JP7301054B2 - 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化 - Google Patents
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Description
本発明は概して、治療用タンパク質に対する翻訳後修飾を特定するシステムおよび方法に関する。
医薬品業界において、組換え型モノクローナル抗体(mAb)はタンパク質治療薬の主要なクラスを構成する。mAb構造への変化は、治療用mAbの治療効果、バイオアベイラビリティ、クリアランス、免疫原性特性に影響を与える場合がある。さらに、mAbの変化は、薬物安全性および薬物有効性を変える可能性がある。mAbの一次構造、翻訳後修飾(PTM)、ジスルフィド結合を包括的に特性化することは、薬物有効性および薬物安全性の評価にとって重要であるだけでなく、構造/機能の関係を理解するために重要である。
[本発明1001]
タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法であって、
前記タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、
前記脱グリコシル化したタンパク質医薬品を処理して、非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片を含む一つのFc*断片、および一つのFab 2 を含む一つのFab 2 断片を生成することと、
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記Fc*複合体およびFab 2 複合体を、Fc*およびFab 2 の酸性画分へと分離することと、
前記酸性画分を乾燥および変性させることと、
前記酸性画分をアルキル化することと、
前記酸性画分をトリプシンで消化してサンプルを形成することと、
前記サンプルをNaBH 4 でインキュベートして、還元されたサンプルを形成することと、
前記還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して前記タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間でマススペクトル分析を比較して、前記還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記タンパク質医薬品がモノクローナル抗体を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記Fc*断片およびFab 2 断片が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換えによって修飾された形態のIdeSを使用して形成される、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記イオン交換クロマトグラフィーが強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記酸性画分が、ヨードアセトアミドでアルキル化される、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のアミノ酸の10%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
[本発明1008]
前記治療用タンパク質のアミノ酸の5%未満がグルクロニル化されている、本発明1007のタンパク質医薬品。
[本発明1009]
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、本発明1007または1008のタンパク質医薬品。
[本発明1010]
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、本発明1007~1009のいずれかのタンパク質医薬品。
[本発明1011]
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、本発明1010のタンパク質医薬品。
[本発明1012]
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のリジンアミノ酸の3%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
[本発明1013]
タンパク質医薬品の純度を増加させる方法であって、
前記タンパク質医薬品を分析して、前記タンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、
グルクロニル化タンパク質を前記タンパク質医薬品から除去して、精製されたタンパク質医薬品を生成することと
を含む、前記方法。
[本発明1014]
前記グルクロニル化タンパク質が高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記クロマトグラフィー技法が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記クロマトグラフィー技法がマススペクトル分析と組み合わされる、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、本発明1013~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、本発明1013~1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法であって、
グルクロニル化のために哺乳類細胞培養物から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることを含み、前記タンパク質医薬品の前記グルクロニル化の存在が、前記タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す、前記方法。
[本発明1021]
前記哺乳類細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記グルクロニル化が前記タンパク質医薬品のリジンアミノ酸上にある、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
前記タンパク質医薬品が、抗体または融合タンパク質である、本発明1020~1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1023のいずれかの方法。
I.定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を意味することを意図する。「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのかかるドメインを、抗体(抗体Fcドメインなど)によって広く共有されるドメインと区別することを意図する。可変領域は「超可変領域」を含み、その残基は抗原結合に関与する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」からのアミノ酸残基(すなわち典型的に、おおよそ軽鎖可変ドメイン内の残基24~34(L1)、50~56(L2)、および89~97(L3)、ならびにおおよそ重鎖可変ドメイン内の残基27~35(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)にある;Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))、および/または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基26~32(L1)、50~52(L2)、および91~96(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3);Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917)を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書で定義される通りの、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
A. グルクロニル化の特定
グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。実施例1~3は、治療用タンパク質中のグルクロニル化アミノ酸を検出および特定するために使用される方法の詳細な説明を提供する。一般的に、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定するための一つの方法は、一つのFc*断片(非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片)および一つのFab2断片を生成するために、タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質医薬品をFabRICATOR(登録商標)で処理することとを含む。一実施形態において、Fc*断片およびFab2断片は、FabRICATOR(登録商標)の名称で販売されている、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換え型IdeS酵素を使用して生成される。
開示された方法は、例えばモノクローナル抗体またはその他の治療用タンパク質などのタンパク質医薬品の純度をモニターするために使用することができる。一実施形態は、タンパク質医薬品を分析してタンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、タンパク質医薬品からグルクロニル化したタンパク質を除去して精製したタンパク質医薬品を生成することとによって、タンパク質医薬品の純度を増加させる方法を提供する。グルクロニル化は、上記および実施例に説明した方法を使用して検出することができる。一実施形態において、グルクロニル化タンパク質は、マススペクトル分析と随意に組み合わされる高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される。代表的なクロマトグラフィー技法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で生じる。
さらに別の実施形態は、治療用タンパク質を含有するタンパク質医薬品を提供し、治療用タンパク質のアミノ酸の1.0%未満、2.0%未満、3.0%未満、4.0%未満、5.0%未満、6.0%未満、7.0%未満、8.0%未満、9.0%未満、または10%未満がグルクロニル化されている。グルクロニル化パーセントは、開示された方法を使用して決定することができる。一実施形態において、アミノ酸はリジンである。典型的に、治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、または融合タンパク質である。
方法
mAbはオンラインIEX-MS分析に供された。脱グリコシル化されたmAbサンプル(約50μg)のアリコートを、質量測定のために、Thermo Exactive Plus EMR質量分析計、またはThermo Q Exactive plus質量分析計に連結されたYMC-BioPro SP-F強力陽イオン交換(SCX)カラム(100×4.6mm)に注入した。サンプルを分離し、そして酢酸アンモニウムベースの緩衝液(緩衝液A:20mM酢酸アンモニウム、pH5.8、緩衝液B:200mM酢酸アンモニウム、pH7.6)を用いたpH勾配で20分間にわたり溶出した。質量検出のための質量分析計の前に分析流量を約2μL/分へと減少させるために、分析スプリッター(約200:1の比率)をSCXカラムの後に接続した。スプリッターからの高流量を、同時UV検出(280nm)のために、Waters ACQUITYフォトダイオードアレイ(PDA)検出器に迂回させた。
結果として、酸性のショルダーピークが検出され、これはおおよそ176Daの質量増加があった抗体のバリアントに起因する。しかしながら、インタクトレベルでの質量測定は正確ではなかった。これは同じ酸性ショルダーピークにおいて溶出され、かつ質量(162Da)が近い糖化修飾からの複雑な要因のためである。
方法
主ピークに対する酸性ピークの解像度を増加させ、かつ質量測定の精度を改善するために、脱グリコシル化mAbサンプルを、二つのヒンジ領域ジスルフィド結合のC末端にて重鎖を切断する酵素であるFabRICATORで処理した。
この処理は、一つのFab2断片および非共有相互作用(Fc*)を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片の生成をもたらした。消化のアリコートは、上記の通りオンラインIEX-MS分析に供された。予想の通り、Fab2とFc*の両方の酸性ピークにおいて、約176Daの質量増加があった同じ酸性バリアントが検出された(図1A~1P)。
方法
アミノ酸残基に対する修飾部位をさらに特定し、かつこの不明な修飾の正確な質量を得るために、Fc*断片とFab2断片の酸性画分をペプチドマッピング分析のためにSCXカラムから収集した。収集された酸性画分は最初にSpeedVac内で乾燥され、次いで5mMのジチオスレイトール(DTT)、8Mの尿素、および100mMのTris-HCl(pH7.5)を含有する20μLの溶液中で、50℃にて30分間の加熱によって変性され、かつ還元された。次いでサンプルは、10mMのヨードアセトアミド(IAA)で室温にて暗所で30分間インキュベートすることによってアルキル化された。次いで、還元されたサンプルおよびアルキル化されたサンプルは175μLの100mMのTris-HCl(pH7.5)で希釈され、トリプシンで酵素対基質比1:10(w/w)にて37℃で4時間にわたり消化された。消化は10%のFAを4μL加えることによって停止した。次いで、消化された各タンパク質サンプルのアリコートをRP-UPLCによって分離し、続いてオンラインMS分析を行った。MSおよびMS/MS実験は、MS/MS実験中にペプチド断片化のために、より高エネルギーの衝突解離(HCD)を用いて、Thermo Q Exactive Plus MSシステムで実施された。次いで、MSの未加工データファイルを、170~180Daの質量のmAb配列および可変ワイルドカード修飾を含有するデータベースに対して検索した。
結果は、この不明な修飾が+176.03Daのモノアイソトピック質量を示し、またmAb配列の複数のLys残基では低レベルにて生じたことを示した(図2)。正確なデルタ質量に基づいて、この修飾はグルクロン酸化と同じ元素組成物(C6H8O6)を有すると仮定されたが、しかしながらこれは、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼによって触媒されたO結合を通してSerおよびThrで生じると報告された。
Claims (6)
- タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法であって、
タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、
前記脱グリコシル化したタンパク質医薬品を処理して、非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片を含む一つのFc*断片、および一つのFab2 断片を含む一つのFab2断片を生成することと、
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記Fc*断片およびFab2 断片を、Fc*およびFab2の酸性画分へと分離することと、
前記酸性画分を乾燥および変性させることと、
前記酸性画分をアルキル化することと、
前記酸性画分をトリプシンで消化して、還元されていないサンプルを形成することと、
前記還元されていないサンプルの一部をNaBH4でインキュベートして、還元されたサンプルを形成することと、
前記還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して前記タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定することと
を含む、前記方法。 - 前記還元されたサンプルと前記還元されていないサンプルとの間でマススペクトル分析を比較して、前記還元されたサンプルと前記還元されていないサンプルとの間の質量差を特定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬品がモノクローナル抗体を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Fc*断片およびFab2断片が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換えによって修飾された形態のIdeSを使用して形成される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーが強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸性画分が、ヨードアセトアミドでアルキル化される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
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