SK1982003A3 - Peptides presented by cells - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobov určenia peptidov prítomných na povrchu cicavčích buniek po pridaní proteínu k bunkám. Vynález sa taktiež týka diagnostických testov založených na určení týchto peptidov alebo modifikovaných molekúl, ktoré sú výsledkom určenia takých peptidov, napríklad farmaceutických entít majúcich výhodne špecifickú biologickú účinnosť a zníženú alebo zvýšenú imunogenicitu v porovnaní s odpovedajúcimi nemodifikovanými molekulami. Spôsoby podlá vynálezu sa výhodne realizujú za použitia nástrojov hmotnostnej spektroskopie (MS).

Doterajší stav techniky

Po príjme proteínov cicavčími bunkami (alebo po produkcii špecifických proteínov bunkami) sa proteíny následne rozložia a, spravidla peptidové fragmenty týchto proteínov, ktoré sa prezentujú na bunkovom povrchu, často asociujú s ďalšími proteínmi. Peptidové fragmenty proteínu možno rozkladať a určité peptidy sa následne prezentujú v asociácii s molekulami hlavného histokompatibilného veľa prípadoch rozpoznať imunologickú odpoveď. Taká prínosná, napríklad pokiaľ bunkám, ktoré produkujú špeci peptidové fragmenty, alebo mô komplexu (MHC), ktoré možno vo T bunkami, a tak iniciovať imunologická odpoveď môže byť imunitný systém pôsobí proti fický proteín, odkiaľ sa odvodia že byť škodlivá, napríklad pokiaľ imunitný systém produkuje protilátky, ktoré sa viažu na

01-3663-02-Ma špecifický protein a obmedzujú jeho účinnosť (napríklad v prípade farmaceutického proteínu).

Doposiaľ nebolo možné pre daný protein predpovedať, v ktorých oblastiach proteínu sa rozklad presne uskutoční, takže sa nedajú spoľahlivo predpovedať konkrétne peptidy, ktoré sa prezentujú na bunkovom povrchu. V prípade MHC molekúl bol pri predpovedi motívov peptidov, ktoré sa viažu na MHC, určitý úspech zaznamenaný, ale v praxi sa niektoré z týchto peptidov rozkladajú pred dosiahnutím MHC molekúl a predpoveď peptidov, ktoré sa rozpadajú, nie je spoľahlivá. Štandardnou metódou detekcie peptidov na bunkovom povrchu je teda vymývanie týchto peptidov a následné určenie ich sekvencie. Tieto metódy nie sú rutinné a sú taktiež nepraktické, pretože vyžadujú analýzu peptidov bunkového povrchu na veľa typoch buniek alebo na veľa MHC molekulách.

Cielom vynálezu je poskytnúť povrchu buniek, Cielom vynálezu buď pre návrh molekuly vakcíny najmä prezentovaných veľa je ďalej taktiež použitie farmaceutickej molekuly, alebo pre diagnostický test.

spôsob určenia peptidov na molekulami.

MHC týchto alebo informácií pre návrh

V prípade farmaceutickej molekuly je cieľom vynálezu najmä identifikácia peptidov prezentovaných MHC molekulami po príjme alebo produkcii proteínov bunkami a použitie tejto informácie pri úprave proteínu, ktorá má zamedziť prezentáciu týchto peptidov.

V prípade molekuly vakcíny je cieľom vynálezu najmä identifikácia peptidov prezentovaných MHC molekulami po príjme alebo produkcii proteínu bunkami a použitie jedného alebo viacej týchto peptidov v molekule vakcíny v snahe stimulovať imunitný systém. Ako v prípade farmaceutickej molekuly, tak v

01-3663-02-Ma prípade molekuly vakcíny je cieľom vynálezu najmä identifikácia peptidov prezentovaných veľa rôznymi MHC molekulami vrátane rôznych alotypových a genotypových variant rôznych populácií.

V prípade diagnostického testu je cieľom vynálezu najmä určenie peptidov prezentovaných molekulami MHC po prijme alebo produkcii proteínu bunkami a použitie tohto určenia ako základu pre test detekujúci biologické alebo fyziologické udalosti, napríklad pre detekciu infekcie.

V prípade diagnostického testu je cieľom vynálezu najmä identifikácia peptidov prezentovaných bunkami testovanej osoby.

Vynález poskytuje presnú a rozsiahlu analýzu peptidov na povrchu buniek, a najmä peptidov v asociácii s MHC molekulami. Určenie profilu alebo identity peptidov na bunkovom povrchu sa uskutočňuje najmä pomocou hmotnostnéj spektrometrie (MS).

MHC/Peptidové komplexy pre určité účely už boli purifikované. V prípade molekúl MHC triedy I a triedy II boli metódy ich imunologického obohatenia a purifikácie nápomocné pri zisťovaniu väzobnej interakcie peptid-MHC a pri zisťovaní MHC väzobných motívov. Relevantné príklady zahrnujú US 5 989 565 a US 6 077 519, kde sú opísané spôsoby identifikácie autologických T-bunkových epitopov založené na kyslom vymývaní peptidov z povrchu nádorových buniek pacienta alebo z dendritických bunkových populácií. Sekvencie vymytých peptidov nachádzajú použiteľnosť pri návrhu syntetických peptidov pre výrobu vakcín.

Podobne Salter a kol. [US 5 487 982] poskytuje geneticky spracované teplotné senzitívne molekuly MHC triedy I, ktoré

01-3663-02-Ma umožňujú ľahké odstránenie peptidov naviazaných na mutantnej molekule MHC triedy I z geneticky vyprodukovaných buniek rastúcich in vitro.

Ďalšie príklady doterajšieho stavu Langlade-Demoyen a kol. [WO 97/44667], purifikované

MHC-peptidové komplexy ako činidlá pre obohatenie imunoterapii nádorov in aplikáciách.

Podobne

US techniky uvádza ktorí používajú afinitné reakčné nádorovo špecifických vitro a in vi vo a

763 585, US 5 734

T-buniek pri pri ďalších

023 a ďalšie poskytujú spôsoby purifikácie určitých MHC/peptidových komplexov pre použitie ako terapeutickej entity, napríklad pri liečbe autoimunitných chorôb a Deshpande a kol. [WO 97/40852] popisujú modifikáciu peptidov so zosilnenou väzbou na proteín MHC triedy II a celý komplex je poskytnutý ako rekombinantný fúzny proteín taktiež určený pre použitie pri liečbe ochorení asociovaných s autoreakčnými T bunkami.

WO 97/34143 a US 5 792 604 poskytujú spôsoby identifikácie MHC triedy I obmedzených antigénov endogénne spracovaných bunkovou sekreční dráhou. Tento biologický test vyžaduje senzibilované cytotoxické T bunky a zdroj indikačných cieľových buniek, na ktoré je lýza nasmerovaná prítomnosťou upravených peptidov vylučovaných do média. Táto schéma nachádza uplatnenie pri identifikácii látok, ktoré sú schopné ovplyvňovať dráhy endogénneho spracovania donorových buniek. Ďalšie schémy na báze biologických komplexov pre identifikáciu MHC triedou I a MHC triedou II obmedzených T-bunkových epitopov zahrnuje WO 00/67761, kde je opísaný spôsob používajúci genetickú vakcináciu a izoláciu dendritických buniek a splenocytov pre uskutočňovanie in vitro testu biologickej T-bunkovej aktivácie.

01-3663-02-Ma

Teraz sa zistilo, že MS meracie prístrojové vybavenie možno použiť pri analýze celých buniek alebo bunečných extraktov a získané dáta začleniť do dráhy pre rozumný vývoj terapeutických molekúl alebo diagnostických testov.

Velké a zložité molekuly biologického pôvodu možno analyzovať za použitia hmotnostnej spektrometrie (MS), ale iba po ich ionizácii. V tej to oblasti sú uznávané dva alternatívne prístupy pre ionizáciu biologických molekúl pre účely MS. Týmito prístupmi sú ionizácia elektrosprejom (ESI) a laserom za prítomnosti matrice (MALDI). Pri ESI sa vzorka čerpá cez nabitú úzku kapiláru a nebulizuje paralelným prúdom plynu, dokial nakoniec elektrostatická repulzia nespôsobí desorpciu iónov analytu do hmotnostného spektrometra. ESI Je kontinuálnou technikou, a ako takou ju možno lahko napojiť na predradené techniky pre separáciu vzorky, napríklad na kvapalinovú chromatografiu (LC) alebo kapilárnu elektroforézu (CE) [Cao & Moini (1998) Am. Soc. Mass Specrom. 9: str. 1081 až 1088] . Týmito znakmi sa líšia od MALDI-MS techník, kedy je vzorka zapuzdrená v materiáli kryštalickej matrice uloženom na platni meracieho prístroja pre umiestnenie vzorky. Ionizácie sa dosiahne excitáciou matrice pomocou lasera a desorbované ióny analytu sa urýchlia a vženú do hmotnostného analyzátora. MALDI je teda diskontinuálnym spôsobom, množina laserových pulzov sa používa pre výrobu iónov a dáta sa kumulatívne hromadia v hmotnostnom analyzátore.

Pokial ide o MALDI, hmotnostná analýza sa väčšinou uskutočňuje pomocou TOF prístroja (tzn. prístroja, ktorý k určeniu pomeru hmotnosti ku náboju (m/z) iónov používa meranie doby prieletu driftovej zóny po urýchlení v elektrickom poli. Také detektory sú v rôznych komerčných prístrojoch podrobené veľa technickým zdokonaleniam. Niektoré modely umožňujú analýzu rozpadu iónových fragmentov za zdrojom

01-3663-02-Ma pre odvodenie sekvencie peptidu a pre ďalšie určenie štruktúry. Kontinuálna povaha inštrumentov na báze ESI vedie k používaniu rastrovacích analyzátorov (napr. Quadrupole Mass Spectrometry hmotový spektrometer, ktorý k separácii iónov používa štyri tyčovité elektródy v magnetickom poli, pričom cez separátor prejdú len ióny s nastaveným pomerom m/e (v rezonancii) alebo Magnetic Sector Mass Spectrometry hmotnostný analyzátor s jednoduchým detektorom, ktorý detekuje len ióny s daným pomerom m/e, kde k separácii iónov dochádza zakrivením dráhy v magnetickom poli, pričom zmenou magnetického alebo elektrického pole možno nastavovať detekovaný pomer m/e), rovnako len možno použiť aj ďalšie formáty prístrojového vybavenia. Typickým formátom je tandemový MS systém, kedy sú dva hmotnostné analyzátory usporiadané v tandeme a prepojené cez kolíznu komôrku obsahujúcu molekuly inertného plynu. Tento tandemový formát umožňuje generovať kolíziou indukovaný rozpad iónov a určiť peptidové sekvencie v zavedenej vzorke. Pre analýzu peptidov prezentovaných na bunkovom povrchu (MHC) možno zostaviť a použiť celý rad násobných a hybridných formátov prístrojového vybavenia.

Hmotnostná spektrometria (MS) bola použitá taktiež pri analýze peptidov vymytých z MHC a najmä z molekúl MHC triedy I, viď napríklad Cox a kol. [Cox, A. L. a kol. (1997)str. 141 až 160 v MHC1:A Practical Approach, vydavatelia Fernadez N. & Butcher G. Oxford University Press, Oxford, UK] a nedávny prehľad týkajúci sa tejto oblasti, viď De Jong [De Jong, A. (1998) Mass Spectrometry Revlews 17: str. 311 až 335] . Ovysyannikova a kol. [Ovysyannikova a kol. (2001) J. Immunol. Methods 246: str. 1 až 12], používa MALDI-TOF pri analýze samotných peptidov vymytých kyselinou z MHC triedy II alely DRBl*0401 po ošetrení buniek vakcínou vírusu osýpok. Podobne Sickman a kol. [Sickman, A. a kol. (2000/ Analyst 125: str.

01-3663-02-Ma

569 až 573] popisuje identifikáciu peptidov naviazaných na molekuly MHC triedy II zo vzorky krysích Langerhansových buniek za použitia kombinácie LC a MALDI-MS techník.

Podstata vynálezu

Jednako len vynález, ktorý vychádza zo spomínaného doterajšieho stavu techniky, prvý raz poskytuje generalizovanú schému pre určenie peptidových druhov naviazaných na molekuly MHC triedy I a MHC triedy II za použitia meracieho prístrojového vybavenia na báze MS, pričom v prvom uskutočnení vynález poskytuje spôsoby odstránenia väzobnej interakcie pomocou aminokyselinovej substitúcie vnútri peptidovej sekvencie s účelom vyvinutia terapeutického proteínu s obmedzenou alebo nulovou schopnosťou poskytovať MHC-médiovanú imunitnú odpoveď po podaní tohoto proteínu subjektu, najvýhodnejšie ludskému subjektu. Cielom vynálezu je poskytnúť spôsob pre vyvinutie terapeutickej molekuly zníženou kapacitou vyvolávať imunitnú odpoveď po podaní tejto molekuly subjektu.

Cielom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov na povrchu buniek, a najmä pokial sú peptidy v asociácii s MHC molekulami.

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov, ktoré sú formálne v asociácii s MHC molekulami prezentovanými na povrchu buniek. Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov v asociácii s veľa rôznymi MHC molekulami prezentovanými na povrchu buniek.

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov v asociácii s MHC molekulami, a to tých peptidov, ktoré pochádzajú z exogénneho proteínu.

01-3663-02-Ma

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov v asociácii s MHC molekulami, a to tých peptidov, ktoré pochádzajú z endogénneho proteínu.

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov na povrchu bunky po spracovaní, pri ktorom sa sledované bunky kontaktovali s exogénnym proteínom alebo s exogénnym mikroorganizmom, takže ich ponuka povrchových peptidov je odlišná od ponuky reprezentovanej na inak identických referenčných bunkách, ktoré neboli uvedené do kontaktu s exogénnym proteínom.

Exogénnym proteínom extrahovaný zo cicavčieho línia alebo tkanivo ex môže byť purifikovaný preparát zdroja, akým je napríklad bunková vivo, alebo môže byť proteínom rekombinantný preparát purifikovaný z ľubovoľného biologického zdroja geneticky vygenerovaného pre expresiu uvedeného proteínu. Proteínom môže byť prirodzene sa vyskytujúci proteín alebo fúzia jedného alebo viacej prirodzene sa vyskytujúcich proteínov. Proteín môže byť odvodený in vitro ako zostava prirodzene sa vyskytujúcich prvkov alebo môže byť syntetizovaný v plnom rozsahu alebo môže byť navrhnutý tak, že nemá žiadny prirodzene sa vyskytujúci ekvivalent.

Príkladom proteínu môže byť člen tried proteínov, akými sú napríklad molekuly protilátky a ich deriváty, cytokíny, rastové faktory, leukotríny, hemostatické faktory alebo môže byť proteínom bunečný toxín alebo proteín, ktorý má enzymatickú kapacitu alebo funkciu. Najvýhodnejšie je proteínom terapeutický proteín.

Zistilo sa, že účinnosť niekoľkých terapeutických proteínov je obmedzená indukciou nežiadúcich imunitných

01-3663-02-Ma reakcií na terapeutický proteín. Príklady takých prípadov zahrnujú okrem inej monoklonálnej protilátky [Schroff, R. W. a kol. (1985) Cancer Res. 45: str. 879 až 885; Shawler, D.L. a kol. (1985) J. Immunol. 135: str. 1530 až 1535] a taktiež niektoré proteíny ludského pôvodu, napríklad granulocytmakrofágové kolónie stimulujúce faktor [Wadhwa, M. a kol. (1999) Clin. Cancer Res. 5: str. 1353 až 1361] a interferón alfa 2 [Russo, D. a kol. (1996) Bri. J. Haem. 94:

str. 300 až 305; Stein, R. a kol.

(1988) New Engl. J. Med.

318:

str. 1409 až 1413] .

Existuje teda signifikantná potreba nájsť spôsoby, pomocou ktorých bude možné identifikovať determinanty, ktoré sa podielajú na indukcii imunitnej odpovedi na terapeutický proteín.

Základným faktorom pri indukcii imunitnej odpovedi je prítomnosť peptidov, ktoré sú schopné stimulovať účinnosť T bunky prezentáciou na molekuly MHC triedy II, tak nazývané T bunkové epitopy, vnútri proteinu. Pre elimináciu alebo redukciu imunogenicity je potreba identifikovať a odstrániť T bunkové epitopy z proteinu. Predmetom vynálezu je teda poskytnutie metód, ktoré umožnia detekciu a identifikáciu T bunkových epitopov.

Exogénne proteíny sa pohltia a spracujú spôsobom, ktorý vedie k ich prezentácii v asociácii s molekulami MHC triedy II typu DR, DQ alebo DP. Molekuly MHC triedy II sú exprimované profesionálnymi antigén predkladajúcimi bunkami (APC), akými sú okrem iného napríklad makrofágy adéndritickej bunky. Schopnosť peptidu naviazať sa na molekulu MHC triedy II za účelom prezentácie na povrchu APC je závislá od celého radu rôznych faktorov, pričom najvýznamnejším faktorom je základná sekvencia. Táto sekvencia ovplyvňuje ako jeho sklon k proteolytickému štiepeniu, tak taktiež jeho afinitu pre naviazanie vnútri rozštepu peptidu v molekule MHC triedy II

01-3663-02-Ma určenému pre tieto účely. Komplex MHC triedy II/peptid na povrchu APC prezentuje väzobné miesto pre príslušný T bunkový receptor (TCR), ktorý je schopný rozpoznať determinanty poskytované ako exponovanými zvyškami peptidu, tak molekulou MHC triedy II. V danej oblasti existujú postupy ^: pre identifikáciu syntetických peptidov, ktoré sú schopné naviazať sa na molekuly MHC triedy II. Tieto peptidy nemusia vďaka mechanizmom (cestám) spracovania alebo vďaka ďalším fenoménom vo všetkých situáciách fungovať ako T bunkové epitopy, najmä nemusia týmto spôsobom fungovať in vi vo. V danom odbore taktiež existujú výpočtové spôsoby pre predpoveď potenciálnych T-bunkových epitopov alebo rozpoznanie sekvenčných motívov v experimentálne určených T-bunkových epitopoch. Schémy zahrnujú techniky pre predpoveď peptidov viažucich molekuly MHC triedy II, viď napríklad WO 98/52976, kde výpočtový prístup identifikuje peptidové sekvencie s potenciálom viazať sa iba na podsúbor možných ľudských DR alotypov MHC triedy II.

Identifikácia T bunečných epitopov je prvým krokom eliminácie epitopu, ako naznačujú WO 98/52976 a WO 00/34317. U týchto techník sa predpokladané T bunkové epitopy odstránia za použitia rozvážne zvolenej aminokyselinovej substitúcie v základnej sekvencií terapeutického proteinu. Predmetom vynálezu je poskytnúť spôsoby vývoja modifikovaných proteínov, ktorých imunitné vlastnosti sú modifikované redukovaným počtom potenciálnych T-bunkových epitopov. Identifikované sekvencie prezentované na povrchu buniek nesúcich MHC alebo naviazané na MHC preparáty potom, čo prebehli prirodzené udalosti intracelulárneho spracovania, sú prítomné v ľubovoľnej kompetentnej APC alebo podobnej bunke. Peptidy identifikované podľa schémy podľa vynálezu možno detekovať z ľubovoľného MHC alotypu alebo zmesi alotypov vrátane MHC triedy II alotypov DR, DQ alebo DP špecificít.

01-3663-02-Ma

Vynález umožňuje detekciu peptidov exponovaných na povrchu buniek, a najmä v asociácii s MHC molekulami triedy I a triedy II, ale neobmedzuje sa iba na celé bunky a zahrnuje aj analýzu peptidov na povrchu exozómov. Peptid-MHC komplexy sú prítomné vo vysokej koncentrácii na povrchu exosomatických vehikúl odvodených z buniek normálne exprimujúcich molekuly MHC triedy

II. Za určitých okolností možno produkciu exozómov z povrchu APC zvýšiť, pričom boli rozpoznané postupy pre obohatenie alebo izoláciu exozómov [Raposo, G. a kol.. (1996) J. Exp. Med. 183: str. 1161 až 1172; Clayton, A. a kol. (2001) J. Immunol. Methods 247: str. 163 až 174] . Do rozsahu vynálezu taktiež spadá analýza APC preparátov a preparátov exosomatických častíc odvodených z APC.

V súhrne sa vynález týka nasledujúcich aspektov:

Metódy vývoja farmaceutického proteínu alebo vakcíny účinnosť oproti antigénu majúcich a zníženú alebo nemodifikovanému má rovnakú polypeptidu alebo špecifickú biologickú zosilnenú imunogenicitu proteínu alebo polypeptidu, ktorý biologickú účinnosť, pričom' pri aplikácii tejto metódy sa (i) bunky uvedú do kontaktu s uvedeným proteínom alebo polypeptidom, ktorý generuje súbor povrchových peptidov na bunkách alebo na ich vehikulách, ktorý je iný ako súbor povrchových peptidov exponovaný na referenčných bunkách, ktoré neboli kontaktované, (ii) uvedené bunky alebo ich exosomatické vehikulá sa analyzujú na peptidy naviazané na povrchu uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl a

01-3663-02-Ma (iii) uvedené peptidy sa podľa štandardných postupov zaradí do sekvencie farmaceutického proteínu alebo polypeptidu alebo antigénu vakcíny.

• Odpovedajúce metódy, ktoré ďalej zahrnujú nasledujúce kroky:

(iv) modifikáciu uvedených peptidov, ktorá má zmeniť ich väzbu na molekuly MHC, a (v) konštrukciu sekvenčných variant konečného farmaceutického proteínu alebo polypeptidu začlenením jednej alebo viacej modifikovaných peptidových sekvencii do sekvencie molekuly proteínu alebo polypeptidu za použitia štandardných metód.

Odpovedajúce metódy, kedy sa analýza uvedených buniek alebo ich exosomatických (ii) uskutočňuje za použitia vehikúl v kroku hmotnostnej spektroskopie (MS), výhodne MALDI-MS a ESI-MS.

Odpovedajúce metódy, kedy sa farmaceutický proteín alebo polypeptid modifikujú tak, že jeden alebo viacej uvedených peptidov už nie je po uvedení do kontaktu bunky s uvedeným proteinom alebo polypeptidom naviazané.

Odpovedajúce metódy, kedy sú peptidy naviazané na povrchu buniek alebo exosomatických vehikúl podľa kroku(i) v asociácii s MHC molekulami, a analýza uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl sa podľa kroku (ii) uskutočňuje za použitia MS.

01-3 663-02-Ma

Odpovedajúce metódy, kedy sú peptidy naviazané na povrchu buniek alebo exosomatických vehikúl podľa kroku (i), produkty intracelulárnej peptidázy a dopravnej dráhy.

Odpovedajúce metódy pre vývoj farmaceutického proteínu alebo polypeptidu majúceho zníženú imunogenicitu, pričom modifikácia imunogénnych peptidov sa prevádza tak, že sa eliminuje alebo obmedzí ich väzba na molekuly MHC, prípadne tak, že sa uskutoční test modifikovaných peptidov na väzbu k bunkovému povrchu, ako naznačuje patentový nárok 1.

Odpovedajúce metódy, kedy sa eliminácia alebo redukcia väzby proteínov na molekuly MHC realizuje tak, že sa uskutoční substitúcia, inzercia alebo delécia jedného alebo niekoľkých aminokyselinových zvyškov v sekvenčnej oblasti peptidu vo farmaceutickom proteínu alebo polypeptidu.

Metódy pre vývoj farmaceutického proteínu alebo polypeptidu majúceho zvýšenú imunogenicitu, pričom modifikácia imunogénnych peptidov sa uskutočňuje tak, že sa zosilní ich väzba na molekuly MHC, prípadne tak, že sa uskutočni test modifikovaných peptidov na väzbu k bunkovému povrchu, ako naznačuje patentový nárok 1.

Odpovedajúce metódy, kedy sa zosilnenie väzby peptidov na molekuly MHC realizuje tak, že sa uskutoční substitúcia, inzercia alebo delécia jedného alebo niekoľkých aminokyselinových zvyškov v sekvenčnej oblasti peptidu zvyšujúca

01-3663-02-Ma účinnosť peptidu pôsobiť ako T-bunkový a/alebo rozšírením rozsahu MHC typov, na ktoré je

T-bunkový epitop obmedzený a/alebo kombináciou niekolkých inak nesúrodých epitopov do jedinej entity.

Metódy vývoja vakcíny, ktoré zahrnujú:

(i) uvedenie bunky do kontaktu s proteínom alebo polypeptidom alebo mikroorganizmom, ktorý má imunogénnu účinnosť, vytvorením súboru povrchových peptidov na uvedených bunkách alebo ich exosomatických vehikulách, ktorý je odlišne od súboru povrchových peptidov exponovaný na referenčných bunkách, ktoré neboli kontaktované, (ii) analýzu uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl na povrchu, na ktorom sú naviazané peptidy, (iii) priradenie uvedených peptidov podľa štandardných metód do sekvencie proteínu alebo polypeptidu a (iv) konštrukciu sekvenčných variant konečnej farmaceutickej vakcíny zavedením jedného alebo viacej peptidov do sekvencie molekuly vakcíny podľa štandardných metód, pričom analýza uvedených buniek alebo exosomatických vehikúl sa uskutočňuje za použitia MS.

• Odpovedajúce metódy využívajúce ľudské bunečné línie geneticky upravené tak, aby produkovali molekuly MHC.

• Odpovedajúce metódy, pri ktorej rodičovská (geneticky

01-3663-02-Ma neupravená) bunečná línia neprodukuje molekuly MHC.

• Odpovedajúce metódy, pri ktorých rodičovská bunečná línia neprodukuje molekuly MHC triedy I.

• Odpovedajúce metódy, pri ktorých rodičovská bunečná línia neprodukuje molekuly MHC triedy II.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa nehumánne bunky, ktoré neprodukujú svoje vlastné molekuly MHC, geneticky upravia tak, aby produkovali molekuly MHC, a použijú naznačeným spôsobom.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa molekuly MHC odvodia z MHC triedy II.

• Odpovedajúce metódy, kedy sú molekulami MHC molekuly HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP.

• Odpovedajúce metódy, kedy sä molekuly MHC odvodia z MHC triedy I.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa použije kombinácia bunkových línií alebo bunkových vzoriek, ktoré poskytujú komplexnú zmes rôznych MHC alotypov a genotypov.

• Odpovedajúce metódy, kedy peptidy pochádzajú z exogénneho proteínu alebo mikroorganizmu.

• Odpovedajúce metódy, kedy peptidy pochádzajú z endogénneho proteínu.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa použijú ludské dendritické bunky alebo ich exosomatické vehikulá, ktoré po

01-3663-02-Ma pridaní proteínu alebo polypeptidu alebo mikroorganizmu prezentujú peptidy na molekulách MHC.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa použijú ludské antigén prezentujúce bunky alebo ich exosomatické vehikulá, ktoré po pridaní proteínu alebo polypeptidu prezentujú peptidy na molekulách MHC.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa pred analýzou na peptidy molekuly MHC obohatia.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa peptidy pred analýzou vymyjú z bunkového povrchu.

Odpovedajúce metódy, kedy sa peptidy pred analýzou vymyjú z molekuly MHC.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa použije MALDI-MS.

• Odpovedajúce metódy, kedy sa použije ESI-MS.

• Metódy vývoja diagnostického testu, pri ktorých sa uskutoční (i) analýza vhodných ľudských buniek zameraná na povrchové peptidy, a (ii) buď (a) sa pripraví profil peptidov, ktoré sa objavia na bunkovom povrchu a, prípadne sa porovná s ďalšími profilmi v snahe identifikovať abnormalitu alebo ochorenie v súvise s ľudskými bunkami, alebo (b) sa určia sekvencie špecifických peptidov na bunkovom povrchu ako prostriedok pre určenie špecifických peptidov, ktoré možno použiť k identifikácii abnormality alebo ochorenia

01-3663-02-Ma spojeného s ľudskými bunkami.

• Použitie proteínu alebo polypeptidu získaného ľubovoľnou vyššie popísanou metódou ako farmaceutickej terapeutickej entity.

• Použitie proteínu alebo polypeptidu získaného ľubovoľnou vyššie popísanou metódou ako vakcíny.

• Použitie proteínu alebo polypeptidu získaného ľubovoľnou vyššie popísanou metódou ako farmaceutickej terapeutickej entity, ktorá má zníženú imunogenicitu.

• Spôsobu detekcie peptidov na povrchu buniek alebo ich exosomatických vehikulách, ktoré sa odvodia z proteínu alebo polypeptidu tak, že (i) sa bunky uvedú do kontaktu s uvedeným proteínom alebo polypeptidom alebo génom kódujúcim tento protein alebo polypeptid, na týchto bunkách alebo ich exosomatických vehikulách sa generuje súbor povrchových peptidov, ktorý je odlišný od súboru povrchových peptidov exponovaných na referenčných bunkách, ktoré neboli kontaktované, (ii) uvedené bunky alebo ich exosomatické vehikulá sa analyzujú na povrchu, na ktorom sú naviazané peptidy, a (iii) uvedené peptidy sa prevedú do sekvencie proteínu alebo polypeptidu podľa štandardných metód, pričom analýza v bunkách alebo exosomatických vehikulách sa uskutoční

MS, výhodne MALDI-MS.

Spôsob podľa prvého hlavného uskutočnenia vynálezu je

01-3663-02-Ma teda použiteľný:

1. Pri identifikácii jedného alebo viacej spracovaných T bunkových epitopov v aminokyselinovej sekvencii cieľového proteínu.

2. Pri navrhovaní nových sekvenčných variant cieľového proteínu s jednou alebo viacej aminokyselinami v identifikovaných potenciálnych T bunkových epitopoch modifikovaným spôsobom, ktorý významne redukuje alebo celkom eliminuje účinnosť T bunkového epitopu, stanovené naviazaním peptidov na molekuly MHC alebo celej bunky, alebo inými prostriedkami. Je dôležité, aby boli tieto sekvenčné varianty vytvorené spôsobom, ktorý vylúči tvorbu nových potenciálnych T bunkových epitopov v dôsledku sekvenčných variácií, pokiaľ tieto nové potenciálne T bunkové epitopy nie sú opäť modifikované spôsobom, ktorý významne obmedzí alebo celkom eliminuje účinnosť T bunkového epitopu.

3. Pri konštrukcii takých sekvenčných variant a pri testovaní uvedených variant s cieľom identifikovať jednu alebo viacej variant s požadovanými vlastnosťami.

Podľa tejto schémy sa bude produkovať a testovať určitý počet variant proteínov, najvýhodnejšie rekombinantnými DNA technikami, hoci možno použiť aj ďalšie postupy vrátane chemických syntéz. Dá sa očakávať, že pre elimináciu epitopu sa uskutočnia jednoduché aminokyselinové substitúcie v danom potenciálnom T bunkovom epitope. V jedinom epitope možno uskutočňovať kombinácie substitúcie.

Podľa hlavného aspektu vynálezu sa populácia cicavčích buniek inkubujú testovaným proteínom alebo transfektujú génom

01-3663-02-Ma kódujúcim testovaný proteín a po prijme alebo expresii proteínu a jeho rozkladu sa určí profil alebo identita peptidov na bunkovom povrchu. Také peptidy budú prezentovať najmä molekuly MHC, a najmä násobné molekuly MHC. Ako jeden aspekt tohto vynálezu je dôležité analyzovať peptidy prezentované na vela rôznych molekulách MHC, a analýza sa teda výhodne uskutočňuje na viacej bunkových populáciách zahrnujúcich velmi vysoké percento MHC alotypov a genotypov, s ktorými sa stretávame vo svetovej populácii. Také bunkové populácie možno získať buď vzorkovaním (sampling) početných bunkových populácií zo svetovej populácie, alebo použitím buniek, ktoré boli geneticky upravené, aby produkovali početné MHC typy. Zvlášť použiteľné sú bunkové línie, ktoré neprodukujú žiadne endogénne molekuly MHC a ktoré exponujú na bunkovom povrchu nízke pozadie peptidov.

Vzhladom na veľký počet ľudských MHC alotypov a genotypov a vzhladom na to, že každý z nich má kapacitu viazať sa na iný profil peptidov z ľubovoľného daného proteínu, predchádzajúce prístupy, ktorých cieľom bolo komplexne identifikovať T bunkové epitopy vyššie popísaným spôsobom, zahrnovali predovšetkým prediktívne prístupy, skôr ako biochemické (pokiaľ sa peptidy testujú na väzbu na veľký počet MHC typov) alebo biologické prístupy (predovšetkým pokiaľ sa peptidy testujú na aktiváciu alebo stimuláciu T buniek). V prípade peptidov, ktoré sa viažu na molekuly MHC triedy II, také prediktívne prístupy zahrnujú techniky motívu a umelých neurónových sietí, pričom veľký počet sekvencii T bunkových epitopov sa analyzuje, s cieľom určiť špecifické kombinácie aminokyselín spoločne pre tieto epitopy pre následnú prediktívnu analýzu ďalších peptidov. Jednako len v prípade MHC triedy II sú tieto prediktívne prístupy obmedzené a často bude chýbať časť T bunkových epitopov (nesprávne označené za negatívne) alebo priradia určité peptidy k T bunkovým

01-3663-02-Ma epitopom, aj keď v praxi chýba táto účinnosť (nesprávne označené za pozitívne). Ďalším podstatným obmedzením prediktívnych prístupov a taktiež biochemických a biologických prístupov v prípade syntetických peptidov je neschopnosť vziať v úvahu spracovanie daného proteínu, ktoré môže ovplyvniť to, ktoré peptidy sú prezentované molekulami MHC. Pre presnú a komplexnú identifikáciu T bunkových epitopov bez zjavne nesprávne negatívne označených alebo nesprávne pozitívne označených, je teda treba vyvinúť vylepšené postupy, a práve také zlepšenie predložený vynález poskytuje.

Pri vývoji ludského farmaceutického proteínu podlá prvého uskutočnenia vynálezu je za primárne využitie považované vyrobenie proteínu, pomocou ktorého sa odstráni epitopy pre aktiváciu a/alebo stimuláciu pomocných T buniek. V tomto prípade je primárny záujem venovaný peptidom prezentovanými molekulami MHC triedy II. Pri vývoji farmaceutického proteínu, ktorý bude účinný u velkej časti ludí, je nezbytné identifikovať peptidy v proteíne, ktorý môže byť prezentovaný jedným alebo viacej alotypmi početnej MHC skupiny alotypov, a následne tieto peptidy upraviť tak, aby boli zbavené schopnosti viazať sa na molekuly MHC. Skôr bola komplexná identifikácia peptidov prezentovaných molekulami MHC triedy II obmedzená obtiažnosťou presnej predpovedi týchto peptidov a predpovedi peptidov, ktoré sa viažu na jednu alebo viacej molekúl z velkého počtu rôznych alotypických a genotypických ľudských molekúl MHC triedy II. V porovnaní s peptidmi, ktoré sa viažu na molekuly MHC triedy I, kde je predpoveď o vela spoľahlivejší, sú peptidy, ktoré sa viažu na molekuly MHC triedy II, o veľa premenlivéjšie vo svojej dĺžke a zvonka, hlavných väzobných vreciek majú aminokyseliny, ktoré o veľa významnejšie ovplyvňujú peptidovú väzbu. V prípade molekúl MHC triedy II teda existuje potreba vyvinúť presnejšie a komplexnejšie metódy, ktoré budú súčasne dostupné pre

01-3663-02-Ma predpoveď alebo detekciu peptidov, ktoré sa viažu na jeden alebo viacej alotypov a genotypov z početnej skupiny MHC triedy II, v snahe komplexne identifikovať potenciálne T bunkové epitopy. Hlavný prínos dostupnosti takého prístupu spočíva v generovaní farmaceutík so všetkými hlavnými (alebo úplne všetkými) identifikovanými a následne odstránenými T bunkovými epitopmi.

Výhodný spôsob vývoja farmaceutickej látky za použitia vynálezu zahrnuje nasledujúce kroky:

1. v prípade proteínu, u ktorého sa zisťuje jeho potenciálne využitie ako farmaceutickej látky, sa proteín pridá k výberu ľudských bunkových línií alebo ku vzorkám ľudských buniek;

2. po uplynutí vhodnej časovej periódy sa priamo na bunkách uskutoční analýza buniek zameraná na povrchové peptidy, ktorá spravidla používa MALDI-MS, alebo alternatívne sa MALDI-MS analýza uskutoční na bunkových frakciách, najmä MHC frakciách, alebo alternatívne sa peptidy pred uskutočnením analýzy, spravidla MALDI-MS alebo ESI-MS, vymyjú z povrchu bunky;

3. z daného proteínu sa označia peptidy, ktoré sa objavujú na bunkovom povrchu;

4. peptidy, ktoré sa objavujú na bunkovom povrchu v odseku (2), sa modifikujú s cieľom eliminovať väzbu na MHC molekuly, v niektorých prípadoch uskutočnením testu modifikovaných peptidov zameraných na väzbu k bunkovému povrchu (viď vyššie); a

01-3663-02-Ma

5. zavedením vhodných modifikácií do jedného alebo viacej peptidov v proteínovej sekvencií, ktoré majú eliminovať väzbu na MHC molekuly, sa generuje konečná farmaceutická proteínová molekula.

Podlá druhého hlavného uskutočnenia vynálezu vynález poskytuje schému, pomocou ktorej možno vyvinúť molekulu vakcíny alebo molekulu schopnú fungovať ako vakcína. Vakcína je najvýhodnejšie určená pre humánnu medicínu, jednako len túto schému možno rovnako tak aplikovať na vývoj molekúl vakcíny určených pre liečbu alebo prevenciu ochorení ostatných živočíchov ako je človek. Pri vývoji vakcíny pomocou vynálezu sa vytvorí peptid alebo proteín, pomocou ktorých sa prezentuje väčšina epitopov pre aktiváciu a/alebo stimuláciu T buniek, najmä epitopov pre pomocné T bunky, ale taktiež pre aplikácie vyžadujúce hubenie buniek, tzn. epitopy pre cytotoxické T bunky (najmä obmedzené MHC triedou I). Pri vývoji vakcíny, ktorá má byť účinná u vysokého percenta ľudskej populácie, je treba identifikovať peptidy vnútri proteínu, ktoré môžu byť prezentované jedným alebo viacej početnými MHC alotypmi a genotypmi, a následne zvoliť z týchto peptidov jeden alebo viacej epitopov, ktoré budú zahrnuté do konečnej molekuly vakcíny. Také epitopy môžu obsahovať peptidy obmedzené MHC triedou I a/alebo MHC triedou II. Vynález pre takú identifikáciu peptidov prezentovaných MHC triedou I a MHC triedou II poskytuje nástroj, a tak tvorí základ pre vývoj účinnejších vakcín.

Zásadným rozdielom medzi epitopmi MHC triedy I a MHC triedy II je pôvod proteínu, z ktorého je peptid obsiahnutý v MHC-peptidovom komplexe spravidla odvodený. Bolo zistené, že exogénne proteíny poskytujú prevážne peptidy v asociácii s MHC triedou II, zatiaľ čo endogénne proteíny exprimované vnútri bunky sú spracovávané pomocou odlišnej peptidázy a

Ol-3663-O2-Ma intracelulárnej dopravnej dráhy, čo vedie prevážne k asociácii s molekulami MHC triedy I na bunkovom povrchu. V prípade exogénnych alebo endogénnych peptidové sekvencie proteínu, proteínov ktoré by môžu byť sa normálne určité mohli viazať na MHC, zničené v priebehu proteínov, takže určité T bunkové epitopy V prípade týchto peptidov nemôžu biochemické/biologické) metódy brať v spracovania in vivo nevznikajú.

prediktívne (alebo týchto úvahu spracovanie peptidov pri identifikácii T bunkových epitopov. Jedným znakom vynálezu je to, že peptidmi identifikovanými z bunkového povrchu sú peptidy vyselektované pomocou APC (alebo inej bunky) ako schopné byť spracované intracelulárnymi mechanizmy a dopravnými dráhami. Tým, že sa vynález zameriava na identifikáciu skutočných produktov spracovateľských krokov, znižuje počet nesprávne pozitívne označených a nesprávne negatívne označených epitopov identifikovaných za použitia prediktívnej alebo in vitro metódy identifikácie epitopu.

Spôsob podľa druhého hlavného uskutočnenia vynálezu možno teda aplikovať:

1. Pri identifikácii jedného alebo viacej T bunkových epitopov v aminokyselinovej sekvencii cieľového proteínu.

2. Pri navrhovaní nových sekvenčných variant cieľového proteínu, ktoré majú jednu alebo _; viacej aminokyselín modifikovaných tak, aby:

i) sa zvýšila aktivita T bunkového epitopu; a/alebo ii) sa rozšíril rozsah MHC typov, pre ktoré je T bunkový epitop obmedzený, pričom tento rozsah sa stanoví naviazaním peptidov na MHC molekuly alebo celej bunky alebo iným spôsobom; a/alebo

01-3663-02-Ma iii)sa skombinovalo niekolko inak nesúrodých epitopov do jedinej (menšej) entity.

3.Pri konštrukcii takých sekvenčných variant a testovaní týchto variant s cieľom identifikovať jednu alebo viacej variant s požadovanými vlastnosťami.

Podlá tejto schémy možno produkovať a testovať určitý počet rôznych proteínov, najvýhodnejšie rekombinantnými DNA technikami, hoci možno použiť aj ďalšie postupy vrátane chemických syntéz.

Výhodný spôsob vývoja vakcíny za použitia vynálezu teda zahrnuje nasledujúce kroky:

1. v prípade proteinu, u ktorého sa zisťuje jeho potenciálne využitie akó vakcína, sa proteín pridá k výberu ľudských bunkových línií alebo k vzorkám ľudských buniek;

2. po uplynutí vhodnej časové periódy sa priamo na bunkách uskutoční analýza buniek zameraná na povrchové peptidy, ktorá spravidla používa MALDI-MS, alebo alternatívne sa MALDI-MS analýza uskutočni na bunkových frakciách, najmä MHC frakciách, alebo alternatívne sa peptidy pred uskutočnením analýzy, spravidla MALDI-MS alebo ESI-MS, vymyjú z povrchu bunky;

3.	z daného proteinu sa označia peptidy, na bunkovom povrchu;	ktoré sa	obj avujú
4.	zvolí sa jeden alebo viacej peptidov,	ktoré sa	objavia na
	bunkovom povrchu v odseku (2), pre	použitie	v konečnej
	molekule vakcíny.

01-3663-02-Ma

Je zrejmé, že pri analýze peptidov bunkového povrchu vhodných pre použitie ako farmaceutická látka alebo vo vakcíne, je možné použiť kombináciu bunkových línií alebo vzoriek ľudských buniek poskytujúcich komplexnú zmes rôznych MHC alotypov a genotypov, a že tieto vzorky prirodzených buniek budú poskytovať komplexnú zmes epitopov obmedzených MHC triedou I a/alebo MHC triedou II. Zvlášť vhodné sú ľudské dendritické bunky (čiže exozómy), ktoré možno aktivovať po pridaní testovaného proteínu tak, aby účinne prezentovali peptidy na MHC molekulách. Alternatívne možno ľudské bunkové línie geneticky upraviť a rozšíriť tak ich MHC súbory transfekciou génov kódujúcich jeden alebo viacej MHC typov do týchto buniek, takže sa produkujú bunky s početnými MHC typmi pre analýzu peptidov bunkového povrchu. Zvlášť vhodné budú nehumánne bunky, ktoré neprodukujú svoje vlastné MHC molekuly, napríklad myšacie bunky, v ktorých sa myšacie MHC gény vypustia alebo inak urobia neschopnými. Analýza peptidov bunkového povrchu bude taktiež zahrnovať prípadný krok obohatenia MHC molekúl uskutočnený pred analýzou peptidov, pričom pre toto obohatenie sa napríklad použijú imunoafinitné kolóny. V prípade MHC triedy II má spôsob analýzy peptidu bunkového povrchu podľa vynálezu zvláštnu výhodu, ktorá spočíva v tom, že umožňuje analýzu väzby na alotypy iné ako DR. Analýza peptidovéj prezentácie takými alotypmi, akými sú DQ a DP, bola veľmi obtiažha, pretože neexistovala prediktívna metóda dostupná najmä pre DQ, na základe ktorej by sa dalo domnievať, že sa oba reťazce MHC molekuly podieľajú na väzbe (na rozdiel práve od β reťazce DR).

Podľa tretieho hlavného aspektu vynálezu možno schému spôsobu podľa vynálezu použiť pri vývoji diagnostického testu.

Účelom tohto uskutočnenia je najmä generovať profil peptidov prezentovaný na bunkovom povrchu v snahe identifikovať

01-3663-02-Ma abnormálnu prítomnosť, absenciu alebo vzor peptidov, ktoré môžu naznačiť určité ochorenie alebo bunkový inzult.

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby detekcie peptidov na povrchu bunky po ukončení procesu, pri ktorom sa sledované bunky uvedú do kontaktu s exogénnym proteínom alebo organizmom alebo iným činidlom, a v dôsledku tohto procesu sa súbor povrchových proteínov líši od súboru na povrchu inak identických buniek, ktoré neboli uvedené do kontaktu s exogénnym proteínom alebo organizmom. Pri realizácii vynálezu možno v prítomnosti diagnostického peptidu” alebo indikačného peptidu realizovať izolovane registráciou hmotnosti indikačného peptidu do prístroja alebo záznamom hmotnostného spektra MS sekvencie (alebo podobnom) spektre.

Prítomnosť indikačného peptidu v CID indikačného peptidu možno rovnako tak indikovať porovnaním s hmotnostným spektrom odvodeným z kontaktu s referenčnej exogénnym analýza vzorky, proteínom ktorý nebol uvedený do alebo činidlom.

Táto komparatívna hmotnosti indikačných inými prostriedkami.

je vhodná peptidov nie

Komparatívnu najmä v prípadoch, sú známe alebo kedy predpovedané analýzu možno in silico odpočtom identických hmotnostných píkov uskutočňovať a je vhodná najmä v prípadoch, kedy strata príslušného hmotnostného pika odpovedá diagnostickému indikátoru. Skôr sa v komparatívnej analýze biologických vzoriek taktiež používali MS techniky. Jednako len v prípade, ktorý popisuje Liotta a kol. [WO 00/49410], sa táto komparatívna analýza zameriava na obsah proteínov v jednotlivých bunkách získaných laserovou mikrodisekciou, čo je rozdiel oproti predkladanému vynálezu, kde sá diagnóza (komparatívna, odpočtová alebo iná) uskutočňuje na peptidoch detekovaných z povrchu bunky, a najmä na peptidoch, ktoré sú v asociácii s MHC molekulami na povrchu bunky.

01-3663-02-Ma

Ďalšie diagnostické techniky, ktoré používajú MS technológiu, popisuje napríklad Little a kol. [US 6 207 370], ktorý uvádza, že diagnostický postup na báze MS je zameraný na identifikáciu genetického ochorenia, ktoré je konštitučným znakom osoby a ale nie stavu. Tento postup môže identifikovať hmotnosť cieľového proteínu, ktorý je v populácii premenný, v závislosti od genetickej konštitúcie osoby. Ďalšia diagnostická schéma popisuje Geng a kol. [Geng, M. (2000) J. Chromatography A. 870: str. 295 až 313], ktorý analyzoval

MALDI-TOF spektrá získané z tryptických digestov vzoriek sérových proteínov. Ich spôsob detekuje znakové peptidy ako diagnózu prítomnosti proteínu prítomného v komplexnej zmesi.

Tento spôsob sa taktiež líši od predkladaného vynálezu, kde sa diagnóza (komparatívna, odpočtová alebo iná) uskutočňuje na peptidoch detekovaných z povrchu bunky, a najmä na peptidoch, ktoré sú v asociácii s MHC molekulami na povrchu bunky.

Podľa tejto schémy vynálezu výhodný spôsob vývoja diagnostického testu zahrnuje nasledujúce kroky:

1. analýzu vhodných ludských buniek zameranú na povrchové peptidy, ktorá spravidla používa MALDI-MS, alebo alternatívne sa MALDI-MS analýza uskutoční na bunkových frakciách, najmä MHC frakciách, alebo alternatívne sa peptidy pred uskutočnením analýzy, spravidla MALDI-MS alebo ESI-MS, vymyjú z povrchu bunky;

2. produkciu profilu peptidov, ktoré sa objavia na bunkovom povrchu, a pokiaľ je to vhodné, porovnanie s ďalšími profilmi, v snahe identifikovať abnormalitu alebo ochorenie v súvise s týmito ľudskými bunkami, alebo určenie sekvencie špecifických peptidov na bunkovom

01-3663-02-Ma povrchu ako prostriedku pre určenie špecifických peptidov, ktoré možno použiť pre identifikáciu abnormality alebo ochorenia v súvise s týmito ľudskými bunkami.

Vzhľadom na ľahký prístup k rôznym databázam proteínových sekvencií a vzhľadom na ich rozširujúci sa obsah, nie je pre všetky uskutočnenia vynálezu podstatným znakom získanie kompletných sekvencií pre určenie identity peptidov. Aj málo informácii o vnútornej sekvencií (čo môžu byť dva až tri známe zvyšky) môže byť v spojení so známou hmotnosťou rodičovského iónu dostatočnou informáciou pre charakterizáciu peptidových druhov. Existujú dostupné algoritmy pre prieskum databáz obsahujúcich súbory dát, týkajúce sa iónov neprerušených fragmentov.

Významnými príkladmi týchto algoritmov sú napríklad

ProteinLynx

Global

Server search algorithm (Micromass,

Wythenshawe, UK) ,

Mascot od Matrix Science [www.matrix.com] alebo Proteín Prospector súbor programov [http:./Zprospector.ucsf.edu] alebo podobné algoritmy. Tieto programy simulujú fragmentáciu sekvenčných vstupov v databázach s hmotnosťami sledovaného peptidu.

Nasledujúce príklady majú iba ilustratívny charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený priloženými patentovými nárokmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Spôsob detekcie peptidov naviazaných na bunkovom povrchu

HLA-DR za použitia MALDI-TOF

01-3663-02-Ma

EBV Transformované ľudské B bunkové línie JESTHOM a BSM sa získali z ECACC (Porton Down, UK) . B Bunková línia JESTHOM je homozygótna pre HLA-DRl*0101 a línia BSM je homozygótna pre DRBI*0401. Bunkové línie sa kultivovali in vitro, za použitia podmienok doporučených dodávateľom. Myšacie NSO bunky (ECACC #85110503), kultivované za podmienok doporučovaných dodávateľmi , sa použili ako negatívna kontrolná bunková línia.

Syntetické peptidy sa získali od Zeneca (Zeneca LSM, Northwich, UK). Peptid HA1 bol 13mérom, ktorý odpovedal zvyškom 307 až 319 hemaglutínového proteínu chrípkového vírusu (Rothbard, J. B. a kol. (1988) Celí 52: str. 515). Peptid MP1 bol 13mérom, ktorý odpovedal zvyškom 17 až 29 matricového proteínu chrípkového vírusu [Rothbard, J.B.a kol. (1988), viď tam isto]. Aj keď je známo, že oba tieto peptidy viažu určitý počet rôznych HLA-DR špecificít, určitá rozdielna väzobnosť je patrná na DR4 alotypu. MP1 sa viaže na DR4, zatiaľ čo MP1 nevykazuje významnejšiu väzbu na DR4 špecificitu [Busch R. a kol. (1990) Int. Inanunol. 2: str. 443].

V niektorých experimentoch sa použili analogické peptidy obsahujúce labilnú biotínovú linkérovú časť. V ich prípade sa linkér biotín-HPDP (Pierce, Chester, UK) naviazal na N-koncový cysteínový zvyšok, za vzniku peptidov HA1B a MP1B. S výnimkou dodatočného cysteínového zvyšku sú tieto sekvencie inak identické s HA1 a MP1. Naviazanie sa dosiahne za použitia protokolov dodaných spoločne s biotín-HPDP (Pierce,

Chester,

UK) s tou výnimkou, že sa purifikácia naviazaného peptidu uskutočňovala za použitia

HPLC a štandardného elučného profilu. Inhibičné experimenty sa uskutočnili za purifikovanej monoklonálnej látky LB3.1 [ATCC číslo použitia

HB-298].

Protilátka sa purifikovala z hybridómom LB3.1 kondiciovaného

01-3663-02-Ma média za použití proteín A sepharose (Millipore, Conset, UK) afinitnej chromatografie a postupov doporučených dodávateľom. Hybridom sa uchovával za štandardných podmienok. LB3.1 Sa koinkuboval s peptidom a bunkami pri maximálnej koncentrácii 10 dg/ml. ,

Bunky sa pred ošetrením rôznymi syntetickými peptidmi pri testovacích ¹ a kontrolných experimentoch fixovali paraformaldehydom. Experimenty sa uskutočňovali za použitia 3x 10⁶ buniek v 50 □ 1 kompletného média pridaného do 150 □ 1 peptidmi viažuceho pufra (50mM fosfát citrát pufor pri pH 4,0;

0,1% NP40) obsahujúceho peptid, pri finálnej koncentrácii 50 CM. Inkubácia sa uskutočňovala 24 h pri 37 °C. Pri teste sa peptidom ošetrené bunky pozberali odstreďovaním a trikrát prepláchli za použitia PBS. Bunky sa umiestnili do 10 dl alikvotného podielu 50 % acetonitril - 0,1 % kyseliny trifluóroctovej v 0,5 ml mikrokyvete. Každá vzorka sa následne 5 s búrlivo miešala pred aplikáciou vzorky (spotting) na platňu pre umiestnenie vzorky v MALDI prístroji. Použila sa dvojvrstvá metóda aplikácie vzorky (spotting), pri ktorej sa 10 dl roztoku kyselinovej matrice [0,1 M kyseliny sinapovej v 1:1:1 zmesi acetonitrilu, metanolu a vody] vysušilo na MS platni pre umiestnenie vzorky. Potom nasledoval 1 dl buniek a ďalej 1 dl roztoku matricovej kyseliny sinapovej.

v experimentoch používajúcich syntetické peptidy obsahujúce labilný linkér hmotnosť-tag sa odstránenie linkéra dosiahlo inkubáciou buniek v PBS obsahujúcom lOOmM dmerkaptoetanol (BME). Inkubácia BME sa uskutočňovala pri 37 °C po dobu 30 min a bunky sa tri razy prepláchli za použitia PBS, načo sa vzorka už popísaným spôsobom podrobil MALDI.

Hmotnostný spektrometer Voyager DE (Perseptive Biosystems, Foster City, CA, USA) sa použil v režime kladných iónov.

01-3663-02-Ma

Prístroj sa kalibroval zmesou konského srdcového apomyglobínu a albumínu bovinného séra (Sigma, Poole, UK) a v časovej perióde kratšej ako 30 min pred každou analýzou sa overila 0,1% presnosť hmotnosti pre každý štandard. Škvrny vzoriek sa vysušili na vzduchu a analyzovali v režime kladných iónov. Opozdená extrakcia sa nastavila na 150 ns pri 25 kV. Spodná vstupná hmotnostná hodnota sa nastavila na 600 Da. Z každej vzorky bolo napospol zhromaždené 125 laser striel.

Predpokladané hmotnostné piky pre peptidy HA1 a MP1 sa identifikovali vo spektrách generovaných z JESTHOM buniek. Z HLA-DR4 exprimujúcich BSM buniek sa naopak identifikoval iba peptid HA1. V experimentoch používajúcich označené peptidy sa identifikovali hmotnostné posuny peptidového pika v spektrách BME ošetrených buniek. Spektrá z LB1.1 inkubovaných buniek (inhibičné experimenty) ukázali, že liečba protilátkou nemôže zrušiť peptidovú väzbu, určité dôkazy o redukovanej relatívnej iónovej nadbytočnosti bolo možno nájsť , v trojcestných konkurenčných testoch využívajúcich peptid, označené peptidy a LB1.1 protilátku. Spektrá z myšacích NSO buniek, ošetrených peptidmi alebo peptidovými kombináciami, ukazujú velmi nízky nadbytok cieľových iónových píkov, čo ukazuje na nešpecifickú interakciu a alebo nedostatočné preplachovanie pri spracovaní buniek.

Príklad 2

Spôsob analýzy MHC-DR naviazaných peptidov za použitia MALDITOF

HLA-DRl*0101 Sa purifikoval z JESTHOM bunkových membrán imunoafinitnou chromatografiou. HLA-DRB1*O4O1 Sa purifikoval z

BSM buniek. Solubilizované bunkové membrány sa pripravili a

01-3663-02-Ma spracovali už popísaným spôsobom [Gorga kol. (1987) J. Biol. Chem. 262: str. 16087 až 16094; Sette a kol. (1989) J. Immunol. 42: str. 35 až 40]. Anti-DR monoklonálna protilátka LB3.1 [ATCC číslo HB-298] sa použila ako imunoafinitné reakčné činidlo. Protilátka sa purifikovala z hybridómom LB3.1 kondiciovaného média za použitia proteín A sepharose (Millipore, Conset, UK) afinitnej chromatografie a postupov doporučených dodávateľom.

Hybridom sa uchovával za štandardných podmienok. LB3.1 Protilátka sa naviazala na sepharózu 4B (Pharmacia Biotech, St. Albans, UK) pomocou systému Linx poskytnutého spoločností InVitrogen (InVitrogen, Groningen NQ) a za podmienok doporučených dodávateľom.

Syntetické peptidy HA1 a MP1 popísané v príklade 1 sa inkubovali 50 dl alikvotným podielom HLA-DRl*0101 preparátu. Peptidy sa inkubovali 26 h pri 37 °C v pufri viažucim peptid (50 mM fosfát citrát pufor pri pH 4,0; 0,1% NP4O) pri konečnej koncentrácii 50 Dl. Nenaviazaný peptid sa odstránil ultrafiltráciou za použitia microcon odstredivej filtrácie buniek (Millipore, USA) a početných cyklov (minimálne štyroch) prieplachov PBS. Konečný objem sa redukoval na 20 Dl. U niektorých experimentov sa peptidy pred analýzou MALDI-TOF vymývali z MHC. V tomto prípade sá vymývanie uskutočňovalo extrakciou roztokom 0,1% TFA v H₂O. Eluát sa odparil do sucha a ako v príklade 1 resuspendoval priamo za použitia MALDI matricového roztoku. V ďalších experimentoch sa MHC-peptidový komplex resuspendovaný v matricovom roztoku aplikoval na platňu meracieho prístroja pre umiestnenie vzorky.

Predpokladané hmotnostné piky pre peptidy HA1 a MP1 sa identifikovali v spektrách generovaných z HLA-DRl*0101

01-3663-02-Ma preparátov. V spektrách z DRBl*0401 preparátov možno identifikovať iba HA1 hmotnoštný pík.

Príklad 3

Spôsob analýzy peptidov bunkového povrchu nasledujúci po liečbe buniek celým proteínom

Ľudské dendritické bunky sa obohatili z 40 ml periférnych krvných vzoriek získaných od zdravých darcov. Krv sa antikoagulovala za použitia heparínu a mononukleárnej bunkovej frakcie, pripravenej za použitia média hustotného gradientu histopaque 1077 (Sigma, Poole, UK) a podmienok doporučených dodávateľom. Dendritické bunky sa získali negatívnou selekciou za použitia postupu imunomagnetickej separácie, za použitia všetkých reakčných činidiel a podmienok poskytnutých spoločností Mitenyi Biotec (Bisely, UK) . Dendritické bunky sa vymyli do viacjamkových misiek pre tkanivovú kultiváciu, kde sa ošetrili proteínovým antigénom. Bunky sa počas experimentov udržovali v RPMI médiu obohatenom 10 % (obj./obj.) fetálneho bovinného séra a štandardnými protilátkami. Všetky reakčné činidlá sa získali od spoločnosti Life Technologies (Paisley, UK) .

V týchto štúdiách sa použil prípravok rekombinantnej stafylokinázy. Štandardný stafylokinázový gén sa syntetizoval na základe zmluvy s Genosys Biotechnologies Ltd (Cambridge,

UK) . Gén sa konštruoval pomocou polymerázovej reťazovej reakcie, za použitia prekrytia syntetických primérov a sekvencie uvádzanej Collenom a kol. [Collen

D. (1996)

Circulation 94: str. 197 až 206].

Syntetický gén sa klonoval ako 453 bp EcoRI-HinDIII reštrikčným fragmentom do bakteriálneho expresného vektora pMEX (MoBiTec, Gottingen,

Germany). pMEX/Stafylokinázový gén sa transformoval do

01-3663-02-Ma kompetentného E. coli reťazca TG1 štandardnými technikami a jednoducho transformovaný kloň vylučujúci aktívnu stafylokinázu sa selektoval za použitia fibrínového stanovenia na platni [Astrup, T. a kol. (1952) Árch. Biochem. Siophys. 40: str. 346 až 351; Collen, D. a kol. (1992) Fibrinolysis 6: str. 203 až 213] . Vypestoval sa najlepšie exprimujúci kloň a rekombinantný proteín sa purifikoval z kultivačného supernatantu za použitia sekvenčnej stĺpcovej chromatografie a už popísaných spôsobov [Collen, D. a kol. (1992) tam isto; Schlott, B. a kol. (1999) Biotechnology 12: str. 185 až 189].

Dendritické bunky sa inkubovali purifikovanou stafylokinázou pri koncentrácii 10 □g/ml a inkubácia sa uskutočňovala cez noc. U niektorých experimentov sa spracovanie antigénu blokovalo pomocou inhibičných kokteilov pridaných do kultivačného média. Inhibítory sa pridali 1 h pred pridaním testovaného proteínu v nasledujúcich koncentráciách: 50 mM chloridu amónneho; 1 mg/ml azidu sodného; 500 DM chlórchínu a colchicínu. Všetky zlúčeniny sa získali od Sigma (Sigma, Poole, UK).

Po ošetrení proteínom sa bunky vybrali z kultivačných misiek, prepláchli za použitia troch cyklov odstreďovania a ošetrili PBS, v snahe odstrániť všetko médium a nepatričný proteín. Pre MALDI-TOF analýzu sa bunky pripravili spôsobom popísaným v príklade 1. Zhromaždili sa spektrá a analyzovala na prítomnosť peptidov, ktoré možno pričítať testovanému proteínu. Tie sa identifikovali porovnaním so spektrami získanými z kontrolných buniek neošetrených stafylokinázou.

Iónové piky pričítané stafylokináze sa identifikovali vo spektrách získaných z buniek liečených stafylokinázou a neboli patrné v spektrách buniek ošetrených metabolickými inhibitormi

01-3663-02-Ma alebo vo spektrách kontrolných buniek neošetrených stafylokinázou.

Príklad 4

Spôsob určenia peptidových sekvencií odvodených z buniek liečených celým proteínom

Rovnakým spôsobom ako v príklade 3 sa bunky liečili sledovaným proteínom. Peptidy sa vymyli z buniek niekoľkými extrakčnými cyklami (4 až 6) roztokom 5 % acetonitrilu, 0,1% kyseliny mravčej. Prítomnosť sekvencií pričítaných testovanému proteínu sa určila za použitia ESI-MS/MS.

sa vysušili a resuspendovali v roztoku 0,1%

Celý surový eluát sa separoval

Vymyté vzorky kyseliny mravčej. pomocou modulárneho CapLC systému (Micromass, Wythenshawe,

UK) priamo spektrometra. pri prietoku roztoku kyseliny /min a presmeroval napojeného

Vzorky sa

Dl/min a na Z-spray zdroj hmotnostného zaviedli do, C18 pre-kolóny min odsoľovali za použitia 0,1% vymyla za použitia

95% H₂O, 5% acetonitrilu,

mravčej.	Prietok sa	znížil	na 10	□1
do C18	180 mm pepmap	kolóny	Kolóna	sa
štandardného rozsahu elučného	qradientu	od

až

0,1% po rozpúšťadlový roztok

0,1% kyseliny mravčej.

5% kyseliny mravčej

H₂O, 95% acetonitrilu

Elektrosprej MS prístroje Micromass prepojeného s Z-spray

MS /MS

Q-Tof 2 nanoflow hodnoty sa získali pomocou (Micromass, Wythenshawe, UK) electrosparay iónovým zdrojom.

Prístroj pracoval v režime kladných iónov s teplotou zdroja 80 °C, prietokom plynu čítacom 40 1/h a s potenciálom 2800 V aplikovaným na nanosprejovú kontinuálnu LC sondu. Všetky

01-3663-02-Ma hodnoty sa získali za použitia prístroja pracujúceho v automatickom, od údajov závislých spínacieho režimu.

Prístroj sa kalibroval dvomi bodovými kalibráciami zvolenými fragmentovými ióny, ktoré sa získali kolízne indukovaným rozpadom glufibrinopeptidu b. Všetky dáta sa pomocou ProteinLynx software spracovali automaticky, identifikácia proteinu sa získala analýzou pomocou ProteinLynx Global Server search algorithm (Micromass, Wythenshawe, UK).

Manuálne získanie dát sa uskutočnilo vstreknutím surovej vzorky do prístroja pomocou borokremičitanových ihiel. Vzorky sa nastavili na koncentráciu približne 1 ΠΗ. Vzorky sa pred vstreknutím do prístroja odsolili pomocou C18 ZipTip jednorázových minikolón (Millipore, USA).

Spektrá sa zhromaždili a analyzovali na prítomnosť hmotností peptidov pričítaných testovanému proteinu. Tie sa identifikovali porovnaním so spektrami získanými z kontrolných buniek, ktoré zahrnujú bunky, u ktorých bolo zablokované spracovanie antigénom. Po ošetrení stafylokinázou sa identifikovali hmotnosti peptidu pričítané stafylokináze. Ekvivalentné iónové piky v bunkách neošetrených stafylokinázou alebo u buniek ošetrených metabolickými inhibítormi neboli dokázané.

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob vývoja farmaceutického proteínu alebo polypeptidu alebo vakcíny antigénu majúcich špecifickú biologickú účinnosť a zníženú alebo zosilnenú imunogenicitu proti ľubovoľnému nemodifikovanému proteínu alebo polypeptidu majúcemu rovnakú biologickú účinnosť, vyznačujúci sa t ý m, že (i) sa bunky uvedú do kontaktu s uvedeným proteínom alebo polypeptidom generujúcim súbor povrchových peptidov na bunkách alebo na ich exosomatických vehikulách, ktorý je iný ako súbor povrchových peptidov exponovaný na referenčných bunkách, ktoré neboli kontaktované, (ii) uvedené bunky alebo ich exosomatické vehikulá sa analyzujú na peptidy naviazané na povrchu uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl a (iii) uvedené peptidy sa podľa štandardných postupov zaradia do sekvencie farmaceutického proteínu alebo polypeptidu alebo antigénu vakcíny.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vy zn ačuj ú c i sa tým, že ďalej zahrnuje nasledujúce kroky:

   (iv) modifikáciu uvedených peptidov, ktorá má zmeniť ich väzbu na molekuly MHC, a (v) konštrukciu sekvenčných variant konečného farmaceu01-3663-02-Ma tického proteínu alebo polypeptidu začlenením jednej alebo viacej modifikovaných peptidových sekvencii do sekvencie molekuly proteínu alebo polypeptidu za použitia štandardných metód.
3. 3. Spôsob podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že sa analýza uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl v kroku (ii) uskutočňuje za použitia hmotnostnej spektroskopie (MS).
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa použije MALDI-MS.
5. 5. Spôsob podľa nároku 3, vy zn a č u j ú c i sa tým, že sa použije ESI-MS.
6. 6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa farmaceutický proteín alebo polypeptid modifikuje tak, že jeden alebo viacej uvedených peptidov už nie je po uvedení do kontaktu bunky s uvedeným proteínom alebo polypeptidom naviazaný.
7. 7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že sú peptidy naviazané na povrchu buniek alebo exosomatických vehikúl podľa kroku (i) v asociácii s MHC molekulami a analýza uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl sa podľa kroku (ii) uskutočňuje za použitia MS.

   01-3663-02-Ma
8. 8. Spôsob podía ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že peptidy naviazané na povrchu buniek alebo exosomatických vehikúl podľa kroku (i) sú produkty intracelulárnej peptidázy a dopravnej dráhy.
9. 9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 pre vývoj farmaceutického proteínu alebo polypeptidu majúceho zníženú imunogenicitu, vyznačujúci sa tým, že sa modifikácia imunogénnych peptidov uskutočňuje tak, že sa eliminuje alebo obmedzí ich väzba na molekuly MHC, prípadne tak, že sa uskutoční test modifikovaných peptidov na väzbu k bunkovému povrchu, ako naznačuje patentový nárok 1.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa eliminácia alebo redukcia väzby proteínov na molekuly MHC realizuje tak, že sa uskutočni substitúcia, inzercia alebo delécia jedného alebo niekoľkých aminokyselinových zvyškov v sekvenčnej oblasti peptidu vo farmaceutickom proteínu alebo polypeptidu.
11. 11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 pre vývoj farmaceutického proteínu alebo polypeptidu majúceho zvýšenú imunogenicitu, vyznačuj úci sa tým, že sa modifikácia imunogénnych peptidov uskutočňuje tak, že sa zosilní ich väzba na molekuly MHC, prípadne tak, že sa uskutoční test modifikovaných peptidov na väzbu k bunkovému povrchu, ako naznačuje patentový nárok 1.

    01-3663-02-Ma
12. 12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa zosilnenie väzby peptidov na molekuly MHC realizuje tak, že sa uskutoční substitúcia, inzercia alebo delécia jedného alebo niekoľkých aminokyselinových zvyškov v sekvenčnej oblasti peptidu zvyšujúci účinnosť peptidu pôsobiť ako T-bunkový epitop a/alebo rozšírením rozsahu MHC typov, na ktoré je T-bunkový epitop obmedzený a/alebo kombináciou niekoľkých inak nesúrodých epitopov do jedinej entity.
13. 13. Spôsob vývoja vakcíny, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (i) uvedenie bunky do kontaktu s proteínom alebo polypeptidom alebo mikroorganizmom, ktorý má imunogénnu účinnosť, vytvorením súboru povrchových peptidov na uvedených bunkách alebo ich exosomatických vehikulách, ktorý je odlišne od súboru povrchových peptidov exponovaný na referenčných bunkách, ktoré neboli kontaktované, (ii) analýzu uvedených buniek alebo ich exosomatických vehikúl na povrchu, na ktorom sú naviazané peptidy, (iii) priradenie uvedených peptidov podľa štandardných metód do sekvencie proteínu alebo polypeptidu a (iv) konštrukciu sekvenčných variant konečnej farmaceutickej vakcíny zavedením jedného alebo viacej peptidov do sekvencie molekuly vakcíny podľa štandardných metód, pričom analýza uvedených buniek alebo exosomatických vehikúl sa uskutočňuje za použitia MS.
14. 14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, v y 01-3663-02-Ma značujúci sa tým, že pre produkciu molekúl MHC používa ľudskej geneticky upravenej bunkovej línie.
15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že rodičovská (geneticky neupravená) bunková línia neprodukuje molekuly MHC.
16. 16. Spôsob podľa nároku 14, vyznačuj úci tým, že rodičovská bunková línia neprodukuje MHC triedy I molekuly.
17. 17. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že rodičovská bunková línia neprodukuje molekuly MHC triedy II.
18. 18. Spôsob podľa nárokov 1 až 13, vyznačuj úci sa t ý m, že sa nehumánne bunky, ktoré neprodukujú svoje vlastné molekuly MHC, geneticky upravia tak, že produkujú molekuly MHC a použijú sa naznačeným spôsobom.
19. 19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že sa molekuly MHC odvodia z MHC triedy II.
20. 20. Spôsob podlá nároku 19, vyznačujúci sa t ým, že molekulami MHC sú HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP.

    01-3 663-02-Ma
21. 21. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že sa molekuly MHC odvodia z MHC triedy I.
22. 22. Spôsob podlá nároku 19, vyznačujúci sa tým, že sa použije kombinácia bunkových línií alebo bunkových vzoriek poskytujúca komplexnú zmes rôznych MHC alotypov a genotypov.
23. 23. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 22, vyznačujúci sa tým, že peptidy pochádzajú z exogénneho proteínu alebo mikroorganizmu.
24. 24. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 22, vyznačujúci sa tým, že peptidy pochádzajú z endogénneho proteínu.
25. 25. Spôsob podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 24, vyznačujúci sa tým, že sa použijú ľudské dendritické bunky alebo ich exosomatická vehikulá, ktoré po pridaní proteínu alebo polypeptidu alebo mikroorganizmu prezentujú na molekulách MHC peptidy.
26. 26. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24, vyznačujúci sa tým, že sa použije ľudský antigén prezentujúci bunky alebo ich exosomatické vehikulá, ktoré po pridaní proteínu alebo polypeptidu prezentujú na molekulách MHC peptidy.

    01-3663-02-Ma
27. 27. Spôsob podlá ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov

    1 až 26, vyznačujúci sa tým, že sú molekuly MHC pred analýzou, ktoré určujú peptid, obohatené.
28. 28. Spôsob podlá ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov

    1 až 27, vyznačujúci sa tým, že sa peptidy pred analýzou vymyjú z bunkového povrchu.
29. 29. Spôsob podlá ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov

    1 až 27, vyznačujúci sa tým, že sa peptidy pred analýzou vymyjú z molekuly MHC.
30. 30. Spôsob vývoja diagnostického testu,v yznačujúc i sa t ý m, že sa uskutoční (i) analýza vhodných ludských buniek zameraná na povrchové peptidy a (ii) buď (a) sa pripraví profil peptidov, ktoré sa objavia na bunkovom povrchu a prípadne sa porovná s ďalšími profilmi, v snahe identifikovať abnormalitu alebo ochorenie v súvise s ludskými bunkami, alebo (b) sa určí sekvencia špecifických peptidov na bunkovom povrchu ako prostriedok pre určenie špecifických peptidov, ktoré možno použiť k identifikácii abnormality alebo ochorenia spojeného s ludskými bunkami.
31. 31. Použitie proteínu alebo polypeptidu získaného spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 ako farmaceutickej terapeutickej entity.

    01-3663-02-Ma
32. 32. Použitie proteinu alebo polypeptidu získaného spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13 ako vakcíny.
33. 33. Použitie proteinu alebo polypeptidu získaného spôsobom podľa nároku 9 alebo 10 ako farmaceutickej terapeutickej entity, ktorá má obmedzenú imunogenicitu.
34. 34. Spôsob detekcie peptidov na povrchu buniek alebo ich exosomatických vehikulách, ktoré sa odvodia z proteinu alebo polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že (i) sa bunky uvedú do kontaktu s uvedeným proteínom alebo polypeptidom alebo génom, ktorý kóduje tento proteín alebo polypeptid, na týchto bunkách alebo ich exosomatických vehikulách sa generuje súbor povrchových peptidov, ktorý je odlišný od súboru povrchových peptidov exponovaných na referenčných bunkách, ktoré neboli kontaktované, (ii) uvedené buky alebo ich exosomatické vehikulá sa analyzujú na povrchu, na ktorom sú naviazané peptidy, a (iii) uvedené peptidy sa prevedú do sekvencie proteinu alebo polypeptidu podľa štandardných metód, pričom analýza v bunkách alebo exosomatických vehikulách sa uskutočňuje MS, výhodne MALDI-MS.