersten Profils, das unter der ersten Vielzahl von Liganden basierend auf mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; (f) Bereitstellen einer zweiten Probe der bestimmten Zellart, wobei die zweite Probe im Wesentlichen identisch ist mit der ersten Probe, wobei die zweite Probe eine zweite Vielzahl von Polypeptidliganden gebunden an den ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst; (g) Isolieren des ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs von der zweiten Probe; (h) Abtrennen der zweiten Vielzahl von Liganden von dem ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; (i) Fraktionieren der zweiten Vielzahl von Liganden; (j) Erstellen eines zweiten Profils, das unter der zweiten Vielzahl von Liganden basierend auf mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; und (k) Bestätigen, dass das erste Profil und das zweite Profil im Wesentlichen identisch sind und gemeinsam ein reproduzierbares Ligandenprofil für die bestimmte Zellart darstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei anschließend an die Fraktionierungsschritte eine zweite chemische oder physikalische Eigenschaft von jedem Liganden bestimmt und in den Profilen dargestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei anschließend an die Fraktionierungsschritte eine dritte chemische oder physikalische Eigenschaft von jedem Liganden bestimmt und in den Profilen dargestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Isolierungs- und Abtrennungsschritte unter Verwendung geeigneter Säulen erfolgen, die in Reihe angeordnet sind.
Verfahren zur Charakterisierung einer bestimmten Zellart, wobei die Zellart einen ausgewählten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst, durch das Erstellen eines Ligandenprofils der Zellart, umfassend: (a) Bereitstellen einer Probe eines Lysates der bestimmten Zellart, wobei die Probe eine erste Vielzahl von an einen ersten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebundenen Polypeptidliganden und eine zweite Vielzahl von an einen zweiten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebundenen Polypeptidliganden umfasst; (b) Isolieren der ersten und zweiten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typen von der Probe; (c) Abtrennen der ersten Vielzahl von Liganden von dem ersten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ und der zweiten Vielzahl von Liganden von dem zweiten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; (d) Fraktionieren der ersten Vielzahl von Liganden und der zweiten Vielzahl von Liganden; und (e) Erstellen eines ersten Profils, das unter der ersten Vielzahl von Liganden basierend auf mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet, und eines zweiten Profils, das unter der zweiten Vielzahl von Liganden basierend auf der gleichen mindestens einen chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet.
Verfahren zum Erstellen eines Subtraktionsprofils von Polypeptidliganden, umfassend: (a) Erzeugen eines ersten Ligandenprofils mittels eines Verfahrens umfassend: (i) Bereitstellen einer ersten Probe, umfassend eine Zelle von Interesse, wobei die erste Zelle von Interesse einen bestimmten an einen ersten Satz von Polypeptidliganden gebundenen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst; (ii) Isolieren des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs und des ersten Satzes von Liganden aus der ersten Probe; (iii) Abtrennen des ersten Satzes von Liganden von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; (iv) Erstellen eines ersten Profils, das unter dem ersten Satz von Liganden basierend auf mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; (b) Erzeugen eines zweiten Profils von Liganden mittels eines Verfahrens, umfassend: (i) Bereitstellen einer zweiten Probe, umfassend eine zweite Zelle von Interesse, wobei die zweite Zelle von Interesse den bestimmten an einen zweiten Satz von Polypeptidliganden gebundenen Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ umfasst; (ii) Isolieren des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs und des zweiten Satzes von Liganden aus der zweiten Probe; (iii) Abtrennen des zweiten Satzes von Liganden von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; (iv) Erstellen eines zweiten Profils, das unter dem zweiten Satz von Liganden basierend auf der gleichen mindestens einen chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; (c) Vergleichen des ersten Profils mit dem zweiten Profil zur Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Liganden, wodurch ein Subtraktionsprofil von Liganden erstellt wird.
Verfahren zum Vergleichen einer ersten Zellprobe mit einer Referenzzellprobe, umfassend: (a) Herstellen eines ersten Ligandenprofils mittels eines Verfahrens, umfassend: (i) Bereitstellen einer ersten Zellprobe, umfassend einen bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ gebunden an einen ersten Satz von Polypeptidliganden; (ii) Isolieren des bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typs und des ersten Satzes von Liganden von der ersten Zellprobe; (iii) Abtrennen des ersten Satzes von Liganden von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ; (iv) Erstellen eines ersten Ligandenprofils, das unter dem ersten Satz von Liganden basierend auf mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; (b) Bereitstellen eines Referenzligandenprofils, das einen zweiten Satz von Polypeptidliganden repräsentiert, die von dem bestimmten Multi-Ligandenbindungsrezeptor-Typ einer Referenzzellprobe isoliert wurden, wobei das Referenzligandenprofil unter dem zweiten Satz von Polypeptidliganden basierend auf mindestens einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft unterscheidet; und (c) Vergleichen eines ersten Ligandenprofils mit dem Referenzligandenprofil zur Identifizierung von Unterschieden oder Ähnlichkeiten zwischen der ersten Zellprobe und der Referenzzellprobe.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Referenzzellprobe im Wesentlichen aus gesunden tierischen Zellen besteht und die erste Zellprobe Zellen umfasst, bei denen ein Verdacht auf eine Erkrankung besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die erste Zellprobe in Anwesenheit einer Testverbindung gezüchtete Zellen umfasst, und die Referenzzellprobe nicht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Referenzzellprobe in Anwesenheit einer Testverbindung gezüchtete Zellen umfasst, und die erste Zellprobe nicht.
Verfahren zur Erfassung eines Unterschieds zwischen dem Satz von Proteinen, die in einer ersten Zelle exprimiert werden, und dem Satz von Proteinen, die in einer zweiten Zelle exprimiert werden, umfassend das Verfahren nach Anspruch 6, wobei jeglicher Unterschied, der zwischen dem ersten Profil und dem zweiten Profil festgestellt wird, einen Hinweis auf den Unterschied zwischen dem Satz von Proteinen, die in der ersten Zelle exprimiert werden, und dem Satz von Proteinen, die in der zweiten Zelle exprimiert werden, darstellt.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend den weiteren Schritt des (d) Erstellens eines Differenzialprofils, das mindestens einige der Unterschiede zwischen dem Satz von Proteinen, die in der ersten Zelle exprimiert werden, und dem Satz von Proteinen, die in der zweiten Zelle exprimiert werden, darlegt.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend die weiteren Schritte der Selektion eines Liganden, der in einem der Profile jedoch nicht in dem anderen Profil vertreten ist, und der Identifizierung der Aminosäuresequenz des Liganden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein MHC-Klasse-I- oder ein MHC-Klasse-II-Rezeptor ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei mindestens 500 Polypeptidliganden in dem Ligandenprofil dargestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Multi-Ligandenbindungsrezeptor kein MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Rezeptor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Chaperon, ein Calnexin, ein Calreticutin, eine Mannosidase, eine N-Glycanase, ein BIP, ein grp94, ein grp96, ein E2-Ubiquitin-Trägerprotein, eine E3-Ubiquitin-Ligase, eine Unfoldase, ein Proteasom, ein Trafficking-Protein oder ein Retentionsprotein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Multi-Ligandenbindungsrezeptor ein Chaperon ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Chaperonin, hsp60, hsp65, hsp70, hsp90, hsp25 und hsp100.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei mindestens eine chemische oder physikalische Eigenschaft Hydrophobizität oder Ladung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei mindestens eine chemische oder physikalische Eigenschaft das Masse-zu-Ladung-Verhältnis umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei mindestens eine chemische oder physikalische Eigenschaft eine Aminosäuresequenz umfasst.