JP2013507603A - 署名ペプチドおよび質量分析による混合物中の個々の組換えタンパク質の多重定量化 - Google Patents
署名ペプチドおよび質量分析による混合物中の個々の組換えタンパク質の多重定量化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013507603A JP2013507603A JP2012532458A JP2012532458A JP2013507603A JP 2013507603 A JP2013507603 A JP 2013507603A JP 2012532458 A JP2012532458 A JP 2012532458A JP 2012532458 A JP2012532458 A JP 2012532458A JP 2013507603 A JP2013507603 A JP 2013507603A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- recombinant
- peptide
- polyclonal antibody
- antibody
- recombinant polyclonal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
Abstract
Description
本発明は、複雑なサンプル中における選択された複数の組換えタンパク質、例えば血清中の組換えポリクローナル抗体または培養上清中に発現される組換えポリクローナル抗体の定量化のための分析方法に関する。該方法には、質量分析によるペプチドの高感度な定量化を含む。
様々な複雑なタンパク質サンプル中、例えばヒトの血清または血漿中における組換えタンパク質の定量的アッセイが必要とされている。従来、これらのアッセイは、標的タンパク質に対する特定の抗体を特異性および検出の試薬として利用するイムノアッセイ、例えば ELISA として行われてきた。
本発明は、薬物動態研究におけるポリクローナル性(polyclonality)の特徴決定およびハイスループット解析のための方法に関する。
i) 第1の画分を得るための、親和性精製による該1以上の組換えタンパク質の濃縮(up-concentration)
ii) 該組換えタンパク質の各々についての1以上の特定の署名ペプチドを第2の画分の中へ放出させるための、該第1の画分の消化
iii) 該署名ペプチドの各々についての1以上の内部基準ペプチドの、該第1の画分および/または該第2の画分への添加
iv) 所望により、第3の画分を得るための、抗署名ペプチド抗体と結合した樹脂を用いる該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの濃縮ならびにその後の該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの放出、および/または所望により、サンプルを分画し、それによって対象のペプチドを濃縮することができる化学(chemistry)を有する樹脂を用いる該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの濃縮
v) 質量分析による該署名ペプチドの定量化
を含む方法に関する。
‘署名ペプチド’の用語は、サンプル中における所与のタンパク質のモニター断片/ペプチドとして選択された1以上の異なるペプチドを意味する。
本発明は、複雑なサンプル中の選択された複数の組換えタンパク質、例えば血清中の組換えポリクローナル抗体または細胞または組織培養上清中に発現される組換えポリクローナル抗体の定量化のための方法に関する。該方法は、質量分析によるペプチドの高感度定量化を含む。
i) 第1の画分を得るための、親和性精製による該1以上の組換えタンパク質の濃縮
ii) 該組換えタンパク質の各々についての1以上の特定の署名ペプチドを第2の画分の中へ放出させるための、該第1の画分の消化。該消化の前に該第1の画分の還元および/またはアルキル化を行ってもよい。
iii) 該署名ペプチドの各々についての1以上の内部基準ペプチドの、該第1の画分および/または該第2の画分への添加
iv) 所望により、第3の画分を得るための、抗署名ペプチド抗体と結合した樹脂を用いる該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの濃縮ならびにその後の該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの放出、および/または所望により、サンプルを分画し、それによって対象のペプチドを濃縮することができる化学を有する樹脂を用いる該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの濃縮
v) 質量分析による該署名ペプチドの定量化
vi) 所望により、サンプル中にスパイクされた既知濃度の対応するタンパク質調製物を用いて工程 i) から v) までを繰り返してタンパク質検量線を得る
vi) 工程 v) において得られた該署名ペプチドの定量化を工程 vi) において得られたタンパク質検量線と比較し、該サンプル中における該1以上の組換えタンパク質の定量化を得る。一つの態様において、該方法は、該サンプル中の該1以上の組換えタンパク質の絶対的な定量化をもたらす。
上記工程 i) は、1以上の組換えタンパク質の濃縮/富化のための当該技術分野において記載されるあらゆる方法を含み得る − 富化された画分を第1の画分と称する。一つの態様において、該濃縮/富化は、インタクトなタンパク質、例えばインタクトな組換えタンパク質、例えばインタクトな組換えポリクローナル抗体を捕獲する。
工程 i) における最初の濃縮の後、定量化しようとする各々のタンパク質から1以上の特定の署名ペプチドを第2の画分中へ放出させるため、選択されたプロテアーゼを用いて第1の画分を消化する。一つの態様において、第1の画分は消化の前に還元およびアルキル化される。第2の画分は、プロテアーゼによって放出される署名ペプチドおよび他のペプチドを含む。該第1のおよび/または第2の画分の還元、アルキル化および消化は、当該技術分野において公知のあらゆる方法によって行うことができる。ペプチドは、例えばジチオスレイトール(DTT)を用いて還元することができ、その後、例えば 4-ビニルピリジン、ヨードアセトアミドまたはヨード酢酸を用いてアルキル化することができる。
MS 解析によって標識されたペプチドを通常のペプチド(天然に存在する量の各元素の同位体を含む)と区別できるよう、化学構造は維持されているが1以上の原子が同位体によって置換されている、安定な同位体で標識された選択された署名ペプチドのバージョンを合成する。これらの同位体標識されたペプチドを、内部基準ペプチドと称する。
署名ペプチドおよび内部基準ペプチドのプールは、その後に、例えばウサギにおいて産生された抗署名ペプチド抗体と結合した樹脂の使用によって濃縮し得る。署名ペプチドのプールはその後に放出される(かかる画分を第3の画分と称する)。あるいは、署名および基準ペプチドは、選択幅の広い既知の分離手法のいずれか、例えば陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用、逆相、親水性相互作用、サイズ排除および他の分離原理を用いる粗分画(crude fractionation)によって濃縮することができる。工程 iv) は任意選択である。
質量分析(MS)は、タンパク質の構造的特徴決定に必須のツールである。質量分析測定は、気相中において、イオン化された分析物について行われる。定義として、質量分析計は、イオン源、イオン化された分析物の質量対電荷比(m/z)を測定する質量分析器、および各 m/z 値におけるイオンの数を記録する検出器からなる。エレクトロスプレーオン化(ESI)およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)が、MS 解析用にタンパク質またはペプチドを揮発およびイオン化させるために最も一般的に用いられる2つの手法である。ESI は、溶液から分析物をイオン化するものであり、そのため、液体に基づく(例えばクロマトグラフィーおよび電気泳動)分離ツールと容易に連結することができる。MALDI は、レーザーパルスによって、乾燥した結晶性マトリックスからサンプルを昇華させ、イオン化する。MALDI-MS は通常、比較的単純なペプチド混合物を解析するために用いられ、一方、統合された液体クロマトグラフィー ESI-MS システム(LC-MS)は、複雑なサンプルの解析にとって好ましい。質量分析器は、当該技術の中核をなすものであり、その重要なパラメータは、感度、分解能、質量精度、およびペプチド断片から情報に富んだイオン質量スペクトル(MS/MSスペクトル)を生成する能力である。少なくとも4つの基本的な型の質量分析器が存在する。これらは、イオントラップ型、飛行時間(TOF)型、四重極型およびフーリエ変換イオンサイクロトロン(FT-MS)型分析器である。それらは設計および性能において非常に異なっており、各々が独自の長所および短所を有している。これらの分析器は、単独であっても良く、場合によっては各々の長所を活かすために直列に組み合わせることもできる(より詳細には、[8-9]を参照されたい)。MALDI-および ESI-MS の両方において、存在する分析物の量と測定されるシグナル強度との関係は複雑であり、完全には理解されていない。したがって、質量分析計は本質的には貧弱な定量装置である。定量的 MS データを得るために、プロテオミクスの分野において、安定な同位体タンパク質標識法が開発された。これらの方法は、異なる安定な同位体組成を有する化学的に同一のペプチドのペアをそれらの質量の差異によって質量分析計において区別できること、およびかかるペプチドのペアについてのシグナル強度の比が該2つのペプチドの存在比を正確に示すことを利用している。ESI-MS において、ペプチドは、LC-MS のランにおいて共溶出する他の分析物によるイオン抑制を受ける。したがって、定量化は、基準ペプチドが署名ペプチド/分析物と共溶出し、同じ度合いのイオン抑制を受ける場合にのみ確実なものとなる。同一の化学組成を有し、同位体の取り込みによって質量のみが異なる基準ペプチドを用いることで、基準および署名ペプチドの共溶出が保証される。かくして、元のサンプル中における対応するタンパク質の相対的存在量は、署名ペプチド対内部基準の比を署名ペプチドの絶対濃度と相関させる検量線の使用によって決定することができる。安定な同位体タグは、i) 代謝標識によって、ii) 酵素的に、または iii) 化学反応によってタンパク質に導入することができる。現在では、タンパク質またはペプチドの化学的同位体タギングが最もよく用いられる方法である(より詳細には、[8]を参照されたい)。一つの態様において、1つの詳細に明らかにされた純粋な重いアミノ酸を含む合成ペプチド、例えば Sigma Aldrich の AQUA ペプチドを用いることができる。
タンパク質検量線、例えば抗体検量線(例えば組換えポリクローナル抗体検量線)は、ブランクのサンプル、例えば血清サンプル中にスパイクされた既知濃度の対応するタンパク質(抗体/組換えポリクローナル抗体)調製物から得ることができる。該タンパク質(抗体/組換えポリクローナル抗体)は、スパイクされたサンプルから精製され、本物のサンプルと同じ手順を用いて − 即ち、全てのサンプルに添加される固定された量の基準ペプチドを含む上記工程 i) から v) を用いて分析される。したがって、検量線は、相対的シグナル(基準ペプチドに対する署名ペプチド)を署名ペプチドの濃度と関連付ける。
本発明の重要な特徴は、本発明が、2以上のサンプルの未知の構成成分の全てを互いに比較するという課題よりも、事前に選択された特定の組換えタンパク質についての定量的アッセイを確立することに向けられているという事である。
抗ペプチド抗体の産生用の動物を免疫化するために、ペプチドを、キャリアタンパク質(例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH); ヒトのタンパク質と相同でない)と結合させ、抗ペプチド抗体を効率的に生成させる既知のプロトコールの一つによって動物(例えばウサギ、ニワトリ、ヤギまたはヒツジ)を免疫化するために用いる。便宜のため、免疫化および抗体精製のために用いるペプチドは、好ましくは、署名ペプチドの配列(ここでは SIGNATURE と省略する)に付加される追加的 c末端残基を含むものであり、例えば: n末端-SIGNATURE-lys-gly-ser-gly-cys-c末端である。得られる伸長された署名ペプチドは、複数の SH-反応性の基が付加されるよう事前にヘテロ二官能性試薬と反応させたキャリア KLH と都合良く結合させることができる。ペプチド(ここではキャリアタンパク質上のハプテンとしての)を用いる古典的な免疫化において、ペプチド、キャリアおよび他の非特異的エピトープに向けられた抗体を含むポリクローナル抗血清が生産される。また、伸長または修飾の有無に関わらず、ペプチドを抗体産生用のキャリアと結合させるための当該技術分野において公知の多くの方法が存在しており、これらのいずれかを用いることができる。
本発明は、サンプル中の選択された組換えタンパク質の定量化のための分析方法に関する。好ましい態様において、本発明は、サンプル、即ち複雑なマトリックス中の選択された複数の組換えタンパク質の定量化のための分析方法に関する。該選択された複数の組換えタンパク質とは、一つの態様において、2 以上の選択された組換えタンパク質、例えば 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 または 100 より多い選択された組換えタンパク質をいう。
a) 1以上の感染症の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体
b) 1以上の細菌感染の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体
c) 1以上のウイルス感染の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体
d) 1以上の癌の形態の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体
e) 1以上のアミロイド関連疾患、例えばアルツハイマー病の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体
f) Sym001 - 25 の異なる組換えポリクローナル抗 Rhesus D (RhD) 抗体からなる組換えポリクローナル抗体(WO 2006/007850)
g) 既存の抗ワクシニア過免疫イムノグロブリン(VIG)を置換する組換えポリクローナル抗ワクシニアウイルス抗体により構成される Sym002 (WO 2007/065433)
h) Sym003 - 抗呼吸器多核体ウイルス(RSV)を標的とする組換えポリクローナル製品候補(WO 2008/106980 および WO 2007/101441)
i) Sym004 は、ヒトの癌抗原である上皮増殖因子受容体を標的とする組換えポリクローナル抗体製品候補である(WO 2008/104183)
j) ヒトの癌抗原を標的とする組換えポリクローナル抗体製品候補
j) 細菌性病原体に対して開発された組換えポリクローナル抗体
k) 感染症標的を標的とする組換えポリクローナル抗体
本発明の方法によって分析されるサンプルは、1以上の組換えタンパク質を含むあらゆるサンプルであり得る。一つの態様において、該サンプルは、1以上の組換えタンパク質、例えば1以上の組換えポリクローナル抗体を含む血清または血漿 − 例えばヒトの血清または血漿である。本発明は、単一の個々の源からのサンプルの分析のため、あるいは集団における特定のタンパク質のレベルを評価するために用いることができ、標的集団からのプールされたサンプルを分析するために用いることができる。
本発明はさらに、サンプル中の組換えタンパク質の定量化のための本発明の方法を用いる工程を含む、組換えポリクローナル抗体を製造する方法に関する。したがって、該方法によって定量化し得るポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体のプールから選択することができる。
本実施例は、上皮増殖因子受容体(EGFR)に対する2つの抗体 A992 および A1024 (WO 2008/104183) の 1:1 の混合物からなる組換えポリクローナル抗体組成物の多重定量化について記載する。薬物リードの投与後の血漿中において個々の抗体 A992 および A1024 を測定した、カニクイザルにおける前臨床薬物動態(PK)測定を示した。
・プロテインA 親和性クロマトグラフィーによる A992 および A1024 の濃縮
・AQUA ペプチド(Sigma)を用いる液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)。
3つの対象からの 25 μl のプールされたブランクのカニクイザル血漿を含むサンプルに、薬物リードを以下の濃度でスパイクした: 0、5、10、20、50、100、150 および 200 μg/ml。pH 7.2 の PBS (Gibco) を、総容積 100 μlまで添加した。25 μlの血漿を pH 7.2 の PBS (Gibco)に添加して総容量 100 μlとすることにより、PK サンプルを調製した。該サンプルを、96 ウェルのプロテインA HP MultiTrap プレート(GE Healthcare)上にロードした。モデル番号 5804R のエッペンドルフ遠心機を用いた工程 6 を除き、全ての工程において、ウェル中の液体は Univac マニフォールド(Whatman)を用いる排出(evacuation)によって除去した。以下の手順を適用した:
クエン酸 0.1M:
19.21 g のクエン酸 (Sigma) を水に溶解させて 1000 mlとする、1L のメスフラスコ中で調製する。
Na2HPO4、200 mM :
53.61 g の Na2HPO4・7*H2O (Merck) を水に溶解させて 1000 mlとする、1L メスフラスコ中で調製する。
クエン酸リン酸 pH 6.5 (ストック A):
136 ml の 0.1M クエン酸および 364 ml の 0.2 M Na2HPO4 (Merck)に水を添加して 900 mlとする。水を添加して 1000 ml とする。
クエン酸リン酸 pH 3.5 (ストック B):
359 ml の 0.1M クエン酸 +141 ml の 0.2 M Na2HPO4 に水を添加して 900 mlとする。水を加えて 1000 mlとする。
クエン酸リン酸 pH 5.25:
567 ml のクエン酸リン酸ストック A + 433 ml のクエン酸リン酸ストック B。
工程 1: プロテインA HP MultiTrap プレートの調製
製造者の手順に従って、プレートを上下に振ることによって保存溶液を懸濁させ、シールを除去し、保存溶液を排出する。
工程 2: 平衡化
300μl の pH 7.2 の PBS を各ウェルに添加する。
工程 3: 薬物リードの結合
100μl のスパイクされたサンプルまたは PK サンプルを各ウェルに添加し、プレートをエッペンドルフのサーモミキサーコンフォート(thermomixer comfort)中において、室温で 4 分間、800rpm においてインキュベートする。
工程 4: 洗浄 1
a) 250μl の pH 7.2 の PBS を各ウェルに添加し、排出する。
b) 250μl の pH 7.2 の PBS を各ウェルに添加し、排出する。
工程 5: 洗浄 2
a) 250μl の pH 5.25 のクエン酸リン酸洗浄バッファーを各ウェルに添加し、排出する。
b) 250μl の pH 5.25 のクエン酸リン酸洗浄バッファーを各ウェルに添加し、排出する。
工程 6: 薬物リードの溶出
プロテインA HP MultiTrap プレートを、96 ウェルの回収プレート(GE Healthcare)上に置く。
a) 200μl の pH 3.5 のクエン酸リン酸溶出バッファーを各ウェルに添加し、70xg で遠心する。
b) 200μl の pH 3.5 のクエン酸リン酸溶出バッファーを各ウェルに添加し、70xg で遠心する。
プロテインA 親和性クロマトグラフィーによる濃縮の後、内在性 Ig および薬物リードを含むサンプルを LC-MS 解析のために調製した。この工程の間に、AQUA ペプチドをサンプルに添加した。AQUA ペプチドは、A992 および A1024 からのユニークな署名ペプチドと同一であるが、MS 解析を用いてこれらペプチドを署名ペプチドと区別することを可能にする1つの安定な同位体標識されたアミノ酸を含んでいる合成ペプチドである。該標識されたアミノ酸は 98 atom% の 13C および 15N を含んでおり、そのため、A992 および A1024 のネイティブな署名ペプチドと比較して質量が増大していた。絶対的定量化のために選択した AQUA ペプチドを、表 1 に示した。
プロテインA HP MultiTrap プレートから溶出した免疫グロブリン(Ig)を、800μl の氷冷アセトン(Merck)を用いて沈殿させた。その後、サンプルを 9μl の 1% Rapigest SF 界面活性剤(Waters)中に溶解させ、エッペンドルフサーモミキサーコンフォート(Thermomixer Comfort)中において 800rpm で混合しながら 100℃で 5 分間加熱した。サンプルに 50mM の NH4HCO3 および 1mM の CaCl2 を添加して最終容積 90μl とし、該サンプルをエッペンドルフサーモミキサーコンフォート中において 800rpm で混合しながら 100℃で 5 分間加熱した。その後、サンプルを 0.1M のジチオスレイトール(DTT)(Sigma)を用いて還元し、0.25M のヨードアセトアミド(Sigma)を用いてアルキル化し、1:20(w/w)の酵素対Ig比でトリプシン(Worthington)を用いて 37℃で 16 時間消化した。終濃度 1% (v/v)までトリフルオロ酢酸(TFA)(Fluka)を添加することにより消化をクエンチし、サンプルを 37℃で 30 分間インキュベートした。2 pmol 総 AQUA/μl の濃度を有する 0.1%(v/v)のギ酸(FA)(Fluka)中の A992 および A1024 AQUA(Sigma)ペプチドの 1:1 の混合物を 10 μl 添加した。即ち、サンプル中の各 AQUA ペプチドの総量は 10 pmol であった。該サンプルを、エッペンドルフ ミニスピンプラス(minispin plus)遠心機において 14100rcf で 10 分間遠心し、HPLC バイアル(Dionex)へ移した。
ペプチドを、Zorbax 300SB-C18 カラム (2.1 x 150mm; Agilent) および RSLC system Ultimate 3000 (Dionex) を用いる逆相 LC によって分離した。溶媒は、溶媒 A: 0.1%(v/v)の FA (Fluka)を有する水、および溶媒 B: 0.1%(v/v)の FA (Fluka) を有するアセトニトリルであり、流速は 200μl/分であった。サンプルを 5% の溶媒 B においてロードし、30 分間の 15% から 40% の溶媒 B の勾配を用いて溶出させた。カラムを 80% の溶媒 B で 20 分間洗浄し、該カラムを 5% の溶媒 B で 14.7 分間再平衡化した。
ペプチドを、microQTOF装置(Bruker)上で分析した。サンプルの分析のため、400 から 3000 までの m/z 範囲において 表 3 に記載のパラメータを用いて取得(acquisition)を行った。
EIC における A992 および A1024 についての AQUA ペプチドに対する署名ペプチドのピーク面積の比は、検量線によって薬物リードの濃度と相関させることができる。かかる実験において、検量線の作成のため、A1024 および A992 の両方からなる薬物リードを3頭のカニクイザルからの血漿プール中に8つの濃度: 0、5、10、20、50、100、150 および 200μg/ml でスパイクした。抗体の各々について、その濃度は 0、2.5、5、10、25、50、75 および 100μg/ml に相当する(図 1 および図 2)。
本実施例は、上皮増殖因子受容体(EGFR)に対する2つの抗体 A992 および A1024 (WO 2008/104183)の 1:1 の混合物からなる組換え抗体組成物の多重定量化について記載する。該抗体をドナー血清プール中にスパイクし、同時に測定した。各抗体につき1つずつ、2つの検量線を作成した。
該2つの抗体を、各抗体につき 100μg/ml で血清中にスパイクした。次いで、該サンプルを血清中で希釈して検量線用のサンプルを作成した。用いた血清は、10 人の健康なドナーのプールであった。表 5 は、検量線の作成に用いた濃度を示す。
全 IgG を実施例 1 に記載の 96ウェルのプロテインA プレート上で精製したが、該プレートは 200 μl の pH 3.0 の 0.5M GndHCl/0.1M グリシン中に溶出させた。検量線の各点について、33 μl ずつ分注したものを3つ分析した。溶出液を蒸発させ、次いでウェルあたり 50 μl の 50 mM 重炭酸アンモニウムの添加によって再構成した。タンパク質を DTT (56℃、1h) によって還元し、IAA によって室温で 1 時間アルキル化した。
サンプル中の抗体濃度を、2つの抗体の CDR 領域からの選択されたペプチドの LC-MS および多重反応モニタリングを用いて定量化した。
質量分析計: Agilent 6400 Triple Quad LC/MS (QQQ)
HPLC: Agilent 1200 シリーズ
カラム: Waters Acquity UPLC BEH300 C18 1.7 μm、2.1 x 50 mm カラム
流速: 300 μl/分
溶媒 A: 0.1% ギ酸
溶媒 B: 99.9% ACN、0.1% ギ酸
注入量: 30 μl
MS1: 単位(Unit)
MS2: 最広(Widest)
各サンプルにつき 30 μl を LC-MS システムに注入し、表 6 に示す勾配を用いた。
各抗体につき1つ、図 4 に示される2つの検量線を作成した。測定は3連で行い、良好な再現性を示し、検量線は非線形適合に適合させる。各抗体につき、両方の曲線の範囲は 0.2 μg/ml-100 μg/ml である。2つの抗体は同時に測定する。
[1] Anderson and Hunter, Mol Cell Proteomics. 2006 Apr;5(4):573-88.
[2] Dubois et al., Anal Chem. 2008 Mar 1;80(5):1737-45.
[3] Nicol et al. Mol Cell Proteomics. 2008 Oct;7(10):1974-82.
[4] Ackermann and Berna, Expert Rev Proteomics. 2007 Apr;4(2):175-86. Review.
[5] WO 2004/031730
[6] Ong and Mann, Nature Chemical Biology 1, 252 - 262 (2005).
[7] Yan and Chen HENRY STEWART PUBLICATIONS 1473-9550. BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS. VOL 4. NO 1. 1-12. MONTH 2005.
[8] Aebersold & Mann, Nature 2003, 422: 198-207
[9] Keshishian et al, Molecular & Cellular Proteomics 2007 Dec;6(12):2212-29.
Claims (137)
- 以下の工程を含む、サンプル中の1以上の組換えタンパク質の定量化のための方法:
i) 第1の画分を得るための、親和性精製による該1以上の組換えタンパク質の濃縮
ii) 該組換えタンパク質の各々についての1以上の特定の署名ペプチドを第2の画分中へ放出させるための、該第1の画分の消化
iii) 該署名ペプチドの各々についての1以上の内部基準ペプチドの、該第1の画分および/または該第2の画分への添加
iv) 質量分析による該署名ペプチドの定量化。 - 以下の工程をさらに含む、請求項1に記載の方法
i) タンパク質検量線を得るための、サンプル中にスパイクされた既知濃度の対応するタンパク質調製物を用いる、請求項1の工程 i) から iv) の反復、および
ii) 請求項1の工程 iv) において得られた該署名ペプチドの定量化を工程 i) において得られたタンパク質検量線と比較し、該サンプル中の該1以上の組換えタンパク質の定量化を得る工程。 - 請求項1の工程 ii) における消化の前に還元および/またはアルキル化の工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- サンプルを分画し、それによって対象のペプチドを濃縮することができる化学を有する樹脂を用いる該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの濃縮工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第3の画分を得るための、抗署名ペプチド抗体と結合した樹脂を用いる該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの濃縮工程ならびにその後の該署名ペプチドおよび該内部基準ペプチドの放出をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程 i) における親和性精製が、1以上の免疫グロブリン結合タンパク質との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程 i) における親和性精製が、1以上の細菌の免疫グロブリン結合タンパク質との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 免疫グロブリンがヒトの免疫グロブリンである、請求項6に記載の方法。
- ヒトの免疫グロブリンが、ヒト IgG1、ヒト IgG2、ヒト IgM、ヒト IgA またはヒト IgE である、請求項8に記載の方法。
- 免疫グロブリンが、マウス、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ラクダ、イヌ、ネコ、ニワトリ、魚またはサルの免疫グロブリンである、請求項6に記載の方法。
- マウスの免疫グロブリンが、マウス IgG2a、マウス IgG2b、マウス IgG3 または マウス IgG1 である、請求項10に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、プロテインA との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、プロテインG との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、プロテインA/G との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、プロテインL との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、ポリクローナル抗体の定常部分に対する抗体との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、Fc 受容体との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、Con A との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 i) における親和性精製が、抗体の標的との結合を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、トリプシンを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、キモトリプシンを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、Asp-N を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、Glu-C を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、Lys-C を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、lys-N を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程 ii) における消化が、Arg-C を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 消化が、本質的に完全に行われる、請求項1に記載の方法。
- 還元が、ジチオスレイトール(DTT)を用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- 還元が、メルカプトエタノールを用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- アルキル化が、4-ビニルピリジンを用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- アルキル化が、ヨードアセトアミドを用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- アルキル化が、ヨードアセトアミドおよび/またはヨード酢酸を用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、13Cで標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、15Nで標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、18Oで標識されたものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、合成後標識によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、化学合成によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、代謝的取り込みを介して生細胞において作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、微生物の部分である、請求項38に記載の方法。
- 細胞が、培養中の哺乳類細胞である、請求項38に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、インビトロで作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、第一級アミノ基を標識するための重水素化酢酸を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、n末端特異的試薬を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、ペプチドの カルボキシル基のパーメチルエステル化を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、切断の間のトリプシンペプチドの c末端への2つの 18O 標識の付加を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、N末端ペプチド標識を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、NIT(N末端同位体コードタギング)を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、C末端ペプチド標識を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、N末端および C末端ペプチド標識とは異なる標識を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、アミノ酸に基づく標識を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 工程 iii) における1以上の内部基準ペプチドが、各ペプチド中の1つのアミノ酸のアミノ酸に基づく標識を含む方法によって作成されるものである、請求項1に記載の方法。
- 抗署名ペプチド抗体が、ポリクローナル血清に由来する抗体である、請求項4に記載の方法。
- 抗署名ペプチド抗体が、モノクローナル抗体である、請求項4に記載の方法。
- 内部基準ペプチドが、組換えポリクローナル抗体および/または TcR 内の配列と同一の配列を有するものである、請求項1に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の定常領域内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の可変領域内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の軽鎖内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の重鎖内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体のフレームワーク内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の超可変ドメイン内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の CDR1 内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の CDR2 内のものである、請求項54に記載の方法。
- 組換えポリクローナル抗体内の配列が、該組換えポリクローナル抗体の CDR3 内のものである、請求項54に記載の方法。
- 署名ペプチドが、陰イオン交換に基づく分離を用いて濃縮される、請求項4に記載の方法。
- 署名ペプチドが、逆相に基づく分離を用いて濃縮される、請求項4に記載の方法。
- 署名ペプチドが、親水性相互作用に基づく分離を用いて濃縮される、請求項4に記載の方法。
- 署名ペプチドが、疎水性相互作用に基づく分離を用いて濃縮される、請求項4に記載の方法。
- 署名ペプチドが、サイズ排除に基づく分離を用いて濃縮される、請求項4に記載の方法。
- 抗署名ペプチド抗体が、ウサギにおいて産生されるものである、請求項5に記載の方法。
- 抗署名ペプチド抗体が、ニワトリにおいて産生されるものである、請求項5に記載の方法。
- 抗署名ペプチド抗体が、ヤギにおいて産生されるものである、請求項5に記載の方法。
- 抗署名ペプチド抗体が、ヒツジにおいて産生されるものである、請求項5に記載の方法。
- バッチ形式で行われる、請求項5に記載の方法。
- 96 ウェル形式で行われる、請求項5に記載の方法。
- 多次元 LC-MS システムの部分として行われる、請求項5に記載の方法。
- 非直結型で行われる、請求項5に記載の方法。
- 該署名および基準ペプチドをイオン源の中へ直接溶出させることを含む、請求項5に記載の方法。
- 署名および基準ペプチドを ESI ソースへ直接溶出させることを含む、請求項5に記載の方法。
- 質量分析が、ESI によるイオン化を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、MALDI によるイオン化を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、2次元以上のクロマトグラフィー分画を含む LC-MS 解析を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、多次元クロマトグラフィーを含む LC-MS 解析を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、単次元の LC 分離を含む LC-MS 解析を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、2次元以上の LC 分離を含む LC-MS 解析を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)、Q-TOF または三重四重極に基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、LC-MS/MS を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、LC-ESI-MS/MS を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、LC-MALDI-MS/MS を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、多重反応モニタリング(MRM)に基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、抽出イオンクロマトグラムを含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、イオントラップに基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、ESI-三重四重極に基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、オービトラップに基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、ESI-TOF に基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析が、ESI-Q-TOF に基づく方法を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、2以上の組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、2以上のキメラポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 2以上のキメラポリクローナル抗体が、ヒト部分およびマウス部分を含むものである、請求項98に記載の方法。
- ヒト部分が、ポリクローナル抗体の定常領域である、請求項99に記載の方法。
- ヒト部分が、ポリクローナル抗体の可変領域である、請求項99に記載の方法。
- マウス部分が、ポリクローナル抗体の定常領域である、請求項99に記載の方法。
- マウス部分が、ポリクローナル抗体の可変領域である、請求項99に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、1以上の相同なものを含む、請求項1に記載の方法。
- サンプルが、血清サンプルである、請求項1に記載の方法。
- サンプルが、血漿サンプルである、請求項1に記載の方法。
- サンプルが、細胞培養上清である、請求項1に記載の方法。
- サンプルが、バイオリアクターの上清である、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、2以上の感染症の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、2以上の細菌感染の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、2以上のウイルス感染の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、2以上の癌の形態の治療および/または予防のために用いられる組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、異なる組換えポリクローナル抗体からなる組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、異なる組換えポリクローナル抗 Rhesus D (RhD) 抗体、例えば Sym001 からなる組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、既存の抗ワクシニア過免疫イムノグロブリン(VIG)を置換する組換えポリクローナル抗ワクシニアウイルス抗体、例えば Sym002 を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、抗呼吸器多核体ウイルス(RSV)を標的とする組換えポリクローナル抗体、例えば Sym003 を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、ヒトの癌抗原を標的とする組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、ヒト EGFR を標的とする組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、細菌性病原体を標的とする組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、ウイルス性病原体を標的とする組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、感染症標的を標的とする組換えポリクローナル抗体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、1以上の組換えB細胞受容体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 1以上の組換えタンパク質が、1以上の組換えT細胞受容体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- サンプル中の1以上の組換えタンパク質の定量化のための、請求項1から123のいずれかに記載の方法の使用。
- 該方法が、個体からの血清中における組換えポリクローナル抗体組成物を構成する個々の抗体のインビボのクリアランスの決定のために用いられる、請求項124に記載の使用。
- 該方法が、個体の薬物動態試験のために用いられる、請求項124に記載の使用。
- 個体が、ヒトである、請求項125または126に記載の使用。
- 個体が、げっ歯類である、請求項125または126に記載の使用。
- 個体が、サルである、請求項125または126に記載の使用。
- 該方法が、原体におけるポリクローナル性の特徴決定のために用いられる、請求項124に記載の使用。
- 該方法が、製剤におけるポリクローナル性の特徴決定のために用いられる、請求項124に記載の使用。
- 該方法が、工程中のサンプルにおける1以上の組換え抗体の定量化のために用いられる、請求項124に記載の使用。
- 組換えポリクローナル抗体の製造に関連する、請求項1に記載の方法の使用。
- 原体の生産の上流または下流における組換えポリクローナル抗体の製造に関連する、請求項1に記載の方法の使用。
- 製剤の生産の上流または下流における組換えポリクローナル抗体の製造に関連する、請求項1に記載の方法の使用。
- ポリクローナル細胞バンクについてのクローンの選択のための、請求項1に記載の方法の使用。
- 定量化される組換えタンパク質の数が2以上である、請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200901112 | 2009-10-09 | ||
DKPA200901112 | 2009-10-09 | ||
US25623209P | 2009-10-29 | 2009-10-29 | |
US61/256,232 | 2009-10-29 | ||
PCT/DK2010/050258 WO2011042027A2 (en) | 2009-10-09 | 2010-10-07 | Multiplex quantitation of individual recombinant proteins in a mixture by signature peptides and mass spectrometry |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013507603A true JP2013507603A (ja) | 2013-03-04 |
JP2013507603A5 JP2013507603A5 (ja) | 2013-11-21 |
Family
ID=42166454
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012532458A Pending JP2013507603A (ja) | 2009-10-09 | 2010-10-07 | 署名ペプチドおよび質量分析による混合物中の個々の組換えタンパク質の多重定量化 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120264155A1 (ja) |
EP (1) | EP2486411A2 (ja) |
JP (1) | JP2013507603A (ja) |
KR (1) | KR20120100982A (ja) |
CN (1) | CN102687020A (ja) |
AU (1) | AU2010305150A1 (ja) |
BR (1) | BR112012007815A2 (ja) |
CA (1) | CA2776508A1 (ja) |
IL (1) | IL218821A0 (ja) |
IN (1) | IN2012DN03911A (ja) |
MX (1) | MX2012003538A (ja) |
RU (1) | RU2012118620A (ja) |
WO (1) | WO2011042027A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201202431B (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019518195A (ja) * | 2016-03-25 | 2019-06-27 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ |
JP2019196989A (ja) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 株式会社島津製作所 | 分析方法、処理装置、分析装置およびプログラム |
JP2020530103A (ja) * | 2017-08-01 | 2020-10-15 | アムジエン・インコーポレーテツド | 質量分析法による分析用ポリペプチド試料のリアルタイム調製のためのシステム及び方法 |
JP2021512280A (ja) * | 2018-01-31 | 2021-05-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化 |
JP2022069446A (ja) * | 2016-02-25 | 2022-05-11 | ザ バインディング サイト グループ リミティド | 質量分析キット |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2241875A1 (en) * | 2009-04-14 | 2010-10-20 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Up-concentration of organic microobjects for microscopic imaging. |
JP5987053B2 (ja) * | 2011-05-12 | 2016-09-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングlc−ms/ms法 |
WO2013019714A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Mems affinity sensor for continuous monitoring of analytes |
WO2016022696A1 (en) * | 2014-08-05 | 2016-02-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of isolating aptamers for minimal residual disease detection |
US10627407B2 (en) | 2015-03-12 | 2020-04-21 | Mars, Incorporated | Ultra high resolution mass spectrometry and methods of using the same |
WO2016179397A1 (en) * | 2015-05-06 | 2016-11-10 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods of glycoprotein analysis |
CN105242050A (zh) * | 2015-09-16 | 2016-01-13 | 同济大学 | 一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法 |
CN105218671A (zh) * | 2015-09-29 | 2016-01-06 | 李艳华 | 一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法 |
US20170370906A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-12-28 | Genentech, Inc. | Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates |
CN107525934A (zh) * | 2016-06-21 | 2017-12-29 | 张效龙 | 一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法 |
WO2018035350A1 (en) * | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Glycan oxonium ion profiling of glycosylated proteins |
CN108072728A (zh) * | 2016-11-16 | 2018-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法及其应用 |
CN108956789A (zh) * | 2017-05-17 | 2018-12-07 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种血清中免疫球蛋白g糖肽的绝对定量分析方法 |
US10615016B2 (en) * | 2017-09-07 | 2020-04-07 | Thermo Fisher Scientific (Bremen) Gmbh | Determining isotope ratios using mass spectrometry |
CN108226516B (zh) * | 2017-11-30 | 2020-05-19 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法 |
CN108169397B (zh) * | 2017-11-30 | 2019-11-15 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽s转移酶gsta2的方法 |
CN109900815B (zh) * | 2017-12-08 | 2021-06-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 血清中IgG糖肽的绝对定量分析 |
CN110824096B (zh) * | 2018-08-13 | 2022-11-29 | 齐鲁制药有限公司 | 一种蛋白错配二硫键的分析方法 |
CN110007019A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-07-12 | 绿城农科检测技术有限公司 | 一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法 |
EP4107529A1 (en) | 2020-02-21 | 2022-12-28 | Genmab B.V. | Methods for the quantification of glycoproteins |
CN111551739A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-08-18 | 杭州璞湃科技有限公司 | 一种免疫球蛋白a和免疫球蛋白a1的检测方法及其试剂盒 |
US20230228763A1 (en) * | 2020-06-18 | 2023-07-20 | Northwestern University | Process for direct readout of immunoglobulins |
CN111766323B (zh) * | 2020-07-10 | 2022-06-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法 |
CN113933409B (zh) * | 2021-09-14 | 2023-11-14 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040033530A1 (en) * | 2002-04-08 | 2004-02-19 | Awrey Donald E. | High throughput purification, characterization and identification of recombinant proteins |
WO2006080396A1 (ja) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Shionogi & Co., Ltd. | 組換え蛋白質の定量法 |
JP2006300758A (ja) * | 2005-04-21 | 2006-11-02 | Apro Life Science Institute Inc | 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法 |
WO2008106980A2 (en) * | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Symphogen A/S | Recombinant antibodies for treatment of respiratory syncytial virus infections |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004031730A2 (en) | 2002-10-03 | 2004-04-15 | Norman Leigh Anderson | High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry |
CA2569311A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-29 | Anderson Forschung Group Llc | Stable isotope labeled polypeptide standards for protein quantitation |
AU2005263331B8 (en) | 2004-07-20 | 2011-06-16 | Symphogen A/S | Anti-Rhesus D recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture |
KR101319848B1 (ko) * | 2004-07-20 | 2013-10-18 | 심포젠 에이/에스 | 재조합 폴리클로날 단백질 또는 폴리클로날 세포주의구조적 특성화 방법 |
US7850965B2 (en) | 2005-12-05 | 2010-12-14 | Symphogen A/S | Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody |
WO2007101441A1 (en) | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Symphogen A/S | Recombinant polyclonal antibody for treatment of respiratory syncytial virus infections |
ES2582386T3 (es) * | 2007-03-01 | 2016-09-12 | Symphogen A/S | Composiciones de anticuerpos recombinantes contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico |
US20090000419A1 (en) * | 2007-06-29 | 2009-01-01 | Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. | Handlebar assembly with axial locking feature |
-
2010
- 2010-10-07 AU AU2010305150A patent/AU2010305150A1/en not_active Abandoned
- 2010-10-07 MX MX2012003538A patent/MX2012003538A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-10-07 EP EP10774121A patent/EP2486411A2/en not_active Withdrawn
- 2010-10-07 CN CN2010800562278A patent/CN102687020A/zh active Pending
- 2010-10-07 RU RU2012118620/15A patent/RU2012118620A/ru unknown
- 2010-10-07 WO PCT/DK2010/050258 patent/WO2011042027A2/en active Application Filing
- 2010-10-07 IN IN3911DEN2012 patent/IN2012DN03911A/en unknown
- 2010-10-07 BR BR112012007815A patent/BR112012007815A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-10-07 CA CA2776508A patent/CA2776508A1/en not_active Abandoned
- 2010-10-07 JP JP2012532458A patent/JP2013507603A/ja active Pending
- 2010-10-07 US US13/501,051 patent/US20120264155A1/en not_active Abandoned
- 2010-10-07 KR KR1020127011934A patent/KR20120100982A/ko not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-03-25 IL IL218821A patent/IL218821A0/en unknown
- 2012-04-03 ZA ZA2012/02431A patent/ZA201202431B/en unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040033530A1 (en) * | 2002-04-08 | 2004-02-19 | Awrey Donald E. | High throughput purification, characterization and identification of recombinant proteins |
WO2006080396A1 (ja) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Shionogi & Co., Ltd. | 組換え蛋白質の定量法 |
JP2006300758A (ja) * | 2005-04-21 | 2006-11-02 | Apro Life Science Institute Inc | 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法 |
WO2008106980A2 (en) * | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Symphogen A/S | Recombinant antibodies for treatment of respiratory syncytial virus infections |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022069446A (ja) * | 2016-02-25 | 2022-05-11 | ザ バインディング サイト グループ リミティド | 質量分析キット |
JP2019518195A (ja) * | 2016-03-25 | 2019-06-27 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ |
JP2020530103A (ja) * | 2017-08-01 | 2020-10-15 | アムジエン・インコーポレーテツド | 質量分析法による分析用ポリペプチド試料のリアルタイム調製のためのシステム及び方法 |
JP7237022B2 (ja) | 2017-08-01 | 2023-03-10 | アムジエン・インコーポレーテツド | 質量分析法による分析用ポリペプチド試料のリアルタイム調製のためのシステム及び方法 |
JP2021512280A (ja) * | 2018-01-31 | 2021-05-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化 |
JP7301054B2 (ja) | 2018-01-31 | 2023-06-30 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化 |
JP2019196989A (ja) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 株式会社島津製作所 | 分析方法、処理装置、分析装置およびプログラム |
JP7205077B2 (ja) | 2018-05-10 | 2023-01-17 | 株式会社島津製作所 | 分析方法、処理装置、分析装置およびプログラム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2011042027A2 (en) | 2011-04-14 |
EP2486411A2 (en) | 2012-08-15 |
ZA201202431B (en) | 2012-12-27 |
KR20120100982A (ko) | 2012-09-12 |
CN102687020A (zh) | 2012-09-19 |
AU2010305150A1 (en) | 2012-04-05 |
IL218821A0 (en) | 2012-06-28 |
MX2012003538A (es) | 2012-08-03 |
BR112012007815A2 (pt) | 2018-03-20 |
US20120264155A1 (en) | 2012-10-18 |
IN2012DN03911A (ja) | 2015-09-04 |
RU2012118620A (ru) | 2013-11-20 |
CA2776508A1 (en) | 2011-04-14 |
WO2011042027A3 (en) | 2011-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2013507603A (ja) | 署名ペプチドおよび質量分析による混合物中の個々の組換えタンパク質の多重定量化 | |
RU2476886C2 (ru) | Способ характеризации рекомбинантного поликлонального белка | |
US10281473B2 (en) | Compositions and methods for analysis of protein sequences and post-translational modifications | |
Tran et al. | Comprehensive glycosylation profiling of IgG and IgG-fusion proteins by top-down MS with multiple fragmentation techniques | |
Pham et al. | De novo proteomic sequencing of a monoclonal antibody raised against OX40 ligand | |
US11899023B2 (en) | Quantitation and identification of dimers in co-formulations | |
Todoroki et al. | Current mass spectrometric tools for the bioanalyses of therapeutic monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates | |
JP2023134463A (ja) | 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化 | |
US20200369720A1 (en) | Characterization of domain-specific charge variants of antibodies | |
Sun et al. | Characterization and monitoring of charge variants of a recombinant monoclonal antibody using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry | |
JP2022517338A (ja) | 抗体の断片化を特定及び定量する方法及びシステム | |
Jiang et al. | Quantification of protein posttranslational modifications using stable isotope and mass spectrometry: I: Principles and applications | |
Adamczyk et al. | Complete sequencing of anti-vancomycin fab fragment by liquid chromatography–electrospray ion trap mass spectrometry with a combination of database searching and manual interpretation of the MS/MS spectra | |
US11639939B2 (en) | Tandem mass tag multiplexed quantitation of post-translational modifications of proteins | |
US20210080471A1 (en) | Lc-ms methods for antibody isotyping and quantification | |
KR20170071849A (ko) | Lc-ms를 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법 | |
Boeuf et al. | Mass Spectrometry‐Based Strategies for Therapeutic Antibodies Extensive Characterization and Optimization (OptimAbs) | |
Hessmann | Development of analytical strategies in quantitative proteomic: quantitation of host cell proteins by mass spectrometry as a quality control tool for the biopharmaceutical industry | |
EA044417B1 (ru) | Количественное определение и идентификация димеров в совместных составах | |
KR20230167058A (ko) | Lc-mrm-ms 분석을 통해 피험자에게 동시 투여된 치료 단백질 측정 | |
CN117280217A (zh) | 通过lc-mrm-ms测定对共同施用于受试者的治疗蛋白的测量 | |
Gandhi | Mass Spectrometric Techniques for Sequence and Structural Characterization of Proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131004 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131004 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20140120 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140627 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140722 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150324 |