KR20170071849A - Lc-ms를 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법 - Google Patents

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충남대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 질량분석을 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법에 관한 것으로, 상세하게는 항체 약물을 개체에게 투여한 후, 혈액에 존재하는 양을 측정하기 위하여, LC-TOF MS/MS 기법을 이용하여 정량하는 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 유방암 치료제로 알려진 트라스투주맙의 혈액 내 양을 정량하는 방법으로, ELISA 기법에 비해 편리하고 정확하게 혈액 내에 존재하는 양을 정량할 수 있다.

Description

LC-MS를 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법{Method for quantifying antibody in blood using LC-MS}
본 발명은 LC-MS를 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법에 관한 것이다.
제약산업에서 치료 단백질 분야는 발견 및 개발로부터 성장에 이르기까지 눈 부신 발전이 이루어지고 있으며, 치료용 단백질 중에서 치료 단클론 항체가 가장 빠르게 성장하는 분야 중의 하나이다. 작은 분자 약물에 비해 치료 단클론 항체는 여러 가지 측면에서 이점이 있는데, 친화력(affinity), 결합력(avidity), 생체분포, 이펙터(effector) 기능 및 긴 반감기 등을 설계할 수 있기 때문이다.
모노클로날 항체는 통상적으로 면역흡착어세이(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 방사성 면역검정과 같은 면역 형광분석법으로 정량화하는데, 이와 같은 분석법은 여러 가지 장점이 있기는 하지만, 고감도 및 고농도의 처리량이 필요하다는 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 특정 약물의 개발은 종종 노동 집약적이고, 매번 새롭게 설계해야 하는 등의 문제가 있다. 따라서, 치료적 단클론 항체의 개발 초기단계에서는 제한적이며, 전임상 연구를 위해 개발된 면역학적 방법이 실제 임상 시험 시료분석에서는 적용되지 않는 경우가 종종 있다.
한편, 액체크로마토그래피-질량분석기기는 광범위하게 사용될 수 있는 장비로, 작은 분자에서부터 거대한 단백질에 이르기까지 다양한 크기의 질량을 측정할 수 있을 뿐만 아니라. 동위원소의 치환된 차이를 구별할 수 있을 정도로 고 해상도를 가지고 있으므로, 정량을 위한 기법에 적용하기 적합한 장비이다.
질량분석 기반의 항체를 정량하는 알려진 기술로는 한국공개특허 제2013-0135028호에서 항원 특이적인 가변 영역 후보의 탐지 및 원하는 항체 특이성을 가지는 항체나 항원 결합 단편의 생성을 위한 방법과 조성물을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0916651호에 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 약적 감시에 의한 질환의 진단 방법에 대하여 개시되어 있다.
한편, 항체 약물 중에서 트라스투주맙(trastuzumab)은 허셉틴주(herceptin)라고도 하며, 사람 상피증식인자 수용체 HER-2 유전자 또는 그의 유전자 산물의 과잉발현으로 나타나는 전이성 유방암 치료제이다. HER-2인 세포 외 부분을 항원결정부(epitope)로 하여 인식하는 항체인데, 생쥐 항HER-2 단일클론성 항체 분자의 상보적 항원 결합부위를 사람 IgG1의 상당부분에 유전자 공학적으로 이식하여 제조한 단일클론성 항체이다. HER-2를 고 발현하는 유방암 환자에 대해 정맥 내 투여하여 직접적으로 세포 증식억제 외에 항체 의존성 세포상해(ADCC)와 혈관신생저해 등에 의한 항종양작용을 발휘하는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 트라스투주맙의 유효성을 평가하는 기술로는 일본등록특허 제5682976호에 항체를 유효성분으로 포함하는 의약품의 유효성 판정 방법이 개시되어 있고, 일본 공개특허 제2013-466620호에 트라스투주맙에 의한 치료의 후보 환자를 확인하기 위한 진단방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 질량분석을 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법에 관하여 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 질량분석을 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법에 관한 것으로, 항체 약물 중에서 트라스트주맙에 대하여 LC-TOF MS 분석으로 혈액 내의 양을 정량하는 방법을 확립하고, 종래의 방법인 ELISA 기법으로 획득한 결과와 유사하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은
(1) 항체 약물을 개체에 투여하는 단계;
(2) 상기 항체 약물이 투여된 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;
(3) 상기 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 분리된 혈장 내에 포함된 상기 항체 약물을 단백질 A가 결합된 자석비드에 융합시키는 단계;
(4) 상기 단계 (3)에서, 단백질 A가 결합된 자석비드에 융합되지 않은 잔여물을 제거 또는 세척하는 단계;
(5) 상기 항체 약물의 서열 중에서 효소를 처리하여 획득할 수 있는 펩티드 서열과 동일하면서, 2~4개의 동위원소로 치환된 아미노산을 포함하는 펩티드인 내부 표준물질(internal standard)을 첨가하는 단계;
(6) 상기 단계 (5) 이후에, 효소를 처리하여 자석비드에 융합된 항체 약물을 펩티드로 절단(digestion)하는 단계;
(7) 상기 절단된 펩티드를 포함하는 상층액을 취하여, LC-TOF MS/MS를 수행하는 단계;
(8) 상기 단계 (7)에서 수행하여 획득한 LC-TOF MS/MS 스펙트럼으로부터, 상기 절단된 펩티드에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)와 상기 내부 표준물질에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)를 측정하는 단계; 및
(9) 0.5~100㎍/㎖의 항체 약물을 혈장에 용해하여 제조한 표준용액에 효소를 처리하여 획득한 상기 절단된 펩티드와 동일한 서열을 가지는 펩티드의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity) 및 상기 표준 용액에 첨가된 상기 내부 표준물질의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)의 비율과 상기 항체 약물 농도와의 관계로부터 작성된 2차 회귀식(quadratic regression)에 상기 단계 (8)에서 측정된 절단된 펩티드와 내부 표준물질에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)를 대입하여 항체 약물의 농도를 결정하는 단계;를 포함하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 질량분석을 이용하는 항체 약물의 혈액 내 정량방법에 관한 것으로, 상세하게는 항체 약물을 개체에게 투여한 후, 혈액에 존재하는 양을 측정하기 위하여, LC-TOF MS/MS 기법을 이용하여 정량하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 정량방법은 정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)가 우수한 방법으로, 시료의 전 처리 과정에서 비드를 이용하여 측정하고자 하는 단백질 이외의 잔여물을 쉽게 제거할 수 있고, LC-MS 분석을 수행하기 위해 처리하는 효소를 소량만 사용하여도 효율적으로 단백질을 펩티드로 절단할 수 있으므로, 혈액 내 항체 약물의 양을 간편하면서도, 빠르게 측정할 수 있다.
도 1(a)는 이온 크로마토그램으로 추출한 5개의 시그니쳐 펩티드(TPEVTCVVVDVSHEDPEVK, FNWYVDGVEVHNAK, VVSVLTVLHQDWLNGK, GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK, TTPPVLDSDGSFFLYSK)의 LC-TOF MS 스캔 결과이고, 도 1(b) 및 도 1(c)는 trastuzumab의 LC-TOF MS 정량을 위해 선택된 타겟 펩티드(TTPPVLDSDGSFFLYSK)와 안정적인 동위원소 표지된 내부 표준물질(ISTD) 펩티드의 LC-TOF MS 스펙트럼이다.
도 2는 표준용액을 측정한 질량분석의 강도와 농도와의 상관관계를 나타낸 보정용 표준곡선(Calibration standard curve)이다.
도 3(a)는 선택된 타겟 펩티드의 최저 정량 한계점에서의 LC-TOF MS의 피크를 나타낸 것이고, 도 3(b)는 최저 정량 한계점에 대한 선택된 타겟 펩티드의 안정적인 동위원소 표지된 펩티드의 LC-TOF MS의 피크를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스, 렛트, 개 및 원숭이로부터 유래한 4종의 전임상 검체에서 혈장을 포함하지 않는 경우와 QC low 시료의 trastuzumab에 대한 LC-TOF MS/MS 피크를 비교한 것이다. (a)는 마우스 유래의 혈장을 포함하지 않는 시료, (b)는 마우스 혈장 유래의 QC low 시료, (c)는 마우스 혈장의 내부 표준물질(ISTD)이고, (d)는 렛트 유래의 혈장을 포함하지 않는 시료, (e)는 렛트 혈장 유래의 QC low 시료, (f)는 렛트 혈장의 내부 표준물질(ISTD)이며, (g)는 개 유래의 혈장을 포함하지 않는 시료, (h)는 개 혈장 유래의 QC low 시료, (i)는 개 혈장의 내부 표준물질(ISTD)이고, (j)는 원숭이 유래의 혈장을 포함하지 않는 시료, (k)는 원숭이 혈장 유래의 QC low 시료, (l)은 원숭이 혈장의 내부 표준물질(ISTD)이다.
도 5는 트라스트주맙을 실험쥐에 투여 후 시간경과에 따른 MS 강도의 비율(시료의 강도/내부 표준물질의 강도)(A)과 그 비율에 해당하는 농도(B)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 ELISA의 정량 결과와 LC-TOF MS의 정량결과의 상관관계를 나타낸 것이다.
본 발명은
(1) 항체 약물을 개체에 투여하는 단계;
(2) 상기 항체 약물이 투여된 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;
(3) 상기 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 분리된 혈장 내에 포함된 상기 항체 약물을 단백질 A가 결합된 자석비드에 융합시키는 단계;
(4) 상기 단계 (3)에서, 단백질 A가 결합된 자석비드에 융합되지 않은 잔여물을 제거 또는 세척하는 단계;
(5) 상기 항체 약물의 서열 중에서 효소를 처리하여 획득할 수 있는 펩티드 서열과 동일하면서, 2~4개의 동위원소로 치환된 아미노산을 포함하는 펩티드인 내부 표준물질(internal standard)을 첨가하는 단계;
(6) 상기 단계 (5) 이후에, 효소를 처리하여 자석비드에 융합된 항체 약물을 펩티드로 절단(digestion)하는 단계;
(7) 상기 절단된 펩티드를 포함하는 상층액을 취하여, LC-TOF MS/MS를 수행하는 단계;
(8) 상기 단계 (7)에서 수행하여 획득한 LC-TOF MS/MS 스펙트럼으로부터, 상기 절단된 펩티드에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)와 상기 내부 표준물질에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)를 측정하는 단계; 및
(9) 0.5~100㎍/㎖의 항체 약물을 혈장에 용해하여 제조한 표준용액에 효소를 처리하여 획득한 상기 절단된 펩티드와 동일한 서열을 가지는 펩티드의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity) 및 상기 표준 용액에 첨가된 상기 내부 표준물질의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)의 비율과 상기 항체 약물 농도와의 관계로부터 작성된 2차 회귀식(quadratic regression)에 상기 단계 (8)에서 측정된 절단된 펩티드와 내부 표준물질에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)를 대입하여 항체 약물의 농도를 결정하는 단계;를 포함하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법에 관한 것이다.
상기 항체 약물은 트라스투주맙(trastzumab), 압식시맙(abciximab), 리툭시맙(rituximab), 바실릭시맙(basiliximab), 인플릭시맙(infiliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세툭시맙(Cetuximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 로보투주맙(lorvotuzumab), 브렌툭시맙(brentuximab) 및 글렘바투무맙(glembatumumab) 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 트라스투주맙(trastzumab) 이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 효소는 단백질 가수분해 효소인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 트립신(trypsin), 펩티데이즈(peptidase) 또는 펩신(pepsin)이며, 더더욱 바람직하게는 트립신(trypsin)이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 항체 약물 중에서 트라스투주맙에 효소를 처리하여 절단한 펩티드는 서열번호 1 내지 8의 서열로 이루어진 펩티드 중에서 선택된 어느 하나인 것이 특징이고, 상기 펩티드 중에서 서열번호 1의 펩티드를 측정하는 타겟으로 하는 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
또한, 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열 중에서 N 말단으로부터 4번째의 프롤린과 5번째의 발린이 동위원소로 치환된 펩티드를 내부 표준물질로 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니며, 선택된 타겟 펩티드에 동일한 서열을 가지면서 동위원소를 2~4개 치환한 펩티드를 내부 표준물질로 이용할 수 있다.
상기 단계(9)에서 유도한 2차 회귀식은 하기 식 1인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 측정하고자 하는 항체 약물에 따라 제조된 표준용액은 상이할 수 있고, 이에 따른 2차 회귀식은 다르게 적용할 수 있다.
Y = 7.55657×10-5 X2+0.02545 X-0.00108 (식 1)
(식 중, Y는 [측정하고자 하는 개체로부터 획득한 혈장에 포함된 서열번호 1로 이루어진 펩티드의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)]/[내부 표준물질의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)]이고,
X는 측정하고자 하는 혈액 내의 항체 약물의 농도를 의미한다).
상기 표준용액은 0.5 내지 100㎍/㎖의 표준물질이 용해된 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않고, 측정하고자 하는 표준용액 또는 시료에 포함하는 내부 표준물질의 농도는 8 내지 12㎍/㎖인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10㎍/㎖이지만, 이에 한정하지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[시료의 준비]
트라스투주맙(trastuzumab)은 삼성의료원으로부터 구입하였고, 서열번호 1의 타겟 펩티드(TTPPVLDSDGSFFLYSK, M.W. 1874) 및 상기 서열번호 1의 타겟 펩티드 서열 중에서 4번째의 프롤린과 5번째의 발린이 동위원소로 치환된 펩티드(TTPP*V*LDSDGSFFLYSK, M.W. 1886)는 에니젠으로부터 구입하였다.
단백질 A가 결합된 자석 비드는 밀리포어사로부터 구입하였고(Cat. No. LSKMAGA10), RapiGest SF는 워터스사로부터 구입하였다. DTT(dithiothreitol)는 Carl Roth 사로부터 구입하였으며, IAA(iodoacetic acid)는 Wako사로부터 구입하였다.
시퀀싱 등급의 변형된 트립신(modified trypsin)은 프로메가로부터 구입하였다. 다른 모든 화학약품은 분석용 또는 시약등급으로 시판되는 것을 구입하여 정제없이 사용하였다.
[LC-TOF MS 및 LC-TOF MS/MS 분석 조건]
액체 크로마토그래피-질량분석(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)은 두 대의 시마주(Shimadzu) LC-20AD 펌프, 한 대의 시마주(Shimadzu)CBM-20A HPLC용 펌프 조절기(Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA) 및 CTC HTS PAL 오토샘플러(CEAP Technologies, Carrboro, NC, USA)가 장착된 quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOFTM 5600 질량분석기를 이용하였으며, Phenomenex Kinetex XB-C18 칼럼을 이용하였다.
1) 액체 크로마토그래피(Liquid chromatography) 분석조건
이동상은 0.1% FA(formic acid)를 포함하는 증류 및 탈이온 수의 이동상 A와 0.1% FA를 포함하는 아세토나이트릴(acetonitrile)의 이동상 B를 이용하였고, 이들의 농도 구배(gradient)는 0~0.5분 동안은 95%의 이동상 및 5%의 이동상 B의 조건으로, 0.5~1.8분 동안은 5%에서 70%까지 직선형의 농도 구배로 이동상 B의 농도를 변화시키는 조건으로, 1.8~2.0분 동안은 70%에서 95%까지 직선형의 농도 구배로 이동상 B의 농도를 변화시키는 조건으로, 2.0~2.3분 동안은 95%의 이동상 B의 조건으로, 2.3~2.4분 동안은 95%에서 5%로 직선형 농도 구배로 이동상 B의 조건으로, 이후 1.1분 동안 5%의 이동상 B인 조건으로 하였다. 이때 이동상의 유속은 0.3 mL/min이고, 10㎕의 시료를 투여하였다.
2) 질량분석(mass spectrometry) 분석 조건
TOF MS 분석 조건은 ~35,000 전체-폭 절반-최대(full-width half-maximum)의 해상도를 갖는 양이온 모드로, 5ppm 이하의 정확도이며, 질량분석 범위는 TOF-MS 스캔에 대해서는, 0.2초의 축적시간으로 m/z 100~1,000을 스캔하였고, TOF-MS/MS 스캔에 대해서는, 0.3초의 축적시간으로 특이 신호 펩티드의 신호인 m/z 832~842를 스캔하였고, 0.1초의 축적시간으로 안정적인 동위원소 표지된 펩티드의 신호인 m/z 837~847을 스캔하였다. 총 사이클 시간은 0.6초였다.
고순도 질소가스는 nebulizer/DuosprayTM 장비를 이용하여 공급하고, 소스 온도는 500℃이며, 소스를 포함하는 가스의 흐름은 30ℓ/min의 속도 조건으로 하였다. 이온 스프레이(ESI) 전압은 5500V이고, declustering 포텐셜은 162V이며, 충돌에너지는 38V인 조건으로 수행하였다.
[소프트웨어]
본 발명에서, 사용된 LC-TOF MS 장비의 조절 및 데이터 수집을 위하여, Analyst® TF Version 1.6 (AB Sciex) 소프트웨어를 이용하였다. 피크의 적분(Peak intergation)은 MultiQuant® Version 2.1.1 (AB Sciex) 소프트웨어를 이용하였다.
피크 면적 비율, 표준곡선 회귀(standard curve regressions), 시료농도 값 및 기술통계(descriptive staticstics)는 MultiQuant® Version 2.1.1 소프트웨어를 이용하였다.
실시예 1. 보정용 표준용액, 내부 표준용액 및 품질관리( QC ) 시료의 제조
본 발명의 정량방법에서 보정용 표준용액(STD)은 트라스투주맙(trastuzumab) 용액을 사용하였으며, 트라스투주맙(trastuzumab)을 PBS에 용해시켜, 5,000㎍/㎖의 트라스투주맙(trastuzumab) 저장용액을 제조하였으며, 상기 트라스투주맙(trastuzumab) 저장용액은 PBS를 이용하여 500㎍/㎖로 희석하여 사용하고, 상기 500㎍/㎖의 트라스투주맙(trastuzumab)을 쥐 혈장(rat plasma)으로 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20, 40, 80, 및 100㎍/㎖의 농도가 되도록 희석하여, 보정용 표준용액을 제조하였다.
또한, 내부 표준용액(internal standard solution, ISTD)은 동위원소가 표지된 펩티드 용액으로, 서열번호 1의 서열로 이루어지며, N 말단의 4번째 프롤린과 5번째 발린이 동위원소로 표지된 펩티드를 10㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS로 용해시켜 제조하였다.
또한, 품질관리(QC) 시료는 농도를 정확히 알고 있는 쥐 혈장 용액으로, 농도가 2.5, 25, 50㎍/㎖가 되도록 쥐 혈장(rat plasma) 용액을 제조하였다.
실시예 2. 항체 약물로부터 절단된 펩티드를 이용한 보정용 표준곡선( Calibration standard curve )의 작성
LC-TOF MS 분석을 위하여, 20㎕의 트라스트주맙이 처리된 보정용 표준용액(STD)에 340㎕의 PBS 및 60㎕의 자석비드(magnetic bead)를 혼합하였다. 상기 혼합용액을 2시간 동안 상온에서 약하게 흔들면서 자석비드에 결합된 단백질 A와 항체의 Fc 영역이 컨쥬게이션 되도록 반응시키고, 상기 반응 이후, PBS를 이용하여 자석 비드(magnetic bead)를 3번 세척함으로써 비드에 융합되지 않은 잔여물을 제거하였고, 이후, 자석비드(magnetic bead)에 융합된 트라스트주맙(trastuzumab)을 변성 및 환원시키기 위하여, 상기 세척된 비드에 25㎕의 내부 표준용액(ISTD), 75㎕의 RapiGest, 10㎕의 DTT를 첨가하고, 1분 동안 상기 혼합물을 흔들어 준 후, 1시간 동안 60℃에서 인큐베이션하였다. 이후에, 25㎕의 IAA(iodoacetic acid)를 첨가하여 시료를 알킬화시키기 위하여, 1분 동안 상기 혼합물을 흔들어 준 후, 30분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 이후에, 10㎕의 시퀀싱 등급의 변형된 트립신(sequencing grade modified trypsin)을 혼합물에 첨가한 후, 하루 동안 37℃에서 인큐베이션하여 비드(bead) 상에서 시료를 절단(digestion)하였다. 이후에, 15㎕의 2M HCl을 혼합물에 첨가하고, 1분 동안 혼합물을 흔들어 준 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 5분 동안 4℃에서 4500g로 원심분리하여 상층액을 취하였다.
상기 획득한 상층액을 이용하여, 상기 LC-TOF MS 및 LC-TOF MS/MS 조건으로 질량분석을 수행하였다. 그 결과, trastuzumab의 정량을 위한 액체 크로마토그래피-질량분석에서 예상되는 8개의 펩티드(TTPPVLDSDGSFFLYSK(서열번호 1), SGTASVVCLLNNFYPR(서열번호 2), TVAAPSVFIFPPSDEQLK(서열번호 3), DSTYSLSSTLTLSK(서열번호 4), TPEVTCVVVDVSHEDPEVK(서열번호 5), FNWYVDGVEVHNAK(서열번호 6), VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 7), GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(서열번호 8)) 중에서 5개의 펩티드(TPEVTCVVVDVSHEDPEVK, FNWYVDGVEVHNAK, VVSVLTVLHQDWLNGK, GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK, TTPPVLDSDGSFFLYSK)의 질량분석 결과를 획득하였고(도 1(a)), 최종적으로, 서열번호 1로 이루어진 펩티드(TTPPVLDSDGSFFLYSK)의 [M+2H]2+ 이온과 안정적 동위원소 표지된 펩티드(m/z 937.4398 및 943.4558)를 측정하고자 하는 타겟 펩티드로 선별하였으며, 타겟 펩티드(TTPPVLDSDGSFFLYSK: 서열번호 1)의 m/z는 836.3934 및 842.4075으로 나타났다(도 1(b) 및 (c)).
또한, 획득한 타겟 펩티드의 [M+2H]2+ 이온과 안정적 동위원소가 표지된 펩티드(m/z 937.4398 및 943.4558)의 LC-TOF MS의 강도를 구하는데, 9단계의 농도로 나누어 분석하였으며, 두 번씩 실험한 강도를 획득하였으며, 표준용액에서 획득한 MS 강도와 내부 표준용액으로부터 획득한 MS 강도의 비율과 농도와의 상관관계를 나타내는 2차 회귀식 (식 1)을 구하였으며, [1/농도2]의 가중치를 적용하였다(도 2).
Y = 7.55657×10-5 X2+0.02545 X-0.00108 (식 1)
이후, 측정하고자하는 시료 내에 포함된 항체 약물의 농도를 구하기 위해, 본 실시예 2에서 획득한 보정용 표준곡선(Calibration standard curve)으로부터 구한 2차 회귀식을 이용하였다.
본 발명에서 획득한 보정용 표준곡선(Calibration standard curve)의 범위는 0.5~100㎍/㎖이며, 도 3(a)에 개시한 바와 같이 선택된 타겟 펩티드의 최저 정량 한계점은 S/N가 ~8이고, 최저 정량 한계점에 대한 선택된 타겟 펩티드의 안정적인 동위원소 표지된 펩티드의 LC-TOF MS의 피크도 잘 획득할 수 있다는 것을 확인하였다(도 3(b)).
실시예 3. QC 시료를 이용한 품질 분석
상기 실시예 1에서 제조한 QC 시료를 이용하며, 실시예 2와 동일한 방법으로 획득한 시료와 내부 표준물질 간의 비율을 구하여 보정용 표준곡선에 대입하여 검정하였다. QC 시료는 3단계(low, medium, high)로 분석하였으며, 두 번씩 실험하여 보정용 표준곡선을 구하였다. 상기 QC 시료에 대한 수용 기준(acceptance criteria)은 ±25%의 정확도와 정밀도로 정하였고, 1.53~9.20%의 Within-run accuracy 범위로 하였다.
QC 시료를 이용하여 보정용 표준곡선(calibration standard curve)을 이용하여 정확도(accuracy)와 정밀도(precision)를 확인한 결과.
평균(Mean) 정밀도(Precision, %) n 정확도(accuracy, %)
QC low(2.5㎍/㎖) 2.73 10.0 8 109
QC medium(25㎍/㎖) 25.4 10.3 8 102
QC hgih(50㎍/㎖) 52.2 5.33 8 104
실시예 4. 다양한 기원의 혈장으로부터 트라스투주맙의 정량분석
본 실시예에서는 트라스투주맙이 처리된 다양한 기원의 마우스, 렛트, 개 및 원숭이로부터 채취한 혈장시료에서의 타겟 펩티드를 확인하였으며(도 4(b, e, h, k)), 이때 음성 대조구로서 혈장이 포함되지 않은 시료(도 4(a, d, g, j)에서는 아무런 신호가 나타나지 않음을 확인하였으며, 동위원소로 표지된 타겟 펩티드인 내부 표준물질(도 4(c, f, i, l)의 LC-TOF MS/MS 분석결과도 확인하였다.
실시예 5. 렛트에서 혈액 내 트라스투주맙의 정량분석
SD 렛트에 2.5mg/kg의 트라스투주맙(trastuzumab) 정맥 주사하여 투여한 후, 혈장을 채취하였다.
트라스투주맙(trastuzumab)을 정맥 주사하고 15분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 7일, 10일, 14일 후에 혈장을 채취하였으며, 이를 이용한 혈액 내 항체 약물의 농도 분석은 LC-TOF MS/MS와 ELISA로 분석하였다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 트라스투주맙의 투여 후, 시간에 따른 혈액 내 트라스투주맙의 양을 확인할 수 있었다.
이후, 이와 같이 LC-TOF MS/MS 분석을 통해 측정된 농도와 ELISA로 측정된 농도를 비교하여 상관계수(correlation coefficient)를 계산하였다.
LC-TOF-MS/MS 분석은 상기 실시예 2에 기재한 방법과 동일하게 수행하였으며, 상기 식 1에 적용하여 농도를 구하였고, 면역흡착어세이(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)는 최종농도가 5㎍/㎖ 되도록, 항-인간 IgG(Fab specific) 항체를 96웰에 코팅시켜 4℃에 저장하였고, 혈장 시료를 1% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS로 500배 희석하여 준비하였다. 면역흡착어세이(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)법은 종래에 알려진 방법에 따라 수행하였다.
그 결과 도 6에 개시한 바와 같이, R2이 0.9104로 나타나 종래의 방법으로 측정한 농도와 차이가 거의 나지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예 6. trastuzumab 의 정량을 위한 액체 크로마토그래피-질량분석( LC -MS)의 동결/융해에 대한 안정성 분석
내부 표준물질이 포함되거나 포함되지 않은 2개의 블랭크 혈장 시료(blank plasma sample)도 준비하였고, 시료의 동결/융해(freeze/thaw)에 대한 안정성 시험은 QC 시료를 이용하여 수행하였으며, 다양한 기원의 마우스, 렛트, 개 및 원숭이로부터 채취한 혈장으로 평가하였고, 상기 다양한 기원의 혈장의 매트릭스 효과(matrix effect)를 평가하였다.
그 결과, 표 2에 개시한 바와 같이, trastuzumab의 혈장시료를 동결/융해(freeze/thaw)하는 사이클을 3번 반복하여도 시료에 대한 정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)가 유지되는 것을 확인하였다.
Trastuzumab의 선택된 특이적 시그너처 펩티드(specific signature peptide)를 이용한 LC-TOF MS 정량에서 혈장시료의 안정성을 확인한 결과
통계 QC low(2.5㎍/㎖) QC medium(25㎍/㎖) QC hgih(50㎍/㎖)
평균(Mean) 2.74 26.1 54.7
정밀도(Precision, %) 11.4 3.96 13.2
n 3 3 3
정확도(accuracy, %) 110 104 109
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Method for quantifying antibody in blood using LC-MS <130> 15-429, PN15430 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-1 <400> 1 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Lys <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-2 <400> 2 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-3 <400> 3 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-4 <400> 4 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-5 <400> 5 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-6 <400> 6 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-7 <400> 7 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab-8 <400> 8 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1 5 10 15 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 20

Claims (6)

  1. (1) 항체 약물을 개체에 투여하는 단계;
    (2) 상기 항체 약물이 투여된 개체로부터 혈액을 채취하는 단계;
    (3) 상기 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 분리된 혈장 내에 포함된 상기 항체 약물을 단백질 A가 결합된 자석비드에 융합시키는 단계;
    (4) 상기 단계 (3)에서, 단백질 A가 결합된 자석비드에 융합되지 않은 잔여물을 제거 또는 세척하는 단계;
    (5) 상기 항체 약물의 서열 중에서 효소를 처리하여 획득할 수 있는 펩티드 서열과 동일하면서, 2~4개의 동위원소로 치환된 아미노산을 포함하는 펩티드인 내부 표준물질(internal standard)을 첨가하는 단계;
    (6) 상기 단계 (5) 이후에, 효소를 처리하여 자석비드에 융합된 항체 약물을 펩티드로 절단(digestion)하는 단계;
    (7) 상기 절단된 펩티드를 포함하는 상층액을 취하여, LC-TOF MS/MS를 수행하는 단계;
    (8) 상기 단계 (7)에서 수행하여 획득한 LC-TOF MS/MS 스펙트럼으로부터, 상기 절단된 펩티드에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)와 상기 내부 표준물질에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)를 측정하는 단계; 및
    (9) 0.5~100㎍/㎖의 항체 약물을 혈장에 용해하여 제조한 표준용액에 효소를 처리하여 획득한 상기 절단된 펩티드와 동일한 서열을 가지는 펩티드의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity) 및 상기 표준 용액에 첨가된 상기 내부 표준물질의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)의 비율과 상기 항체 약물 농도와의 관계로부터 작성된 2차 회귀식(quadratic regression)에 상기 단계 (8)에서 측정된 절단된 펩티드와 내부 표준물질에 대한 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)를 대입하여 항체 약물의 농도를 결정하는 단계;를 포함하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 약물은 트라스투주맙(trastzumab)인 것을 특징으로 하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 트립신(Trypsin)인 것을 특징으로 하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 절단된 펩티드는 서열번호 1 내지 8의 서열로 이루어진 펩티드 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 절단된 펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩티드이며, 내부 표준물질은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열 중에서 N 말단으로부터 4번째의 프롤린과 5번째의 발린이 동위원소로 치환된 펩티드인 것을 특징으로 하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계(9)에서 유도한 2차 회귀식은 하기 식 1인 것을 특징으로 하는 혈액 내 항체 약물의 정량 방법:
    Y = 7.55657×10-5 X2 + 0.02545 X - 0.00108 (식 1)
    (식 중, Y는 [측정하고자 하는 개체로부터 획득한 혈장에 포함된 서열번호 1로 이루어진 펩티드의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)]/[내부 표준물질의 LC-TOF MS/MS 강도(intensity)]이고,
    X는 측정하고자 하는 혈액 내의 항체 약물의 농도를 의미한다).
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113804746A (zh) * 2021-09-14 2021-12-17 上海市刑事科学技术研究院 一种对尿液中的合成卡西酮类毒品进行快速定量的方法

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