JP2022502683A - 生体試料中の抗体の定量化 - Google Patents

Abstract

本発明は、生体試料中の二重特異性抗体、特に二重特異性抗体治療薬を、質量分析によって前記抗体の独特のシグネチャーペプチドを定量化することによって、定量化するための方法に関する。本発明はまた、独特のシグネチャーペプチドを含むキットに関する。【選択図】図４

Description

本発明は、生体試料中の二重特異性抗体、特に二重特異性抗体治療薬を定量化するため、質量分析によって前述抗体の独特のシグネチャーペプチドを定量化することによる方法に関する。本発明はまた、独特のシグネチャーペプチドを含むキットに関する。

医薬品開発における治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の急速な成長に伴い、ｍＡｂ治療薬の定量的バイオアナリシスは、前臨床試験および臨床試験をサポートするために必須となっている。伝統的に、薬物動態分析法では、生体マトリックス中のタンパク質の定量分析のために免疫学に基づくアッセイが用いられている。免疫学に基づく方法では、血清などの複雑なマトリックス中のタンパク質を、低ｐｇ／ｍＬ濃度まで検出できる。しかし、免疫学的アッセイでは、適切な捕捉試薬および検出試薬の開発が必要であり、これには時間とリソースを要し、創薬および初期開発では手頃な価格ではない可能性がある。

それらの潜在的な利点（例えば、広いダイナミックレンジ、迅速な方法開発、特定の試薬の必要性の減少、および複数のタンパク質を同時に定量化する能力）により、近年、質量分析（ＭＳ）ベースのアッセイではｍＡｂ定量化に関心が高まっている。ＭＳにより定量化するｍＡｂは、まず、血清中１ｇ／ｄＬを超える内因性ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）という非常に類似したポリクローナルバックグラウンドと区別する必要がある。ほとんどの質量分析法は、標的ｍＡｂのタンパク質消化と、全タンパク質のレベルに相当する少なくとも１つの独特のシグネチャーペプチドの定量とに依存する。ヒト血清中の治療用ｍＡｂ定量化のための独特のシグネチャーペプチドは、免疫グロブリン可変領域に由来する。これは、各治療用ｍＡｂの新しいシグネチャーペプチドの同定とその後の使用に関わる。

液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と免疫親和性試料濃縮を組み合わせることは、血清中の治療用（ヒト）ｍＡｂ定量化のための最も感度の高いＬＣ−ＭＳアッセイを達成するために選択する現在の方法であり、非霊長類哺乳動物血清では低ｎｇ／レベル（ラット血清では５ｎｇ／ｍＬ）で、ヒト血清では１００ｎｇ／ｍＬより高い、定量化の下限（ＬＬＯＱ）に達する。このレベルの感度は、ヒトまたは非ヒト前臨床種の薬物動態試験の場合、特に抗ＣＤ３二重特異性抗体などの低用量で投与されるｍＡｂには不十分である。

したがって、ヒトおよび非ヒト霊長類血清中の治療用ｍＡｂの定量化のためのより感度の高いＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのアッセイが必要である。様々なｍＡｂの定量化ために同じ試薬（シグネチャーペプチド）を使用する高感度ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのアッセイが最も望まれる。

本発明者らは、質量分析による二重特異性抗体定量化のための独特のシグネチャーペプチドを同定し、これにより、ヒト血清中の高感度抗体検出（５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱおよび５０ｐｇ／ｍＬ〜５０００ｐｇ／ｍＬの検出／定量範囲）が可能になる。シグネチャーペプチドで得られる感度は、抗ＣＤ３二重特異性抗体などの低用量で投与される治療用二重特異性抗体の前臨床および臨床の薬物動態試験に適している。シグネチャーペプチドを選択するための標準的な予測ルールを使用して同定されなかったシグネチャーペプチドは、遺伝子操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を含む二重特異性抗体のＣＨ３ドメインに位置している。したがって、この独特のシグネチャーペプチドは、それらの特異性とは無関係に、前記操作されたＣＨ３ヘテロ二量体を含むすべての二重特異性抗体の高感度で特異的な定量化に有利に使用することができる。多用途性と組み合わされた高感度で特異的な抗体検出により、この新しいシグネチャーペプチドは、前臨床試験および臨床試験における治療用二重特異性抗体の定量化のための非常に有用なツールになる。

したがって、本発明は、生体試料中の二重特異性抗体を定量化するための方法であって、この抗体が、第１のＣＨ３ドメインの８０位〜８８位の少なくとも２つの置換を含むＣＨ３ドメインにおけるいくつかの置換を含む操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を含み、この方法が、質量分析によって前記抗体のシグネチャーペプチドを定量化することを含み、このシグネチャーペプチドが、前記第１のＣＨ３ドメインの８０位〜８８位に対応するトリプシンペプチドであり、アミノ酸位置はＩＧＭＴ（登録商標）の番号付けに従って示される、方法を提供する。

本発明による方法のいくつかの実施形態において、シグネチャーペプチドは、以下の配列からなり、
ＴＸ_１ＰＰＸ_２ＬＸ_３ＳＸ_４ＧＳＦＸ_５ＬＸ_６ＳＸ_７（配列番号１）
式中、Ｘ_１は、ＴまたはＤを表し、Ｘ_２は、Ｖ、Ｌ、ＰまたはＭを表し、Ｘ_３は、Ｄ、ＱまたはＥを表し、Ｘ_４は、ＤまたはＱを表し、Ｘ_５は、Ｆ、ＡまたはＷを表し、Ｘ_６は、Ｓ、ＷまたはＨを表し、Ｘ_７は、ＫまたはＲを表すが、ただし、Ｘ_１がＴの場合、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_７のうちの少なくとも１つは、Ｘ_２がＬ、ＰまたはＭであり、Ｘ_３がＱまたはＥであり、Ｘ_４がＱであり、Ｘ_５がＡまたはＷであり、Ｘ_７がＲであることを条件とする。

いくつかの好ましい実施形態において、シグネチャーペプチドは、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＳＳＫ（配列番号３）、ＴＤＰＰＬＬＥＳＤＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号４）、ＴＤＰＰＬＬＥＳＱＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号５）、ＴＴＰＰＰＬＱＳＤＧＳＦＷＬＷＳＫ（配列番号６）、およびＴＴＰＰＭＬＥＳＤＧＳＦＦＬＨＳＫ（配列番号７）からなる群、好ましくは配列番号４または配列番号５から選択される。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、Ｔ細胞受容体ベースの免疫グロブリンドメインインターフェースを使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、第１のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１に由来し、少なくともＦ８５．１ＡおよびＹ８６Ｓの置換を含み、第２のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３に由来し、少なくともＳ２０Ｋ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｋ７９Ｙ、Ｋ８８ＷおよびＴ９０Ｎの置換を含み、前記位置はＩＧＭＴ（登録商標）番号付けに従って示される。

いくつかの好ましい実施形態において、
−第１のＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｑ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２Ｅ、Ｋ８８ＲおよびＴ９０Ｒのうちの１つ以上、好ましくは、Ｑ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２Ｅ、Ｋ８８ＲおよびＴ９０Ｒ、またはＱ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２ＥおよびＫ８８Ｒをさらに含み、
−第２のＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｑ３Ａ、Ｄ１２Ｅ、Ｌ１４Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｖ８４Ｍ、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６Ｖ、Ｖ１０１Ｉ、Ｈ１１５ＲおよびＹ１１６Ｆのうちの１つ以上、好ましくは、Ｆ８５．１ＳおよびＹ８６Ｖ、またはヒトＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインの場合はＦ８５．１Ｓ、Ｙ８６ＶおよびＱ３Ａ、ならびにヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメインの場合はＤ１２Ｅ、Ｌ１４Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｖ８４Ｍ、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６Ｖ、Ｖ１０１Ｉ、Ｈ１１５ＲおよびＹ１１６Ｆをさらに含む。これらの実施形態による二重特異性抗体は、配列番号３、４、５のシグネチャーペプチドを含む。好ましくは、二重特異性抗体は、配列番号４または５のシグネチャーペプチドを含む。

いくつかの他の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインとＩｇＤのＣＨ３ドメインとの間の免疫グロブリンドメインインターフェース交換を使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、第１のＣＨ３ドメインが、Ｑ３Ｖ、Ｙ５Ｌ、Ｋ２６Ｓ、Ｖ８４Ｐ、Ｄ８４．２Ｑ、Ｆ８５．１ＷおよびＹ８６Ｗの置換を含み、第２のＣＨ３ドメインが、Ｓ２０Ｗ、Ｋ７９Ａ、Ｔ８１Ａ、Ｋ８８Ｖ、およびＴ９０Ｒの置換を含む。これらの実施形態による二重特異性抗体は、配列番号６のシグネチャーペプチドを含む。

いくつかの他の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインとＩｇＭのＣＨ３ドメインとの間の免疫グロブリンドメインインターフェース交換を使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、第１のＣＨ３ドメインが、Ｑ３Ｄ、Ｋ２６Ｔ、Ｖ８４Ｍ、Ｄ８４．２ＥおよびＹ８６Ｈの置換を含み、第２のＣＨ３ドメインが、Ｓ２０Ｔ、Ｋ７９Ｖ、Ｔ８１Ｓ、およびＫ８８Ｉの置換を含む。これらの実施形態による二重特異性抗体は、配列番号７のシグネチャーペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ヒト免疫グロブリン、好ましくはヒトＩｇＧ、より好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３由来のＦｃ、ＦａｂおよびｓｃＦｖを含む。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、治療用抗体、好ましくは二重特異性抗ＣＤ３抗体、より好ましくは抗ＣＤ３および抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ３８、または抗ＣＤ３および抗ＥＧＦＲの二重特異性抗体である。

いくつかの実施形態において、本発明による方法は、
ａ）免疫捕捉によって生体試料から二重特異性抗体を精製するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた二重特異性抗体をトリプシンまたはトリプシン／Ｌｙｓ−Ｃで消化して、シグネチャーペプチドを含むペプチドを生成するステップと、
ｃ）ステップｂ）で得られたペプチドを質量分析にかけ、内部標準または標準曲線との比較により、生体試料中のシグネチャーペプチドの量を決定するステップとを含む。

いくつかの好ましい実施形態において、免疫捕捉は、二重特異性抗体に特異的な抗原または抗体、好ましくは、抗イディオタイプ抗体、シグネチャーペプチドに対する抗体、またはそれらの組み合わせを用いて行われ、好ましくは、免疫捕捉は、固体支持体上で、または免疫磁気分離法を使用して、より好ましくは、ビオチン化抗体およびストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して行われる。

いくつかの実施形態において、質量分析は、エレクトロスプレーイオン化Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析と組み合わせた二次元ナノ液体クロマトグラフィーを含む。

他の実施形態において、異なる質量分析技術が使用される。

いくつかの実施形態において、生体試料は、ヒト生体試料、好ましくはヒト体液、より好ましくはヒト血清である。

いくつかの実施形態では、ヒト血清において、二重特異性抗体の定量下限（ＬＬＯＱ）は５０ｐｇ／ｍＬであり、二重特異性抗体の検出範囲は、５０ｐｇ／ｍＬ〜５０００ｐｇ／ｍＬである。

本発明はまた、本発明によって生体試料中の二重特異性抗体を定量化するための方法を実施するための、少なくとも本発明によるシグネチャーペプチドを含み、好ましくは、上記で定義された二重特異性抗体に特異的な抗体をさらに含む、キットを提供する。

特に、キットには、シグネチャーペプチドと同じ配列または拡張配列を有する安定同位体標識内部標準が含まれている。

本発明は、生体試料において、操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を含む二重特異性抗体を定量化するための高感度で特異的な方法を提供する。この方法は、質量分析によって前記抗体の独特のシグネチャーペプチドを定量化することを含み、シグネチャーペプチドは、１つのＣＨ３ドメインの８０位〜８８位に対応するトリプシンペプチドであり、アミノ酸位置は、ＩＧＭＴ（登録商標）番号付けに従って示される。

定義
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」とは、２つの異なるエピトープに結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（または抗原結合アーム）に連結された免疫グロブリンＦｃヘテロ二量体を含む抗体を指す。２つの異なる抗原結合ドメインは、２つの異なる免疫グロブリン重鎖（Ｈｃ）の一部であり、操作されたＣＨ３ヘテロ二量体を形成する操作されたＣＨ３ドメインの対を介して、ホモ二量体を形成する代わりにヘテロ二量体化する。

本明細書で使用される場合、「操作されたＣＨ３ヘテロ二量体」とは、ヘテロ二量体の構築を促進し、ホモ二量体の形成を妨げる、ＣＨ３ドメインのインターフェースに突然変異を含むＣＨ３ヘテロ二量体を指す。「ノブ・イン・ホール」（ＫｉＨ）、「鎖交換遺伝子操作ドメイン」（ＳＥＥＤ）および「免疫グロブリンドメインインターフェース交換」など、当技術分野でよく知られている様々な技術を使用して、ＣＨ３ヘテロ二量体を操作することができる。免疫グロブリンドメインインターフェース交換は、特に、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３もしくはＩｇＧ３のＣＨ３などのＩｇＧのＣＨ３）のホモ二量体タンパク質−タンパク質インターフェースを完全なヘテロ二量体インターフェース（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α／βまたはＴＣＲγ／δ定常ドメインの対）またはホモ二量体インターフェースの半分（例えば、ＩｇＡのＣＨ３、ＩｇＤのＣＨ３、ＩｇＧＭのＣＨ４）と交換することを含む。免疫グロブリンドメインインターフェース交換は、ＷＯ２０１２／１３１５５５およびＳｋｅｇｒｏ ｅｔ．ａｌ．，ＪＢＣ、２０１７、２９２、９７４５−９７５９に開示されている。ＴＣＲベースの免疫グロブリンドメインインターフェース交換技術を用いて操作された二重特異性抗体は、Ｔ細胞受容体に基づいた抗体により二重特異性結合のためのＢＥＡＴ（登録商標）抗体が指定されている。ＣＨ３ヘテロ二量体の２つのＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％を形成する。ヘテロ二量体形成は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって測定することができる（例えば、Ｓｋｅｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ、２０１７、２９２、９７４５−９７５９を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「シグネチャーペプチド」とは、二重特異性抗体に独特のペプチドを指し、これは、それが生体試料の他のタンパク質には見られないことを意味する。

本明細書で使用される場合、「生体試料」とは、タンパク質の混合物を含む複雑なマトリックスを指す。

アミノ酸位置は、ＩＧＭＴ（登録商標）番号付けに従って示される。

シグネチャーペプチドを含むＣＨ３ドメインは、本明細書では第１のＣＨ３ドメインと呼ぶ。

二重特異性抗体およびシグネチャーペプチド
本発明の方法に従って定量化される二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインの８０位〜８８位までのアミノ酸配列に由来するトリプシンペプチドである、独特のシグネチャーペプチドを含む：
ＴＴＰＰＺ_１ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＺ_２（配列番号２）、
式中、Ｚ_１は、ＶまたはＭであり、Ｚ_２は、ＫまたはＲであり、
前記シグネチャーペプチドは、配列番号２と比較して少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。

シグネチャーペプチドは、配列番号２の２、３、４、５、６、７個以上のアミノ酸置換、好ましくは６、７個以上のアミノ酸置換を含み得る。

シグネチャーペプチドはトリプシンペプチドであるため、抗体配列は、シグネチャーペプチド配列に対して１位にリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含む。

独特のペプチドであるシグネチャーペプチドは、第１のＣＨ３ドメインにのみ見られる（すなわち、第２のＣＨ３ドメインには見られない）。

いくつかの好ましい実施形態において、シグネチャーペプチドは、以下の配列からなる：
ＴＸ_１ＰＰＸ_２ＬＸ_３ＳＸ_４ＧＳＦＸ_５ＬＸ_６ＳＸ_７（配列番号１）、
式中、Ｘ_１は、ＴまたはＤを表し、
Ｘ_２は、Ｖ、Ｌ、Ｐ、またはＭを表し、
Ｘ_３は、Ｄ、Ｑ、またはＥを表し、
Ｘ_４は、ＤまたはＱを表し、
Ｘ_５は、Ｆ、Ａ、またはＷを表し、
Ｘ_６は、Ｓ、Ｗ、またはＨを表し、
Ｘ_７は、ＫまたはＲを表すが、
ただし、Ｘ_１がＴの場合、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_７のうちの少なくとも１つは、Ｘ_２がＬ、Ｐ、またはＭであり、Ｘ_３がＱまたはＥであり、Ｘ_４がＱであり、Ｘ_５がＡまたはＷであり、Ｘ_７がＲであることを条件とする。好ましくは、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_７のうちの少なくとも２、３、４、またはすべては、Ｘ_２がＬ、Ｐ、またはＭであり、Ｘ_３がＱまたはＥであり、Ｘ_４がＱであり、Ｘ_５がＡまたはＷであり、Ｘ_７はＲであることを条件とし、より好ましくは、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_７の４つまたはすべては、Ｘ_２がＬ、ＰまたはＭであり、Ｘ_３がＱまたはＥであり、Ｘ_４はＱであり、Ｘ_５がＡまたはＷであり、Ｘ_７がＲであることを条件とする。

いくつかのより好ましい実施形態において、シグネチャーペプチドは、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＳＳＫ（配列番号３）、ＴＤＰＰＬＬＥＳＤＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号４）、ＴＤＰＰＬＬＥＳＱＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号５）、ＴＴＰＰＰＬＱＳＤＧＳＦＷＬＷＳＫ（配列番号６）およびＴＴＰＰＭＬＥＳＤＧＳＦＦＬＨＳＫ（配列番号７）からなる群、好ましくは、配列番号４または配列番号５から選択される。

本発明の方法に従って定量化される二重特異性抗体は、操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を含む免疫グロブリンＦｃヘテロ二量体を含み、該ＣＨ３ヘテロ二量体は、ＣＨ３ドメインにおいていくつかの置換、例えば、第１のＣＨ３ドメインの８０位〜８８位で少なくとも２つの置換を含む。

この方法の様々な実施形態において、操作されたＣＨ３ヘテロ二量体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの組み合わせに由来する。第１のＣＨ３ドメインは、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４からのものであり、より好ましくはヒトＩｇＧ１からのものである。第２のＣＨ３ドメインは、任意のヒトＩｇＧに由来する。いくつかの好ましい実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３に由来する。

この方法の様々な実施形態において、操作されたＣＨ３ヘテロ二量体は、第１のＣＨ３ドメインの８０位〜８８位で２、３、４、５、６、７個またはそれ以上の置換、好ましくは６、７個またはそれ以上の置換を含む。

いくつかの実施形態において、操作されたＣＨ３ヘテロ二量体の第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３に由来し、第１のＣＨ３ドメインは、８０位〜８８位で６、７個またはそれ以上の置換を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ＴＣＲベースの免疫グロブリンドメインインターフェース交換（ＢＥＡＴ（登録商標））技術を使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来し、少なくとも置換Ｆ８５．１ＡおよびＹ８６Ｓを含み、第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３に由来し、少なくとも置換Ｓ２０Ｋ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｋ７９Ｙ、Ｋ８８Ｗ、およびＴ９０Ｎを含む。

いくつかのより好ましい実施形態において：
−第１のＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｑ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２Ｅ、Ｋ８８ＲおよびＴ９０Ｒのうちの１つ以上、好ましくは、Ｑ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２Ｅ、Ｋ８８ＲおよびＴ９０ＲまたはＱ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２ＥおよびＫ８８Ｒをさらに含み、
−第２のＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｑ３Ａ、Ｄ１２Ｅ、Ｌ１４Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｖ８４Ｍ、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６Ｖ、Ｖ１０１Ｉ、Ｈ１１５ＲおよびＹ１１６Ｆのうちの１つ以上、好ましくは、Ｆ８５．１ＳおよびＹ８６Ｖ、またはヒトＩｇＧ１に由来するＣＨ３ドメインの場合は、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６ＶおよびＱ３Ａ、ならびにヒトＩｇＧ３に由来するＣＨ３ドメインの場合は、Ｄ１２Ｅ、Ｌ１４Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｖ８４Ｍ、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６Ｖ、Ｖ１０１Ｉ、Ｈ１１５ＲおよびＹ１１６Ｆをさらに含む。

第１の好ましい実施形態による二重特異性抗体は、配列番号３、４、５のシグネチャーペプチドを含む。好ましくは、二重特異性抗体は、配列番号４または５のシグネチャーペプチドを含む。

いくつかの好ましい他の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインとＩｇＤのＣＨ３ドメインとの間の免疫グロブリンドメインインターフェース交換を使用して操作されたヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、第１のＣＨ３ドメインが、Ｑ３Ｖ、Ｙ５Ｌ、Ｋ２６Ｓ、Ｖ８４Ｐ、Ｄ８４．２Ｑ、Ｆ８５．１ＷおよびＹ８６Ｗの置換を含み、第２のＣＨ３ドメインが、Ｓ２０Ｗ、Ｋ７９Ａ、Ｔ８１Ａ、Ｋ８８ＶおよびＴ９０Ｒの置換を含む。これらの実施形態による二重特異性抗体は、配列番号６のシグネチャーペプチドを含む。

いくつかのさらに他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインとＩｇＭのＣＨ３ドメインとの間の免疫グロブリンインターフェース交換を使用して操作されたヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、第１のＣＨ３ドメインが、Ｑ３Ｄ、Ｋ２６Ｔ、Ｖ８４Ｍ、Ｄ８４．２ＥおよびＹ８６Ｈの置換を含み、第２のＣＨ３ドメインが、Ｓ２０Ｔ、Ｋ７９Ｖ、Ｔ８１Ｓ、およびＫ８８Ｉの置換を含む。これらの実施形態による二重特異性抗体は、配列番号７のシグネチャーペプチドを含む。

本発明の方法に従って定量化される二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（または抗原結合アーム）に連結された免疫グロブリンＦｃヘテロ二量体を含む。

Ｆｃヘテロ二量体は、少なくとも操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を含む。それは通常、好ましくはＩｇＧ由来、より好ましくはヒトＩｇＧ由来、さらにより好ましくはヒトＩｇＧ１由来の少なくとも１対のＣＨ２ホモ二量体をさらに含む。

Ｆｃヘテロ二量体は、２つの免疫グロブリンヒンジ、好ましくはＩｇＧヒンジ、より好ましくはヒトＩｇＧヒンジ、さらにより好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジを介して抗原結合アームに有利に連結されている。

抗原結合アームは、免疫グロブリンＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント、好ましくはヒトまたはヒト化ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントであり得る。二重特異性抗体は、２つのＦａｂフラグメント、２つのｓｃＦｖフラグメント、または１つのＦａｂフラグメントおよび１つのｓｃＦｖフラグメントを含み得る。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ヒト免疫グロブリン由来のＦｃヘテロ二量体、ＦａｂとｓｃＦｖを含む。Ｆｃヘテロ二量体は、好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。Ｆｃヘテロ二量体は、好ましくは、ＩｇＧ１ヒンジ、好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジを介してＦａｂおよびｓｃＦｖのそれぞれに連結されている。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は治療用抗体である。二重特異性抗体は、２つの治療標的に向けられている。二重特異性抗体の治療標的の非限定的な例としては、ＣＤ３、ＣＤ３８、Ｈｅｒ−２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、補体Ｃ５、その他が挙げられる。モノクローナル抗体の多数の治療標的は当技術分野で周知であり、様々な標的に向けられた多数のモノクローナル抗体は、癌、自己免疫、炎症性疾患、感染症および他の疾患などの様々な疾患の治療に利用可能である。二重特異性抗体は、これらの治療標的のいずれかに向けることができ、またはこれらの治療用モノクローナル抗体のいずれかに由来し得る。

いくつかの好ましい実施形態において、治療的二重特異性抗体は、二重特異性抗ＣＤ３抗体、好ましくは抗ＣＤ３および抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ３８、または抗ＣＤ３および抗ＥＧＦＲの二重特異性抗体である。

生体試料調製
生体試料は、好ましくは、二重特異性抗体で処理されたヒト源または動物源、より好ましくはヒトまたはサルの対象、さらにより好ましくはヒトの対象由来のものである。試料は、生体組織または生体液であり、好ましくは、全血、血清、血漿、尿、組織生検または粘膜分泌物（唾液、涙液、気管支肺胞洗浄液など）など、より好ましくは血漿または血清が挙げられるが、これらに限定されない。

試料は、抗体を抽出する、および／または干渉成分を除去するために、従来の技術を使用して処理することができる。例えば、固体試料および／または組織試料は、均質化され、遠心分離され、ろ過され、および／またはクロマトグラフィー技術にかけられて、細胞または組織断片を除去することができる。別の場合では、干渉成分を沈殿または結合することが知られている試薬を加えることができる。例えば、全血は、赤血球と白血球および血小板を除去するために従来の凝固技術を使用して処理することができる。

二重特異性抗体は、当技術分野で知られているモノクローナル抗体に使用される標準的な方法を使用して、試料から単離するか、または試料中で濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）（すなわち、濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ））することができる。このような方法には、試料から１つ以上の非二重特異性抗体混入物を除去することが含まれる。試料は、遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー精製、沈殿、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、および化学分画を使用して濃縮または精製できる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体、またはその重鎖および／または軽鎖は、実質的に単離され、これは、二重特異性抗体が、それが提供された試料から少なくとも部分的または実質的に分離されることを意味する。実質的な分離には、二重特異性抗体、またはその重鎖および／または軽鎖の少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する試料を含み得る。上記のようなモノクローナル抗体を単離するための方法は、当技術分野では日常的である。

いくつかの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、免疫捕捉によって生体試料から精製される。免疫捕捉は、二重特異性抗体に特異的な抗原または抗体、好ましくは、抗イディオタイプ抗体、シグネチャーペプチドに対する抗体、またはそれらの組み合わせを用いて行われ、抗イディオタイプ抗体および抗ペプチド抗体が連続して使用される。二重特異性抗体が抗ＣＤ３抗体である場合、免疫捕捉は、抗ＣＤ３イディオタイプ抗体、例えば抗ＯＫＴ３抗体を使用して行われる。免疫捕捉は、好ましくは、固体支持体上で、または免疫磁気分離を使用することによって、より好ましくは、ビオチン化抗体およびストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズを使用することによって行われる。免疫捕捉は、当技術分野で知られているモノクローナル抗体に使用される標準的な方法を使用して行われる。

精製に続いて、好ましくは免疫捕捉により、二重特異性抗体をトリプシンまたはトリプシン／ＬｙｓＣで消化して、シグネチャーペプチドを含む（トリプシン）ペプチドを生成する。トリプシンまたはトリプシン／ＬｙｓＣ消化は、当技術分野でよく知られている標準的な方法を使用して行われる。消化条件（インキュベーション時間、温度、トリプシン対二重特異性抗体の比率）は、十分な一貫した消化を確実にするために最適化されている。固定化トリプシンまたはトリプシン／ｌｙｓＣが有利に使用される。

消化効率と完全性を改善するために、前処理は、二重特異性抗体を展開し、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を減少させ、それらの再編成を防ぐことによって有利に行われる。これは、二重特異性抗体をＤＴＴやＤＴＥ（２，３ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオール）、チオグリコレート、亜硫酸システイン、亜硫酸水素塩、硫化物、二硫化物、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）および２−メルカプトエタノールなどの還元剤、ならびにヨードアセトアミドなどのアルキル化剤で処理することで実現することができる。尿素などの変性剤による付加処理は、還元剤による処理の前に行うことができる。あるいは、トリプシン消化プロセスは、消化温度の上昇、有機溶媒の添加、マイクロ波支援消化、またはペレット消化方法によって加速することができる。例えば、二重特異性抗体は、ＴＣＥＰおよびヨードアセトアミドで処理することができる。

質量分析
試料調製後、二重特異性抗体のトリプシンペプチドは、液体クロマトグラフィーの物理的分離機能と質量分析の質量分析機能を組み合わせたタンデム質量分析（ＭＳ）技術（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけられる。質量分析は、質量に基づいた荷電種の分離に依存する。任意のＬＣ−ＭＳ装置を使用できる。ＬＣは高速液体クロマトグラフィーカラムを使用して行われる。ＬＣは、二次元ナノ液体クロマトグラフィーなどの二次元高速液体クロマトグラフィー（２−Ｄ−ＨＰＬＣ）を使用して有利に行われる。例えば、二次元トラップ−ナノＬＣ構成を使用できる。トラップカラムは、逆相Ｃ１８液体クロマトグラフィーＨＰＬＣカラムが有利である。

質量分析検出は、四重極質量分析計（ＥＳＩ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＭＳ）と組み合わせたエレクトロスプレーイオン化を使用して行なうことができる。四重極質量分析計（Ｑ）は、互いに平行に設定された４本のシリンダーロッドからなる。Ｑは、六角形や八角形などの他の多角形のロッド、ならびに、わずかに平行でない構成からなることもある。四重極質量分析計では、四重極は、その質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて試料イオンをろ過する役割を果たす装置の構成部分である。任意のＥＳＩトリプルクワッド質量分析計を使用できる。高分解能精密質量分析（ＨＲＭＳ）を使用することで、感度と特異性を向上させることができる。ＨＲＭＳ装置の例としては、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計および飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計がある。

いくつかの実施形態において、質量分析は、エレクトロスプレーイオン化Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析と組み合わせた二次元ナノ液体クロマトグラフィーを含む。

生体試料中のシグネチャーペプチドの量は、内部標準（ＩＳ）との比較によって決定される。内部標準は、二重特異性抗体の安定同位体標識（ＳＩＬ）類似体、安定同位体標識（ＳＩＬ）シグネチャーペプチド、または同じシグネチャーペプチドを含むものなどの同様の二重特異性抗体であり得る。この方法により、５０ｐｇ／ｍＬの低レベルの定量化（ＬＬＯＱ）と、ヒト血清中５０ｐｇ／ｍＬ〜５０００ｐｇ／ｍＬの範囲の二重特異性抗体の検出を達成することが可能である。

キット
本発明はまた、少なくとも本発明によるシグネチャーペプチドを含む、本発明による方法を使用して生体試料中の二重特異性抗体を定量化するためのキットに関する。好ましくは、キットは、二重特異性抗体に特異的な抗体および／または本発明による内部標準をさらに含む。

方法の使用
本発明はまた、治療的二重特異性抗体の薬物動態試験、特に治療的二重特異性抗体の前臨床試験または臨床試験を行うため、および対象における治療的二重特異性抗体による疾患の治療をモニタリングするための本発明の方法の使用に関する。

本発明は、ＨＥＲ２陽性固形癌の治療に使用するための、二重特異性抗体などのＴ細胞リダイレクト抗体に関する。

開示された抗体の治療有効量を患者に投与することによって、ＨＥＲ２陽性固形癌を治療する方法も本開示により提供される。

本発明の一態様によれば、Ｔ細胞リダイレクト抗体は、ＢＥＡＴ（登録商標）技術（ＷＯ２０１２／１３１５５５）によって生成される。本発明のより具体的な態様において、Ｔ細胞リダイレクト抗体は、ＧＢＲ１３０２として知られているＨＥＲ２ｘＣＤ３二重特異性抗体であり、細胞傷害性Ｔ細胞をリダイレクトして、ＨＥＲ２過剰発現癌細胞を殺傷する。より具体的には、本発明の抗体は、配列番号１１〜１３のアミノ酸配列を含む。別の特定の態様において、Ｔ細胞リダイレクト抗体は、ＧＢＲ１３４２（配列番号１４〜１６）として知られているＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体である。

本発明の好ましい態様によれば、この方法は、以下のパラメータを使用して行われる。

本発明の一実施形態において、開示されたＴ細胞リダイレクト抗体は、ＨＥＲ２陽性固形腫瘍の治療に使用される。

本発明の特定の実施形態において、開示された抗体は、２８日の治療サイクルにおいて、１日目および１５日目に、１ｎｇ／ｋｇ〜７５０ｎｇ／ｋｇの間の用量で静脈内投与される。

より具体的な実施形態において、治療用量は、約１ｎｇ／ｋｇ、約３ｎｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ、約３０ｎｇ／ｋｇ、約６０ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ、約２００ｎｇ／ｋｇ、約３００ｎｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇおよび約７５０ｎｇ／ｋｇを含む群から選択される。

開示された抗体を治療薬として使用するためには、薬物の有効性を高め、その毒性を低下させるために、薬物の吸収、分布、代謝、および排泄の時間経過を試験する必要がある。総称して薬物動態試験として知られるこれらの試験を実施するには、以下を含む特定のパラメータを調査する必要がある：最大観察血清濃度（Ｃ_ｍａｘ）、時間０から最後の測定可能な濃度の時間までの血清濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）、最大観察血清濃度の時間（Ｔ_ｍａｘ）、最後に観察された血清濃度の時間（Ｔ_ｌａｓｔ）、血清排出半減期（ｔ_１／２）、最後に測定可能な血漿濃度（Ｃ_ｌａｓｔ）。

本発明の一態様によれば、開示される抗体は、以下の用量で投与される：
（ａ）約３０ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約０．２５ｎｇ／ｍＬ以上、約０．４５ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約１０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約２５時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約４時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約４０時間以上、約１６０時間以下であり、ｔ_１／２は約７０時間であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．０５ｎｇ／ｍＬ以上、約０．１５ｎｇ／ｍＬ以下であり；
（ｂ）約６０ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約０．３ｎｇ／ｍＬ以上、約０．９ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約１．３時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約９０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約４時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約４時間以上、約３５０時間以下であり、ｔ_１／２は約９０時間以上、約１３０時間以下であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．０５ｎｇ／ｍＬ以上、約０．６５ｎｇ／ｍＬ以下であり；
（ｃ）約１００ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約０．５ｎｇ／ｍＬ以上、約３ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約２５時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約２１０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約５時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約１１０時間以上、約３６０時間以下であり、ｔ_１／２は約８０時間以上、約１３０時間以下であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．０５ｎｇ／ｍＬ以上、約０．２ｎｇ／ｍＬ以下であり；
（ｄ）約２００ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約０．９ｎｇ／ｍＬ以上、約２．５ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約７４時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約２３０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約７時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約１４０時間以上、約３４０時間以下であり、ｔ_１／２は約８０時間以上、約１３０時間以下であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．０５ｎｇ／ｍＬ以上、約０．３ｎｇ／ｍＬ以下であり；
（ｅ）約３００ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約２ｎｇ／ｍＬ以上、約４．５ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約９時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約３３０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約６時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約４時間以上、約５４０時間以下であり、ｔ_１／２は約８０時間以上、約１２０時間以下であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．０８ｎｇ／ｍＬ以上、約２．４ｎｇ／ｍＬ以下であり；
（ｆ）約５００ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約２．５ｎｇ／ｍＬ以上、約８ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約１６０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約７６０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約１１時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約４８時間以上、約５００時間以下であり、ｔ_１／２は約１００時間以上、約１５０時間以下であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．１ｎｇ／ｍＬ以上、約２ｎｇ／ｍＬ以下であり；
（ｇ）約７．５ｎｇ／ｋｇでは、Ｃ_ｍａｘは約７．５ｎｇ／ｍＬ以上、約１７ｎｇ／ｍＬ以下であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔは約２４０時間^＊ｎｇ／ｍＬ以上、約１１００時間^＊ｎｇ／ｍＬ以下であり、Ｔ_ｍａｘは約１時間以上、約６時間以下であり、Ｔ_ｌａｓｔは約４０時間以上、約３４０時間以下であり、ｔ_１／２は約１００時間以上、約１６０時間以下であり、Ｃ_ｌａｓｔは約０．３５ｎｇ／ｍＬ以上、約３．５ｎｇ／ｍＬ以下である。

本発明の一態様によれば、Ｔ細胞リダイレクト抗体は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌、特に、乳房癌、卵巣癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の群から選択される癌の治療に適している。本発明の好ましい態様において、ＨＥＲ２陽性癌は乳癌である。

ＧＢＲ１３０２トリプシン消化物のＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳプロファイルを表す。 Ａ．ｍ／ｚ８９６．４４（Ｍ＋２Ｈ）^２＋のペプチドＴＤＰＰＬＬＥＳＤＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号４）を示すＧＢＲ１３０２トリプシン消化物。Ｂ．ｍ／ｚ６１５．３１（Ｍ＋２Ｈ）^２＋のペプチドＥＰＥＶＡＴＦＰＰＳＲ（配列番号１０）を示すＧＢＲ１３０２トリプシン消化物。Ｃ．ヒト血清ブランク。 ＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳによるヒト血清中のＧＢＲ１３０２の定量化を表す。 ＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳによるサル血清中のＧＢＲ１３４２の定量化を表す。 ＧＢＲ１３０２の幾何平均血清プロファイル。

材料および方法
１．材料
−二重特異性抗体
−ＧＢＲ１３０２：抗ＣＤ３／抗Ｈｅｒ２ヒトＩｇＧ１ ＢＥＡＴ（登録商標）二重特異性抗体
−ＧＢＲ１３４２：抗ＣＤ３／抗ＣＤ３８ヒトＩｇＧ１ ＢＥＡＴ（登録商標）二重特異性抗体
−ＧＢＲ１３７２：抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲヒトＩｇＧ１ ＢＥＡＴ（登録商標）二重特異性抗体
−内部標準
−ＧＢＲ１３０２−ＩＳ：安定同位体標識（ＳＩＬ）シグネチャーペプチド配列番号４（ｍ／ｚ９０１．４４（Ｍ＋２Ｈ）^２＋）。ＡＣＮ：水＝３０：７０に溶解した作業溶液１００ｐｇ／ｍＬ
−ＧＢＲ１３４２−ＩＳ：安定同位体標識（ＳＩＬ）シグネチャーペプチド配列番号５（ｍ／ｚ９０７．９６（Ｍ＋２Ｈ）^２＋）；ＡＣＮ：水＝３０：７０に溶解した作業溶液１００ｐｇ／ｍＬ
−試薬
−生体マトリックス：ヒトまたはサルの血清
−ストレプトアビジンビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓストレプトアビジンＴ１、ｐ／ｎ６５０−０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−ビオチン化ＯＫＴ３抗体（Ａｂｐｒｏおよび社内）
−ビオチン化９Ｇ７抗体（Ａｂｐｒｏおよび社内）
−ビオチン化ＳＰ３４抗体（Ｂｉｏ−ｒａｄおよび社内）
−ＴＣＥＰ還元溶液（水中７５ｍＭのＴＣＥＰ、新たに調製）
−ヨードアセトアミドアルキル化（ＩＡＡ）溶液（水中１５０ｍＭのＩＡＡ、新たに調製）
−トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（ＰＲＯＭＥＧＡ）水中５０μｇ／ｍＬ；新たに調製）
−アセトニトリル（ＡＣＮ）溶液：ＡＣＮ：水＝３０：７０
−ＰＢＳ／ＢＳＡ：ＰＢＳ中１０ｍＭの０．１％ＢＳＡ
−ＴｒｉｓＨＣｌ、１Ｍ、ｐＨ８．３
−ＨＣｌ ３０ｍＭ
−キャリブレーション標準および品質対照（ＱＣ）試料
−ＱＣ試料：生体マトリックス中５０、１５０、３００、７５０、４０００ｐｇ／ｍＬの二重特異性抗体
−標準：ＳＴＤ１〜ＳＴＤ８：生体マトリックス中５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、３０００、および５０００ｐｇ／ｍＬの二重特異性抗体

２．方法
２．１試料調製
ＰＢＳ−ＢＳＡの試料、品質対照、標準、ゼロ試料、ブランクをプレートＡのウェルに分配し、ビオチン化抗体（２μｇ）を加え、プレートＡを４℃で一晩振とうしながらインキュベートする。次いで、ストレプトアビジンＴ１ビーズをウェルに添加し、プレートＡを室温で１時間インキュベートして、ビオチン化抗体で捕捉された分析物を結合させる。次いで、ビーズを磁気スタンドに置いた収集プレート（プレートＢ）に移し、ＣＨＡＰバッファーで２回、ＰＢＳバッファーで２回洗浄する。抗体の溶出は、プレートＢに３０ｍＭのＨＣｌを添加して、３分間混合し、溶出液を１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．３を含むプレートＣに移すことによって行い、溶出ステップを繰り返す。

内部標準を、プレートＣの試料、品質対照、標準、およびゼロ試料に添加する。ＡＣＮ：水＝３０：７０をプレートＣの対照ブランクに添加する。７５ｍＭのＴＣＥＰを各ウェルに添加し、１分間混合した後、プレートを５６℃で４５分間インキュベートする。プレートを室温で１０分間冷却する。１５０ｍＭのＩＡＡを各ウェルに添加し、１分間混合した後、プレートを暗所で、室温で３５分間インキュベートする。トリプシン（５０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、１分間混合した後、プレートを３７°Ｃで一晩振とうしながらインキュベートする。

２．３クロマトグラフィー

この方法は、Ｔｈｅｒｍｏ ＱＥおよびＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣナノ液体クロマトグラフィーがＴｈｅｒｍｏ Ｅａｓｙ−Ｓｐｒａｙソースと組み合わせた二次元トラップ−ナノ液体クロマトグラフィーの構成を使用して行う。まず、ポンプをトラップカラムにロードすることによって試料をロードし、続いてナノポンプによって６００ｎＬ／分の流量で動作するナノＬＣ分析カラムに切り替える。ループに巻かれた分析カラムをリニアリストリクターエミッターと密接に連結する。トラップカラムと分析カラムをともに高有機溶媒で洗浄し、高度に保持された内因性成分をナノポンプとマイクロポンプによって溶出させる。

２．４質量分析

実施例１：ヒトまたは非ヒト霊長類の血清中の二重特異性抗体定量化のための独特のシグネチャーペプチドの同定
第１のアプローチでは、ヒト血清中の二重特異性抗体を定量化するための潜在的なシグネチャーペプチドを、選択の標準ルールを使用して選択した：６〜１５個のアミノ酸；化学化学反応性残留物なし（トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ））；２Ｒ、２Ｋ、ＲＫを含まない；潜在的なＰＴＭなし（チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ））；好ましくは、プロリン（Ｐ）を含む；Ｐに近接したＲ（トリプシン切断を見逃す可能性）。これらのルールに基づいて、ＧＢＲ１３０２でスパイクしたヒト血清から１５のシグネチャーペプチド（ＳＰ）を選択した。２つのペプチドＬＹＳＧＶＰＳＲ（配列番号８）およびＦＴＩＳＡＤＴＳＫ（配列番号９）をそれらの質量応答強度に基づいて最適化のために選択した。選択したシグネチャーペプチドは、ブランクヒト血清中ならびにＧＢＲ１３０２でスパイクしたヒト血清試料中に存在することが観察され、選択したシグネチャーペプチドがＧＢＲ１３０２に特異的ではないことを示唆した。

第２のアプローチでは、ソフトウェアＥｘｐａｓｙペプチドカッター（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｃｕｔｔｅｒ／）を使用して、ＧＢＲ１３０２、ＧＢＲ１３４２、およびＧＢＲ１３７２二重特異性抗体のトリプシン消化によって生成されたペプチドを予測した。次いで、得られたトリプシンペプチド配列をヒト血漿プロテオーム（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ）と比較して、二重特異性抗体（血漿プロテオームに存在する）に独特ではないペプチドを除外した。

２つの独特のシグネチャーペプチドがＧＢＲ１３０２トリプシン消化物のＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳプロファイルで見出された：ｍ／ｚ８９６．４４（Ｍ＋２Ｈ）^２＋によりＴＤＰＰＬＬＥＳＤＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号４）およびｍ／ｚ６１５．３１（Ｍ＋２Ｈ）^２＋によりＥＰＥＶＡＴＦＰＰＳＲ（配列番号１０）（図１Ａおよび１Ｂ）。これらのシグネチャーペプチドはＧＢＲ１３０２に独特であり、ブランクヒト血清およびトラスツズマブには存在しないことが観察された（図１Ｃ）。

両ペプチドが、免疫グロブリンドメインインターフェース交換技術によって生成されたすべての二重特異性抗体に存在する操作されたＣＨ３ヘテロ二量体に位置していることも観察された。配列番号４のＳＰは、ＩＧＭＴ番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ３ドメインの８０位〜８８位に位置している。配列番号１０のＳＰは、ＩＧＭＴ番号付けに従って、ＩｇＧのＣＨ３ドメインの１位〜１１位に位置している。

質量応答強度に基づいて、シグネチャーペプチドＴＤＰＰＬＬＥＳＤＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号４）を二重特異性抗体の定量化のために選択した。

ＧＢＲ１３７２は、ＧＢＲ１３０２と同じＦｃヘテロ二量体を含む。同じ独特のシグネチャーペプチド（配列番号４）がＧＢＲ１３７２トリプシン消化物のＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳプロファイルで見出された。

ＧＢＲ１３４２は、ＧＢＲ１３０２およびＧＢＲ１３７２のそれとはＤ８４．４Ｑ置換が異なるＦｃヘテロ二量体を含む。ｍ／ｚ９０２．９６（Ｍ＋２Ｈ）^２＋の対応するシグネチャーペプチドＴＤＰＰＬＬＥＳＱＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号５）が、ＧＢＲ１３４２トリプシン消化物のＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳプロファイルで見出された。

これらの結果は、操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体の１つのＣＨ３ドメインの８０位〜８８位のシグネチャーペプチドが、ヒト血清中の操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を有するすべての二重特異性抗体の定量化に用いることができる独特のシグネチャーペプチドであることを示している。

実施例２：ヒトまたはサルの血清中の二重特異性抗体の定量化のための高感度ＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳアッセイ
実施例１で同定された独特のシグネチャーペプチドの検出に基づくＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳアッセイは、ヒトまたは非ヒト霊長類血清中の二重特異性抗体の定量化のために開発された。ＧＢＲ１３０２を、シグネチャーペプチド配列番号４のＭＳ分析に基づいて、ヒト血清中で定量化した。ＧＢＲ１３４２を、シグネチャーペプチド配列番号５のＭＳ分析に基づいてサル血清中で定量化した。アッセイのステップを材料および方法のセクションで詳細に開示する。簡単に説明すると、ヒトまたはサルの血清中でスパイクした二重特異性抗体を、ビオチン化抗イディオタイプ抗体およびストレプトアビジン被覆免疫磁気ビーズを使用して免疫精製した。二重特異性抗体の内部標準（ＩＳ；安定同位体標識（ＳＩＬ）シグネチャーペプチド）を免疫精製した二重特異性抗体に添加してから、ＴＣＥＰとヨードアセトアミドおよびトリプシン消化で前処理した。次に、トリプシン消化物を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して二次元トラップ−ナノＬＣ−ナノＥＳＩ ＭＳ／ＭＳにかけた。

ヒト血清中のＧＢＲ１３０２の定量化
８つの標準（ＳＴＤ１〜ＳＴＤ８：５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、３０００、および５０００ｐｇ／ｍＬ）を使用して、平均相関係数Ｒ^２＝（０．９９７８）で線形キャリブレーン曲線を作成した。キャリブレーション曲線は２桁直線であり、５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱが得られた（図２）。これらの実験で生成された線形回帰曲線を使用して導き出されたＧＢＲ１３０２濃度は、（９７．８〜１００．９％）の正確度と％ＣＶ（不正確）＜９．４を示した（図２および表１）。

サル血清中のＧＢＲ１３４２の定量化
８つの標準（ＳＴＤ１〜ＳＴＤ８：５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、３０００、および５０００ｐｇ／ｍＬ）を使用して、平均相関係数Ｒ^２＝（０．９９６６）で線形キャリブレ−ション曲線を作成した。キャリブレーション曲線は２桁直線であり、５０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱが得られた（図３）。これらの実験で生成された線形回帰曲線を使用して導き出されたＧＢＲ１３４２濃度は、（９４．３〜１０１．８％）の正確度と％ＣＶ（不正確）＜５．７を示した（図３および表２）。

これらの結果は、本発明によるＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳアッセイが、高感度（１００ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱ）、広範囲の検出（２桁、５０ｐｇ／ｍＬ〜５０００ｐｇ／ｍＬ）および優れた精度と正確度で、ヒトおよび非ヒト霊長類の血清中の二重特異性抗体の定量化を達成できることを示している。結果として、本発明によるＬＣ−ＨＲＭＳ／ＭＳアッセイは、二重特異性抗体治療の前臨床試験および臨床試験のための極めて高性能なアッセイである。

実施例３：進行性ＨＥＲ２陽性固形腫瘍患者におけるＧＢＲ１３０２の薬物動態試験
材料および方法
有用な標準治療または根治的治療がない進行性ＨＥＲ２陽性固形腫瘍の成人におけるＧＢＲ１３０２の薬物動態を評価するために、第１相、ヒト初、非盲検、多施設、用量漸増試験を実施した。被験者に、２８日間の治療サイクルの１日目と１５日目に１ｎｇ／ｋｇから開始する漸増用量レベルでＧＢＲ１３０２を静脈内投与した。最初の４つのコホートは、単一の被験者から構成され、後続のコホートは、３＋３デザインを使用して登録されている。薬物動態（ＰＫ）および抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析（二次エンドポイント）のために血液試料を採取した。ＧＢＲ１３０２血清濃度の定量化（ＰＫのため）および抗ＧＢＲ１３０２抗体の検出／確認（免疫原性のため）は、それぞれ検証済みのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法およびＥＬＩＳＡ法を使用して行った。ＰＫパラメータは、標準非コンパートメント法を使用して評価した。

以下のＰＫパラメータを推定した。
−観察された最高血清中濃度（Ｃ_ｍａｘ）
−時間０から最終測定可能な濃度の時間までの血清中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）
−観察された最高血清中濃度の時間（Ｔ_ｍａｘ）
−観察された最終血清中濃度の時間（Ｔ_ｌａｓｔ）
−血清消失半減期（ｔ_１／２）
−最終測定可能な血漿濃度（Ｃ_ｌａｓｔ）

免疫原性を評価するために、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を測定した。

結果：
ＧＢＲ１３０２の薬物動態を、表３と表４、および図４に示すように、１ｎｇ／ｋｇ〜７５０ｎｇ／ｋｇの用量範囲で３１名の被験者を対象に試験した。

血清濃度は、初回投与時（１ｎｇ／ｋｇ）で定量下限の５０ｐｇ／ｍＬ未満であり、３ｎｇ／ｋｇおよび１０ｎｇ／ｋｇ投与量レベルでは一過性濃度のみが観察された。評価可能なＰＫプロファイルは、３０ｎｇ／ｋｇ以降で観察された。ＧＢＲ１３０２は、注入の終わり頃に最高血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）を示し、その後、血清濃度は双指数関数的に減少し、平均終末相半減期は約４〜７日であった。Ｃ_ｍａｘおよび曲線下面積（ＡＵＣ_０−ｔ）の両方で、７５０ｎｇ／ｋｇ（最大評価用量）までほぼ用量比例増加が見られた。コホート５までの被験者から採取された試料はいずれもＡＤＡ陽性反応を示さなかった。これらの結果は、順調な線形ＰＫを示しており、これまでに評価された被験者のいずれも、ＡＤＡ陽性反応を示さなかった。

Claims (16)

1. 生体試料中の二重特異性抗体を定量化するための方法であって、前記抗体が、第１のＣＨ３ドメインの８０位〜８８位の少なくとも２つの置換を含むＣＨ３ドメインにおけるいくつかの置換を含む操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ヘテロ二量体を含み、前記方法が、質量分析によって前記抗体のシグネチャーペプチドを定量化することを含み、前記シグネチャーペプチドが、前記第１のＣＨ３ドメインの８０位〜８８位に対応するトリプシンペプチドであり、アミノ酸位置はＩＧＭＴ（登録商標）番号付けに従って示される、方法。
2. 前記シグネチャーペプチドが、以下の配列からなり、
   ＴＸ_１ＰＰＸ_２ＬＸ_３ＳＸ_４ＧＳＦＸ_５ＬＸ_６ＳＸ_７（配列番号１）
   式中、Ｘ_１は、ＴまたはＤを表し、Ｘ_２は、Ｖ、Ｌ、ＰまたはＭを表し、Ｘ_３は、Ｄ、ＱまたはＥを表し、Ｘ_４は、ＤまたはＱを表し、Ｘ_５は、Ｆ、ＡまたはＷを表し、Ｘ_６は、Ｓ、ＷまたはＨを表し、Ｘ_７は、ＫまたはＲを表すが、ただし、Ｘ_１がＴの場合、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_７のうちの少なくとも１つは、Ｘ_２がＬ、ＰまたはＭであり、Ｘ_３がＱまたはＥであり、Ｘ_４がＱであり、Ｘ_５がＡまたはＷであり、Ｘ_７がＲであることを条件とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記シグネチャーペプチドが、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＳＳＫ（配列番号３）、ＴＤＰＰＬＬＥＳＤＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号４）、ＴＤＰＰＬＬＥＳＱＧＳＦＡＬＳＳＲ（配列番号５）、ＴＴＰＰＰＬＱＳＤＧＳＦＷＬＷＳＫ（配列番号６）およびＴＴＰＰＭＬＥＳＤＧＳＦＦＬＨＳＫ（配列番号７）からなる群から選択され、好ましくは配列番号４または配列番号５である、請求項２に記載の方法。
4. 前記二重特異性抗体が、Ｔ細胞受容体ベースの免疫グロブリンドメインインターフェースを使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、前記第１のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１に由来し、少なくともＦ８５．１ＡおよびＹ８６Ｓの置換を含み、前記第２のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３に由来し、少なくともＳ２０Ｋ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｋ７９Ｙ、Ｋ８８ＷおよびＴ９０Ｎの置換を含み、前記位置はＩＧＭＴ（登録商標）番号付けに従って示される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. −前記第１のＣＨ３ドメインが、以下の置換：Ｑ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２Ｅ、Ｋ８８ＲおよびＴ９０Ｒのうちの１つ以上、好ましくは、Ｑ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２Ｅ、Ｋ８８ＲおよびＴ９０Ｒ、またはＱ３Ｅ、Ｙ５Ａ、Ｌ７Ｆ、Ｓ２０Ｔ、Ｔ２２Ｖ、Ｋ２６Ｔ、Ｔ８１Ｄ、Ｖ８４Ｌ、Ｄ８４．２ＥおよびＫ８８Ｒをさらに含み、
   −前記第２のＣＨ３ドメインが、以下の置換：Ｑ３Ａ、Ｄ１２Ｅ、Ｌ１４Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｖ８４Ｍ、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６Ｖ、Ｖ１０１Ｉ、Ｈ１１５ＲおよびＹ１１６Ｆのうちの１つ以上、好ましくは、Ｆ８５．１ＳおよびＹ８６Ｖ；ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインの場合はＦ８５．１Ｓ、Ｙ８６ＶおよびＱ３Ａ；ならびにヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインの場合はＤ１２Ｅ、Ｌ１４Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｖ８４Ｍ、Ｆ８５．１Ｓ、Ｙ８６Ｖ、Ｖ１０１Ｉ、Ｈ１１５ＲおよびＹ１１６Ｆをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体が、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインとＩｇＤのＣＨ３ドメインとの間の免疫グロブリンドメインインターフェース交換を使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、前記第１のＣＨ３ドメインが、Ｑ３Ｖ、Ｙ５Ｌ、Ｋ２６Ｓ、Ｖ８４Ｐ、Ｄ８４．２Ｑ、Ｆ８５．１Ｗ、およびＹ８６Ｗの置換を含み、前記第２のＣＨ３ドメインが、Ｓ２０Ｗ、Ｋ７９Ａ、Ｔ８１Ａ、Ｋ８８Ｖ、およびＴ９０Ｒの置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記抗体が、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインとＩｇＭのＣＨ３ドメインとの間の免疫グロブリンドメインインターフェース交換を使用して操作されたヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインヘテロ二量体を含み、前記第１のＣＨ３ドメインが、Ｑ３Ｄ、Ｋ２６Ｔ、Ｖ８４Ｍ、Ｄ８４．２ＥおよびＹ８６Ｈの置換を含み、前記第２のＣＨ３ドメインが、Ｓ２０Ｔ、Ｋ７９Ｖ、Ｔ８１Ｓ、およびＫ８８Ｉの置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記二重特異性抗体が、ヒト免疫グロブリン由来のＦｃ、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記二重特異性抗体が、治療用抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記二重特異性抗体が、二重特異性抗ＣＤ３抗体、好ましくは抗ＣＤ３および抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ３８、または抗ＣＤ３および抗ＥＧＦＲの二重特異性抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ａ）免疫捕捉によって生体試料から前記二重特異性抗体を精製するステップと、
    ｂ）ステップａ）で得られた前記二重特異性抗体をトリプシンまたはトリプシン／Ｌｙｓ Ｃで消化して、前記シグネチャーペプチドを含むペプチドを生成するステップと、
    ｃ）ステップｂ）で得られた前記ペプチドを質量分析にかけ、内部標準と、またはキャリブレーション標準を使用して比較することにより、前記生体試料中のシグネチャーペプチドの量を決定するステップと、を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記免疫捕捉が、前記二重特異性抗体に特異的な抗体、好ましくは、抗イディオタイプ抗体、前記シグネチャーペプチドに対する抗体、またはそれらの組み合わせを用いて行われ、好ましくは、前記免疫捕捉は、固体支持体上で、または免疫磁気分離法を使用して、より好ましくは、ビオチン化抗体およびストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して行われる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記質量分析が、エレクトロスプレーイオン化Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析と組み合わせた二次元ナノ液体クロマトグラフィーを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記生体試料がヒトの生体試料、好ましくはヒトの体液、より好ましくはヒトの血清である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ヒト血清において、前記二重特異性抗体の定量下限が５０ｐｇ／ｍＬであり、前記二重特異性抗体の検出範囲が５０ｐｇ／ｍＬ〜５０００ｐｇ／ｍＬである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法を使用して生体試料中の二重特異性抗体を定量化するためのキットであって、少なくとも請求項１〜３のいずれか一項に記載のシグネチャーペプチドを含み、好ましくは、請求項１２に定義される前記二重特異性抗体に特異的な抗体をさらに含む、キット。
    
    

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