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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von Peptiden,
die auf der Oberfläche
von Säugerzellen
nach Zugabe eines Proteins zu den Zellen bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner diagnostische Tests, die
auf der Bestimmung solcher Peptide oder modifizierter Moleküle, die
sich aus der Bestimmung solcher Peptide ergeben, wie pharmazeutischer
Einheiten, die vorzugsweise eine spezifische biologische Aktivität und verglichen
mit den entsprechenden unmodifizierten Molekülen eine geringere oder stärkere Immunogenität besitzen,
basieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren
werden vorzugsweise mit Werkzeugen etabliert, die Massenspektroskopie
(MS) verwenden.
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Nach
der Aufnahme von Proteinen durch Säugerzellen (oder der Produktion
spezifischer Proteine innerhalb von Zellen) werden die Proteine
anschließend
abgebaut, und in der Regel erscheinen Peptidfragmente solcher Proteine,
oft in Verbindung mit anderen Proteinen, auf der Zelloberfläche. Genauer
gesagt, können
Peptidfragmente eines Proteins abgebaut und bestimmte Peptide anschließend mit
Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-)Molekülen zusammengelagert
werden, die in vielen Fällen durch
T-Zellen erkannt werden können,
um eine immunologische Antwort auszulösen. Eine derartige immunologische
Antwort kann nützlich
sein, beispielsweise wenn das Immunsystem Zellen angreift, die das
spezifische Protein produzieren, von dem die Peptidfragmente stammen,
oder sie kann schädlich sein,
beispielsweise wenn das Immunsystem Antikörper produziert, die an das
spezifische Protein binden und dessen Aktivität beschränken (zum Beispiel bei einem
pharmazeutischen Protein).
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Bis
heute ist es unmöglich,
für ein
gegebenes Protein genau vorherzusagen, an welchen Stellen innerhalb
des Proteins dieser Abbau stattfindet, so dass die genauen Peptide,
die auf der Zelloberfläche
erscheinen, nicht zuverlässig
vorhergesagt werden können.
Im Fall von MHC-Molekülen
erzielte man einen gewissen Erfolg bei der Vorhersage der Motive
von Peptiden, die an MHC binden, aber in der Praxis werden einige
dieser Peptide abgebaut, bevor sie MHC-Moleküle erreichen, und die Vorhersage, welche
Peptide abgebaut werden, ist nicht zuverlässig. Somit ist das Standardverfahren
zum Nachweis von Peptiden auf der Zelloberfläche die Elution solcher Peptide,
gefolgt von der Bestimmung ihrer Sequenz. Solche Verfahren sind
keine Routine und zudem undurchführbar,
wenn eine Ana lyse von Zelloberflächenpeptiden
auf mehreren Zelltypen oder an mehreren MHC-Molekülen erforderlich
ist.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden, die insbesondere von mehreren MHC-Molekülen bereitgestellt
werden, auf der Oberfläche
von Zellen bereitzustellen. Es ist ferner eine Aufgabe der Erfindung, diese
Information entweder für
das Design eines pharmazeutischen Moleküls oder für das Design eines Vakzinmoleküls oder
für einen
diagnostischen Test zu verwenden.
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Bei
einem pharmazeutischen Molekül
ist es eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Peptide
zu identifizieren, die nach Aufnahme oder Produktion eines Proteins
durch Zellen von MHC-Molekülen
bereitgestellt werden, und unter Verwendung dieser Information das
Protein so zu verändern,
dass solche Peptide nicht mehr bereitgestellt werden.
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Bei
einem Vakzinmolekül
ist es eine besondere Aufgabe, Peptide zu identifizieren, die nach
Aufnahme oder Produktion eines Proteins durch Zellen von MHC-Molekülen bereitgestellt
werden, und eines oder mehrere dieser Peptide innerhalb eines Vakzinmoleküls zur Stimulation
des Immunsystems zu verwenden.
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Sowohl
bei pharmazeutischen als auch bei Vakzinmolekülen ist es eine besondere Aufgabe
der vorliegenden Erfindung, Peptide zu identifizieren, die von vielen
verschiedenen MHC-Molekülen
bereitgestellt werden, um unterschiedliche allotypische und genotypische
Varianten durch verschiedene Populationen hindurch mit einzuschließen.
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Bei
einem diagnostischen Test ist es eine besondere Aufgabe, Peptide
zu bestimmen, die nach Aufnahme oder Produktion eines Proteins durch
Zellen von MHC-Molekülen
bereitgestellt werden, und diese Bestimmung als Basis für einen
Test zum Nachweis eines biologischen oder physiologischen Ereignisses,
zum Beispiel zum Nachweis einer Infektion, zu verwenden.
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Bei
einem diagnostischen Test ist es eine besondere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, Peptide zu identifizieren, die von Zellen eines Testindividuums
bereitgestellt werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine genaue und umfassende Analyse
von Peptiden auf der Oberfläche
von Zellen und insbesondere von Peptiden in Verbindung mit MHC-Molekülen bereit.
Die Bestimmung des Profils oder der Identität von Peptiden auf der Zelloberfläche wird
insbesondere mittels Massenspektroskopie (MS) durchgeführt.
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Von
anderen wurden bereits MHC/Peptid-Komplexe zu bestimmten Zwecken
gereinigt. Tatsächlich
waren Verfahren zur immunologischen Anreicherung von sowohl MHC-Klasse-I-
als auch -Klasse-II-Molekülen
förderlich
bei der Aufklärung der
Peptid-MHC-Bindungswechselwirkung und gestatteten die Aufklärung von
MHC-Bindungsmotiven. Beispiele in diesem Zusammenhang sind u.a.
US5,989,565 und
US6,077,519 , in denen Verfahren zur
Identifizierung autologer T-Zell-Epitope mittels Säureelution
von Peptiden von der Oberfläche
von Patiententumorzellen oder dendritischen Zellpopulation bereitgestellt
werden. Die eluierten Peptidsequenzen eignen sich zum Design synthetischer
Peptide zur Herstellung von Vakzinen.
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Ebenso
stellen Salter et al. [
US5,487,982 ] genetisch
veränderte,
temperaturempfindliche MHC-Klasse-I-Moleküle bereit, welche die leichte Entfernung
von Peptiden, die an das mutierte MHC-Klasse-I-Molekül gebunden
sind, von in vitro gezüchteten,
veränderten
Zellen gestatten.
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Weitere
Beispiele des Standes der Technik sind u.a. Langlade-Demoyen et
al. [WO9744667], die gereinigte MHC-Peptid-Komplexe als Affinitätsreagenzien
zur Anreicherung tumorspezifischer T-Zellen. für In-vitro- und In-vivo-Tumorimmuntherapien und
andere Anwendungen nutzen. Ebenso stellen
US5,763,585 ,
US5,734,023 und andere Verfahren zur
Reinigung bestimmter MHC-Peptid-Komplexe für die Verwendung als therapeutische
Einheiten zum Beispiel zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen
bereit, und Deshpande et al. [WO9740852] offenbaren modifizierte
Peptide mit stärkerer
Bindung an ein MHC-Klasse-II-Protein, wobei der gesamte Komplex
als rekombinantes Fusionsprotein bereitgestellt wird, das auch für die Verwendung
bei der Behandlung von Erkrankungen in Verbindung mit autoreaktiven
T-Zellen bestimmt ist.
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WO9734143
und
US5,792,604 stellen
Verfahren zur Identifikation MHC-Klasse-I-restringierter Antigene
bereit, die durch den zellulären
Sekretionsweg endogen prozessiert werden. Dieser biologische Assay
erfordert geprimete cytotoxische T-Zellen und eine Quelle für "Indikator"-Zielzellen, auf
die durch das Vorhandensein prozessierter Peptide, die in das Medium
sezerniert werden, die Lyse gerichtet wird. Das Schema eignet sich
zur Identifikation von Substanzen, die die endogenen Prozessierungswege
der Donorzellen beeinflussen können.
Zu weiteren komplexen Schemata auf biologischer Basis für die Identifikation
MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierter
T-Zell-Epitope gehört
WO00/67761, in der ein Verfahren bereitgestellt wird, das genetische
Vakzinierung und Isolation von dendritischen Zellen und Splenocyten
zur Durchführung
eines biologischen In-vitro-T-Zell-Aktivierungsassays
nutzt.
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Die
Erfinder haben erkannt, dass Instrumente auf MS-Basis zur Analyse
von ganzen Zellen oder Zellextrakten angewendet und dass die Daten
in einen Weg zur rationalen Entwicklung therapeutischer Moleküle oder
diagnostischer Assays eingebracht werden können.
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Große und komplexe
Moleküle
biologischen Ursprungs sind einer Analyse mittels Massenspektroskopie
(MS) zugänglich,
jedoch erst nach ihrer Ionisierung. Zwei alternative Ansätze zur
Ionisierung biologischer Moleküle
für die
MS sind auf diesem Gebiet zu anerkannten Technologien geworden.
Dabei handelt es sich um Elektrosprayionisation (ESI) und matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation
(MALDI). Bei der ESI wird die Probe durch eine geladene enge Kapillare
gepumpt und durch einen parallelen Gasstrom zerstäubt, bis
schließlich
durch elektrostatische Abstoßung
eine Desorption der Analytionen in das Massenspektrometer ausgelöst wird.
Bei der ESI handelt es sich um eine Durchflusstechnik, die sich als
solche leicht mit stromaufwärts
durchgeführten Probentrenntechnologien,
wie Flüssigkeitschromatographie
(LC) oder Kapillarelektrophorese (CE) verbinden lässt [Cao & Moini (1998)
Am. Soc. Mass Spectrom. 9: 1081-1088]. Diese Merkmale stehen im Gegensatz
zu MALDI-MS-Techniken, bei denen die Probe innerhalb eines kristallinen
Matrixmaterials eingebettet ist, das auf dem Probenteller des Instruments
abgeschieden wird. Eine Ionisierung wird durch Laseranregung der
Matrix erzielt, und die desorbierten Analytionen werden in den Massenanalysator
hinein beschleunigt. Daher ist MALDI ein diskontinuierliches Verfahren,
und es werden mehrere Laser impulse zur Erzeugung von Ionen verwendet, wobei
die Daten kumulativ im Massenanalysator gesammelt werden.
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Bei
der MALDI wird die Massenanalyse am häufigsten durch ein Time-of-Flight- (TOF-) Instrument
durchgeführt,
wobei die Flugzeit vom ionisierenden Laserimpuls bis zum Nachweis
gemessen wird, wodurch ein Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) berechnet
werden kann. Solche Detektoren sind in verschiedenen kommerziell
erhältlichen
Instrumenten mehreren technischen Verfeinerungen unterzogen worden.
Einige Modelle gestatten die Analyse von metastabilen (post source
decay) Ionenfragmenten für
die Peptidsequenzableitung und andere Strukturbestimmungen. Die
Durchflussnatur der auf ESI basierenden Instrumente führt zur
Verwendung von abtastenden Analysegeräten (z.B. Quadrupol- oder Magnetsektor-Massenanalysegeräten), obwohl auch
andere Instrumentenformate genutzt werden können. Ein übliches Format ist das Tandem-MS-System,
bei dem Doppel-Massenanalysegeräte im Tandem
angeordnet und über
eine "Kollisionskammer", die Inertgasmoleküle enthält, verbunden
sind. Das letztere Merkmal gestattet die Erzeugung von stoßinduzierten
(collision induced decay) Ionen sowie die Bestimmung der Peptidsequenz
aus der gegebenen Eingabeprobe. Mehrfach- und Hybridinstrumentenformate
können
zur Analyse von mit der Zelloberfläche verbundenen (MHC-) Peptiden angeordnet
und genutzt werden.
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Andere
haben MS zur Analyse von Peptiden genutzt, die von MHC- und insbesondere
von MHC-Klasse-I-Molekülen
eluiert wurden, worüber Cox
et al. eine Übersicht
geben [Cox, A. L. et al. (1997) S. 141-160 in MHC1:A Practical Approach Hrsg.
Fernadez N. & Butcher
G. Oxford University Press, Oxford, GB], und eine neuere Übersicht über dieses
Gebiet wird von De Jong gegeben [De Jong, A. (1998) Mass Spectrometry
Reviews 17: 311-335]. So nutzen Ovysyannikova et al. [Ovysyannikova
et al. (2001) J. Immunol. Methods 246: 1-12] MALDI-TOF zur Analyse
von Selbst-Peptiden,
die vom MHC-Klasse-II-Allel DRB1*0401 nach Behandlung der Zellen
mit einem Masernvirus-Vakzin säureeluiert wurden.
Ebenso beschreiben Sickman et al. [Sickman, A. et al. (2000) Analyst
125: 569-573] die Identifizierung von MHC-Klasse-II-gebundenen Peptiden aus
Ratten-Langerhans-Zellen
unter Verwendung einer Kombination von LC- und MALDI-MS-Techniken.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet und erweitert jedoch diesen gesamten
Stand der Technik, indem sie zum ersten Mal ein verallgemeinertes Schema
zur Aufklärung
von Peptidspezies, die an MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Moleküle binden, unter
Verwendung von Instrumenten auf MS-Basis bereitstellt, und stellt
in der ersten Ausführungsform Verfahren
zur Beseitigung der Bindungswechselwirkung durch Aminosäuresubstitution
innerhalb der Peptidsequenz zum Zweck der Entwicklung eines therapeutischen
Proteins mit verringerter oder fehlender Fähigkeit, bei Verabreichung
an einen Patienten, vorzugsweise einen menschlichen Patienten, eine
MHC-vermittelte Immunantwort bereitzustellen, bereit. Es ist eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Entwicklung
eines therapeutischen Moleküls
mit verringerter Fähigkeit,
nach Verabreichung an einen Patienten eine Immunantwort auszulösen, bereitzustellen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden auf der Oberfläche
von Zellen bereitzustellen, wobei die Peptide insbesondere in Verbindung
mit MHC-Molekülen
vorliegen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum formalen
Nachweis von auf der Oberfläche
von Zellen bereitgestellten Peptiden in Verbindung mit MHC-Molekülen bereitzustellen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden in Verbindung mit mehreren verschiedenen MHC-Molekülen, die
auf der Oberfläche
von Zellen vorliegen, bereitzustellen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden in Verbindung mit MHC-Molekülen bereitzustellen, wobei
diese Peptide von einem exogenen Protein stammen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden in Verbindung mit MHC-Molekülen bereitzustellen, wobei
diese Peptide von einem endogenen Protein stammen.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden auf der Oberfläche
einer Zelle nach einem Verfahren bereitzustellen, durch das die
Zellen von Interesse mit einem exogenen Protein oder einem exogenen
Mikroorganismus in Kontakt gebracht wurden, so dass ihr Repertoire
von Oberflächenpeptiden
sich von dem Repertoire unterscheidet, das auf ansonsten identischen
Bezugszellen, die jedoch nicht mit dem exogenen Protein in Kontakt
gebracht wurden, dargeboten wird.
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Bei
dem exogenen Protein kann es sich um eine gereinigte Zubereitung
handeln, die aus einer Säugerquelle,
wie einer Zelllinie oder Gewebe ex vivo extrahiert wurde, oder das
Protein kann eine rekombinante Zubereitung sein, die aus einer beliebigen
biologischen Quelle gereinigt wird, die genetisch verändert wurde,
damit sie das Protein exprimiert. Das Protein kann repräsentativ
für ein
natürlich
vorkommendes Protein oder eine Fusion von einem oder mehreren natürlich vorkommenden
Proteinen sein. Das Protein kann in vitro erzeugt worden sein, wobei
es eine Zusammenlagerung natürlich
vorkommender Bausteine ist, oder vollkommen synthetisch oder erdacht
sein und kein Gegenstück
in der Natur besitzen.
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Das
Protein kann beispielhaft für
eine Klasse von Proteinen sein, wie Antikörpermoleküle und ihre Derivate, Cytokine,
Wachstumsfaktoren, Leukotriene, Hämostasefaktoren, oder kann
ein Zelltoxin sein oder enzymatische Fähigkeit oder Funktion besitzen. Am
stärksten
bevorzugt ist das Protein ein therapeutisches Protein.
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Es
ist bekannt, dass die Wirksamkeit mehrerer therapeutischer Proteine
durch die Induktion unerwünschter
Immunreaktionen gegen das therapeutische Protein beschränkt wird.
Beispiele umfassen monoklonale Antikörper [Schroff, R. W. et al.
(1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. et al. (1985) J.
Immunol. 135: 1530-1535] und ferner einige Proteine menschlichen
Ursprungs, wie Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor
[Wadhwa, M. et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361 ] und Interferon-alpha
2 [Russo, D. et al. (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R.
et al. (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413], unter anderen.
Deshalb besteht ein erheblicher Bedarf an Verfahren, die in der Lage
sind, Determinanten zu identifizieren, die an der Induktion einer
Immunantwort gegen ein therapeutisches Protein beteiligt sind.
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Ein
maßgeblicher
Faktor bei der Induktion einer Immunantwort ist das Vorliegen von
Peptiden innerhalb des Proteins, die die Aktivität von T-Zellen über die
Präsentation
an MHC-Klasse-II-Molekülen stimulieren
können,
so genannten T-Zell-Epitopen. Um Immunogenität zu beseitigen oder zu verringern, ist
es wünschenswert,
T-Zell-Epitope im Protein zu identifizieren und daraus zu entfernen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren bereitzustellen,
die den Nachweis und die Identifizierung von T-Zell-Epitopen gestatten.
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Exogene
Proteine werden aufgenommen und für die Präsentation in Verbindung mit MHC-Klasse-II-Molekülen des
DR-, DQ- oder DP-Typs prozessiert. MHC-Klasse-II-Moleküle werden
von professionellen antigenbereitstellenden Zellen (APC), wie u.a.
Makrophagen und dendritischen Zellen, exprimiert. Die Fähigkeit
eines Peptids, für
die Präsentation
an der Oberfläche
einer APC an ein gegebenes MHC-Klasse-II-Molekül zu binden, hängt von
einer Reihe von Faktoren, ganz besonders von seiner Primärsequenz,
ab. Dies beeinflusst sowohl seine Neigung zur proteolytischen Spaltung
als auch seine Affinität
zur Bindung innerhalb der Peptidbindungsspalte des MHC-Klasse-II-Moleküls. Der MHC-Klasse-II/Peptid-Komplex
auf der APC-Oberfläche
stellt eine Bindungsstelle einem bestimmten T-Zell-Rezeptor (TCR) bereit,
der in der Lage ist, Determinanten zu erkennen, die sowohl von exponierten
Resten des Peptids als auch von dem MHC-Klasse-II-Molekül bereitgestellt werden. Im
Stand der Technik gibt es Verfahren zum Identifizieren synthetischer
Peptide, die an MHC-Klasse-II-Moleküle binden
können.
Solche Peptide können
möglicherweise aufgrund
der Prozessierungswege oder anderer Phänomene insbesondere in vivo
nicht in allen Situationen als T-Zell-Epitope fungieren. Im Stand
der Technik gibt es ferner Computerverfahren zur Vorhersage potenzieller
T-Zell-Epitope oder
zur Erkennung von Sequenzmotiven in experimentell bestimmten T-Zell-Epitopen.
Die Schemata umfassen Techniken zur Vorhersage MHC-Klasse-II-bindender
Peptide, wie in WO98/52976 bereitgestellt, worin ein computergestütztes Faltungserkennungs-
(Threading-) verfahren Peptidsequenzen mit dem Potenzial, nur an eine
Untergruppe möglicher
menschlicher MHC-Klasse-II-DR-Allotypen zu binden, identifiziert.
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Die
T-Zell-Epitop-Identifizierung ist der erste Schritt zur Epitopbeseitigung,
wie in WO98/52976 und WO00/34317 erkannt wird. Bei diesen Lehren werden
vorhergesagte T-Zell-Epitope durch Verwendung von überlegter
Aminosäuresubstitution
innerhalb der Primärsequenz
des therapeutischen Proteins entfernt. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, Verfahren zur Entwicklung modifizierter Proteine bereitzustellen,
wobei das Immuncharakteristikum mithilfe verringerter Anzahlen an
potenziellen T-Zell-Epitopen
modifiziert wird. Die identifizierten Sequenzen liegen dabei auf
der Oberfläche MHC-tragender
Zellen oder gebunden an MHC-Präparationen
nach den natürlichen
intrazellulären
Prozessierungsereignissen, die in jeder beliebigen kompetenten APC
oder ähnlichen
Zelle vorhanden sind, vor. Außerdem
können
gemäß dem erfindungsgemäßen Schema
identifizierte Peptide von jedem MHC-Allotyp oder einem Gemisch
von Allotypen, einschließlich
derjenigen der Spezifitäten
DR, DQ oder DP für
MHC-Klasse-II, nachgewiesen
werden.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung den Nachweis von Peptiden gestattet, die
in der Oberfläche von
Zellen und insbesondere in Verbindung mit MHC-Molekülen der Bezeichnungen Klasse
I und Klasse II bereitgestellt werden, soll sie nicht auf ganze
Zellen beschränkt
sein, sondern umfasst auch die Analyse von Peptiden auf der Oberfläche von
Exosomen. Peptid-MHC-Komplexe
liegen in hoher Konzentration auf der Oberfläche exosomaler Vesikel vor,
die von Zellen stammen, die gewöhnlich
MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren.
Unter bestimmten Umständen
kann der Ausstoß an
Exosomen von der Oberfläche
einer APC erhöht
sein, und man kennt Verfahren zur Anreicherung oder Isolation von
Exosomen [Raposo, G. et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1161-1172;
Clayton, A. et al. (2001) J. Immunol. Methods 247: 163-174]. Die
Analyse von APC-Präparationen
und Präparationen
exosomaler Partikel, die aus APC stammen, fallen daher ebenfalls
unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
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Zusammengefasst,
betrifft die Erfindung die folgenden Punkte:
- • Ein Verfahren
zur Entwicklung eines pharmazeutischen Proteins oder Polypeptids
oder Vakzinantigens mit einer spezifischen biologischen Aktivität und einer
geringeren oder stärkeren
Immunogenität
als irgendein unmodifiziertes Protein oder Polypeptid mit der gleichen
biologischen Aktivität, durch
(i)
In-Kontakt-bringen von Zellen mit dem Protein oder Polypeptid, so
dass ein Repertoire von Oberflächenpeptiden
auf den Zellen oder deren exosomalen Vesikeln erzeugt wird, das
sich von dem Repertoire an Oberflächenpeptiden unterscheidet,
die auf Bezugszellen dargeboten werden, die nicht in Kontakt gebracht
wurden,
(ii) Analysieren der Zellen oder deren exosomaler Vesikel
hinsichtlich Peptiden, die auf der Oberfläche der Zellen oder deren exosomaler
Vesikel gebunden sind, und
(iii) Zuordnen der Peptide zu der
Sequenz des pharmazeutischen Proteins oder Polypeptids oder Vakzinantigens
gemäß Standardverfahren.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, das ferner die folgenden Schritte umfasst:
(iv)
Modifizieren der Peptide, um ihre Bindung an MHC-Moleküle zu verändern, und
(v)
Konstruieren von Sequenzvarianten des endgültigen pharmazeutischen Proteins
oder Polypeptids durch Einbringen von einer oder mehreren der modifizierten
Peptidsequenzen in die Sequenz des Protein- oder Polypeptidmoleküls gemäß Standardverfahren.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Analyse der Zellen oder deren
exosomaler Vehikel von Schritt (ii) unter Verwendung von Massenspektroskopie
(MS), vorzugsweise MALDI-MS und ESI-MS, durchgeführt wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei das pharmazeutische Protein oder
Polypeptid derart modifiziert wird, dass eines oder mehrere der
Peptide nach In-Kontakt-bringen von Zellen mit dem Protein oder
Polypeptid nicht mehr gebunden werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die auf der Oberfläche der
Zellen oder exosomalen Vesikel gemäß Schritt (i) gebundenen Peptide
in Verbindung mit MHC-Molekülen
vorliegen und wobei die Analyse der Zellen oder deren exosomaler
Vesikel gemäß Schritt
(ii) unter Verwendung von MS durchgeführt wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die auf der Oberfläche der
Zellen oder exosomalen Vesikel gemäß Schritt (i) gebundenen Peptide
Produkte des intrazellulären
Peptidase- und Transport(Trafficking-) Wegs sind.
- • Ein
entsprechendes Verfahren zur Entwicklung eines pharmazeutischen
Proteins oder Polypeptids mit geringerer Immunogenität, wobei
die Modifikation der immunogenen Peptide durch Beseitigen oder Verringern
ihrer Bindung an MHC-Moleküle,
gegebenenfalls durch Testen der modifizierten Peptide hinsichtlich
ihrer Bindung an die Zelloberfläche,
wie in Anspruch 1 angegeben, durchgeführt wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Beseitigung oder Verringerung
der Bindung der Peptide an MHC-Moleküle durch Ersetzen, Hinzufügen oder
Deletieren von einem oder mehreren Aminosäureresten innerhalb der Sequenzregion
des Peptids innerhalb des pharmazeutischen Proteins oder Polypeptids
durchgeführt
wird.
- • Ein
Verfahren zur Entwicklung eines pharmazeutischen Proteins oder Polypeptids
mit stärkerer Immunogenität, wobei
die Modifikation der Peptide durch Verstärken ihrer Bindung an MHC-Moleküle, gegebenenfalls
durch Testen der modifizierten Peptide hinsichtlich ihrer Bindung
an die Zelloberfläche,
wie in Anspruch 1 angegeben, durchgeführt wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Verstärkung der Bindung der Peptide
an MHC-Moleküle
durch Ersetzen, Hinzufügen
oder Deletieren von einem oder mehreren Aminosäureresten innerhalb der Sequenzregion
des Peptids durchgeführt
wird, wodurch die Aktivität
des Peptids, als T-Zell-Epitop zu wirken, erhöht und/oder das Spektrum an
MHC-Typen, auf die das T-Zell-Epitop restringiert ist, verbreitert
wird und/oder mehrere ansonsten nicht zusammenhängende Epitope zu einer einzigen
Einheit vereinigt werden.
- • Ein
Verfahren zur Entwicklung eines Vakzins durch
(i) In-Kontakt-bringen
von Zellen mit einem Protein oder Polypeptid oder Mikroorganismus
mit immunogener Aktivität,
Erzeugen eines Repertoires von Oberflächenpeptiden auf den Zellen
oder deren exosomalen Vesikeln, das sich von dem Repertoire an Oberflächenpeptiden
unterscheidet, die auf Bezugszellen dargeboten werden, die nicht
in Kontakt gebracht wurden,
(ii) Analysieren der Zellen oder
deren exosomaler Vesikel, auf deren Oberfläche Peptide gebunden sind,
(iii)
Zuordnen der Peptide zu der Sequenz des Proteins oder Polypeptids
gemäß Standardverfahren
und
(iv) Konstruieren von Sequenzvarianten des endgültigen pharmazeutischen
Vakzins durch Einbringen von einem oder mehreren Peptiden in die Sequenz
des Vakzinmoleküls
gemäß Standardverfahren,
wobei die Analyse der Zellen oder der exosomalen Vesikel darin unter
Verwendung von MS durchgeführt
wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren unter Verwendung menschlicher Zelllinien,
die genetisch verändert
wurden, so dass sie MHC-Moleküle produzieren.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Ausgangs- (nicht genetisch veränderte)
Zelllinie keine MHC-Moleküle
produziert.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Ausgangszelllinie keine MHC-Klasse-I-Moleküle produziert.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Ausgangszelllinie keine MHC-Klasse-II-Moleküle produziert.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei nichtmenschliche Zellen, die nicht
ihre eigenen MHC-Moleküle
produzieren, genetisch verändert werden,
so dass sie MHC-Moleküle
produzieren, und wie angegeben verwendet werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die MHC-Moleküle von MHC-Klasse-II stammen.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die MHC-Moleküle HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP sind.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die MHC-Moleküle von MHC-Klasse-I stammen.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei eine Kombination von Zelllinien
oder Zellproben, die ein umfassendes Gemisch verschiedener MHC-Allotypen
und -Genotypen bereitstellen, verwendet wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Peptide von einem exogenen Protein
oder Mikroorganismus stammen.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Peptide von einem endogenen
Protein stammen.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei menschliche dendritische Zellen
oder deren exosomale Vesikel, die nach Zugabe des Proteins oder
Polypeptids oder Mikroorganismus Peptide an MHC-Molekülen bereitstellen,
verwendet werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei menschliche antigenbereitstellende
Zellen oder deren exosomale Vesikel, die nach Zugabe des Proteins oder
Polypeptids oder Mikroorganismus Peptide an MHC-Molekülen bereitstellen,
verwendet werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die MHC-Moleküle vor der Peptidanalyse angereichert
werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Peptide vor der Analyse von
der Zelloberfläche
eluiert werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei die Peptide vor der Analyse von
MHC-Molekülen
eluiert werden.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei MALDI-MS verwendet wird.
- • Ein
entsprechendes Verfahren, wobei ESI-MS verwendet wird.
- • Ein
Verfahren zur Entwicklung eines diagnostischen Tests durch
(i)
Analysieren geeigneter menschlicher Zellen hinsichtlich Oberflächenpeptiden
und
(ii) entweder (a) Erzeugen eines Profils von Peptiden,
die auf der Zelloberfläche
erscheinen, und gegebenenfalls Vergleichen mit anderen Profilen, um
eine Anomalität
oder Erkrankung in Verbindung mit den menschlichen Zellen zu identifizieren,
oder (b) Bestimmen der Sequenz spezifischer Peptide auf der Zelloberfläche als
Mittel zum Bestimmen spezifischer Peptide, die zur Identifizierung
einer Anomalität
oder Erkrankung in Verbindung mit den menschlichen Zellen verwendet
werden können.
- • Verwendung
eines Proteins oder Polypeptids, das durch eines der vorstehend
beschriebenen Verfahren erhalten wird, als pharmazeutische therapeutische
Einheit.
- • Verwendung
eines Proteins oder Polypeptids, das durch eines der vorstehend
beschriebenen Verfahren erhalten wird, als Vakzin.
- • Verwendung
eines Proteins oder Polypeptids, das durch eines der vorstehend
beschriebenen Verfahren erhalten wird, als pharmazeutische therapeutische
Einheit mit verringerter Immunogenität.
- • Verfahren
zum Nachweis von Peptiden auf der Oberfläche von Zellen oder deren exosomalen Vesikeln,
die von einem Protein oder Polypeptid stammen, durch
(i) In-Kontakt-bringen
von Zellen mit dem Protein oder Polypeptid oder einem Gen, welches
für dieses
Protein oder Polypeptid kodiert, was ein Repertoire von Oberflächenpeptiden
auf den Zellen oder deren exosomalen Vesikeln erzeugt, das sich
von dem Repertoire an Oberflächenpeptiden unterscheidet,
die auf Bezugszellen dargeboten werden, die nicht in Kontakt gebracht
wurden,
(ii) Analysieren der Zellen oder exosomaler Vesikel
darin, auf deren Oberfläche
die Peptide gebunden sind,
(iii) Zuordnen der Peptide zu der
Sequenz des Proteins oder Polypeptids gemäß Standardverfahren, wobei
die Analyse der Zellen oder exosomalen Vesikel mittels MS, vorzugsweise
MALDI-MS, durchgeführt
wird.
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Das
Verfahren nach dem Schema unter gemäß der ersten hauptsächlichen
Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung besteht somit darin, die Verfahren hierin
anzuwenden, um:
- 1. Ein oder mehrere prozessierte
T-Zell-Epitope innerhalb der Aminosäuresequenz eines Zielproteins
zu identifizieren.
- 2. Neue Sequenzvarianten des Zielproteins zu gestalten, wobei
eine oder mehrere Aminosäuren
innerhalb der identifizierten potenziellen T-Zell-Epitope derart
modifiziert werden, dass die Aktivität des T-Zell-Epitops, wie durch die Bindung
der Peptide an MHC-Moleküle
oder ganze Zellen oder andere Mittel bestimmt, im Wesentlichen verringert
oder beseitigt ist. Es ist wichtig, dass solche Sequenzvarianten
auf eine Weise erzeugt werden, dass die Schaffung neuer potenzieller T-Zell-Epitope
durch die Sequenzveränderungen vermieden
wird, wenn diese neuen potenziellen T-Zell-Epitope nicht wiederum
auf eine Weise modifiziert werden, dass die Aktivität des T-Zell-Epitops
im Wesentlichen verringert oder beseitigt wird.
- 3. Solcher Sequenzvarianten und Testen der Varianten zu konstruieren,
um eine oder mehrere Varianten mit wünschenswerten Eigenschaften
zu identifizieren.
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Gemäß diesem
Schema wird eine Reihe von Variantenproteinen erzeugt und getestet,
am stärksten
bevorzugt mittels DNA-Rekombinationstechniken, obwohl andere Verfahren,
einschließlich
chemischer Synthese, ebenfalls ewrogen werden können. Es wird erwartet, dass
einzelne Aminosäuresubstitutionen
innerhalb eines gegebenen potenziellen T-Zell-Epitops durchgeführt werden,
um das Epitop zu beseitigen. Kombinationen von Substitutionen innerhalb
eines einzelnen Epitops können
erwogen werden.
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Unter
einem hauptsächlichen
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Population von Säugerzellen
mit einem Testprotein inkubiert oder mit einem Gen, welches für das Testprotein
kodiert, transfiziert, und nach Aufnahme oder Expression des Proteins
und seinem Abbau wird das Profil oder die Identität von Peptiden
an der Zelloberfläche
bestimmt. Genauer gesagt, stellen MHC-Moleküle, insbesondere mehrere MHC-Moleküle, solche
Peptide bereit. Als ein Aspekt dieser Ausführungsform ist es wichtig,
Peptide zu analysieren, die an vielen verschiedenen MHC-Molekülen bereitgestellt
werden, und daher wird die Analyse vorzugsweise an mehreren Zellpopulationen
durchgeführt,
die einen sehr großen
Anteil an MHC-Allotypen und – Genotypen umfassen,
die man in der Weltpopulation antrifft. Solche Zellpopulationen
können
entweder durch Sammeln mehrerer Zellpopulationen aus der Weltpopulation
oder unter Verwendung von Zellen, die genetisch verändert wurden,
so dass sie mehrere MHC-Typen produzieren, erhalten werden. Von
besonderem Nutzen sind Zelllinien, in denen keine endogenen MHC-Moleküle produziert
werden und die einen niedrigen Hintergrund von Peptiden auf der
Zelloberfläche
darbieten.
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Aufgrund
der großen
Zahl an menschlichen MHC-Allotypen und -Genotypen, jeweils mit der
Fähigkeit,
an ein anderes Profil von Peptiden von einem beliebigen gegebenen
Protein zu binden, umfassten frühere
Ansätze
zur umfassenden Identifizierung von T-Zell-Epitopen, wie vorstehend
beschrieben, größtenteils
prädiktive
Ansätze
an Stelle entweder biochemischer (wobei Peptide hinsichtlich der
Bindung an eine große
Zahl von MHC-Typen
getestet werden) oder biologischer Ansätze (wobei Peptide hauptsächlich hinsichtlich
der Aktivierung oder Stimulation von T-Zellen getestet werden).
Für Peptide,
die an MHC-Klasse-II binden, umfassen diese prädiktiven Verfahren Motiv- und
künstliche
neuronale Netzwerk-Techniken, wodurch eine große Anzahl an Sequenzen von
T-Zell-Epitopen analysiert werden, um für die anschließende prädiktive
Analyse anderer Peptide spezifische Kombinationen von Aminosäuren zu
bestimmen, die diesen Epitopen gemeinsam sind. Für MHC-Klasse-II sind solche
prädiktiven
Ansätze
jedoch beschränkt
und lassen oft einen Teil der T-Zell-Epitope aus (falsch Negative)
oder ordnen bestimmte Peptide den T-Zell-Epitopen zu, wenn diese in
der Praxis eine solche Aktivität
nicht besitzen (falsch Positive). Eine weitere hauptsächliche
Beschränkung
prädiktiver
Ansätze
und auch biochemischer und biologischer Ansätze mit synthetischen Peptiden
ist die Unfähigkeit,
die Prozessierung des gegebenen Proteins zu erhellen, die beeinflussen kann,
welche Peptide durch MHC-Moleküle
bereitgestellt werden. Daher werden verbesserte Verfahren zur genauen
und umfassenden Identifizierung von T-Zell-Epitopen ohne nennenswerte
falsch Negative oder falsch Positive benötigt, und die vorliegende Erfindung
als solche stellt eine solche Verbesserung bereit.
-
Zur
Entwicklung eines menschlichen pharmazeutischen Proteins gemäß der ersten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung besteht eine besondere Anwendung darin,
ein Protein zu erzeugen, wobei Epitope zur Aktivierung und/oder
Stimulation von Helfer-T-Zellen entfernt werden. In diesem Fall
liegt das primäre
Interesse an von MHC-Klasse-II bereitgestellten Peptiden. Zur Entwicklung
eines pharmazeutischen Proteins, das in einem großen Anteil
der Menschen wirksam ist, ist es notwendig, Peptide innerhalb des
Proteins zu identifizieren, die durch einen oder mehrere der zahlreichen
MHC-Allotypen bereitgestellt werden können, und diese Peptide anschließend zu
verändern,
um die Fähigkeit
zur MHC-Bindung zu beseitigen. Früher war die umfassende Identifizierung
von Peptiden, die durch MHC-Klasse-II bereitgestellt werden, beschränkt durch
die Schwierigkeit einer genauen Vorhersage solcher Peptide und einer
Vorhersage von Peptiden, die an eines oder mehrere der großen Anzahl
verschiedener allotypischer und genotypischer menschlicher MHC-Klasse-II-Moleküle binden.
Im Vergleich zu Peptiden, die an MHC-Klasse-I binden, bei denen eine
Vorhersage zuverlässiger
ist, sind Peptide, die an MHC-Klasse-II
binden, variabler in der Länge
und besitzen Aminosäuren
außerhalb
der hauptsächlichen
Bindungstaschen, die eine signifikantere Wirkung auf die Peptidbindung
besitzen. Somit besteht für
MHC-Klasse-II ein Bedarf an genaueren und umfassenderen Verfahren,
als zurzeit verfügbar,
zur Vorhersage oder zum Nachweis von Peptiden, die an einen oder
mehrere der zahlreichen MHC-Klasse-II-Allotypen und -Genotypen binden,
um potenzielle T-Zell-Epitope umfassend zu identifizieren. Der Hauptnutzen
der Verfügbarkeit
eines solchen Ansatzes ist die Erzeugung von Pharmazeutika, wobei
alle maßgeblichen
(oder alle) T-Zell-Epitope identifiziert und anschließend entfernt
worden sind.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Entwicklung eines Pharmazeutikums unter
Verwendung der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:
- 1. bezüglich
des Testproteins für
die potenzielle Verwendung als Pharmazeutikum, das Protein zu einer
Auswahl an menschlichen Zelllinien oder menschlichen Zellproben
zugeben
- 2. die Zellen nach einem angemessenen Zeitraum hinsichtlich
Oberflächenpeptiden
analysieren, insbesondere unter Verwendung von MALDI-MS direkt an
den Zellen oder alternativ unter Verwendung von MALDI-MS an Zellfraktionen,
insbesondere MHC-Fraktionen, oder alternativ durch Eluieren von
Peptiden von der Zelloberfläche
vor einer Analyse, insbesondere durch MALDI-MS oder ESI-MS
- 3. von dem gegebenen Protein Peptide, die auf der Zelloberfläche erscheinen,
dem Testprotein zuordnen
- 4. Peptide, die in (2) auf der Zelloberfläche erscheinen, modifizieren
um die Bindung an MHC-Moleküle
zu beseitigen, in einigen Fällen durch
Testen modifizierter Peptide hinsichtlich der Bindung an die Zelloberfläche (wie
vorstehend)
- 5. das endgültige
pharmazeutische Proteinmolekül
durch Einbringen geeigneter Modifikationen an einem oder mehreren
Peptiden innerhalb der Proteinsequenz erzeugen, um die Bindung an MHC-Moleküle zu beseitigen
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Gemäß der zweiten
hauptsächlichen
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Schema bereitgestellt, wodurch
ein Vakzinmolekül oder
ein Molekül,
das als Vakzin wirken kann, entwickelt werden kann. Das Vakzin ist
am stärksten
bevorzugt zur Verwendung in Menschen bestimmt, obwohl das Schema
gleichermaßen
auch auf die Entwicklung von Vakzinmolekülen zur Behandlung oder Vorbeugung
von Krankheit in nichtmenschlichen Spezies angewendet werden kann.
Für die
Entwicklung eines Vakzins unter Verwendung der vorliegenden Erfindung
ist eine besondere Anwendung die Erzeugung eines Peptids oder Proteins,
wodurch relevante Epitope zur Aktivierung und/oder Stimulation von
T-Zellen, hauptsächlich
Epitope für
Helfer-T-Zellen, aber auch, bei Anwendungen, die eine Zellabtötung erfordern,
Epitope für
cytotoxische T-Zellen (hauptsächlich
MHC-Klasse-I-restringiert),
vorliegen. Zur Entwicklung eines Vakzins, das in einem großen Anteil
der Menschen wirksam ist, ist es notwendig, Peptide innerhalb des
Proteins zu identifizieren, die durch einen oder mehrere der zahlreichen
MHC-Allotypen und -Genotypen bereitgestellt werden können, und
dann aus diesen Peptiden ein oder mehrere Epitope für das Einbringen
in das endgültige
Vakzinmolekül
auszuwählen.
Solche Epitope können
durch MHC-Klasse-I oder MHC-Klasse-II oder beiden restringierte
Peptide umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt eine solche Identifizierung
von durch MHC-Klasse-I und -Klasse-II bereitgestellten Peptiden
bereit und ist somit die Basis für
die Entwicklung wirksamerer Vakzine.
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Ein
hauptsächlicher
Unterschied zwischen MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Epitopen ist der grundlegende
Ursprung des Proteins, von dem das Peptid in dem MHC-Peptid-Komplex
gewöhnlich stammt.
Es ist bekannt, dass exogene Proteine größtenteils zu Peptiden in Verbindung
mit MHC-Klasse-II führen,
während
endogene Proteine, die innerhalb einer Zelle exprimiert werden,
gemäß einem
anderen Peptidase- und intrazellulären Transportweg prozessiert
werden, der hauptsächlich
zu einer Verbindung mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Zelloberfläche führt. Für entweder
exogene oder endogene Proteine können
während
der Abfolge von Prozessierungsschritten bestimmte Peptidsequenzen
aus dem Protein, die normalerweise an MHC binden können, zerstört werden,
so dass bestimmte T-Zell-Epitope in vivo nicht erzeugt werden. Für solche
Peptide können
prädiktive
(oder biochemische/biologische) Verfahren die Prozessierung bei
der Identifizierung von T-Zell-Epitopen nicht aufklären. Es
ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass von der Zelloberfläche identifizierte
Peptide diejenigen sind, die von der APC (oder einer anderen Zelle)
als fähig
zur Passage über
den intrazellulären
Prozessierungs- und Transportweg ausgewählt worden sind. Weil sich
die Erfindung auf die Identifizierung echter Produkte der Prozessierungsereignisse
konzentriert, verringert die Erfindung somit die Rate an falsch
positiven und falsch negativen Epitopen, die unter Verwendung prädiktiver
oder von In-vitro-Verfahren der Epitopidentifizierung identifiziert
werden.
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Das
Verfahren nach dem Schema gemäß der zweiten
hauptsächlichen
Aussführungsform
der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die Verfahren hierin
anzuwenden, um:
- 1. ein oder mehrere T-Zell-Epitope
innerhalb der Aminosäuresequenz
eines Zielproteins zu identifizieren.
- 2. neue Sequenzvarianten des Zielproteins zu gestalten, wobei
eine oder mehrere Aminosäuren derart
modifiziert sind, dass entweder
(i) die Aktivität des T-Zell-Epitops
erhöht
wird und/oder
(ii) das Spektrum an MHC-Typen, auf die das T-Zell-Epitop
restringiert ist, wie durch die Bindung der Peptide an MHC-Moleküle oder
ganze Zellen oder andere Mittel bestimmt, zu verbreitern und/oder
(iii)
mehrere ansonsten nicht zusammenhängende Epitope zu einer einzigen
(kleineren) Einheit zu kombinieren.
- 3. Konstruieren dieser Sequenzvarianten und Testen der Varianten,
um eine oder mehrere Varianten mit wünschenswerten Eigenschaften
zu identifizieren.
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Gemäß diesem
Schema wird eine Reihe von Variantenproteinen erzeugt und getestet,
am stärksten
bevorzugt mittels DNA-Rekombinationstechniken, obwohl andere Verfahren,
einschließlich
chemischer Synthese, ebenfalls erwogen werden können.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Entwicklung eines Vakzins unter Verwendung
der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:
- 1. bezüglich
des Proteins für
die potenzielle Verwendung als Vakzin, das Protein zu einer Auswahl an
menschlichen Zelllinien oder menschlichen Zellproben zugeben
- 2. die Zellen nach einem angemessenen Zeitraum hinsichtlich
Oberflächenpeptiden
analysieren, insbesondere unter Verwendung von MALDI-MS direkt an
den Zellen oder alternativ unter Verwendung von MALDI-MS an Zellfraktionen,
insbesondere MHC-Fraktionen,
oder alternativ durch Eluieren von Peptiden von der Zelloberfläche vor
einer Analyse, insbesondere durch MALDI-MS oder ESI-MS
- 3. von dem gegebenen Protein Peptide, die auf der Zelloberfläche erscheinen,
dem Testprotein zuordnen
- 4. ein oder mehrere Peptide, die in (2) auf der Zelloberfläche erscheinen,
für die
Verwendung im endgültigen
Vakzinmolekül
auswählen.
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Es
versteht sich, dass zur Analyse von Zelloberflächenpeptiden zur pharmazeutischen
oder zur Vakzinverwendung eine Kombination von Zelllinien oder menschlichen
Zellproben eingesetzt werden könnte,
die ein umfassendes Gemisch verschiedener MHC-Allotypen und -Genotypen
bereitstellen, und dass solche natürlichen Zellproben ein umfassendes Gemisch
von MHC-Klasse-I- und/oder -Klasse-II-restringierten Epitopen liefern.
Von besonderem Nutzen wären
menschliche dendritische Zellen (oder Exosomen), die nach Zugabe
des Testproteins aktiviert werden können, Peptide an MHC-Molekülen effizient
bereitzustellen. Alternativ können
für die
Analyse von Zelloberflächenpeptiden
menschliche Zelllinien genetisch so verändert werden, dass ihre MHC-Repertoires
ausgeweitet werden, hauptsächlich
durch Transfektion von Genen, die für einen oder mehrere MHC-Typen
kodieren, in diese Zellen, so dass Zellen mit mehreren MHC-Typen
erzeugt werden. Von besonderem Nutzen wären nichtmenschliche Zellen,
die nicht ihre eigenen MHC-Moleküle
produzieren, wie Mauszellen, in denen die murinen MHC-Gene deletiert
oder anderweitig ausgeschaltet worden sind. Die Analyse von Zelloberflächenpeptiden
umfasst ferner den optionalen Schritt der Anreicherung von MHC-Molekülen, zum
Beispiel unter Verwendung von Immunaffinitätssäulen, vor der Peptidanalyse.
Für MHC-Klasse-II
hat das erfindungsgemäße Verfahren
zur Analyse von Zelloberflächenpeptiden
den besonderen Vorteil, dass eine Analyse der Bindung an andere
Allotypen als DR bereitgestellt wird. Eine Analyse der Peptidpräsentation durch
Allotypen, wie DQ und DP, war sehr schwierig, weil insbesondere
für DQ,
bei dem angenommen wird, dass beide Ketten des MHC-Moleküls zur Bindung
beitragen (im Gegensatz zu ausschließlich der β-Kette bei DR), kein prädiktives
Verfahren zur Verfügung
steht.
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Gemäß dem dritten
hauptsächlichen
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Schema bereitgestellt,
wodurch die Erfindung auf die Entwicklung eines diagnostischen Tests
angewendet wird. Eine besondere Anwendung dieser Ausführungsform
ist die Erzeugung eines Profils von auf der Zelloberfläche bereitgestellten
Peptiden, um das anomale Vorliegen, Fehlen oder Muster von Peptiden
zu identifizieren, das eine bestimmte Erkrankung oder eine Zellverletzung
anzeigen kann.
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Daher
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweis
von Peptiden auf der Oberfläche
einer Zelle anschließend
an ein Verfahren bereitzustellen, wodurch die Zellen von Interesse
mit einem exogenen Protein oder Organismus oder einem anderen Mittel
in Kontakt gebracht wurden, so dass ihr Repertoire von Oberflächenpeptiden
sich von dem Repertoire unterscheidet, das auf ansonsten identischen
Zellen, die aber nicht mit dem exogenen Protein oder Organismus
in Kontakt gebracht wurden, dargeboten wird. Bei der Praxis der Erfindung
kann das Vorliegen eines "diagnostischen Peptids" oder "Indikatorpeptids" isoliert durch Registrierung
der Masse des Indikatorpeptids im Massenspektrum eines MS-Instruments oder
durch Aufzeichnung der Indikatorpeptidsequenz in einem CID- (oder
einem ähnlichen)
Spektrum gezeigt werden. Ebenso kann das Vorliegen des Indikatorpeptids
in Bezug zu einem Massenspektrum angezeigt werden, das von einer
Bezugsprobe stammt, die nicht mit dem exogenen Protein oder Mittel
in Kontakt gebracht wurde. Eine solche vergleichende Analyse ist von
besonderem Wert in Fällen,
in denen die Masse(n) der Indikatorpeptide nicht bekannt oder durch irgendeine
Maßnahme
vorhergesagt sind. Eine vergleichende Analyse kann in silico mittels
Subtraktion identischer Massenpeaks durchgeführt werden und wäre von besonderem
Wert, wenn der Verlust eines bestimmten Massenpeaks der diagnostische
Indikator ist. Auch andere haben MS-Techniken zur vergleichenden
Analyse biologischer Proben genutzt. Im Fall von Liotta et al.
-
[WO0049410]
konzentriert sich eine solche vergleichende Analyse jedoch auf den
Proteingehalt einzelner Zellen, die mittels Laser-Capture-Mikrodissektion
erhalten werden. Dies unterscheidet sich von der vorliegenden Erfindung,
bei der die Diagnose (vergleichend, subtraktiv oder anders) je nach
den von der Oberfläche
nachgewiesenen Peptiden und insbesondere Peptiden in Verbindung
mit MHC-Molekülen
auf der Zelloberfläche
erfolgt.
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Zu
anderen Diagnosetechniken unter Verwendung von MS-Technologie gehört Little
et al. [
US6,207,370 ],
die ein auf MS basierendes Diagnoseverfahren offenbaren, das sich
auf die Identifizierung genetischer Erkrankung richtet, bei der
es sich um ein anlagebedingtes Merkmal des Individuums und nicht
einen erworbenen Zustand oder Status handelt. Das Verfahren kann
die Masse eines Zielproteins identifizieren, das in der Population
je nach der genetischen Ausstattung des Einzelnen variabel ist.
Ein weiteres Diagnoseschema wird von Geng et al. [Geng, M. (2000)
J. Chromafography A. 870: 295-313] offenbart, die MALDI-TOF-Spektren
analysierten, die aus tryptischen Spaltungen von Serumproteinproben
erhalten wurden. Ihr Verfahren weist "Signaturpeptide" nach, die für das Vorliegen eines in einem
komplexen Gemisch vorhandenen Analytproteins diagnostisch sind.
Auch dies ist verschieden von der vorliegenden Erfindung, bei der
die Diagnose (vergleichend, subtraktiv oder anders) je nach den von
der Oberfläche
nachgewiesenen Peptiden und insbesondere Peptiden in Verbindung
mit MHC-Molekülen
auf der Zelloberfläche
erfolgt.
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Daher
umfasst nach dem erfindungsgemäßen Schema
ein bevorzugtes Verfahren zur Entwicklung eines diagnostischen Tests
die folgenden Schritte:
- 1. geeignete menschliche
Zellen hinsichtlich Oberflächenpeptiden
analysieren, insbesondere unter Verwendung von MALDI-MS direkt an
den Zellen oder alternativ unter Verwendung von MALDI-MS an Zellfraktionen,
insbesondere MHC-Fraktionen, oder alternativ durch Eluieren von
Peptiden von der Zelloberfläche
vor einer Analyse, insbesondere durch MALDI-MS oder ESI-MS
- 2. entweder ein Profil von Peptiden, die auf der Zelloberfläche erscheinen,
erzeugen und, wenn nötig,
mit anderen Profilen vergleichen, um eine Anomalität oder Erkrankung
in Verbindung mit den menschlichen Zellen zu identifizieren, oder die
Sequenz spezifischer Peptide auf der Zelloberfläche bestimmen als Mittel zur Bestimmung spezifischer
Peptide, die zur Identifizierung einer Anomalität oder Erkrankung in Verbindung
mit den menschlichen Zellen verwendet werden können.
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Bei
allen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist es aufgrund des leichten Zugangs zu
und des zunehmenden Inhalts in verschiedenen Proteinsequenzdatenbanken
nicht entscheidend, dass vollständige
Sequenzen erhalten werden, um die Identität von Peptiden zu bestimmen.
Eine kleine Menge an interner Sequenzinformation (die nur 2-3 Reste
betragen kann) in Verbindung mit der bekannten Masse des Ausgangsions
kann ausreichend sein, um eine Peptidspezies zu charakterisieren.
Es ist bekannt, dass Algorithmen zum Durchsuchen von Datenbanken
ununterbrochener Fragmentionen-Datensätze verfügbar sind. Signifikante Beispiele
dafür umfassen
den ProteinLynx Global Server-Suchalgorithmus (Micromass, Wythenshawe,
GB), Mascot von Matrix Science [www.matrix.com] oder die Protein Prospector-Programmfolge
[http://prospector.ucsf.edu] oder ähnliche. Solche Programme simulieren
die Fragmentierung von Sequenzeinträgen in den Datenbanken mit
Massen des Peptids von Interesse.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden nicht beschränkenden
Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1
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Verfahren zum Nachweis
an Zelloberflächen-HLA-DR
gebundener Peptiden unter Verwendung von MALDI-tof.
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Die
EBV-transformierten menschlichen B-Zelllinien JESTHOM und BSM wurden
von ECACC (Porton Down, GB) erhalten. Die B-Zelllinie JESTHOM ist
für HLA-DR1*0101
homozygot, und die Linie BSM ist für DRB1*0401 homozygot. Die
Zelllinien wurden in vitro unter Verwendung der vom Zuliefererempfohlenen
Bedingungen kultiviert. Maus-NSO-Zellen (ECACC #85110503), die unter Verwendung
der von den Zulieferern empfohlenen Bedingungen kultiviert wurden,
wurden als negative Kontrollzelllinie verwendet.
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Synthetische
Peptide wurden von Zeneca (Zeneca LSM, Northwich, GB) bezogen. Das
Peptid HA1 war ein 13mer, das den Resten 307-319 des Influenzavirus-Hämagglutininproteins
entsprach (Rothbard, J. B. et al. (1988) Cell 52: 515). Das Peptide MP1
war ein 13mer, das den Resten 17-29 des Influenzavirus-Matrixproteins
entsprach [Rothbard, J. B. et al. (1988) ibid.]. Obwohl von beiden
Peptiden bekannt ist, dass sie an eine Reihe verschiedener HLA-DR-Spezifitäten binden,
erhält
man mit dem DR4-Allotyp eine unterscheidbare Bindung. MP1 bindet
an DR4, wohingegen MP1 keine signifikante Bindung an die DR4-Spezifität aufweist
[Busch R. et al. (1990) Int. Immunol. 2: 443].
-
Für einige
Experimente wurden analoge Peptide verwendet, die eine labile Biotin-Linkereinheit
enthielten. Dazu wurde der Linker Biotin-HPDP (Pierce, Chester,
GB) an einen N-terminalen Cysteinrest gekuppelt, um die Peptide
HA1B und MP1B zu erhalten. Mit Ausnahme des zusätzlichen Cysteinrestes sind
die Sequenzen ansonsten mit HA1 und MP1 identisch. Die Kupplung
wurde unter Verwendung von mit dem Biotin-HPDP bereitgestellten
Protokollen (Pierce, Chester, GB) erzielt, ausgenommen dass die
Reinigung des gekuppelten Peptids unter Verwendung einer HPLC und
eines Standardelutionsprofils durchgeführt wurde. Inhibitionsexperimente wurden
unter Verwendung des gereinigten monoklonalen Antikörpers LB3.1
[ATCC-Nummer HB-298] durchgeführt.
Der Antikörper
wurde aus mit dem Hybridom LB3.1 konditioniertem Medium unter Verwendung
von Protein-A-Sepharose-
(Millipore, Conset, GB) Affinitätschromatographie
und vom Zuliefererempfohlenen Verfahren gereinigt. Das Hybridom
war unter Standardbedingungen gehalten worden. LB3.1 wurde mit dem
Peptid und Zellen in einer maximalen Konzentration von 10 μg/ml coinkubiert.
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Die
Zellen wurden vor der Behandlung mit verschiedenen synthetischen
Peptiden in Test- und Kontrollexperimenten mit Paraformaldehyd fixiert. Die
Experimente wurden unter Verwendung von 3 × 106 Zellen
in 50 μl
Vollmedium, die zu 150 μl
Peptidbindungspuffer (50 mM Phosphat-Citrat-Puffer bei pH 4,0; 0,1%
NP40), der Peptid in einer Endkonzentration von 50 μM enthielt,
gegeben wurden, durchgeführt.
Die Inkubation erfolgte bei 37°C
für 24
Stunden. Für
den Assay wurden peptidbehandelte Zellen durch Zentrifugation geerntet
und dreimal unter Verwendung von PBS gewaschen. Die Zellen wurden
in ein 10-μl-Aliquot
von 50% Acetonitril-0,1% Trifluoressigsäure in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Jede
Probe wurde anschließend
vor dem Probenauftrag auf den Probenteller des MALDI-Instruments
für 5 s
gründlich
gemischt. Das Zweischichten- Probenauftragsverfahren
wurde verwendet, wobei 1 μl
saure Matrixlösung
[0,1 M Sinapinsäure
in einem 1:1:1-Gemisch aus Acetonitril, Methanol und Wasser] auf
dem MS-Probenteller aufgetrocknet wurde. Darauf folgte 1 μl der Zellen
und ein weiterer μl
der Sinapinsäure-Matrixlösung.
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Bei
Experimenten unter Verwendung synthetischer Peptide, die eine labile
Linker-Massenmarkierung enthielten, wurde die Entfernung des Linkers durch
Inkubation der Zellen in PBS, das 100 mM β-Mercaptoethanol (BME) enthielt,
erreicht. Die Inkubation mit BME erfolgte bei 37°C für 30 Minuten, und die Zellen
wurden vor dem Auftrag auf den MALDI-Probenteller, wie vorstehend,
3 Mal unter Verwendung von PBS gewaschen.
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Ein
Voyager-DE-Massenspektrometer (Perseptive Biosystems, Foster City,
CA, USA) wurde im positiven Ionenmodus verwendet. Das Instrument wurde
mit einem Gemisch aus Pferdeherz-Apomyoglobin und Rinder-Serumalbumin (Sigma,
Poole, GB) kalibriert und weniger als 30 Minuten vor jeder Analyse
daraufhin überprüft, ob es
innerhalb einer Massengenauigkeit von 0,1 % für jeden Standard lag. Die Probentropfen
wurden luftgetrocknet und im positiven Ionenmodus analysiert. Die
verzögerte
Extraktion wurden auf 150 ns bei 25 kV eingestellt. Das "low mass gate" wurde auf 600 Da
eingestellt. Insgesamt 125 Laserschüsse wurden von jeder Probe
akkumuliert.
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Die
vorhergesagten Massenpeaks für
die Peptide HA1 und MP1 wurden in den von JESTHOM-Zellen erzeugten
Spektren identifiziert. Dagegen konnte nur das Peptid HA1 von HLA-DR4-exprimierenden
BSM-Zellen identifiziert werden. Bei Experimenten unter Verwendung
markierter Peptide wurden die Massenverschiebungen des Peptidpeaks in
den Spektren BME-behandelter
Zellen identifiziert. Spektren von mit LB1.1 inkubierten Zellen
(Inhibitionsexperimente) zeigten, dass die Antikörperbehandlung die Peptidbindung
nicht aufheben konnte, obwohl bei einem 3-fach-Kompetitionsassay
unter Verwendung von Peptid, markierten Peptiden und LB1.1-Antikörper einige
Hinweise auf eine geringere relative Ionenhäufigkeit gefunden werden konnten. Spektren
von Maus-NSO-Zellen, die mit Peptiden oder Peptidkombinationen behandelt
wurden, zeigten eine sehr geringe Häufigkeit von Zielionenpeaks, was
auf eine unspezifische Wechselwirkung und/oder unzureichendes Waschen
während
der Zellaufarbeitung hindeutet.
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Beispiel 2
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Verfahren zur Analyse
von an MHC-DR gebundenen Peptiden unter Verwendung von MALDI-tof.
-
HLA-DR1*0101
wurde aus JESTHOM-Zellmembranen mittels Immunaffinitätschromatographie gereinigt.
HLA DRB1*0401 wurde aus BSM-Zellen gereinigt. Solubilisierte Zellmembranen
wurden hergestellt und aufgearbeitet, wie zuvor beschrieben [Gorga
et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 16087-16094; Sette et al. (1989) J. Immunol.
42: 35-40]. Der monoklonale Anti-DR-Antikörper LB3.1 [ATCC-Nummer
HB-298] wurde als Immunaffinitätsreagenz
verwendet. Der Antikörper
wurde aus mit dem Hybridom LB3.1 konditioniertem Medium unter Verwendung
von Protein-A-Sepharose-(Millipore, Conset,
GB) Affinitätschromatographie
und vom Zulieferer empfohlener Verfahren gereinigt. Das Hybridom
war unter Standardbedingungen gehalten worden. Der LB3.1-Antikörper wurde
an Sepharose 4B (Pharmacia Biotech, St. Albans, GB) unter Verwendung
des von InVitrogen (InVitrogen, Groningen NL) gelieferten Linx-Systems
und vom Zulieferer empfohlener Bedingungen gekuppelt.
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Die
synthetischen Peptide HA1 und MP1, wie im Beispiel 1 beschrieben,
wurden mit einem 50 μl-Aliquot
der HLA-DR1*0101-Präparation
inkubiert. Die Peptide wurden in Peptidbindungspuffer (50 mM Phosphat-Citrat-Puffer
bei pH 4,0; 0,1 % NP40) in einer Endkonzentration von 50 μM für 26 Stunden
bei 37°C
inkubiert. Ungebundenes Peptid wurde durch Ultrafiltration unter
Verwendung von Microcon-Zentrifugalfiltrationszellen (Millipore,
USA) und mehrere Waschzyklen (mindestens vier) mit PBS entfernt. Das
Endvolumen wurde auf 20 μl
eingeengt. Bei einigen Experimenten wurden die Peptide vor der MALDI-tof-Analyse
vom MHC eluiert. In diesem Fall erfolgte die Elution durch Extraktion
mit einer Lösung von
0,1% TFA in H2O. Das Eluat wurde bis zur
Trockne eingeengt und direkt unter Verwendung von MALDI-Matrixlösung, wie
bei Beispiel 1, resuspendiert. Bei anderen Experimenten wurde der
in Matrixlösung resuspendierte
MHC-Peptid-Komplex auf den Probenteller des Instruments aufgebracht.
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Die
vorhergesagten Massenpeaks für
die Peptide HA1 und MP1 wurden in den von HLA-DR1*0101-Präparationen
erzeugten Spektren identifiziert.
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Dagegen
konnte nur der HA1-Massenpeak in Spektren von DRB1*0401-Präparationen
identifiziert werden.
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Beispiel 3
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Verfahren zur Analyse
von Zelloberflächenpeptiden nach
Behandlung von Zellen mit Gesamtprotein.
-
Menschliche
dendritische Zellen wurden aus 40-ml-Proben von peripherem Blut,
die von gesunden Spendern erhalten worden waren, angereichert. Das
Blut wurde unter Verwendung von Heparin antikoaguliert, und eine
mononukleäre
Zellfraktion wurde unter Verwendung von Histopaque-1077-(Sigma, Poole, GB)
Dichtegradientenmedium und der vom Zulieferer empfohlenen Bedingungen
präpariert.
Die dendritischen Zellen wurden durch negative Selektion unter Verwendung
eines immunomagnetischen Trennverfahrens erhalten, wobei alle Reagenzien und
Bedingungen von Mitenyi Biotec (Bisely, GB) bereitgestellt wurden.
Die dendritischen Zellen wurden für die Behandlung mit Proteinantigen
in Gewebekulturschalen mit mehreren Vertiefungen eluiert. Die Zellen
wurden im Verlauf der Experimente in RPMI-Medium gehalten, das mit
10% (Vol/Vol.) fötalem Rinderserum
und Standardantibiotika angereichert war. Alle Reagenzien stammten
von Life Technologies (Paisley, GB).
-
In
diesen Studien wurde eine Präparation von
rekombinanter Staphylokinase verwendet. Das Wildtyp-Staphylokinase-Gen
wurde vertragsgemäß von Genosys
Biotechnologies Ltd. (Cambridge, GB) synthetisiert. Das Gen wurde
mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung überlappender
synthetischer Primer und der Sequenz, wie von Collen et al. [Collen
D. (1996) Circulation 94: 197-206] angegeben, konstruiert. Das synthetische
Gen wurde als 453-bp-EcoRI-HinDIII-Restriktionsfragment in den bakteriellen
Expressionsvektor pMEX (MoBiTec, Göttingen, Deutschland) kloniert.
Das pMEX/Staphylokinase-Gen wurde durch Standardtechniken in den kompetenten
E.-coli-Stamm TG1 transformiert, und ein einzelner transformierter
Klon, der aktive Staphylokinase sezernierte, wurde unter Verwendung
eines Fibrin-Pattenassays [Astrup, T. et al. (1952) Arch. Biochem.
Biophys. 40: 346-351; Collen, D. et al. (1992) Fibrinolysis 6: 203-213]
selektiert. Der am besten exprimierende Klon wurde aufgezogen, und
rekombinantes Protein wurde aus dem Kulturüberstand unter Verwendung von
aufeinander folgender Säulenchromatographie
und zuvor beschrie benen Verfahren gereinigt [Collen, D. et al. (1992)
ibid.; Schlott, B. et al. (1994) Biotechnology 12: 185-189].
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Dendritische
Zellen wurden mit gereinigter Staphylokinase in einer Konzentration
von 100 μg/ml inkubiert,
und die Inkubation wurde über
Nacht durchgeführt.
Bei einigen Experimenten wurde die Antigenprozessierung durch Verwendung
von Inhibitorcocktails blockiert, die zum Kulturmedium gegeben wurden.
Die Inhibitoren wurden 1 Stunde vor der Zugabe des Testproteins
in den folgenden Konzentrationen hinzugefügt: Ammoniumchlorid 50 mM;
Natriumazid 1 mg/ml; Chloroquin und Colchicin 500 μM. Alle Verbindungen
stammten von Sigma (Sigma, Poole, GB).
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Nach
der Proteinbehandlung wurden die Zellen aus den Kulturschalen entnommen
und unter Verwendung von 3 Zyklen aus Zentrifugation und PBS-Behandlung gewaschen,
um jegliches Medium und fremdes Protein zu entfernen. Die Zellen
wurden für
die MALDI-tof-Analyse aufgearbeitet, wie im Beispiel 1 angegeben.
Spektren wurden aufgenommen und hinsichtlich des Vorliegens von
Peptiden, die dem Testprotein zugeschrieben werden konnten, analysiert.
Diese wurden durch Vergleich mit Spektren identifiziert, die von
nicht mit Staphylokinase behandelten Kontrollzellen erhalten wurden.
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Ionenpeaks,
die Staphylokinase zugeschrieben wurden, wurden in Spektren identifiziert,
die von mit Staphylokinase behandelten Zellen erhalten wurden, und
wurden in den Spektren von Zellen, die mit Stoffwechselinhibitoren
behandelt worden waren, oder von nicht mit Staphylokinase behandelten
Kontrollzellen nicht erkannt.
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Beispiel 4
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Verfahren zur Bestimmung
von Peptidsequenzen, die aus der Behandlung von Zellen mit Gesamtprotein
stammen.
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Zellen
wurden mit dem Protein von Interesse gemäß dem Verfahren des Beispiels
3 behandelt. Peptide wurden aus den Zellen durch mehrere Extraktionszyklen
(4-6) mit einer Lösung
von 5% Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure eluiert. Das Vorliegen
von Sequenzen, die dem Testprotein zugeschrieben werden konnten,
wurde unter Verwendung von ESI-MS/MS bestimmt.
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Eluierte
Proben wurden getrocknet und in einer 0,1 %igen Ameisensäurelösung resuspendiert. Das
gesamte rohe Eluat wurde mithilfe eines modularen CapLC-Systems
(Micromass, Wythenshawe, GB), das direkt mit der Z-Spray-Quelle
des Massenspektrometers verbunden war, aufgetrennt. Die Proben wurden
auf eine C18-Vorsäule
mit einer Flussrate von 30 μl
pro Minute aufgetragen und für
3 Minuten unter Verwendung einer 0,1 %igen Ameisensäurelösung entsalzt.
Die Flussrate wurde auf 1 μl
pro Minute verringert und wieder auf eine C18-180-mm-Pepmap-Säule geleitet.
Die Säule
wurde unter Verwendung eines Standardelutionsgradienten, der von
einer Lösungsmittellösung aus
95% H2O, 5% Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure bis
zu einer Lösungsmittellösung aus
5% H2O, 95% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure reichte,
eluiert.
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Die
Elektrospray-MS- und MS/MS-Daten wurden an einem Micromass-Q-Tof-2-Instrument
(Micromass, Wythenshawe, GB) aufgenommen, das mit einer Z-Spray-Nanoflow-Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet
war. Das Instrument wurde im positiven Ionenmodus bei einer Quellentemperatur
von 80°C, einer
Flussrate des entgegenströmenden
Gases von 40 I/Stunde und bei einer an die Nanospray-Durchfluss-LC-Sonde
angelegten Spannung von 2800V betrieben. Alle Daten wurden aufgenommen,
während
das Instrument im automatischen datenabhängigen Umschaltmodus arbeitete.
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Das
Instrument wurde mit einer Zweipunktkalibrierung ausgewählter Fragmentionen,
die durch die kollisionsinduzierte Zersetzung von Glufibrinopeptid
b erhalten wurden, kalibriert. Alle Daten wurden automatisch mithilfe
von ProteinLynx-Software verarbeitet, die Proteinidentifizierung
wurde mittels Analyse mit dem ProteinLynx Global Server-Suchalgorithmus
(Micromass, Wythenshawe, GB) erreicht.
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Eine
manuelle Datenaufnahme wurde durch Injizieren der rohen Probe in
das Instrument über Borsilikat-Nadeln
durchgeführt.
Die Proben wurden auf eine Konzentration von etwa 1 μM eingestellt.
Die Proben wurden vor der Injektion mithilfe von C18-ZipTip-Einweg-Minisäulen (Millipore,
USA) entsalzt.
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Spektren
wurden aufgenommen und hinsichtlich des Vorliegens von Peptidmassen
analysiert, die dem Testprotein zugeschrieben werden konnten.
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Diese
wurden durch Vergleich mit Spektren identifiziert, die von Kontrollzellen,
einschließlich
Zellen, in denen die Antigenprozessierung blockiert war, erhalten
wurden. Nach der Behandlung mit Staphylokinase wurden Peptidmassen
identifiziert, die Staphylokinase zugeschrieben wurden. Äquivalente
Ionenpeaks traten in Zellen, die nicht mit Staphylokinase behandelt
worden waren, oder in mit Stoffwechselinhibitoren behandelten Zellen
nicht auf.