CN117280217A

CN117280217A - 通过lc-mrm-ms测定对共同施用于受试者的治疗蛋白的测量

Info

Publication number: CN117280217A
Application number: CN202280030156.7A
Authority: CN
Inventors: 钟雪飞; Y·毛
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2023-12-22

Abstract

本发明总体上涉及使用LC‑MRM‑MS对共同施用于受试者的治疗蛋白进行定量的方法。特别地，本发明涉及使用双酶消化来生成独特的替代肽，从而允许使用LC‑MRM‑MS对共同施用的治疗蛋白进行准确定量。

Description

通过LC-MRM-MS测定对共同施用于受试者的治疗蛋白的测量

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年4月8日提交的美国临时专利申请号63/172,567和2021年7月23日提交的美国临时专利申请号63/224,952的优先权和权益，这些美国临时专利申请各自通过引用并入本文。

技术领域

本申请涉及用于对共同施用于受试者的一种或多种治疗蛋白进行定量的测定方法。

背景技术

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)正在成为用于分析诸如治疗蛋白等生物药物的优选方法。虽然通常出于此目的已经使用了配体结合测定(LBA)，但是LC-MS/MS提供了提供快得多的方法开发过程的许多优势。使用LC-MS/MS来分析治疗蛋白的关键方面是通过对源自蛋白水解消化的替代肽进行定量，作为蛋白质的独特标识符。

治疗蛋白可以单独地施用于受试者，或者可以例如在抗体混合物中共同施用。在这种情况下，来自基质组分的干扰或来自共同施用的治疗蛋白的竞争可能使得难以对感兴趣的治疗蛋白的独特替代肽进行鉴定和定量，并且因此难以对所述感兴趣的治疗蛋白或多种感兴趣的治疗蛋白进行定量。

因此，应当理解，需要用以准确地、快速地且同时对多种共同施用的治疗蛋白进行定量的方法。

发明内容

开发了与双酶消化组合的基于液相色谱-多反应监测质谱(LC-MRM-MS)的方法，以用于确定血清样品中抗体混合物的每种抗体组分的总浓度。在酶消化之前和之后的线性度、准确度、精确度、选择性、特异性和分析物稳定性方面来评估该生物分析测定的性能特性。开发的LC-MRM-MS测定具有人血清基质中约10至2000μg/mL抗体药物的动态范围，该动态范围能够覆盖在两个剂量组中药物施用后第0天至第28天的血清药物浓度以用于临床药代动力学研究。通过MRM测定测量的两个剂量组的药代动力学分布与通过完全验证的电化学发光(ECL)免疫测定测量的那些相当。

本公开提供了一种用于同时对至少两种共同施用的治疗蛋白进行定量的方法。在一些示例性实施例中，该方法包括：(a)获得包含第一治疗蛋白和第二治疗蛋白的样品；(b)通过使所述样品与至少两种消化酶接触来针对所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白中的每一者生成独特的替代肽；(c)使用质谱仪对所述替代肽进行定量；以及(d)使用经定量的替代肽对所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白进行定量。

在一方面，所述消化酶选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、LysC、LysN、AspN、GluC和ArgC组成的组。在具体方面，所述消化酶包括胰蛋白酶和AspN。

在一方面，所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白包括抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物或融合蛋白。在另一方面，所述第一治疗蛋白包括卡西瑞单抗(casirivimab)并且所述第二治疗蛋白包括伊德维单抗(imdevimab)。

在一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极质谱仪。在另一方面，所述质谱仪与色谱系统联用。在具体方面，所述色谱系统包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。

在一方面，所述样品包括人血清。在另一方面，所述方法进一步包括使用对潜在替代肽的计算机模拟分析选择所述消化酶。在又一方面，对替代肽的所述定量包括使用多反应监测。在进一步方面，所述方法进一步包括向受试者施用所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白。

在一方面，所述方法具有该样品中约10至约2000μg/mL该第一治疗蛋白的动态范围。在另一方面，所述方法具有该样品中约10至约2000μg/mL该第二治疗蛋白的动态范围。在又一方面，所述质谱仪能够执行多反应监测或平行反应监测。

在一方面，所述方法进一步包括以下步骤：对所述替代肽进行肽作图、选择该替代肽的独特肽和碎片离子以生成多反应监测跃迁、选择该替代肽的前两个或前三个跃迁、优化该替代肽的碰撞能量、随后生成校准曲线以及根据该校准曲线确定LLOQ(量化下限)。

一方面，所述方法进一步包括选择对所述第一治疗蛋白或所述第二治疗蛋白具有特异性的所述至少一种替代肽，其中通过确定以下各项来预先选择该至少一种替代肽：(i)该替代肽对待量化的该治疗蛋白的消化物具有特异性；(ii)在不存在该至少一种治疗蛋白的情况下，该替代肽特异性地不存在于制剂的蛋白酶消化物中；(iii)该替代肽在质谱分析中产生强信号；并且(iv)该替代肽在质谱分析中产生可区分信号。

在一方面，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白变性。在另一方面，所述变性包括使所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白与变性溶液接触。在进一步方面，所述变性溶液包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)、尿素或其组合。在另一具体方面，所述变性包括将所述样品加热至约80℃。

在一方面，所述方法进一步包括在步骤(b)之前还原所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白。在另一方面，所述还原包括使所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白与还原剂接触。在进一步方面，所述还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)。

一方面，所述方法进一步包括在步骤(b)之前烷基化所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白。另一方面，所述烷基化包括使所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白与烷基化剂接触。在进一步方面，所述烷基化剂是碘乙酰胺。

本公开还提供了一种用于从施用的抗体混合物中同时对卡瑞维单抗和伊德维单抗进行定量的方法。在一些示例性实施例中，该方法包括：(a)获得包含卡瑞维单抗和伊德维单抗的血清样品；(b)通过使所述样品与胰蛋白酶和AspN接触来为卡瑞维单抗和伊德维单抗中的每一个生成至少一种独特的替代肽；(c)使用质谱仪对所述替代肽进行定量；以及(d)使用定量的替代肽对卡瑞维单抗和伊德维单抗进行定量。

一方面，所述替代肽包含氨基酸序列LLIYAASNLETGVPSR和DTAVYYCASGS。另一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极质谱仪。又另一方面，所述质谱仪与液相色谱系统联用。

一方面，所述方法进一步包括向受试者施用卡瑞维单抗和伊德维单抗。另一方面，所述质谱仪能够执行多反应监测或平行反应监测。

当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。

附图说明

图1展示了根据示例性实施例的LC-MRM-MS/MS测定的工作流程。

图2A示出了根据示例性实施例的由胰蛋白酶和AspN消化生成的mAb1的替代肽的碰撞诱导解离(CID)MS/MS谱。图2B示出了根据示例性实施例的由胰蛋白酶和AspN消化生成的mAb2的替代肽的CID MS/MS谱。

图3示出了根据示例性实施例的由校准标准物的LC-MRM-MS生成的mAb1(图3A至3C)和mAb2(图3D至3F)的替代肽(图3A、图3D)、内标物(图3B、图3E)和校准曲线绘图(图3C、图3F)的提取离子色谱图(XIC)。

图4A示出了根据示例性实施例的来自共同掺有10μg/mL mAb1和20μg/mL mAb2的十个单独的未受感染人血清样品的mAb1的替代肽的叠置XIC。图4B示出了根据示例性实施例的来自共同掺有10μg/mL mAb1和20μg/mL mAb2的十个单独的未受感染人血清样品的mAb2的替代肽的叠置XIC。图4C示出了根据示例性实施例的十个单独的人血清样品中药物浓度的测量准确度百分比，其中药物以定量下限(LLOQ)水平掺入。

图5A示出了根据示例性实施例的mAb1的替代肽的MRM跃迁的XIC。图5B示出了根据示例性实施例的mAb2的替代肽的MRM跃迁的XIC。图5C示出了根据示例性实施例的在血清基质中不存在mAb2的情况下或者在血清基质背景中有2mg/mL mAb2的情况下测量的mAb1药物浓度在五个质量控制(QC)水平下的准确度百分比的比较。图5D示出了根据示例性实施例的在血清基质中不存在mAb1的情况下或者在血清基质背景中有2mg/mL mAb1的情况下测量的mAb2药物浓度在五个QC水平下的准确度百分比的比较。

图6A示出了根据示例性实施例的在三种不同条件下在五个QC水平下测量mAb1稳定性的准确度百分比。图6B示出了根据示例性实施例的在三种不同条件下在五个QC水平下测量mAb2稳定性的准确度百分比。

图7A示出了根据示例性实施例的通过LC-MRM-MS测定和完全验证的电化学发光(ECL)免疫测定从血清样品测量的mAb1的药代动力学分布。图7B示出了根据示例性实施例的通过LC-MRM-MS测定和完全验证的ECL免疫测定从血清样品测量的mAb2的药代动力学分布。

具体实施方式

REGEN-COV(卡瑞维单抗和伊德维单抗)是Regeneron Pharmaceuticals,Inc.开发的调查研究性抗体混合物疗法，用于治疗由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19)(Hansen等人,2020,Science,369:1010-1014；Baum等人,2020,Science,370:1110-1115；Weinreich等人,2021,N Engl J Med,384:238-251)。抗体混合物包括两种人源化IgG1单克隆抗体(在本文中称为mAb1和mAb2)，其被设计为靶向SARS-CoV-2刺突蛋白上的非重叠表位，并且由此阻断了SARS-CoV-2病毒与人ACE2的相互作用并防止了由于病毒的快速基因突变而导致的病毒逃逸(Hansen等人；Baum等人,2020,Science,369:1014-1018)。最近的临床研究已经表明，REGEN-COV疗法可以为非住院COVID-19患者，尤其血清反应阴性或者在基线时具有高病毒载量的患者降低病毒载量并改善症状(Weinrich等人)。基于来自临床调查研究的有希望的结果，REGEN-COV于2020年11月获得美国食品和药物管理局(FDA)的紧急使用授权(EUA)，用于治疗处于进展至重症COVID-19和/或住院的高风险的成人和儿童患者的近期诊断的轻至中度COVID-19，儿童患者至少12岁且重至少40kg。

测量在患者体内药物施用之后血清中的抗体药物浓度的时间分布对于蛋白质治疗学的药代动力学(PK)表征以及药物剂量优化来说至关重要。为了满足这一需求并管理COVID-19疗法的加速开发，开发了用于REGEN-COV药代动力学研究的适合预期使用的液相色谱-多反应监测质谱(LC-MRM-MS)测定，并在一个月(比开发传统配体结合测定所需的时间要短得多的时间范围)内对其进行资格鉴定。与配体结合测定不同，LC-MRM-MS测定不需要高度特异性亲和捕获和检测试剂用于抗体治疗学，该试剂通常需要几个月来开发和生产。另外，本发明的LC-MRM-MS测定还提供了宽动态范围、良好的准确度和精确度以及优异的选择性和特异性，以用于量化血清基质中的基于蛋白质的生物药物(van den Broek等人,2013,J Chromatogr B,929:161-179)。最近，由于LC-MS仪器性能的不断改进，LC-MRM-MS已经成为用于临床前样品分析和临床样品分析两者的更常采用的生物分析策略(Jiang等人,2013,Anal Chem,85:9859-9867；Zhang等人,2014,Anal Chem,86:8776-8784；Li等人,2012,Anal Chem,84:1267-1273；Cardozo等人,2020,Nat Commun,11:6201；FernandezOcana等人,2012,Anal Chem,84:5959-5967；Shen等人,2015,Anal Chem,87:8555-8563)。

使用LC-MRM-MS对人血清样品中的总抗体药物浓度(包括游离抗体和结合抗体)的量化可以基于对源自抗体要去的可变互补决定区(CDR)的替代肽的离子强度的测量(Jenkins等人,2015,AAPS J,17:1-16)。为了处理患者血清样品，通常将几微升的血清样品还原、烷基化并且然后进行蛋白酶消化。稳定重同位素标记的蛋白质或替代肽通常用作内标物(IS)，以归一化因样品处理和仪器性能波动产生的信号变化。测定的灵敏度、选择性和特异性可以取决于已经被选择用于量化的独特CDR肽。对于共同施用的抗体混合物，可以轻松地多路复用LC-MRM-MS以同时测量多种药物分析物。尽管由于色谱分离而导致通量有限，但本发明的LC-MRM-MS方法满足了在临床试验中早期测量有限数量的血清样品中的REGEN-COV药物浓度所需的动态范围、灵敏度、选择性、稳定性和特异性。将通过本发明的LC-MRM-MS测定测量的两个剂量组的流动患者的REGEN-COV浓度与从完全验证的配体结合免疫测定获得的结果进行比较，这证明这两种测定有良好的一致性。本公开为当递送经过验证的免疫测定以满足紧急时间线存在挑战时，或者如果用于配体结合测定的高质量抗独特型抗体试剂不可用，将LC-MRM-MS适合预期使用地应用于临床样品分析树立了例子。

除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。

术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”，并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的，并且在提供范围的情况下，包含端点。如本文所使用的，术语“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”意指是非限制性的，并且被理解为分别意指“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。

如本文所使用的，术语“蛋白质”或“所关注蛋白”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及经由肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以包括一种或多种多肽以形成单一功能性生物分子。蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。所关注蛋白可以包含以下中的任一种：生物治疗蛋白、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，诸如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗蛋白及其生产的最近综述，参见Ghaderi等人,“Production platforms for biotherapeuticglycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-human sialylation”(Darius Ghaderi等人,Production platforms for biotherapeuticglycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-human sialylation,28BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS147–176(2012)，该文献的全部教导内容并入本文)。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白，诸如球状蛋白和纤维状蛋白；缀合蛋白，诸如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，诸如初级衍生的蛋白和次级衍生的蛋白。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白可以是重组蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白、scFv和其组合。

如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指由于在已经引入到合适的宿主细胞中的重组表达载体上携带的基因的转录和翻译而产生的蛋白质。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是选自由IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE组成的组的同种型的抗体。在某些示例性实施例中，抗体分子是全长抗体(例如，IgG1或IgG4免疫球蛋白)，或者可替代地，抗体可以是片段(例如，Fc片段或Fab片段)。

如本文所使用的，术语“抗体”包含包括四个多肽链、通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，高变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。各VH和VL由从氨基端至羧基端按以下顺序布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。如本文所使用，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其与抗原特异性结合以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，所述标准技术诸如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得或者可以合成。可以通过化学方法或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。

如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域以及三功能抗体、四功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段包括亲本抗体的足够的氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述亲本抗体的片段，使得其如亲本抗体那样与同一抗原结合；在一些示例性实施例中，片段与具有与亲本抗体的亲和力相当的亲和力的抗原结合和/或与亲本抗体竞争以与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。

术语“双特异性抗体”包含能够与两个或多个表位选择性结合的抗体。双特异性抗体通常包含两个不同的重链，其中每个重链特异性结合两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。

典型的双特异性抗体具有两个重链，所述两个重链各自具有三个重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每个重链缔合，或者可以与每个重链缔合且可以与由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位结合，或者可以与每个重链缔合且使得所述重链中的一个或两个重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同形式，诸如但不限于三功能抗体、杵臼IgG(kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双功能抗体形式、单链双功能抗体、串联双功能抗体(TandAb)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock,DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、Zujian Wang和Mingju Hao,双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies and their applications),8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNAL OF HEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann,双特异性抗体(Bispecific Antibodies),《治疗抗体手册(HANDBOOK OF THERAPEUTICANTIBODIES)》265-310(2014)，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。

如本文所使用的，“多特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然此类分子通常将仅结合两种抗原(即，双特异性抗体，bsAb)，但具有另外特异性的抗体，诸如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文所公开的系统和方法来解决。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白可以从哺乳动物细胞中产生。哺乳动物细胞可以是人来源的或非人来源的，并且可以包括原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾脏上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其细胞株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-l细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官的成纤维细胞(包括但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾脏以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、邓普斯细胞、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、细胞株2071(小鼠L)细胞、L-M细胞株(小鼠L)细胞、L-MTK'(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。

如本文所使用的，术语“治疗蛋白”是指可以施用于受试者用于治疗疾病或病症的任何蛋白质。治疗蛋白可以是具有药理学作用的任何蛋白质，例如抗体、可溶性受体、抗体-药物缀合物或酶。在一些示例性实施例中，治疗蛋白可以是抗SARS-CoV-2抗体，包括卡瑞维单抗或伊德维单抗。可以共同施用多种治疗蛋白以实现药理学作用，例如，以防止由于靶病毒的突变而导致的病毒逃逸。如本文所使用的，术语“抗体混合物”是指包含至少两种治疗抗体的共同施用的治疗蛋白。在一些示例性实施例中，抗体混合物可以包含REGEN-COV。

在一些示例性实施例中，样品中治疗蛋白的数量可以为至少两种。在一些具体实施例中，治疗蛋白之一可以是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白或抗体-药物复合物。在一些其他具体实施例中，样品中治疗蛋白之一的浓度可以为约10μg/mL至约2000μg/mL。在一些示例性实施例中，样品中治疗蛋白的数量可以为三种。在一些示例性实施例中，样品中治疗蛋白的数量可以为四种。在一些示例性实施例中，样品中治疗蛋白的数量可以为五种。

如本文所使用的的，“样品”可以从生物过程的任何步骤获得，诸如细胞培养液(CCF)、采集的细胞培养液(HCCF)、下游处理中的任何步骤、药物物质(DS)或包括最终经调配产物的药物产物(DP)。在一些具体的示例性实施例中，样品可以选自澄清、色谱生产、病毒灭活或过滤的下游过程的任何步骤。

在一些示例性实施例中，样品是生物样品。如这里使用的，术语“生物样品”是指取自活生物体，例如人或非人哺乳动物的样品。生物样品可以包括例如全血、血浆、血清、唾液、眼泪、精液、面颊组织、器官组织、尿液、粪便、皮肤或毛发。样品可以取自患者，例如临床样品。

如本文所使用的，术语“药代动力学”(PK)是指处理药物在施用于受试者之后的特征的研究领域。药代动力学分析的示例性组成部分包括药物从药物制剂中的释放、药物吸收到血液循环中、药物在全身的分布、药物代谢(也称为生物转化)成代谢物、以及药物从体内排泄。药物的药代动力学是评估生物治疗候选物的关键特征。具体地，可以进行药代动力学研究以评估药物及其经修饰形式和代谢物的水平在施用于受试者之后如何随时间而改变。可以通过使用液相色谱-质谱分析代表性肽或“靶肽”或“替代肽”来评估生物治疗蛋白。如果肽对于蛋白质来说是独特的或者强烈代表蛋白质(例如抗体的互补决定区)，并且如果可以可靠地回收和测量肽，则该肽可以是合适的靶肽。

如本文所使用的，术语“液相色谱”是指其中由液体携带的生物/化学混合物可以由于组分在其流过固定液相或固相(或流到固定液相或固相中)时的差异分布而分离成组分的过程。液相色谱的非限制性实例包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱或混合模式色谱。

如本文所使用的，术语“质谱仪”包括能够鉴定特异性分子物种并测量其准确质荷比的装置。该术语意味着包括多肽或肽可以表征到其中的任何分子检测器。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中并且同时(如以电喷雾电离的方式)或通过单独的过程被电离。离子源的选择取决于应用。在一些示例性实施例中，质谱仪可以是串联质谱仪。

如本文所使用的，术语“串联质谱”包括通过使用多阶段的质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子被转移到气相中并被电离，使得可以在第一质量选择步骤之后以可预测且可控制的方式形成碎片。多级MS/MS或MSⁿ可以通过首先选择并分离前体离子、将其碎裂(MS2)、分离初级碎片离子、将其碎裂(MS3)、分离次级碎片等(MS4)来执行，只要可以获得有意义的信息或者碎片离子信号是可检测的即可。串联MS已通过各种分析器组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析器可以由许多不同的因素确定，诸如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析器在空间上联用或与空间串联分析器联用。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中解离，并且然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、分离、碎裂和m/z分离。

通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。该表征包括但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。

如本文所使用的，术语“数据库”是指可能例如以FASTA格式的文件的形式存在于样品中的蛋白质序列的编译集合。相关蛋白质序列可以源自正在研究的物种的cDNA序列。可以用于搜索相关蛋白质序列的公共数据库包括由例如Uniprot或Swiss-prot托管的数据库。可以使用本文中称为“生物信息学工具”的工具搜索数据库。生物信息学工具提供针对数据库中所有可能的序列搜索无解释的MS/MS谱的能力，并提供有解释的(带注释的)MS/MS谱作为输出。此类工具的非限制性实例为Mascot(www.matrixscience.com)、SpectrumMill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com

/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。

在一些示例性实施例中，质谱仪可以与液相色谱系统联用。

在一些示例性实施例中，质谱仪可以与液相色谱-多反应监测系统联用。更一般地，质谱仪可以能够通过所选的反应监测(SRM)(包括连续反应监测(CRM)和平行反应监测(PRM))进行分析。

如本文所使用的，“多反应监测”或“MRM”是指可以以高灵敏度、特异性和宽动态范围精确地量化复杂基质内的小分子、肽和蛋白质的基于质谱的技术(Paola Picotti&RuediAebersold,Selected reaction monitoring–based proteomics:workflows,potential,pitfalls and future directions,9NATURE METHODS 555–566(2012))。通常可以用三重四极质谱仪来执行MRM，其中在第一个四极中选择与所选小分子/肽相对应的前体离子，并且在第三个四极中选择前体离子的碎片离子以用于监测(Yong Seok Choi等人,Targetedhuman cerebrospinal fluid proteomics for the validation of multipleAlzheimers disease biomarker candidates,930JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 129–135(2013))。

在一些方面，本申请的方法或系统中的质谱仪可以是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极质谱仪，其中质谱仪可以与液相色谱系统联用，其中质谱仪能够执行LC-MS(液相色谱-质谱)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱)分析。

如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。

如本文所使用的，术语“消化酶”是指可以执行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任何药剂。可以进行酶消化的水解剂的非限制性实例包括来自佐氏曲霉(AspergillusSaitoi)的蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶XIII、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、胰凝乳蛋白酶、曲霉蛋白酶I、LysN蛋白酶(Lys-N)、LysC内切蛋白酶(Lys-C)、内切蛋白酶Asp-N(Asp-N)、内切蛋白酶Arg-C(Arg-C)、内切蛋白酶Glu-C(Glu-C)或外膜蛋白T(OmpT)、化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、V8蛋白酶或其生物活性片段或同系物、或其组合。对于讨论用于蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人,“Protein Digestion:An Overview of the AvailableTechniques and Recent Developments”(Linda Switzar,Martin Giera&WilfriedM.A.Niessen,Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques andRecent Developments,12JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH 1067–1077(2013))。

可以适当地选择消化酶的量和消化所需的时间。当酶与底物的比率不适当地高时，相应地高的消化速率将不允许有足够的时间通过质谱仪来分析肽，并且序列覆盖率将受损。另一方面，低的酶与底物比率将会需要长消化时间并且因此需要长数据采集时间。酶与底物的比率可以在约1:0.5至约1:200的范围内。

在一些示例性实施例中，对治疗蛋白进行定量的方法可以任选地包括使治疗蛋白与蛋白质还原剂接触。

如本文所使用的，术语“蛋白质还原剂”是指用于还原蛋白质中的二硫键的药剂。蛋白质还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂、盐酸羟胺、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。

在一些示例性实施例中，对蛋白质进行定量的方法可以任选地包括使治疗蛋白与蛋白质烷基化剂接触。

如本文所使用的，术语“蛋白质烷基化剂”是指用于烷基化蛋白质中的某些游离氨基酸残基的药剂。蛋白质烷基化剂的非限制性实例是碘乙酰胺(IAM)、氯乙酰胺(CAA)、丙烯酰胺(AA)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)和4-乙烯基吡啶或其组合。

在一些示例性实施例中，对治疗蛋白进行定量的方法可以包括使治疗蛋白变性。

如本文所使用的，“使蛋白质变性”可以指其中分子的三维形状从其天然状态改变的过程。蛋白质变性可以使用蛋白质变性剂进行。蛋白质变性剂的非限制性实例包括热、高或低pH、还原剂如DTT(参见下文)或暴露于离液剂。几种离液剂可以用作蛋白质变性剂。离液溶质通过干扰由非共价力诸如氢键、范德华力和疏水效应介导的分子内相互作用来增加系统的熵。离液剂的非限制性实例包括丁醇、乙醇、盐酸胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、N-月桂酰基肌氨酸、尿素及其盐。

应当理解，本发明不限于任何上述治疗蛋白、抗体混合物、宿主细胞、蛋白质变性剂、蛋白质烷基化剂、蛋白质还原剂、消化酶、质量分析器、用于鉴定的仪器、或色谱方法，并且可以通过任何合适的方式选择任何治疗蛋白、抗体混合物、宿主细胞、蛋白质变性剂、蛋白质烷基化剂、蛋白质还原剂、消化酶、质量分析器、用于鉴定的仪器、或色谱方法。

通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。

实例

根据示例性实施例的本发明的LC-MRM-MS/MS测定的总体工作流程展示在图1中。

化学品和试剂。从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(伊利诺伊州罗克福德)购买三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)、三氟乙酸(TFA)、0.1％甲酸(v/v)水溶液(LC-MS级)和0.1％甲酸(v/v)乙腈溶液(LC-MS级)。从英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)获得超纯的1M Tris-HCl pH 8.0。从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)购买尿素和碘乙酰胺(IAM)。从普洛麦格公司(Promega)(威斯康星州麦迪逊)购买胰蛋白酶(质谱级)和rAspN。从创新研究公司(InnovativeResearch)(密歇根州诺维)购买来自10个人的汇集人血清和单一人血清。从赛默飞世尔科技公司(伊利诺伊州罗克福德)订购用于内标物(IS)的AUQA级定制合成重肽LLIYAASNLETGVPSR*(10Da)、DTAV*(6Da)YYCASGS。从再生元制药公司(RegeneronPharmaceuticals)(纽约州塔里敦)开发并获得mAb1和mAb2药物物质(DS)。COVID-19患者血清样品来自再生元制药公司赞助的REGEN-COV临床试验(ClinicalTrials.gov标识符：NCT04425629)。

标准溶液的制备。通过将mAb1和mAb2 DS掺入到汇集人血清中来制备REGEN-COV在人血清中的储备溶液。通过使用汇集人血清对储备溶液进行系列稀释来制成校准标准物(mAb1为20、25、30、50、100、250、500、1000、2000μg/mL；mAb2为10、20、25、30、50、100、250、500、1000、2000μg/mL)。还通过将mAb1和mAb2 DS掺入到汇集人血清和系列稀释液中来制备五种资格鉴定QC标准物，包括定量上限(ULOQ，2000μg/mL mAb1、2000μg/mL mAb2)、高QC(HQC，1500μg/mL mAb1、1500μg/mL mAb2)、中QC(MQC，750μg/mL mAb1、750μg/mL mAb2)、低QC(LQC，60μg/mL mAb1、30μg/mL mAb2)和定量下限(LLOQ、20μg/mL mAb1、10μg/mL mAb2)。

通过将mAb1和mAb2 DS共同掺入到十个单独的人血清空白中来制备掺有LLOQ(20μg/mL mAb1、10μg/mL mAb2)的单独人血清样品。对于药物特异性测定，通过使用汇集人血清作为稀释剂对抗体药物的储备溶液进行系列稀释来制成含有一种药物的QC标准物。使用汇集人血清中的2mg/mL共同施用的药物作为稀释剂对储备溶液进行系列稀释来制成存在共同施用的药物作为基质背景的含有一种药物的QC标准物。

血清样品的消化。在样品处理之前，将血清样品(校准标准物、QC标准物和患者样品)在冰上解冻。在96孔板(0.5mL，聚丙烯，安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)中进行血清样品消化。将5μL血清样品添加到预先装有80μL变性溶液(10mM TCEP，8M尿素)的每个样品孔中。将96孔板用粘合板密封件(沃特世公司(Waters)，马萨诸塞州米尔福德)密封，并在Thermomixer C(艾本德公司(Eppendorf)，德国汉堡)上以650rpm在80℃加热10分钟。冷却至室温之后，将15μL0.25M IAM添加到每个样品孔中，并且通过在黑暗中以650rpm振荡来在室温下将板孵育30分钟。使用前，通过在9mL 0.1M Tris缓冲液中重构200μg胰蛋白酶、100μg rAspN、150μL mAb1 IS储备溶液(5pmol/μL)和100μlmAb2 IS储备溶液(5pmol/μL)来制成含有两种酶和两种IS肽的消化溶液。烷基化后，将10μL的每个样品转移到第二96孔板中并与含有两种酶和IS肽的90μL消化溶液混合。将样品板密封并在37℃以650rpm振荡孵育3小时。当消化完成时，向每个样品孔添加10μL 10％ TFA以淬灭反应。LC-MRM-MS分析前，将样品板以700rpm旋转1分钟。

LC-MRM-MS方法。使用与6495三重四极质谱仪(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)联用的Agilent Infinity II UPLC系统执行LC-MRM-MS实验。将10μL消化的血清样品(对应于约45nL原始血清)上样到C18柱(ACQUITY UPLC BEH300 1.7μm，2.1mm x 100mm，Waters)上，并使用流动相A作为0.1％甲酸水溶液以及流动相B作为0.1％甲酸乙腈溶液以0.3mL/分钟的流速反相梯度洗脱来分离。每次进样前，将样品进样路径依次用IPA/ACN/H₂Ov/v/v(3:1:1)、ACN/H₂O/FA v/v/v(25:75:0.1)和ACN/H₂O/FA v/v/v(5:95:0.1)冲洗。将MRM实验的LC梯度设置如下：0-0.5分钟，5％B；0.5-16分钟，5％-25％ B；16-18分钟，25％～90％ B；18-20分钟，90％ B；20-20.5分钟，90％～5％ B以及20.5％～25,5％ B。在样品分析期间，将柱温设置在60℃并且将自动进样器维持在7℃。

将三重四极MS离子源参数设置如下：气体温度200℃，气体流速12L/分钟，雾化器气体20psi，护套气体温度300℃，护套气体流量11L/分钟，毛细管电压3500V，喷嘴电压500V。两种替代肽和两种IS肽的时间调度MRM跃迁(其中每个跃迁通道的参数列于表1-1和表1-2中)适用于所有定量分析实验。

表1-1.用于LC-MRM-MS数据采集的时间调度MRM跃迁

表1-2.用于LC-MRM-MS数据采集的时间调度MRM跃迁

数据分析。使用Agilent MassHunter定量分析软件分析来自LC-MRM-MS实验的原始数据。将监测到的跃迁的提取离子色谱(XIC)峰面积与Agile2算法整合。为了构建每种药物的校准曲线，使用1/x²加权的三参数二次模型(其中标准曲线的每个点都有可变权重)针对其相应的标称浓度绘制由来自对应的共同稀释IS肽的峰面积归一化的来自校准标准物的替代肽的峰面积，随后计算来自该峰面积的所有其他读数。二次拟合方程为y＝ax²+bx+c，其中y＝替代肽的XIC峰面积与对应的IS肽的XIC峰面积的比率，x＝药物浓度(μg/mL)，并且a、b、c分别＝二次系数、线性系数和常数项。标准曲线的每个点的权重与分析物浓度成反比。校准曲线参数由Agilent MassHunter定量分析软件自动计算。

电化学发光免疫测定。测定程序采用涂覆有生物素化小鼠抗mAb1单克隆抗体或生物素化小鼠抗mAb2单克隆抗体的链霉亲和素微孔板。使用对mAb1或mAb2具有特异性的两种钌基化的非竞争性小鼠单克隆抗体检测在板上捕获的对每种分子具有特异性的mAb1和mAb2。由MSD读取器测量当向板施加电压时由钌标记生成的电化学发光信号。测量的电化学发光与血清样品中总mAb1或总mAb2的浓度成比例。

实例1.MRM测定的方法开发

mAb1和mAb2均为由一对轻链和一对重链构成的二聚体分子。mAb1轻链包含221个氨基酸残基，并且其重链包含450个氨基酸残基。mAb2轻链包含216个氨基酸残基，并且其重链包含450个氨基酸残基。因为人血清中IgG蛋白丰富并且这两种人源化IgG1药物的氨基酸序列的大于93％与内源血清IgG相同，所以对用于基于MRM的IgG抗体药物量化的合适替代肽的选择局限于源自可变结构域的CDR区(通常3个来自重链，3个来自轻链)的肽。来自恒定区的肽无法与源自人血清中的内源抗体的肽区分开。

为了选择合适的替代肽用于MRM量化，应用以下考虑因素来筛选通过人IgG药物的CDR区中的蛋白酶切割生成的候选肽：1)Uniprot人蛋白质组数据库(www.uniprot.org/blast/)中没有相同的BLAST匹配命中；2)肽长度短于20个氨基酸残基；3)序列不含在酶消化期间容易漏切的位点，诸如用于胰蛋白酶切割的KR、RDR；以及4)序列不含对体内生物转化敏感的位点或在样品处理期间容易部分修饰的残基，诸如甲硫氨酸。通过应用这些标准来检查mAb1和mAb2的计算机模拟胰蛋白酶消化生成的CDR肽，发现仅一种肽LLIYAASNLETGVPSR(其来自mAb1的轻链CDR2)可以充当用于mAb1量化的替代肽。来自mAb2CDR区的胰蛋白酶肽均无法满足上文列出的所有标准，如表2-1所示。在这种情况下，使用另一种蛋白酶rAspN来从重链CDR3生成具有适当长度的独特替代肽DTAVYYCASGS以用于mAb2量化，如表2-2所示。CDR区序列以粗体字指示。排除肽作为用于MRM方法开发的MRM替代肽的原因用“x”标记。

表2-1.通过胰蛋白酶消化mAb1和mAb2来预测含有CDR的肽序列。

表2-2.通过胰蛋白酶和AspN组合消化mAb2来预测含有CDR的肽序列。

使用mAb1药物物质的胰蛋白酶消化物和mAb2药物物质的rAspN消化物来优化Agilent QQQ系统上的MRM跃迁参数。执行在反相LC分离期间用于替代肽候选物的时间调度产物离子扫描实验，以选择最佳跃迁和碰撞能量。基于所采集的CID MS/MS谱，选择从+2前体离子到y3产物离子的跃迁来监测mAb1替代肽LLIYAASNLETGVPSR的丰度(图2A)；并且选择从+2前体离子到y5产物离子的跃迁来监测烷基化mAb2替代肽DTAVYYC(Cam)ASGS的丰度(图2B)。应注意的是，该双电荷mAb2替代肽的最优碰撞能量为约5V，这与双电荷胰蛋白酶肽所需的典型碰撞能量相比要小得多。

检查替代肽的所选跃迁通道及其内标肽的对应跃迁的人血清基质背景干扰。用16分钟反相LC梯度以及对四个跃迁通道的时间调度MRM采集来分析用胰蛋白酶和rAspN的组合消化的汇集人血清空白以及10个单独的血清空白样品(5个为女性，5个为男性)。从这两种替代肽的轻或重跃迁通道中未观察到信号干扰。在评估这两种替代肽的所选跃迁的基质干扰之后，在MRM模式下进一步优化仪器参数，并且应用表1-1和表1-2中所列的参数进行测定资格鉴定和患者样品分析。

实例2.LC-MRM-MS测定资格鉴定

应用于临床样品分析前，使用以下最关键的参数评估所开发的LC-MRM-MS测定的性能：1)线性度；2)准确度和精确度；3)选择性；4)特异性；以及5)样品消化前后的分析物稳定性。

2.1线性度

线性度是指在适当的线性或非线性回归统计模型下仪器响应与标准物浓度的比例。在该LC-MRM-MS测定中，通过三天内mAb1的九个非零标准物和mAb2的十个非零标准物的归一化提取离子色谱(XIC)峰面积来确定线性度。来自校准标准物的替代肽和IS肽的代表性XIC以及这两种抗体药物的校准曲线示出在图3中。使用以下方程，使用利用归一化响应和相应的标准物曲线方程反算的校准标准物药物浓度来估计标准物的准确度。

准确度％(ACC％)＝100％×(测定浓度/标称浓度)。

表3和表4中总结了来自三个独立实验的两种药物的非零标准物的测量浓度的统计分布。所有标准物的平均ACC％值范围为：mAb1为89％至105％并且mAb2为92％至106％。所有非零标准物的测量浓度值的CV％(变化系数)有变化：mAb1为2.6％至11％并且mAb2为0.7％至12％。这些结果符合生物分析标准：对于非零标准物，ACC％应在标称值的±20％内，处于LLOQ或ULOQ水平的标准物除外，该标准物必须在±25％内；并且对于所有非零标准物，CV％必须≤20％，处于LLOQ或ULOQ水平的标准物除外，该标准物必须≤25％。

表3.来自三个独立实验的mAb1的所有非零标准物的准确度和精确度

表4.来自三个独立实验的mAb2的所有非零标准物的准确度和精确度

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2.2准确度和精确度

准确度是指测量结果与其理论真值之间的一致紧密度，并且表达为准确度百分比(ACC％)。精确度是指同一样品的重复测量之间的随机变化的定量度量，其表达为变化系数百分比(浓度CV％)。日内准确度和精确度由三天内的三次独立测量中每次运行的五个资格鉴定QC复制品来确定，该复制品是如上文在标准溶液的制备中所描述的制备的。日间准确度和精确度通过三天内从样品制备到LC-MS/MS分析的三次独立测量来确定，每次测量具有五个资格鉴定QC复制品。日内、日间准确度和精确度参数的数据呈现于表5-1、表5-2和表5-3中。

表5-1.用于LC-MRM-MS测定的mAb1在五个QC水平下的日内(N＝5)准确度和精确度。

表5-2.用于LC-MRM-MS测定的mAb2在五个QC水平下的日内(N＝5)准确度和精确度。

表5-3.用于LC-MRM-MS测定的mAb1和mAb2在五个QC水平下的日间(N＝3)准确度和精确度。

日间准确度和精确度评定的统计分布表明，所有五个QC的mAb1的ACC％值的范围为95％至103％，并且所有五个QC的mAb2的ACC％值的范围为96％至106％。所有QC的日间浓度CV％值发生变化，mAb1为3％和13％并且mAb2为3％和9％。对于日内评定，五个QC的mAb1的ACC％值介于89％与114％之间，其中浓度CV％值介于1％与6％之间，并且五个QC的mAb2的ACC％值介于92％与111％之间，其中浓度CV％值介于2％与9％之间。这些结果表明，对于mAb1和mAb2两者，该LC-MRM-MS测定的日内和日间准确度对于HQC、MQC和LQC均介于80％与120％之间，并且对于LLOQ和ULOQ均介于75％与125％之间。测量浓度的日内和日间CV％对于HCQ、MQC和LQC均在20％以内，并且对于LLOQ和ULOQ均25％以内。

2.3选择性

选择性是指在存在不同的内源性和非测定特异性基质成分的情况下对分析物的选择性和特异性定量。对一组十个单独的未受感染人血清样品进行分析，以检查测定是否经受非特异性基质干扰。对于mAb1和mAb2两者，所有样品被示出为低于定量极限(BLQ)，其中mAb1为20μg/mL并且mAb2为10μg/mL。通过对掺有LLOQ的单独未受感染人血清样品进行准确度评定来评估选择性的进一步证据。如图4所示，对于共同掺有20μg/mL mAb1和10μg/mLmAb2的十个单独血清样品中的每一个，mAb1的测量浓度在标称值的±25％以内，其中ACC％值的范围为92％至116％。mAb2的ACC％值的范围为87％至126％，其中在一个样品中mAb2的测量浓度超出标称值的±25％。这些结果均符合《生物分析方法验证行业指南》中规定的接受标准：至少80％的掺有LLOQ的未受感染样品必须符合在标称值的±25％以内的ACC％接受标准(美国卫生部与公众服务部、食品和药物管理局、药物评价和研究中心、兽医学中心。《2018年生物分析方法验证行业指南》)。

根据这些评估证明，所开发的LC-MRM-MS测定对含有mAb1和mAb2的人血清样品具有选择性。另外，用掺有LLOQ的样品获得的结果证实，纯血清中的测定可以对低至20μg/mL的总mAb1水平和低至10μg/mL的总mAb2水平进行定量，从而进一步建立了LLOQ MRM测定。

2.4特异性

特异性是指方法在存在预期存在的其他组分的情况下评定分析物的能力。因为mAb1和mAb2作为抗体混合物疗法共同施用，所以评估了伴随用药对每种药物的方法特异性的干扰。如图5的XIC所示，在人血清中以2mg/mL mAb2检测不到来自保留时间为14分钟时mAb1替代肽的跃迁通道(m/z 853.0->m/z 359.2)的信号(图5A)。在人血清中2mg/mL mAb1的样品中，对于来自mAb2的跃迁通道(m/z 597.6->m/z 481.2)的信号，观察到类似的响应(图5B)。

为了系统地评估每种药物的药物特异性，在五个不同的QC浓度水平下，将单独用一种药物制成的QC标准物的准确度与含有2mg/mL共同施用的药物的QC标准物的准确度进行比较。在不存在mAb2的情况下，mAb1 QC的ACC％值的范围为98％至103％，这与为血清中有2mg/mL mAb2的mAb1 QC测量的ACC％范围(97％至120％)相当(图5C)。在不存在mAb1的情况下，mAb2 QC的ACC％值的范围为100％至114％，这也与为血清中掺有2mg/mL mAb1的mAb2QC测量的ACC％范围(96％至108％)相当(图5D)。每种药物在所有五个QC水平下的QC ACC％值在存在或不存在共同施用的药物的情况下均符合在标称值的±20％以内的ACC％接受标准，在标称值的±25％以内的ULOQ和LLOQ ACC％除外。

2.5分析物稳定性

分析物稳定性是指在样品已经经受压力或不同的储存条件之后在测定的接受标准内准确地测量分析物的能力。为了适合该测定的目的，对在暴露于三个冷冻/解冻(FT)循环之后完整治疗蛋白在人血清中的稳定性以及在UPLC自动进样器中储存期间消化的分析物的稳定性进行评估。

为了评定在冷冻/解冻循环条件下的分析物稳定性，在消化之前将ULOQ、HQC、MQC和LQC的五个复制品冷冻/解冻三个循环。为了评定仪器自动进样器中的分析物稳定性，在自动进样器中在7℃储存72小时之后，对ULOQ、HQC、MQC、LQC和LLOQ的五个复制品进行分析。将新鲜QC样品的测量准确度与在消化之前经受冷冻/解冻循环的QC样品以及在消化之后在自动进样器中长时间储存的QC样品的测量准确度进行比较。如图6所示，在评估条件下，未观察到药物浓度的测量准确度的显著改变。所有QC符合所有QC在标称值的±20％以内的ACC％接受标准，在标称值的±25％以内的ULOQ ACC％除外，从而表明mAb1和mAb2均在测试的条件下在人血清中是稳定的并且该稳定性可以使用本发明的方法准确地评定。

实例3.COVID-19患者血清样品中的REGEN-COV浓度的测量

由于迫切需要可靠的定量药代动力学测定来表征REGEN-COV，因此所开发的LC-MRM-MS测定充当临时方法以确定从门诊COVID-19患者的REGEN-COV I期临床试验中收集的患者血清样品中mAb1和mAb2的总浓度(Weinrich等人)。将参与双盲临床研究的患者随机分配(1:1:1)为通过静脉注射接收安慰剂、2.4g REGEN-COV(每种抗体1.2g)或8.0g REGEN-COV(每种抗体4g)。在给药前、药物输注后1小时以及药物施用后2、4、6、14和28天从2.4g和8.0g剂量组患者收集血清样品，并通过本发明的LC-MRM-MS测定对该血清样品进行分析。

将校准标准物以及呈三个复制品的在四个浓度水平(LLOQ、LQC、MQC、HQC)下的QC标准物与每批患者样品一起进行消化和分析。由非零校准标准物的准确度百分比以及QC的准确度百分比和变化系数限定LC-MRM-MS测定的运行接受标准。校准标准物的测量浓度的准确度必须在LLOQ下标称浓度的25％以内，并且在所有其他浓度下在标称浓度的20％以内。至少三分之二的测量QC浓度必须在其相应标称值的20％或25％(LLOQ)以内。QC在每个水平下的至少两个复制品应当在其标称浓度的20％或25％(LLOQ)以内。精确度的接受标准是在每个浓度水平下确定的并且应当在20％以内。所测量的所有给药前患者血清样品对于mAb1和mAb2两者具有低于LLOQ的响应，这进一步验证了该LC-MRM-MS测定的选择性。

施用单剂量注射后血清药物浓度的时间分布来确定mAb1和mAb2的药代动力学参数，如图7所示。结果表明，抗体药物浓度在静脉注射1小时内达到最大值并随时间而衰减。每种抗体的药代动力学是线性的且成剂量比例的，并且第29天时血清中的药物浓度保持在基于体外和临床前数据的预测中和目标浓度以上(Hansen等人；Baum等人；Weinrich等人)。开发的测定的线性度范围覆盖来自这两个剂量组的所有临床样品以及药物输注后一个月内的六个PK采样时间点。

实例4.通过免疫测定进行的方法验证

免疫测定传统上一直是用于确定血清基质中的抗体药物浓度以进行临床样品分析的首选方法。免疫测定将蛋白质靶标作为完整分子进行测量，而不是像LC-MRM-MS测定中那样测量源自蛋白酶消化的替代片段。临床PK免疫测定开发最关键的试剂是与抗体药物的独特型特异性结合的抗独特型抗体，并且筛选和生产这些试剂通常需要花费几个月。免疫测定通常在ng-mL范围内提供非常好的灵敏度，这是传统LC-MRM测定在没有附加免疫亲和富集步骤的情况下所无法达到的。免疫测定的另一个优点是，一旦方法建立，就可以以高通量的形式进行一大批患者样品分析。

在完全验证了REGEN-COV电化学发光免疫测定之后，用该方法来重新分析了I期临床样品。比较通过免疫测定与通过本发明的LC-MRM-MS方法测量的浓度之间的结果，如图7所示。比较表明，这两种测定的结果之间具有良好的一致性。来自通过这两种测定测量的个体患者(每剂量组n＝15～20)的平均药物浓度差异为mAb1在23％以内并且mAb2在11％以内。这验证了，本发明的LC-MRM-MS方法对于抗体治疗学的准确、灵敏和特异性测量是有效的，同时与依赖于抗独特型抗体试剂的免疫测定相比具有更快开发的优点。

Claims

1.一种用于同时对至少两种治疗蛋白进行定量的方法，所述方法包括：

(a)获得包含第一治疗蛋白和第二治疗蛋白的样品；

(b)通过使所述样品与至少两种消化酶接触来针对所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白中的每一者生成至少一种独特的替代肽；

(c)使用质谱仪对所述替代肽进行定量；以及

(d)使用经定量的替代肽对所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化酶选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、LysC、LysN、AspN、GluC和ArgC组成的组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化酶是胰蛋白酶和AspN。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白选自由抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物或融合蛋白组成的组。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一治疗蛋白是卡西瑞单抗并且所述第二治疗蛋白是伊德维单抗。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极质谱仪。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪与色谱系统联用。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述色谱系统包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括人血清。

10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用对潜在替代肽的计算机模拟分析选择所述消化酶。

11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括向受试者施用所述第一治疗蛋白和所述第二治疗蛋白。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有所述样品中约10至约2000μg/mL所述第一治疗蛋白的动态范围。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有所述样品中约10至约2000μg/mL所述第二治疗蛋白的动态范围。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪能够执行多反应监测或平行反应监测。

15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：对所述替代肽进行肽作图、选择所述替代肽的独特肽和碎片离子以生成多反应监测跃迁、选择所述替代肽的前两个或前三个跃迁、优化所述替代肽的碰撞能量、随后生成校准曲线以及根据所述校准曲线确定LLOQ(量化下限)。

16.根据权利要求1所述的方法，进一步包括选择对所述第一治疗蛋白或所述第二治疗蛋白具有特异性的所述至少一种替代肽，其中通过确定以下各项来预先选择所述至少一种替代肽：

i.所述替代肽对待量化的所述治疗蛋白的消化物具有特异性；

ii.在不存在所述至少一种治疗蛋白的情况下，所述替代肽特异性地不存在于制剂的蛋白酶消化物中；

iii.所述替代肽在质谱分析中产生强信号；并且

iv.所述替代肽在质谱分析中产生可区分信号。

17.一种用于从施用的抗体混合物中同时对卡西瑞单抗和伊德维单抗进行定量的方法，所述方法包括：

(a)获得包含卡西瑞单抗和伊德维单抗的血清样品；

(b)通过使所述样品与胰蛋白酶和AspN接触来针对卡西瑞单抗和伊德维单抗中的每一者生成至少一种独特的替代肽；

(c)使用质谱仪对所述替代肽进行定量；以及

(d)使用经定量的替代肽对卡西瑞单抗和伊德维单抗进行定量。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述替代肽包含氨基酸序列LLIYAASNLETGVPSR和DTAVYYCASGS。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极质谱仪。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述质谱仪与液相色谱系统联用。

21.根据权利要求17所述的方法，进一步包括向受试者施用卡西瑞单抗和伊德维单抗。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述质谱仪能够执行多反应监测或平行反应监测。