KR20210075101A

KR20210075101A - 생물학적 샘플에서의 항체 정량법

Info

Publication number: KR20210075101A
Application number: KR1020217012065A
Authority: KR
Inventors: 기리쉬 구디; 수니타 지엔; 에릭 플룰러
Original assignee: 아이크노스 사이언스 에스. 아.
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-06-22
Also published as: US20220034899A1; WO2020064865A1; AU2019348606A1; EP3856347A1; JP2022502683A; CN112955220A; MX2021003407A; IL281796A; CA3113756A1

Abstract

본 발명은 질량 분석법에 의해서 상기 항체의 고유한 특징 펩티드를 정량함으로써 생물학적 샘플에서 이중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체 치료제를 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고유한 특징 펩티드를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

생물학적 샘플에서의 항체 정량법

본 발명은 질량 분석법에 의해서 상기 항체의 고유한 특징 펩티드(signature peptide)를 정량함으로써 생물학적 샘플에서 이중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체 치료제를 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고유한 특징 펩티드를 포함하는 키트에 관한 것이다.

약물 개발에서 치료용 단클론성 항체(monoclonal antibody: mAb)의 신속한 성장으로, mAb 치료제의 정량 생물분석은 전임상 및 임상 연구를 뒷받침하는데 필수적이 되었다. 전통적으로, 약동학 분석 방법은 생물학적 매트릭스에서 단백질의 정량 분석을 위해 면역-기반 검정을 사용하였다. 면역-기반 방법은 혈청과 같은 복잡한 매트릭스에서 낮은 pg/ml 농도까지 단백질을 검출할 수 있다. 그러나 면역학적 검정은 적합한 포획 및 검출 시약의 개발을 필요로 하는데, 이는 시간 및 자원이 필요하며, 약물 발견 및 초기 개발에 적합하지 않을 수 있다.

잠재적인 장점(예를 들어, 넓은 동적 범위, 신속한 방법 개발, 특정 시약의 필요성 감소 및 복수의 단백질을 동시에 정량화할 수 있는 능력)으로 인해 최근 수 년 동안 질량 분석법(Mass spectrometry: MS)-기반 검정이 mAb 정량을 위해서 관심대상이었다. mAb를 MS로 정량하기 위해서, 이것은 먼저 혈청에서 1g/dL 초과의 내인성 인간 면역글로불린(Ig)의 매우 유사한 다클론성 배경과 구별화될 필요가 있다. 대부분의 질량 분석법 방법은 표적 mAb의 단백질분해 소화 및 전체 단백질 수준과 동등한 적어도 하나의 특징 펩티드의 정량에 의존한다. 인간 혈청에서 치료용 mAb 정량을 위한 고유한 특징 펩티드는 면역글로불린 가변 영역으로부터 유래하며, 이것은 각각의 치료용 mAb에 대한 새로운 특징 펩티드의 식별 및 후속 사용을 포함한다.

면역친화도 샘플 농축과 결합된 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(liquid chromatography-tandem mass spectrometry: LC-MS/MS)은 혈청에서 치료용(인간) mAb 정량을 위한 가장 민감한 LC-MS 검정을 달성하여, 비-영장류 포유동물 혈청에서 낮은 ng/수준(래트 혈청에서 5 ng/ml) 그리고 인간 혈청에서 100 ng/ml 초과의 정량 하한(lower limit of quantification: LLOQ)에 도달한 현재 선택된 방법이다. 이러한 감도 수준은 인간 또는 비-인간 전임상 종에서의 약동학 연구, 특히 항-CD3 이중 특이적 항체와 같이 저용량으로 투여되는 mAb에 대해서는 불충분하다.

따라서, 인간 및 비-인간 영장류 혈청에서 치료용 mAb의 정량을 위해 보다 민감한 LC-MS/MS-기반 검정이 필요하다. 다양한 mAb의 정량화를 위해서 동일한 시약(특징 펩티드)을 사용하는 고감도 LC-MS/MS 기반 검정이 가장 필요하다.

본 발명자들은 인간 혈청(50 pg/ml의 LLOQ 및 50 pg/ml 내지 5000 pg/ml의 검출/정량 범위)에서 매우 민감한 항체 검출을 가능하게 하는 질량 분석법에 의한 이중특이적 항체 정량을 위한 고유한 특징 펩티드를 식별하였다. 특징 펩티드로 얻은 감도는 항-CD3 이중특이적 항체와 같은 저용량으로 투여되는 치료용 이중특이적 항체의 전임상 및 임상 약동학 연구에 적합하다. 특징 펩티드를 선택하기 위한 표준 예측 규칙을 사용하여 식별되지 않는 특징 펩티드는, 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 포함하는 이중특이적 항체의 CH3 도메인에 위치된다. 따라서, 이러한 고유한 특징 펩티드는 특이성과 독립적으로, 상기 조작된 CH3 이종이량체를 포함하는 모든 이중특이적 항체의 고도로 민감하고 특이적인 정량에 이롭게 사용될 수 있다. 다기능성과 조합된 매우 민감하고 특이적인 항체 검출은 이러한 새로운 특징 펩티드를 전임상 및 임상 연구에서 치료 이중특이적 항체 정량화에 매우 유용한 도구로 만든다.

따라서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 이중특이적 항체를 정량하는 방법을 제공하며, 여기서 항체는 제1 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에서의 적어도 2개의 치환을 포함하여, CH3 도메인 내에 수 개의 치환을 포함하는 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 포함하고, 방법은 상기 항체의 특징 펩티드를 질량 분석법에 의해서 정량하는 단계를 포함하고, 특징 펩티드는 상기 제1 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에 상응하는 트립신소화성(tryptic) 펩티드이고, 아미노산 위치는 IGMT^® 넘버링에 따라서 제시된다.

본 발명에 따른 방법의 일부 실시형태에서, 특징 펩티드는 서열:

TX₁PPX₂LX₃SX₄GSFX₅LX₆SX₇(서열번호 1)로 이루어지고,

X₁은 T 또는 D를 나타내고, X₂는V, L, P 또는 M을 나타내고, X₃은D, Q 또는 E를 나타내고, X₄는 D 또는 Q를 나타내고, X₅는 F, A 또는 W를 나타내고, X₆은 S, W 또는 H를 나타내고, X₇은 K 또는 R을 나타내되, 단 X₁이 T인 경우, X₂, X₃, X₄, X₅ 및 X₇ 중 적어도 하나는 X₂가 L, P 또는 M이고; X₃이 Q 또는 E이고; X₄가 Q이고; X₅가 A 또는 W이고; X₇이 R이도록 한다.

일부 바람직한 실시형태에서, 특징 펩티드는 TTPPVLDSDGSFALSSK(서열번호 3), TDPPLLESDGSFALSSR(서열번호 4), TDPPLLESQGSFALSSR(서열번호 5), TTPPPLQSDGSFWLWSK(서열번호 6) 및 TTPPMLESDGSFFLHSK(서열번호 7), 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 T-세포 수용체-기반 면역글로불린 도메인 계면(interface)을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체이되, 제1 CH3 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되고, 적어도 치환 F85.1A 및 Y86S를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래되고, 적어도 치환 S20K, T22V, K26T, K79Y, K88W 및 T90N을 포함하고, 상기 위치는 IGMT^® 넘버링에 따라서 제시된다.

일부 바람직한 실시형태에서:

- 제1 CH3 도메인은 하기 치환: Q3E, Y5A, L7F, S20T, T22V, K26T, T81D, V84L, D84.2E, K88R 및 T90R; 바람직하게는 Q3E, Y5A, L7F, S20T, T22V, K26T, T81D, V84L, D84.2E, K88R 및 T90R 또는 Q3E, Y5A, L7F, S20T, T22V, K26T, T81D, V84L, D84.2E 및 K88R 중 하나 이상을 더 포함하고;

- 제2 CH3 도메인은 하기 치환: 인간 IgG1로부터의 CH3 도메인에 대해서 Q3A, D12E, L14M, N44S, V84M, F85.1S, Y86V, V101I, H115R 및 Y116F; 바람직하게는 F85.1S 및 Y86V; 또는 F85.1S, Y86V 및 Q3A 및 인간 IgG3으로부터의 CH3 도메인에 대해서 D12E, L14M, N44S, V84M, F85.1S, Y86V, V101I, H115R 및 Y116F 중 하나 이상을 더 포함한다. 이들 실시형태에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 3, 4, 5의 특징 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 서열번호 4 또는 5의 특징 펩티드를 포함한다.

일부 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG 도메인과 IgD CH3 도메인 간의 면역글로불린 도메인 계면 교환을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체를 포함하되, 제1 CH3 도메인은 치환: Q3V, Y5L, K26S, V84P, D84.2Q, F85.1W 및 Y86W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 치환: S20W, K79A, T81A, K88V 및 T90R을 포함한다. 이들 실시형태에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 6의 특징 펩티드를 포함한다.

일부 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG 도메인과 IgM CH3 도메인 간의 면역글로불린 도메인 계면 교환을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체를 포함하되, 제1 CH3 도메인은 치환: Q3D, K26T, V84M, D84.2E 및 Y86H를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 치환: S20T, K79V, T81S 및 K88I를 포함한다. 이들 실시형태에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 7의 특징 펩티드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 면역글로불린으로부터의 Fc, a Fab 및 scFv, 바람직하게는 인간 IgG, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 또는 IgG3을 포함한다.

일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 치료용 항체, 바람직하게는 이중특이적 항-CD3 항체, 보다 바람직하게는 항-CD3 및 항-Her2, 항-CD3 및 항-CD38 또는 항-CD3 및 항-EGFR 이중특이적 항체이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은,

a) 면역캡처(immunocapture)에 의해서 생물학적 샘플로부터 이중특이적 항체를 정제하는 단계,

b) 단계 a)에서 얻은 이중특이적 항체를 트립신 또는 트립신/Lys C로 소화시켜 특징 펩티드를 포함하는 펩티드를 생성시키는 단계 및

c) 단계 b)에서 얻은 펩티드를 질량 분석법에 적용하여 내부 표준품 또는 표준 곡선과 비교하여 생물학적 샘플에서 특징 펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 면역캡처는 이중특이적 항체에 특이적인 항원 또는 항체; 바람직하게는 항-아이오타입 항체, 특징 펩티드에 대한 항체 또는 이들의 조합물로 수행되고; 바람직하게는 면역캡처는 고체 지지체 상에서 또는 면역자성 분리를 사용하여; 보다 바람직하게는 비오티닐화된 항체 및 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드를 사용하여 수행된다.

일부 실시형태에서, 질량 분석법은 전자분무-이온화 Orbitrap 질량 분석법에 커플링된 2차원 나노-액체 크로마토그래피를 포함한다.

다른 실시형태에서 상이한 질량 분석법 기술이 사용된다.

일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 인간 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간 체액, 보다 바람직하게는 인간 혈청이다.

일부 실시형태에서, 이중특이적 항체의 정량 하한(LLOQ)은 50 pg/ml이고, 이중특이적 항체의 검출 범위는 인간 혈청에서 50 pg/ml 내지 5000 pg/ml이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라서 본 발명에 따른 적어도 특징 펩티드를 포함하고; 바람직하게는 상기에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체에 특이적인 항체를 더 포함하는, 생물학적 샘플에서 이중특이적 항체를 정량하는 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

특히 키트는 특징 펩티드와 동일한 서열 또는 연장된 서열을 갖는 안정적인 동위원소 표지된 내부 표준품을 포함한다.

본 발명은 생물학적 샘플에서 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 포함하는 이종특이적 항체를 정량하는 상당히 민감하고 특이적인 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 항체의 고유한 특징 펩티드를 질량 분석법에 의해서 정량하는 단계를 포함하고, 특징 펩티드는 하나의 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에 상응하는 트립신소화성 펩티드이고, 여기서 아미노산 위치는 IGMT^® 넘버링에 따라서 제시된다.

정의

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이중특이적 항체"는 2개 상이한 에피토프에 결합하는 2개 상이한 항원-결합 도메인(또는 항원-결합 아암)에 연결된 면역글로불린 Fc 이종이량체를 포함하는 항체를 지칭한다. 2개 상이한 항원-결합 도메인은 동종이량체를 형성하는 대신에, 조작된 CH3 이종이량체를 형성하는 한 쌍의 조작된 CH3 도메인을 통해서, 이종이량체화되는 2개 상이한 면역글로불린 중쇄(Hc)의 부분이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조작된 CH3 이종이량체"는 이종이량체 조립을 촉진하고, 동종이량체 형성을 방해하는 CH3 도메인의 계면에서 돌연변이를 포함하는 CH3 이종이량체를 지칭한다. CH3 이종이량체를 조작하기 위해서 당업계에 널리 공지된 다양한 기술, 예컨대, "놉스-인투-홀즈(Knobs-into-Holes)"(KiH), "가닥-교환 조작된 도메인" (SEED) 및 "면역글로불린 도메인 계면 교환"이 사용될 수 있다. 면역글로불린 도메인 계면 교환은 특히 면역글로불린(예를 들어, IgG CH3, 예컨대, IgG1 CH3 또는 IgG3 CH3)의 동종이량체 단백질-단백질 계면을 완전 이종이량체 계면(T-세포 수용체(TCR) α/β 또는 TCR γ/δ 불변 도메인 쌍) 또는 동종이량체 계면(예를 들어, IgA CH3, IgD CH3, IgGM CH4)의 절반부(half)로 교환하는 것을 포함한다. 면역글로불린 도메인 계면 교환은 국제특허 제WO 2012/131555호 및 문헌[Skegro et al., JBC, 2017, 292, 9745-9759]에 개시되어 있다. TCR-기반 면역글로불린 도메인 계면 교환 기술을 사용하여 조작된 이중특이적 항체는 T-세포 수용체를 기반으로 하는 항체에 의한 이중특이적 결속(Bispecific Engagement by 항체 based on the T-cell receptor)을 위한 BEAT^® 항체라고 지칭된다. CH3 이종이량체의 2개의 CH3 도메인은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 80% 또는 90%의 이종이량체를 형성한다. 이종이량체 형성은 당업계에 공지된 표준 검정에 의해서 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Skegro et al., JBC, 2017, 292, 9745-9759] 참고).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특징 펩티드"는 이중특이적 항체에 고유한 펩티드를 지칭하는데, 이것은 생물학적 샘플의 다른 단백질에서 발견되지 않는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 샘플"은 단백질의 혼합물을 포함하는 복합 매트릭스를 지칭한다.

아미노산 위치는 본 명세서에서 IGMT^® 넘버링을 따라서 제시된다.

특징 펩티드를 포함하는 CH3 도메인은 본 명세서에서 제1 CH3 도메인으로 지정된다.

이중특이적 항체 및 특징 펩티드

본 발명의 방법에 따라서 정량되는 이중특이적 항체는 하기 인간 IgG CH3 도메인의 80 내지 88번 위치로부터 아미노산 서열로부터 유래되는 트립신소화성 펩티드인 특징 펩티드를 포함하고:

TTPPZ₁LDSDGSFFLYSZ₂(서열번호 2),

(식 중, Z₁은 V 또는 M이고, Z₂는 K 또는 R임)

상기 특징 펩티드는 서열번호 2에 비해서 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다.

특징 펩티드는 서열번호 2에서 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 바람직하게는, 6, 7개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

특징 펩티드는 트립신소화성 펩티드이기 때문에, 항체 서열은 특징 펩티드 서열에 비해서 -1번 위치에서 라이신(K) 또는 아르기닌(R)을 포함한다.

고유한 펩티드인 특징 펩티드는 제1 CH3 도메인에서만 발견된다(즉, 제2 CH3 도메인에서가 아니다).

일부 실시형태에서, 특징 펩티드는 하기 서열로 이루어지고:

TX₁PPX₂LX₃SX₄GSFX₅LX₆SX₇(서열번호 1),

식 중, X₁은 T 또는 D를 나타내고,

X₂는 V, L, P 또는 M을 나타내고,

X₃은 D, Q 또는 E를 나타내고,

X₄는 D 또는 Q를 나타내고,

X₅는 F, A 또는 W를 나타내고,

X₆은 S, W 또는 H를 나타내고,

X₇은 K 또는 R을 나타내되,

단 X₁이 T인 경우, X₂, X₃, X₄, X₅ 및 X₇ 중 적어도 하나는 X₂가 L, P 또는 M이고; X₃이 Q 또는 E이고; X₄가 Q이고; X₅가 A 또는 W이고; X₇이 R이도록 한다. 바람직하게는, X₂, X₃, X₄, X₅ 및 X₇ 중 적어도 2개, 3개, 4개 또는 모두는 X₂가 L, P 또는 M이고; X₃이 Q 또는 E이고; X₄가 Q이고; X₅가 A 또는 W이고; X₇이 R이도록 하며; 보다 바람직하게는, X₂, X₃, X₄, X₅ 및 X₇ 중 4개 또는 모두는 X₂가 L, P 또는 M이고; X₃이 Q 또는 E이고; X₄가 Q이고; X₅가 A 또는 W이고; X₇이 R이도록 한다.

일부 보다 바람직한 실시형태에서, 특징 펩티드는 TTPPVLDSDGSFALSSK(서열번호 3), TDPPLLESDGSFALSSR(서열번호 4), TDPPLLESQGSFALSSR(서열번호 5), TTPPPLQSDGSFWLWSK(서열번호 6) 및 TTPPMLESDGSFFLHSK(서열번호 7), 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법에 따라서 정량되는 이중특이적 항체는 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 포함하는 면역글로불린 Fc 이종이량체를 포함하며, 여기서 CH3 이종이량체는 제1 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에서의 적어도 2개의 치환을 포함하여, CH3 도메인에서 수 개의 치환을 포함한다.

방법의 다양한 실시형태에서, 조작된 CH3 이종이량체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 제1 CH3 도메인은 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래되고, 보다 바람직하게는 인간 IgG1로부터 유래된다. 제2 CH3 도메인은 임의의 인간 IgG로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되고, 제2 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래된다.

방법의 다양한 실시형태에서, 조작된 CH3 이종이량체는 제1 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에서 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과의 치환, 바람직하게는, 6, 7개 또는 그 초과의 치환을 포함한다.

일부 실시형태에서, 조작된 CH3 이종이량체의 제1 CH3 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되고, 제2 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래되고, 제1 CH3 도메인은 80 내지 88번 위치에서 6, 7개 또는 그 초과의 치환을 포함한다.

일부 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 TCR-기반 면역글로불린 도메인 계면 교환(BEAT^®) 기술을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체이되, 제1 CH3 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되고, 적어도 치환 F85.1A 및 Y86S를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래되고, 적어도 치환 S20K, T22V, K26T, K79Y, K88W 및 T90N을 포함한다.

일부 보다 바람직한 실시형태에서:

- 제2 CH3 도메인은 하기 치환: 인간 IgG1로부터 유래된 CH3 도메인에 대해서 Q3A, D12E, L14M, N44S, V84M, F85.1S, Y86V, V101I, H115R 및 Y116F; 바람직하게는 F85.1S 및 Y86V; 또는 F85.1S, Y86V 및 Q3A; 및 인간 IgG3으로부터 유래된 CH3 도메인에 대해서 D12E, L14M, N44S, V84M, F85.1S, Y86V, V101I, H115R 및 Y116F 중 하나 이상을 더 포함한다.

제1 바람직한 실시형태에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 3, 4, 5의 특징 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 이중특이적 항체는 서열번호 4 또는 5의 특징 펩티드를 포함한다.

일부 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG 도메인과 IgD CH3 도메인 간의 면역글로불린 도메인 계면 교환을 사용하여 조작된 인간 IgG1 CH3 도메인 이종이량체를 포함하고, 여기서 제1 CH3 도메인은 치환: Q3V, Y5L, K26S, V84P, D84.2Q, F85.1W 및 Y86W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 치환: S20W, K79A, T81A, K88V 및 T90R을 포함한다. 이들 실시형태에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 6의 특징 펩티드를 포함한다.

일부 또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG 도메인과 IgM CH3 도메인 간의 면역글로불린 계면 교환을 사용하여 조작된 인간 IgG1 CH3 도메인 이종이량체를 포함하고, 여기서 제1 CH3 도메인은 치환: Q3D, K26T, V84M, D84.2E 및 Y86H를 포함하고, 여기서 제2 CH3 도메인은 치환: S20T, K79V, T81S 및 K88I를 포함한다. 이들 실시형태에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 7의 특징 펩티드를 포함한다.

본 발명의 방법에 따라서 정량되는 이중특이적 항체는 2개 상이한 에피토프에 결합하는 2개 상이한 항원-결합 도메인(또는 항원-결합 아암)에 연결된, 면역글로불린 Fc 이종이량체를 포함한다.

Fc 이종이량체는 적어도 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 포함한다. 그것은 보통 바람직하게는 IgG로부터, 보다 바람직하게는 인간 IgG로부터, 보다 더 바람직하게는 인간 IgG1로부터의 적어도 한 쌍의 CH2 동종이량체를 추가로 포함한다.

Fc 이종이량체는 이롭게는 2개 면역글로불린 힌지, 바람직하게는 IgG 힌지, 보다 바람직하게는 인간 IgG 힌지, 보다 더 바람직하게는 인간 IgG1 힌지를 통해서 항원-결합 아암에 연결된다.

항원-결합 아암은 면역글로불린 Fab 또는 scFv 단편, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 Fab 또는 scFv 단편일 수 있다. 이중특이적 항체는 2개의 Fab 단편, 2개의 scFv 단편 또는 1개의 Fab 단편 및 1개의 scFv 단편을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 면역글로불린으로부터의 Fc 이종이량체, Fab 및 scFv를 포함한다. Fc 이종이량체는 바람직하게는 인간 IgG1로부터 유래된다. Fc 이종이량체는 바람직하게는 IgG1 힌지, 바람직하게는 인간 IgG1 힌지를 통해서 Fab 및 scFv 각각에 연결된다.

일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 치료용 항체이다. 이중특이적 항체는 2개의 치료 표적에 지향된다. 이중특이적 항체의 치료 표적의 비제한적인 예는 CD3, CD38, Her-2, EGFR, CD20, TNFα, VEGF, CEA, IL-12, IL-23, PD-L1, PD-1, 보체 C5 등을 포함한다. 단클론성 항체에 대한 다수의 치료 표적은 당업계에 널리 공지되어 있고, 다양한 표적에 지향되는 다수의 단클론성 항체는 다양한 질환, 예컨대, 암, 자가면역, 염증 질환, 감염성 질환 등의 치료를 위해서 사용 가능하다. 이중특이적 항체는 이들 치료 표적 중 임의의 것에 지향될 수 있거나 또는 이러한 치료용 단클론성 항체 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.

일부 바람직한 실시형태에서, 치료용 이중특이적 항체는 이중특이적 항-CD3 항체, 바람직하게는 항-CD3 및 항-Her2, 항-CD3 및 항-CD38 또는 항-CD3 및 항-EGFR 이중특이적 항체이다.

생물학적 샘플 제조

생물학적 샘플은 바람직하게는 이중특이적 항체로 치료된 인간 또는 동물 공급원, 보다 바람직하게는 인간 또는 유인원 대상체, 보다 더 바람직하게는 인간 대상체로부터 유래된다. 샘플은 생물학적 조직 또는 유체, 바람직하게는 생물학적 유체, 예컨대, 비제한적으로 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 조직 생검 또는 점막 분비물(타액, 누액, 기관지 폐포 세척액 등), 보다 바람직하게는 혈장 또는 혈청이다.

샘플은 항체를 추출하고/하거나 간섭 성분을 제거하기 위해 종래의 기술을 사용하여 처리될 수 있다. 예를 들어, 고체 및/또는 조직 샘플을 균질화하고, 원심분리, 여과 및/또는 크로마토그래피 기술을 적용하여 세포 또는 조직 단편을 제거할 수 있다. 다른 경우에, 간섭 성분을 침전시키거나 이에 결합하는 것으로 공지된 시약을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 종래의 응고 기술을 사용하여 전혈을 처리하여 적혈구 및 백혈구 및 혈소판을 제거할 수 있다.

이중특이적 항체는 당업계에 공지된 단클론성 항체에 대해서 사용되는 표준 방법을 사용하여 샘플로부터 단리되거나 또는 샘플에서 풍부화(즉, 농축)될 수 있다. 이러한 방법은 샘플로부터 1종 이상의 비-이중특이적 항체 오염물을 제거하는 단계를 포함한다. 샘플은 원심분리, 여과, 한외여과, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 단백질 A/G 친화도 크로마토그래피, 친화도 정제, 침전, 겔 전기영동, 모세관 전기영동 및 화학 분별을 사용하여 풍부화 또는 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 중쇄 및/또는 경쇄는 실질적으로 단리되는데, 이것은 이중특이적 항체가 그것이 제공된 샘플로부터 적어도 부분적으로 또는 실질적으로 분리된다는 것을 의미한다. 실질적인 분리는 중량 기준으로 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%의 이중특이적 항체 또는 이의 중쇄 및/또는 경쇄를 함유하는 샘플을 포함할 수 있다. 상기에 기재된 것과 같은 단클론성 항체의 단리 방법은 당업계에서 일상적이다.

일부 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 면역캡처에 의해서 생물학적 샘플로부터 정제된다. 면역캡처는 이중특이적 항체에 특이적인 항원 또는 항체; 바람직하게는 항-아이오타입 항체, 특징 펩티드에 대한 항체 또는 이들의 조합물로 수행되고, 여기서 항-이디오타입 및 항-펩티드 항체가 연속적으로 사용된다. 이중특이적 항체가 항-CD3 항체인 경우, 면역캡처는 항-CD3 아이오타입 항체, 예를 들어, 항-OKT3 항체를 사용하여 수행된다. 면역캡처는 바람직하게는 고체 지지체 상에서 또는 면역자성 분리를 사용하여; 보다 바람직하게는 비오티닐화된 항체 및 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드를 사용하여 수행된다. 면역캡처는 당업계에 공지된 단클론성 항체에 대해서 사용되는 표준 방법을 사용하여 수행된다.

바람직하게는 면역캡처에 의한 정제 후에, 이중특이적 항체를 트립신 또는 트립신/LysC로 소화시켜 특징 펩티드를 포함하는 (트립신소화성) 펩티드를 생성시킨다. 트립신 또는 트립신/LysC 소화는 당업계에 널리 공지된 표준 방법을 사용하여 수행된다. 소화 조건(인큐베이션 시간, 온도, 트립신 대 이중특이적 항체 비)를 최적화하여 충분하고 일관적인 소화를 보장한다. 고정된 트립신 또는 트립신/lysC가 이롭게 사용된다.

이롭게는 전처리를 수행하여 이중특이적 항체의 언폴딩에 의한 소화 효능 및 완결성, 중쇄와 경쇄 간의 디설파이드 결합 감소 및 이의 재형성 방지를 개선시킨다. 이것은 이중특이적 항체를 환원제, 예컨대, DTT 및 DTE(2,3 디히드록시부탄-1,4-디티올), 티오글리콜레이트, 시스테인 설파이트, 바이설파이트, 설파이드, 바이설파이드, TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀) 및 2-머캅토에탄올 및 알킬화제, 예컨대, 아이오도아세트아미드로 처리함으로써 달성될 수 있다. 환원제로의 처리 전에 변성제, 예컨대, 우레아로의 추가 처리를 수행할 수 있다. 대안적으로, 트립신소화성 소화 공정은 소화 온도의 증가, 유기 용매의 첨가, 마이크로파-보조 소화 또는 펠릿 소화 방법에 의해서 가속화될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 TCEP 및 아이오도아세트아미드로 처리될 수 있다.

질량 분석법

샘플 제조 후, 이중특이적 항체의 트립신소화성 펩티드를 질량 분석법의 질량 분석 능력을 갖는 액체 크로마토그래피의 물리적 분리 능력과 조합된 탠덤 질량 분석법(MS) 기술(LC-MS/MS)에 적용한다. 질량 분석법 분석은 이의 질량에 기초한 하전된 종의 분리에 의존한다. 임의의 LC-MS 장비를 사용할 수 있다. LC는 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행된다. LC는 2차원-고성능 액체 크로마토그래피(2-D-HPLC), 예컨대, 2차원 나노-액체 크로마토그래피를 사용하여 이롭게 수행된다. 예를 들어, 2D Trap-Nano LC 구성을 사용할 수 있다. Trap 컬럼은 이롭게는 역상 C18 액체 크로마토그래피 HPLC 컬럼이다.

질량 분석법 검출은 사중극 질량 분석기에 커플링된 전자분무 이온화(ESI Triple Quad MS)를 사용하여 수행될 수 있다. 사중극 질량 분석기(Q)는 서로에 평행하게 설정된 4개의 원통형 막대로 이루어진다. Q는 또한 다른 다각형 막대, 예컨대, 육각형 및 팔각형뿐만 아니라 평행을 약간 벗어난 설정으로 이루어질 수 있다. 사중극 질량 분석계에서, 사중극은 질량-대-전하 비(m/z)에 기초하여 샘플 이온을 필터링하는 책임이 있는 기기의 성분이다. 임의의 ESI Triple Quad 질량 분석계를 사용할 수 있다. 고-분해능 정밀-질량 분석법(High-resolution accurate-mass spectrometry: HRMS)을 사용함으로써 개선된 감도 및 특이성을 달성할 수 있다. HRMS 장비의 예는 Orbitrap 및 Time-Of-Flight(TOF) 질량 분석계이다.

생물학적 샘플 중에서 특징 펩티드의 양은 내부 표준품(IS)과의 비교에 의해서 결정된다. 내부 표준품은 이중특이적 항체의 안정적인-동위원소-표지(SIL) 유사체, 안정적인-동위원소-표지(SIL) 특징 펩티드 또는 동일한 특징 펩티드를 포함하는 것과 같은 유사한 이중특이적 항체일 수 있다. 방법은 인간 혈청에서 이중특이적 항체의 50 pg/ml의 LLOQ(Lower Level of Quantification) 및 50 pg/ml 내지 5000 pg/ml의 검출 범위를 달성할 수 있다.

키트

본 발명은 또한 적어도 본 발명에 따른 특징 펩티드를 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 이중특이적 항체를 정량하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 키트는 본 발명에 따른 이중특이적 항체 및/또는 내부 표준품에 특이적인 항체를 추가로 포함한다.

방법의 용도

본 발명은 또한 치료용 이중특이적 항체의 약동학 연구, 특히 치료용 이중특이적 항체의 전임상 또는 임상 연구를 수행하기 위한 본 발명의 방법의 용도 및 대상체에서 치료용 이중특이적 항체를 사용하여 질환의 치료를 모니터링하기 위한 본 발명의 방법의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 HER2-양성 고형암의 치료에 사용하기 위한, T-세포 재지향 항체(redirecting antibody), 예컨대, 이중특이적 항체에 관한 것이다.

또한 본 개시내용은 환자에게 치료 유효량의 개시된 항체를 투여함으로써 HER2-양성 고형암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따라서, T-세포 재지향 항체는 BEAT® 기술(WO2012131555)에 의해서 생성된다. 본 발명의 보다 구체적인 양태에서, T-세포 재지향 항체는 세포독성 T-세포에 재지향되어 HER2 과발현 암 세포를 사멸시키는 GBR1302라고 공지된, HER2xCD3 이중특이적 항체이다. 보다 구체적으로 본 발명의 항체는 서열번호 11 내지 13의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 측면에서 T-세포 재지향 항체는 GBR1342(서열번호 14 내지 16)라고도 공지된 CD38xCD3 이중특이적 항체이다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 방법은 하기 파라미터를 사용하여 수행된다:

본 발명의 일 실시형태에서, 개시된 T 세포 재지향 항체는 HER2-양성 고형 종양의 치료를 위해서 사용된다.

본 발명의 구체적인 실시형태에서, 개시된 항체는 28일 치료 주기로 제1일 및 제15일에 1 ng/kg 내지 750 ng/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.

보다 구체적인 실시형태에서, 치료 용량은 약 1 ng/kg, 약 3 ng/kg, 약 10 ng/kg, 약 30 ng/kg, 약 60 ng/kg, 약 100 ng/kg, 약 200 ng/kg, 약 300 ng/kg, 약 500 ng/kg 및 약 750 ng/kg을 포함하는 군으로부터 선택된다.

치료제로서 개시된 항체를 사용하기 위해서, 약물 흡수, 분포, 대사 및 배설의 시간 과정을 연구하여 약물의 효능을 향상시키고, 이의 독성을 감소시키는 것이 필요하다. 총괄하여 약동학 연구라고 공지된 이러한 연구를 수행하기 위해서, 관찰된 최대 혈청 농도(C_max), 0시간에서부터 마지막 측정 가능한 농도의 시간까지의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적(AUC_last), 관찰된 최대 혈청 농도의 시간(T_max), 관찰된 마지막 혈청 농도의 시간(T_last), 혈청 제거 반감기(t_½), 마지막 측정 가능한 혈장 농도(C_last)를 비롯한 특정 파라미터가 조사를 위해서 필요하다.

본 발명의 일 양태에 따라서, 개시된 항체는,

(a) 약 30 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 0.25 ng/mL 이상 내지 약 0.45 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 10 시간*ng/mL 이상 내지 약 25 시간*ng/mL 이하이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 약 4시간 이하이고, T_last는 약 40시간 이상 내지 약 160시간 이하이고, t_1/2은 약 70시간이고, C_last는 약 0.05 ng/mL 이상 내지 약 0.15 ng/mL 이하이고;

(b) 약 60 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 0.3 ng/mL 이상 내지 약 0.9 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 1.3 시간*ng/mL 이상 내지 약 90 시간*ng/mL 이하이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 이하 약 4시간이고, T_last는 약 4시간 이상 내지 약 350시간 이하이고, t_1/2은 약 90 시간 이상 내지 약 130시간 이하이고, C_last는 약 0.05 ng/mL 이상 내지 약 0.65 ng/mL 이하이고;

(c) 약 100 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 0.5 ng/mL 이상 내지 약 3 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 25 시간*ng/mL 이상 내지 약 210 시간*ng/mL 이하이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 약 5시간 이하이고, T_last는 약 110시간 이상 내지 약 360시간 이하이고, t_1/2은 약 80시간 이상 내지 약 130시간 이하이고, C_last는 약 0.05 ng/mL 이상 내지 약 0.2 ng/mL 이하이고;

(d) 약 200 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 0.9 ng/mL 이상 내지 약 2.5 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 74 시간*ng/mL 이상 내지 약 230 시간*ng/mL 이하이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 약 7시간 이하이고, T_last는 약 140시간 이상 내지 약 340시간 이하이고, t_1/2은 약 80시간 이상 내지 약 130시간 이하이고, C_last는 약 0.05 ng/mL 이상 내지 약 0.3 ng/mL 이하이고;

(e) 약 300 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 2 ng/mL 이상 내지 약 4.5 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 9 시간*ng/mL 이상 내지 약 330 시간*ng/mL 이하이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 약 6시간 이하이고, T_last는 약 4시간 이상 내지 약 540시간 이하이고, t_1/2은 약 80시간 이상 내지 약 120시간 이하이고, C_last는 약 0.08 ng/mL 이상 내지 약 2.4 ng/mL 이하이고;

(f) 약 500 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 2.5 ng/mL 이상 내지 약 8 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 160 시간*ng/mL 이상 내지 약 760 시간*ng/mL 이하이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 약 11시간 이하이고, T_last는 약 48시간 이상 내지 약 500시간 이하이고, t_1/2은 약 100시간 이상 내지 약 150시간 이하이고, C_last는 약 0.1 ng/mL 이상 내지 약 2 ng/mL 이하이고;

(g) 약 7,5 ng/kg의 용량으로 투여되고, C_max는 약 7.5 ng/mL 이상 내지 약 17 ng/mL 이하이고, AUC_last는 약 240 시간*ng/mL 이상 내지 약 1100 시간*ng/mL이고, T_max는 약 1시간 이상 내지 약 6시간 이하이고, T_last는 약 40시간 이상 내지 약 340시간 이하이고, t_1/2은 약 100시간 이상 내지 약 160시간 이하이고, C_last는 약 0.35 ng/mL 이상 내지 약 3.5 ng/mL 이하이다.

본 발명의 일 양태에 따라서, T 세포 재지향 항체는 HER2의 과발현을 특징으로 하는 암, 특히 유방암, 난소암, 방광암, 침샘암, 자궁내막암, 췌장암 및 비소세포폐암(non-small-cell lung cancer: NSCLC)의 치료에 적합하다. 본 발명의 가장 선호되는 양태에서, HER2-양성 암은 유방암이다.

도면 설명

- 도 1은 GBR 1302 트립신소화성 소화물의 LC-HRMS/MS 프로파일을 나타낸다.

A. m/z 896.44(M+2H)²⁺를 갖는 펩티드 TDPPLLESDGSFALSSR(서열번호 4)를 나타내는 GBR 1302 트립신소화성 소화물 B. m/z 615.31(M+2H)²⁺를 갖는 펩티드 EPEVATFPPSR(서열번호 10)을 나타내는 GBR 1302 트립신소화성 소화물. C. 인간 혈청 블랭크.

- 도 2는 LC-HRMS/MS에 의한 인간 혈청에서의 GBR 1302 정량을 나타낸다.

- 도 3은 LC-HRMS/MS에 의한 원숭이 혈청에서의 GBR 1342 정량을 나타낸다.

- 도 4: GBR1302에 대한 기하 평균 혈청 프로파일.

실시예

물질 및 방법

1. 물질

- 이중특이적 항체

- GBR 1302: 항-CD3/항-Her2 인간 IgG1 BEAT® 이중특이적 항체

- GBR 1342: 항-CD3/항-CD38 인간 IgG1 BEAT® 이중특이적 항체

- GBR 1372: 항-CD3/항-EGFR 인간 IgG1 BEAT® 이중특이적 항체

- 내부 표준품

- GBR 1302 IS: 안정적인 동위원소 표지된(SIL) 특징 펩티드 서열번호 4(m/z 901.44 (M+2H)²+). 작업 용액 30:70 ACN:물 중의 100 pg/mL

- GBR 1342 IS: 안정적인 동위원소 표지된(SIL) 특징 펩티드 서열번호 5(m/z 907.96 (M+2H)²⁺); 작업 용액 30:70 ACN:물 중의 100 pg/mL

- 시약

- 생물학적 매트릭스: 인간 또는 원숭이 혈청

- 스트렙타비딘 비드(DynaBeads 스트렙타비딘 T1, p/n 650-02, Invitrogen)

- 비오티닐화된 OKT3 항체(Abpro 및 인하우스)

- 비오티닐화된 9G7 항체(Abpro 및 인하우스)

- 비오티닐화된 SP34 항체(Bio-rad 및 인하우스)

- TCEP 환원 용액(물 중의 75 mM TCEP, 새로 제조됨)

- 아이오도아세트아미드 알킬화(Iodoacetamide Alkylation: IAA) 용액(물 중의 150 mM IAA, 새로 제조됨)

- 트립신 용액(물 중의 트립신 Gold(PROMEGA) 50 μg/mL; 새로 제조됨)

- 아세토니트릴(ACN) 용액: 30:70 ACN:물

- PBS/BSA : 10 mM PBS 중의 0.1% BSA

- TrisHCl, 1M, pH 8.3

- HCl 30 mM

- 교정 표준품 및 품질 대조군(QC) 샘플

- QC 샘플: 생물학적 매트릭스 중의 이중특이적 항체 50, 150, 300, 750, 4000 pg/mL

- 표준품: STD1 내지 STD8: 생물학적 매트릭스 중의 이중특이적 항체 50, 75, 100, 250, 500, 1000, 3000 및 5000 pg/mL

2. 방법

2.1 샘플 제조

PBS-BSA 중의 샘플, 품질 대조군, 표준품, 제로 샘플 및 블랭크를 플레이트 A의 웰에 분포시키고, 이어서, 비오티닐화된 항체(2 μg)를 첨가하고, 플레이트 A를 진탕하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨다. 이어서, 스트렙타비딘 T1 비드를 웰에 첨가하고, 플레이트 A를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 비오티닐화된-항체 포획된 분석물을 결합시킨다. 이어서 비드를 자석 스탠드 상에 놓인 수집 플레이트(플레이트 B)로 옮기고, CHAP 완충액으로 2회 그리고 PBS 완충액으로 2회 세척한다. 30 mM의 HCl을 플레이트 B에 첨가하고, 3분 동안 혼합하고, 용리물을 1 M Tris pH 8.3을 함유하는 플레이트 C로 옮김으로써 항체 용리를 수행하고; 용리 단계를 반복한다.

내부 표준품을 플레이트 C의 샘플, 품질 대조군, 표준품 및 제로 샘플에 첨가한다. 30:70 ACN:물을 플레이트 C의 대조군 블랭크에 첨가한다. 75 mM의 TCEP를 각각의 웰에 첨가하고, 1분 동안 혼합한 후, 플레이트를 56℃에서 45분 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 RT로 10분 동안 냉각한다. 150 mM의 IAA를 각각의 웰에 첨가하고, 1분 동안 혼합한 후, 플레이트를 RT에서 35분 동안 암실에서 인큐베이션시킨다. 트립신(50 μg/mL)을 각각의 웰에 첨가하고, 1분 동안 혼합한 후, 진탕하면서 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨다.

2.3 크로마토그래피

체류 시간: GBR 1302 4.40 ± 1.0분

GBR 1302-IS 4.40 ± 1.0분

GBR 1342 4.10 ± 1.0분

GBR 1342-IS 4.10 ± 1.0분

Thermo QE 및 Dionex ultimate 3000 RSLC nano LC가 Thermo Easy-Spray 공급원과 함께 커플링된 2D Trap-Nano LC Configuration을 사용하여 방법을 수행한다. 먼저 로딩 펌프에 의해서 샘플을 트랩 컬럼 상에 로딩하고, 그 다음 나노 펌프에 의해서 600 nL/분의 유량으로 작동되는 nanoLC 컬럼으로 교체한다. 루프 내에 코일형으로 감긴 분석 컬럼을 선형 리스트릭터 에미터(restrictor emitter)와 친밀하게 커플링한다. 트랩 컬럼 및 분석 컬럼 둘 다를 고순도 유기 용매로 세척하여 나노 펌프 및 마이크로펌프에 의해서 상당히 잔류하는 내인성 성분을 용리시킨다.

2.4 질량 분석법

MS 획득 시간: GRB1302 및 GRB1302 IS: 4.1분 내지 5.1분

GRB1342 및 GRB1342 IS: 4분 내지 5분

실시예 1 : 인간 또는 비-인간 영장류 혈청에서 이중특이적 항체 정량을 위한 고유한 특징 펩티드의 식별

제1 접근법에서, 인간 혈청에서 이중특이적 항체를 정량하기 위한 잠재적인 특징 펩티드를 선택을 위한 표준 규칙을 사용하여 선택하였다: 6 내지 15 aa; 화학 반응성 잔류물(트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C)) 존재하지 않음; 2R, 2K 및 RK 포함하지 않음; 잠재적인 PTM(타이로신(Y), 트레오닌(T), 세린(S), 라이신(K)) 존재하지 않음; 바람직하게는 프롤린(P) 함유; P 근접한 R(잠재적인 누락된 트립신소화성 절단). 이러한 규칙에 기초하여, 15개의 특징 펩티드(SP)를 GBR 1302로 스파이킹된 인간 혈청에서 선택하였다. 2개 펩티드 LYSGVPSR(서열번호 8) 및 FTISADTSK(서열번호 9)를 질량 반응 강도에 기초하여 최적화를 위해서 선택하였다. 선택된 특징 펩티드는 블랭크 인간 혈청뿐만 아니라 GBR 1302 스파이킹된 인간 혈청 샘플에 존재하였는데, 이는 이것이 GBR 1302에 특이적이지 않음을 시사하였다.

제2 접근법에서, 소프트웨어 Expasy 펩티드 커터(http://web.expasy.org/peptide_cutter/)를 사용하여 GBR 1302, GBR 1342 및 GBR 1372 이중특이적 항체의 트립신 소화에 의해서 생성된 펩티드를 추정하였다. 이어서 생성된 트립신소화성 펩티드 서열을 인간 혈장 프로테옴(NCBI BLAST)과 비교하여 이중특이적 항체에 고유하지 않은 펩티드(혈장 프로테옴에 존재함)를 제외시켰다.

2개긔 고유한 특징 펩티드가 GBR 1302 트립신소화성 소화물의 LC-HRMS/MS 프로파일에서 발견되었다: m/z 896.44(M+2H)²⁺를 갖는 TDPPLLESDGSFALSSR(서열번호 4) 및 m/z 615.31 (M+2H)²⁺를 갖는 EPEVATFPPSR(서열번호 10)(도 1a 및 도 1b). 이들은 GBR 1302에 대해서 고유하였지만, 블랭크 인간 혈청 및 트라스투주맙에는 존재하지 않음이 관찰되었다(도 1c).

또한 두 펩티드 모두는 면역글로불린 도메인 계면 교환 기술에 의해서 생성된 이중특이적 항체 모두에 존재하는 조작된 CH3 이종이량체에 배치되었다는 것이 관찰되었다. 서열번호 4의 SP는 IGMT 넘버링에 따라서 IgG CH3 도메인의 80번 내지 88번 위치에 배치된다. 서열번호 10의 SP는 IGMT 넘버링에 따라서 IgG CH3 도메인의 1번 내지 11번 위치에 배치된다.

질량 반응 강도에 기초하여, 특징 펩티드 TDPPLLESDGSFALSSR(서열번호 4)을 이중특이적 항체 정량을 위해서 선택하였다.

GBR 1372는 GBR 1302와 동일한 Fc 이종이량체를 포함한다. 동일한 고유한 특징 펩티드(서열번호 4)를 GBR 1372 트립신소화성 소화물의 LC-HRMS/MS 프로파일에서 발견하였다.

GBR 1342는 D84.4Q 치환에 의해서 GBR 1302 및 GBR 1372의 것과 상이한 Fc 이종이량체를 포함한다. m/z 902.96 (M+2H)²⁺를 갖는 상응하는 특징 펩티드 TDPPLLESQGSFALSSR(서열번호 5)을 GBR 1342 트립신소화성 소화물의 LC-HRMS/MS 프로파일에서 발견하였다.

이러한 결과는, 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체의 하나의 CH3 도메인의 80번 내지 88번 위치의 특징 펩티드가 고유한 특징 펩티드이며, 이것이 인간 혈청에서 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 갖는 모든 이중특이적 항체의 정량을 위해서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2 : 인간 또는 원숭이 혈청에서 이중특이적 항체 정량을 위한 고감도 LC-HRMS/MS 검정

인간 또는 비-인간 영장류 혈청에서 이중특이적 항체 정량을 위해서 실시예 1에서 식별된 고유한 특징 펩티드의 검출에 기초한 LC-HRMS/MS 검정을 개발하였다. 특징 펩티드 서열번호 4의 MS 분석에 기초하여 인간 혈청에서 GBR 1302를 정량하였다. 특징 펩티드 서열번호 5의 MS 분석에 기초하여 원숭이 혈청에서 GBR 1342를 정량하였다. 검정 단계는 물질 및 방법 섹션에 상세하게 개시되어 있다. 약술하자면, 인간 또는 원숭이 혈청에 스파이킹된 이중특이적 항체를 비오티닐화된 항-아이오타입 항체 및 스트렙타비딘 코팅된 면역자성 비드를 사용하여 면역정제하였다. 이중특이적 항체 내부 표준품(IS; 안정적인-동위원소-표지된(SIL) 특징 펩티드)를 면역정제된 이중특이적 항체에 첨가한 후, TCEP 및 아이오도아세트아미드 및 트립신 소화로 전처리하였다. 이어서 트립신 소화물을 Thermo Q-Exactive Orbitrap 질량 분석계를 사용하여 2D Trap-Nano LC-Nano ESI MS/MS에 적용하였다.

인간 혈청에서 GBR 1302 정량

8개의 표준품(STD1 내지 STD8: 50, 75, 100, 250, 500, 1000, 3000 및 5000 pg/mL)을 사용하여 R² = (0.9978)의 평균 상관 계수로 선형 교정 곡선을 확립하였다. 교정 곡선은 2차의 선형이었고, LLOQ는 50 pg/mL였다(도 2). 이 실험에서 생성된 선형 회귀 곡선을 사용하여 유래된 GBR 1302 농도는 (97.8 내지 100.9%) 및 9.4 미만의 % CV(비정밀)를 나타내었다(도 2 및 표 1).

원숭이 혈청에서 GBR 1342 정량

8개의 표준품(STD1 내지 STD8: 50, 75, 100, 250, 500, 1000, 3000 및 5000 pg/mL)을 사용하여 R² = (0.9966)의 평균 상관 계수로 선형 교정 곡선을 확립하였다. 교정 곡선은 두 자릿수에 대해서 선형이었고, LLOQ는 50 pg/mL였다(도 3). 이 실험에서 생성된 선형 회귀 곡선을 사용하여 유래된 GBR 1342 농도는 (94.3 내지 101.8%) 및 5.7 미만의 % CV(비정밀)를 나타내었다(도 3 및 표 2).

이들 결과는, 본 발명에 따른 LC-HRMS/MS 검정이 인간 및 비-인간 영장류 혈청에서 이중특이적 항체 정량을 고감도(100 pg/mL의 LLOQ), 넓은 범위의 검출(두 자릿수, 50 pg/mL to 5000 pg/mL) 및 양호한 정확성 및 정밀성으로 달성할 수 있다는 것을 나타낸다. 결론적으로, 본 발명에 따른 LC-HRMS/MS 검정은 이중특이적 항체 치료제의 전임상 및 임상 연구에 대한 매우 성능 기준에 맞는 검정이다.

실시예 3: 공격적 HER2-양성 고형 종양을 갖는 환자에서 GBR1302의 약동학 연구

물질 및 방법

표준 또는 치유적 치료가 사용 가능하지 않는 공격성 HER2-양성 고형 종양을 갖는 성인에서 GBR1302의 약동학을 평가하기 위해서, 1상 인간 최초 공개 다기관 용량 증가 연구(phase 1, first-in-human, open-label, multicenter, dose-escalation study)를 수행하였다. 대상체에게 정맥내 GBR 1302를 1 ng/kg에서 시작하여, 증가하는 용량 수준으로 28일 치료 주기로 제1일 및 제15일에 제공하였다. 첫 번째 4개의 코호트는 단일 대상체로 이루어졌고; 후속 코호트는 3+3 설계를 사용하여 등록한다. 혈액 샘플을 약동학(PK) 및 항-약물 항체(ADA) 분석(2차 평가변수(secondary endpoint))을 위해서 수집하였다. GBR 1302 혈청 농도의 정량(PK를 위해서) 및 항 GBR 1302 항체의 검출/확인(면역원성을 위해서)을 각각 검증된 LC/MS/MS 및 ELISA 방법을 사용하여 수행하였다. 표준 비-구획 방법을 사용하여 PK 파라미터를 평가하였다.

하기 PK 파라미터를 추정하였다:

- 관찰된 최대 혈청 농도(C_max)

- 0시간에서부터 마지막 측정 가능한 농도의 시간까지의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적(AUC_last)

- 관찰된 최대 혈청 농도의 시간(T_max)

- 관찰된 마지막 혈청 농도의 시간(T_last)

- 혈청 제거 반감기(t_½)

- 마지막 측정 가능한 혈장 농도(C_last)

면역원성을 평가하기 위해서 항약물 항체(antidrug antibody: ADA) 반응을 측정하였다.

결과:

GBR1302의 약동학을 표 3 및 표 4 및 도 4에 제시된 바와 같이 31명의 대상체에서 1 ng/kg 내지 750 ng/kg의 용량 범위에 걸쳐서 연구하였다.

혈청 농도는 제1 용량(1 ng/kg)에서 50 pg/mL의 정량 하한보다 낮았고, 3 및 10 ng/kg 용량 수준에서 단지 일시적인 농도가 관찰되었다. 평가 가능한 PK 프로파일이 30 ng/kg 이후부터 관찰하였다. GBR 1302는 주입 마지막 근처에 최대 혈장 농도(C_max)를 나타내었고, 그 후 혈청 농도는 대략 4 내지 7일의 평균 최종 반감기로 이중 지수적으로(bi-exponentially) 감소되었다. C_max 및 곡선 하 면적(AUC_0-t)은 750 ng/kg(최대 평가된 용량)까지 대략 용량-비례적인 증가를 나타내었다. 코호트 5까지 대상체로부터 수집된 샘플 중 어느 것도 양성 ADA 반응을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 유리한 선형 PK를 나타내며, 지금까지 평가된 대상체 중 누구도 양성 ADA 반응을 나타내지 않았다.

SEQUENCE LISTING <110> Glenmark Pharmaceuticals SA Glenmark Pharmaceuticals S.A. <120> ANTIBODY QUANTIFICATION IN BIOLOGICAL SAMPLES <130> GBT4001 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signature peptide 1 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> T D <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> V, L, P or M <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> D, Q or E <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> D or Q <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> F, A or W <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> S, W or H <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> K or R <400> 1 Thr Xaa Pro Pro Xaa Leu Xaa Ser Xaa Gly Ser Phe Xaa Leu Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signature peptide 2 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> V or M <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> K or R <400> 2 Thr Thr Pro Pro Xaa Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 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Claims

생물학적 샘플에서 이중특이적 항체를 정량하는 방법으로서, 항체는 제1 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에서의 적어도 2개의 치환을 포함하여, CH3 도메인 내에 수 개의 치환을 포함하는 조작된 인간 IgG CH3 이종이량체를 포함하되, 방법은 상기 항체의 특징 펩티드(signature peptide)를 질량 분석법에 의해서 정량하는 단계를 포함하고, 특징 펩티드는 상기 제1 CH3 도메인의 80 내지 88번 위치에 상응하는 트립신소화성(tryptic) 펩티드이고, 아미노산 위치는 IGMT^® 넘버링에 따라서 제시되는, 방법.
제1항에 있어서, 특징 펩티드는 서열:
TX₁PPX₂LX₃SX₄GSFX₅LX₆SX₇(서열번호 1)로 이루어지고,
X₁은 T 또는 D를 나타내고, X₂는 V, L, P 또는 M을 나타내고, X₃은D, Q 또는 E를 나타내고, X₄는 D 또는 Q를 나타내고, X₅는 F, A 또는 W를 나타내고, X₆은 S, W 또는 H를 나타내고, X₇은 K 또는 R을 나타내되, 단 X₁이 T인 경우, X₂, X₃, X₄, X₅ 및 X₇ 중 적어도 하나는 X₂가 L, P 또는 M이고; X₃이 Q 또는 E이고; X₄가 Q이고; X₅가 A 또는 W이고; X₇이 R이도록 하는, 방법.
제2항에 있어서, 특징 펩티드는 TTPPVLDSDGSFALSSK(서열번호 3), TDPPLLESDGSFALSSR(서열번호 4), TDPPLLESQGSFALSSR(서열번호 5), TTPPPLQSDGSFWLWSK(서열번호 6) 및 TTPPMLESDGSFFLHSK(서열번호 7), 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 T-세포 수용체-기반 면역글로불린 도메인 계면(interface)을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체이되, 제1 CH3 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되고, 적어도 치환 F85.1A 및 Y86S를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래되고, 적어도 치환 S20K, T22V, K26T, K79Y, K88W 및 T90N을 포함하고, 상기 위치는 IGMT^® 넘버링에 따라서 제시되는, 방법.
제4항에 있어서,
- 제1 CH3 도메인은 하기 치환: Q3E, Y5A, L7F, S20T, T22V, K26T, T81D, V84L, D84.2E, K88R 및 T90R; 바람직하게는 Q3E, Y5A, L7F, S20T, T22V, K26T, T81D, V84L, D84.2E, K88R 및 T90R 또는 Q3E, Y5A, L7F, S20T, T22V, K26T, T81D, V84L, D84.2E 및 K88R 중 하나 이상을 더 포함하고;
- 제2 CH3 도메인은 하기 치환: 인간 IgG1로부터의 CH3 도메인에 대해서 Q3A, D12E, L14M, N44S, V84M, F85.1S, Y86V, V101I, H115R 및 Y116F; 바람직하게는 F85.1S 및 Y86V; F85.1S, Y86V 및 Q3A 및 인간 IgG3으로부터의 CH3 도메인에 대해서 D12E, L14M, N44S, V84M, F85.1S, Y86V, V101I, H115R 및 Y116F 중 하나 이상을 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 IgG 도메인과 IgD CH3 도메인 간의 면역글로불린 도메인 계면 교환을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체를 포함하되, 제1 CH3 도메인은 치환: Q3V, Y5L, K26S, V84P, D84.2Q, F85.1W 및 Y86W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 치환: S20W, K79A, T81A, K88V 및 T90R을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 IgG 도메인과 IgM CH3 도메인 간의 면역글로불린 도메인 계면 교환을 사용하여 조작된 인간 IgG CH3 도메인 이종이량체를 포함하되, 제1 CH3 도메인은 치환: Q3D, K26T, V84M, D84.2E 및 Y86H를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 치환: S20T, K79V, T81S 및 K88I를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 인간 면역글로불린으로부터의 Fc, a Fab 및 scFv를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 치료용 항체인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 이중특이적 항-CD3 항체, 바람직하게는 항-CD3 및 항-Her2, 항-CD3 및 항-CD38 또는 항-CD3 및 항-EGFR 이중특이적 항체인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 면역캡처(immunocapture)에 의해서 생물학적 샘플로부터 이중특이적 항체를 정제하는 단계,
b) 단계 a)에서 얻은 이중특이적 항체를 트립신 또는 트립신/Lys C로 소화시켜 특징 펩티드를 포함하는 펩티드를 생성시키는 단계 및
c) 단계 b)에서 얻은 펩티드를 질량 분석법에 적용하여 내부 표준품과 비교하거나 교정 표준품을 사용하여 생물학정 샘플에서 특징 펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 면역캡처는 이중특이적 항체에 특이적인 항체; 바람직하게는 항-아이오타입 항체, 특징 펩티드에 대한 항체 또는 이들의 조합물로 수행되고; 바람직하게는 면역캡처는 고체 지지체 상에서 또는 면역자성 분리를 사용하여; 보다 바람직하게는 비오티닐화된 항체 및 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드를 사용하여 수행되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분석법은 전자분무-이온화 Orbitrap 질량 분석법에 커플링된 2차원 나노-액체 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 인간 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간 체액, 보다 바람직하게는 인간 혈청인, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 정량 하한은 50 pg/ml이고, 이중특이적 항체의 검출 범위는 인간 혈청에서 50 pg/ml 내지 5000 pg/ml인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 이중특이적 항체를 정량하는 키트로서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 특징 펩티드를 포함하고; 바람직하게는 제12항에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체에 특이적인 항체를 더 포함하는, 키트.