KR20210153102A

KR20210153102A - 숙주세포 단백질의 확인

Info

Publication number: KR20210153102A
Application number: KR1020217037223A
Authority: KR
Inventors: 이-수안 천; 닝 리; 후이 샤오
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2021-12-16
Also published as: MX2021012677A; IL287246A; SG11202111200QA; BR112021020378A2; US12117452B2; US20200333353A1; WO2020214777A1; AU2020257220A1; CN114144672A; CA3136813A1; EA202192850A1; JP2022528807A; EP3956668A1

Abstract

샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계; 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계; 및 바람직하게는 질량분석기기로, 숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함한다.

Description

숙주세포 단백질의 확인

본 발명은 일반적으로 숙주세포 단백질을 확인하는 방법과 관련이 있다.

단백질-기반 바이오 의약품은 암, 자가면역질환, 감염 및 심장대사 장애의 치료를 위한 중요한 약물로 부상하였으며, 이들은 제약 산업의 급속도로 성장하는 제품 부문 중 하나에 해당한다. 단백질-기반 바이오 의약품은 매우 높은 순도 기준을 반드시 충족해야 한다. 따라서, 약물 개발, 생산, 보관 및 취급의 여러 단계에서 이러한 바이오 의약품 내 임의의 불순물을 모니터링하는 것이 중요할 수 있다.

예를 들어, 숙주세포 단백질 (HCP)은 세포-기반 시스템을 사용하여 개발된 단백질-기반 바이오 의약품에 존재할 수 있다. 완제의약품 내 HCP의 존재는 모니터링할 필요가 있으며, 일정량 이상에서는 허용불가능할 수 있다. HCP 특성 검정을 위한 분석적 방법은 충분한 정확도 및 분해능을 보여야 한다. 직접적 분석은 검정을 위해 충분히 많은 양의 생성물의 단리가 요구될 수 있으며, 이는 바람직하지 않고 선택된 경우에만 가능하였다. 따라서, 압도적으로 높은 농도의 활성 약물과 혼합된 경우, 샘플에서 HCP를 특성화하기 위한 워크플로우 및 분석적 테스트를 결정하는 것은 어려운 과제이다. 전술한 내용으로부터 샘플에서 HCP를 특성화하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 존재함을 인식할 것이다.

요약

바이오 의약품 개발의 핵심 기준은 생성물에서 불순물을 모니터링하는 것일 수 있다. 이러한 불순물이 발생하는 경우, 이들의 확인 및 정량화가 생물공정에서 중요한 단계를 구성한다.

본원에 개시된 예시적인 구현예는 숙주세포 단백질(들)을 확인하기 위한 방법을 제공함으로써 전술한 요구를 충족시킨다.

하나의 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계 및 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 단백질 해리는 단백질 해리제를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 또 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트 및 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 본질적으로 분해될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 100 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 다른 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 50 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1 ppm 농도의 숙주세포 단백질을 검출하도록 구성될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배까지 농축시킨다. 이 구현예의 일 측면에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 다른 측면에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

하나의 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계, 및 여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 단백질 해리는 단백질 해리제를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 또 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트 및 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 본질적으로 분해될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 100 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 50 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1 ppm일 수 있는, 방법의 검출 한계 농도의 숙주세포 단백질만을 검출하도록 구성될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배까지 농축시킨다. 이 구현예의 일 측면에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 다른 측면에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 가수분해제는 트립신일 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 상기 방법은 여과된 숙주세포 단백질을 단백질 환원제에 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 환원제는 TCEP일 수 있다. 이 구현예의 다른 측면에서, 상기 방법은 여과된 숙주세포 단백질을 단백질 알킬화제에 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 알킬화제는 CAA일 수 있다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 상기 방법은 여과된 숙주세포 단백질을 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

하나의 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계 및 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 단백질 해리는 단백질 해리제를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 단백질 해리는 단백질 해리제를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 또 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트 및 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 본질적으로 분해될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 100 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 50 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 숙주세포 단백질의 확인은 질량 분석계를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 결합될 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 나노 액체 크로마토그래피 시스템일 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 질량 분석계는 탠덤 질량 분석계일 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1 ppm 농도의 숙주세포 단백질을 검출하도록 구성될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배까지 농축시킨다. 이 구현예의 일 측면에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

하나의 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계, 여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계 및 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 단백질 해리는 단백질 해리제를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 또 다른 특정 측면에서, 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트 및 N-라우로일사르코신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 해리제는 본질적으로 분해될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 100 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 50 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 가수분해제는 트립신일 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1 ppm 농도의 숙주세포 단백질을 검출하도록 구성될 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배까지 농축시킨다. 이 구현예의 일 측면에서, 숙주세포 단백질의 확인은 질량 분석계를 사용하여 수행될 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 결합될 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 나노 액체 크로마토그래피 시스템일 수 있다. 이 구현예의 다른 특정 측면에서, 질량 분석계는 탠덤 질량 분석계일 수 있다. 이 구현예의 일 측면에서, 상기 방법은 여과된 숙주세포 단백질을 단백질 환원제에 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 환원제는 TCEP일 수 있다. 이 구현예의 다른 측면에서, 상기 방법은 여과된 숙주세포 단백질을 단백질 알킬화제에 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 구현예의 특정 측면에서, 단백질 알킬화제는 CAA일 수 있다. 이 구현예의 또 다른 측면에서, 상기 방법은 여과된 숙주세포 단백질을 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 예시적인 구현예에 따른 분자량 컷오프 여과를 이용한 HCP (숙주세포 단백질) 확인의 실험적 워크플로우를 나타낸다.
도 2는 NIST 표준물질의 직접적 소화로부터 얻은 총 이온 크로마토그래피 그래프를 나타낸다.
도 3은 예시적인 구현예에 따른 HCP 확인 방법으로 처리된 NIST 표준물질로부터 얻은 총 이온 크로마토그래피 그래프를 나타낸다.
도 4는 예시적인 구현예에 따른 HCP 확인 방법의 여부에 따라 m/z 546.60³⁺를 갖는 하나의 펩티드의 XIC를 나타낸다.
도 5는 예시적인 구현예에 따른 HCP 확인 방법 전후로 NIST 표준물질의 스트레스-유도 인단백질 1로부터 펩티드 LAYINPADLAEEK의 표적화된 정량화 (PRM)를 나타낸다.
도 6은 예시적인 구현예에 따라 수행된 HCP 확인 방법의 중복 실행 간에 중첩된 단백질 및 펩티드를 확인하는 벤 다이어그램을 나타낸다.
도 7은 예시적인 구현예에 따라 수행된 HCP 확인 방법의 2개의 개별 중복 실행에서 단백질 및 펩티드 강도의 비교를 나타낸다.
도 8은 예시적인 구현예에 따라 수행된 HCP 확인 방법, 제한된 소화 및 2D LC-MS/MS 방법 간의 확인 비교의 벤 다이어그램을 나타낸다.

최초의 치료용 단클론성 항체 (mAb)인 muromona-CD3가 급성 거부반응이 있는 장기 이식 환자를 치료하기 위해 1992년 FDA에 의해 승인된 이후, 80개 이상의 치료용 mAb가 큰 성공과 함께 임상 사용을 위해 승인되었다. 이러한 치료용 단백질의 세포-기반 생성 동안, 최종 단백질 기반 의약완제품은 임상 사용 전에 세포로부터의 불순물이 허용가능한 낮은 수준이 되도록 고도로 정제되어야 한다. 불순물, 특히 포유동물 발현 시스템(예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포)으로부터 유래된 숙주세포 단백질 (HCP)은 모니터링되도록 요구된다. 최종 약물 물질의 HCP에 대한 일반 지침은 100 ppm 미만이다 (John H. Chon & Gregory Zarbis-Papastoitsis,　Advances in the production and downstream processing of antibodies, 28　NEW BIOTECHNOLOGY　458-463 (2011)). 그러나, 약물 물질에 낮은 수준으로 존재하는 총 HCP 불순물이라도, 미량의 HCP는 주사 후 독성이 있거나 생물학적으로 활성인 면역반응을 유발할 수 있는 일부 특정 HCP에 대해 허용가능하지 않을 수 있다 (J.R. Bierich,　Treatment of Pituitary Dwarfism with Biosynthetic Growth Hormone, 75　ACTA PAEDIATRICA　13-18 (1986); T. Romer 등,　Efficacy and safety of a new ready-to-use recombinant human growth hormone solution, 30　JOURNAL OF ENDOCRINOLOGICAL INVESTIGATION　578-589 (2007); Daniel G. Bracewell, Richard Francis & C. Mark Smales,　The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control, 112　BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 1727-1737 (2015); Saloumeh Kadkhodayan Fischer 등,　Specific Immune Response to Phospholipase B-Like 2 Protein, a Host Cell Impurity in Lebrikizumab Clinical Material, 19　THE AAPS JOURNAL　254-263 (2016)). 또한 HCP가 항체를 분해하는 가능성 또는 항체 결합을 변경하는 가능성과 관련이 있는 경우에도 허용할 수 없다 (Nitin Dixit 등,　Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles, 105　JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 1657-1666 (2016); Troii Hall 등,　Polysorbates 20 and 80 Degradation by Group XV Lysosomal Phospholipase A2 Isomer X1 in Monoclonal Antibody Formulations., 105　JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 1633-1642)). 따라서, 모든 HCP 구성요소 개별적으로 모니터링할 수 있는 방법을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

전통적으로, 다클론성 항-HCP 항체를 사용한 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)이 전체 HCP 존재비를 정량화하는 데 사용되었다 (Denise C. Krawitz 등,　Proteomic studies support the use of multi-product immunoassays to monitor host cell protein impurities, 6　PROTEOMICS　94-110 (2006); Catherine Em Hogwood, Daniel G Bracewell & C Mark Smales,　Host cell protein dynamics in recombinant CHO cells, 4　BIOENGINEERED　288-291 (2013)). 개별 HCP 구성요소의 측정에 대한 요구를 고려해 볼 때, ELISA는 HCP의 수준 평가를 위한 최종 솔루션이 아닐 수 있다. 또한, 일부 약하거나 비면역원성 HCP는 ELISA 검출을 위한 항체를 생성하지 않을 수 있고, 따라서 이러한 HCP는 검출될 수 없다.

다수의 보완 분석적 접근법이 1D/2D-PAGE 및 질량분석기기 기반 분석 기술을 포함하여, HCP를 모니터링하는데 이용되었다 (Julita K. Grzeskowiak 등,　Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparison of affinity and non-affinity based downstream processing of recombinant monoclonal antibody, 1216　JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A　4902-4912 (2009); Catalin Doneanu 등,　Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry, 4　mAbs　24-44 (2012); Mi Jin 등,　Profiling of host cell proteins by two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE): Implications for downstream process development, 105　BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 306-316 (2010)). 액체 크로마토그래피가 결합된 탠덤 질량분석기기 (LC-MS/MS)는 또한 HCP 불순물에 대하여 동시에 확인 및 정량화 둘 다를 위한 수단을 제공할 수 있으며, 이는 ELISA 검정을 보완하는 주요 직교 방법으로 부상하였다. 그러나, 질량분석기기 기반 방법에 대한 주요 과제는 압도적인 고농축 항체 약물 물질과 혼합된 경우에 질량 분석계만으로 저농도의 HCP를 검출하는 능력이 부족하다는 것이다. 낮은 ppm 수준의 HCP와 높은 존재비(abundance)의 치료용 항체 사이의 광범위한 동적 범위 (6 초과 자릿수)의 문제를 극복하기 위한, 한 가지 전략은 분리 효율성을 증가시키고자 데이터 종속 수집(data-dependent acquisition) 또는 데이터 독립 수집(data-independent acquisition) 상에 2D-LC 및 이온 이동성과 같은 또 다른 차원의 분리를 추가하여, 질량분석기기 분석 전에 펩티드의 동시-용출을 해결하는 것이다. 한 연구에서, Ecker 등은 데이터 독립 수집과 함께 LC-MS/MS를 사용하여 한 자릿수 ppm 수준의 HCP 확인을 보고하였으며, 이들은 또한 null 균주로부터의 HCP에 대한 질량, 체류시간 및 단편 이온을 포함하는 라이브러리를 확립하였다. 이 방법은 민감하지만, 이 방법은 단지 특정 생성물과 동시-발현되는 HCP를 손실시킬 수 있다 (Dawn M Ecker, Susan Dana Jones & Howard L Levine,　The therapeutic monoclonal antibody market, 7　mAbs　9-14 (2014)). 또 다른 연구는 이온 이동성이 있는 2D-HPLC를 사용하여 10 내지 50 ppm의 HCP를 확인하는 능력을 보여주었다 (Catalin Doneanu 등,　Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry, 4　mAbs　24-44 (2012)). 그러나, 2D-LC의 주기 시간이 매우 길고, 이 방법은 낮은 수준의 HCP (<10 ppm) 분석에 충분히 민감하지 않다. 다른 전략은 친화성 정제, 제한된 소화로 샘플에서 항체를 제거함으로써, 또는 다클론성 항체를 사용하여 HCP를 포획함으로써, HCP를 농축하는 샘플 준비에 중점을 둔다 (Lihua Huang 등,　A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies, 89　ANALYTICAL CHEMISTRY 5436-5444 (2017); Jenny Heidbrink Thompson 등, Improved detection of host cell proteins (HCPs) in a mammalian cell-derived antibody drug using liquid chromatography/mass spectrometry in conjunction with an HCP-enrichment strategy, 28　RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY 855-860 (2014); James A Madsen 등,　Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis, 7　mAbs　1128-1137 (2015)).

기존 방법의 주요 과제 중 하나는 HCP와 약물 사이의 광범위한 동적 범위 (5-8 차수)를 가진 샘플 (예를 들어, 0.01-10 ppm)에서 저농도의 HCP 검출에 대한 능력의 부족일 수 있으며, 이는 HCP 신호가 분석에서 마스킹되는 것을 유발할 수 있다.

기존 방법의 한계를 고려하여, HCP 확인을 위한 효과적이고 효율적인 방법을 개발하였다.

달리 기술되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 재료가 기술된다. 언급된 모든 간행물은 여기에 참조로 포함된다.

용어 "하나"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 편차를 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 개시는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하기 위한 방법이다.

본원에 사용된 용어, "숙주세포 단백질"은 숙주세포로부터 유래된 단백질을 포함하고, 소정의 관심 단백질과 관련이 없을 수 있다. 숙주세포 단백질은 제조 공정으로부터 유래할 수 있는 공정-관련 불순물일 수 있으며, 세포 기질 유래, 세포 배양 유래 및 다운스트림 유래의 세 가지 주요 범주를 포함할 수 있다. 세포 기질 유래 불순물에는 숙주 유기체 및 핵산 (숙주세포 게놈, 벡터, 또는 총 DNA)으로부터 유래된 단백질이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 세포 배양 유래 불순물에는 유도제, 항생제, 혈청 및 기타 배지 성분을 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 다운스트림 유래 불순물에는 효소, 화학적 및 생화학적 처리 시약 (예를 들어, 브롬화 시아노겐, 구아니딘, 산화제 및 환원제), 무기염 (예를 들어, 중금속, 비소, 비금속 이온), 용매, 담체, 리간드 (예를 들어, 단클론성 항체), 및 기타 침출물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

세포-기반 시스템을 사용하여 단백질을 제조하는 동안, 생성물 자체는 임의의 세포-기반 불순물에서 허용가능한 수준으로 사용 전에 정제되어야 한다. 발현 시스템으로부터 유래될 수 있는 불순물은, 수확을 위해 수집되는 세포 배양액에 분비된 관심 단백질 뿐만 아니라, 생성물 불순물과 함께 배양 배지로 방출될 수 있는 숙주세포 단백질(들) (HCP), 핵산, 지질 및 기타 세포 물질이다 (상기 Bracewell 참조). 특히 HCP는, 위험 또는 생성물 분해 측면에서 특정 HCP에 대해 허용불가능하거나 생성물의 면역원성 형태의 발달로 이어질 수 있으므로, 최종 생성물에서 반드시 모니터링되어야 한다. 다운스트림 공정(downstream processing)은 분리를 사용하여 HCP의 다양한 스펙트럼으로부터 관심 단백질을 분리할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스는 관심 단백질을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "관심 단백질"은 공유 결합으로 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 당업계에서 일반적으로 "폴리펩티드"로 알려진, 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 펩티드 결합을 통해 연결된 이의 관련된 자연 발생 구조적 변이체, 및 합성 비-자연 발생 유사체, 이의 관련된 자연 발생 구조적 변이체, 및 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고상 펩티드 합성 방법이 당업자에게 알려져 있다. 단백질은 하나 또는 다수의 폴리펩티드를 함유하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 단백질은 임의의 생체치료용 단백질, 연구 또는 치료법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 인간 항체, 및 이중특이성 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 측면에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 재조합 세포-기반 생성 시스템, 예컨대 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템 (예를 들어, 피키아(Pichia) 종), 포유동물 시스템 (예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)을 사용하여 생성될 수 있다. 생체치료용 단백질 및 이의 생성을 논의하는 리뷰는 Ghaderi 등, "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (BIOTECHNOL. GENET. ENG. REV. 147-175 (2012))를 참조한다. 일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 변형, 부가물, 및 기타 공유 결합으로 연결된 모이어티(moiety)를 포함한다. 이러한 변형, 부가물 및 모이어티는 예를 들어 아비딘, 스트렙트아비딘, 비오틴, 글리칸 (예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스, 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAGtag, 말토스 결합 단백질 (MBP), 키틴 결합 단백질 (CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도를 기준으로 분류될 수 있으며, 따라서 단순 단백질, 예컨대, 구상 단백질 및 섬유성 단백질; 접합 단백질, 예컨대, 핵단백질, 당단백질, 뮤코단백질, 색소단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지방단백질; 및 유도 단백질, 예컨대, 1차 유도 단백질 및 2차 유도 단백질을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질은 항체, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 항체 단편, 단클론성 항체, 숙주세포 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.

본원에 사용된 용어, "항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이의 다량체 (예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (C.sub.L1)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되는, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 상이한 예시적인 구현예에서, 항-big-ET-1 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식세포계열 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석을 기반으로 정의될 수 있다. 본원에 사용된 용어, "항체"는 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다.

본원에 사용된 용어, 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함하며, 이는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 단백질분해 소화 또는 재조합 유전공학 기법을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 알려져 있고/있거나 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 쉽게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배치로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 추가 또는 결실시키는 등의 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 시퀀싱되고 조작될 수 있다.

본원에 사용된, "항체 단편"은 예를 들어, 항체의 항원 결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디(diabody), dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 뿐만 아니라 항체 단편으로부터 형성된 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 다중 특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자이다. 항체 단편은 다양한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 예를 들어, 이황화 결합에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 단클론성 항체는 당업계에서 이용가능하거나 알려진 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시에 유용한 단클론성 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 알려진 매우 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.

특정 측면에서, 관심 단백질은 애플리버셉트, 재조합 Mini-Trap (이의 예는 미국특허 제7,279,159호에 개시되어 있음), scFv 및 기타 항-VEGF 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 측면에서, 관심 재조합 단백질은 애플리버셉트이다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스는 선택적으로 생성물-관련 불순물을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "생성물-관련 불순물" (예를 들어, 전구체, 특정 분해 생성물)은 제조 및/또는 보관 중에 발생하는 분자 변이체일 수 있으며, 이는 활성, 효능, 및 안전성과 관련하여 소정의 생성물과 필적하는 특성을 갖지 않는다. 이러한 변이체는 변형(들)의 유형을 확인하기 위해 단리 및 특성화에 상당한 노력이 필요할 수 있다. 생성물-관련 불순물에는 절단된 형태, 변형된 형태, 및 응집체가 포함될 수 있다. 절단된 형태는 펩티드 결합의 절단을 촉매하는 가수분해 효소 또는 화학물질에 의해 형성된다. 변형된 형태는 이에 제한되지는 않으나, 탈아미드화, 이성질화, 미스매치 S-S 연결, 산화, 또는 변경된 접합 형태 (예를 들어, 글리코실화, 인산화)를 포함한다. 변형된 형태는 또한 번역 후 임의의 변형 형태를 포함할 수 있다. 응집체는 이량체 및 더 높은 배수의 소정의 생성물을 포함한다. (Q6B 사양: 생명공학/생물학적 생성물에 대한 테스트 절차 및 허용 기준, ICH 1999년 8월, 미국 보건복지부).

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스는 단백질 제제일 수 있다.

본원에 사용된 용어, "단백질 제제"는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클과 함께 제형화되는 치료 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 치료 요법에서 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다. 일부 예시적인 구현예에서, 제제는 이에 제한되지는 않으나 완충제, 증량제, 장성 개질제(tonicity modifier), 계면활성제, 가용화제, 및 보존제를 포함하는 부형제를 더 포함할 수 있다. 다른 추가의 부형제는 또한 기능을 기반으로 선택될 수 있고, 제형과의 호환성은 예를 들어 Loyd V. Allen,　Remington: the science and practice of pharmacy　(19 ed. 1995), John E Hoover,　Remington's Pharmaceutical Sciences　(1975), 및 Lyod Allen,　Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems　(10 ed.)에서 확인할 수 있으며, 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계를 포함할 수 있다. 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리하는 단계는 단백질 해리제를 사용하여 수행될 수 있다. 단백질 해리제의 비제한적인 예는 열, 고 pH 또는 저 pH, 또는 카오트로픽제(chaotropic agent)에 대한 노출을 포함한다. 여러 카오트로픽제는 단백질 해리제로 사용될 수 있다. 카오트로픽 용질은 비공유력(non-covalent force), 예컨대 수소 결합, 반데르발스 힘 및 소수성 효과에 의해 매개되는 분자내 상호작용(intramolecular interaction)을 방해함으로써 시스템의 엔트로피를 증가시킨다. 카오트로픽제의 비제한적인 예는 부탄올, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 프로판올, 소듐 도데실 설페이트, 티오우레아, N-라우로일사르코신, 우레아, 및 이들의 염을 포함한다. 일 측면에서, 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계는 관심 단백질을 변성시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계는 숙주세포 단백질을 변성시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어, "변성"은 펩티드 결합의 파열 없이 분자의 3차원 형태가 이의 천연 상태로부터 변화되는 과정을 지칭한다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "분자량 컷오프 필터"는 적어도 약 90%의 용질 또는 알려진 분자량 (KDa)의 단백질을 보유하는 능력을 가질 수 있는 필터 또는 멤브레인 또는 여과 방법을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 30 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 일부 다른 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 50 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 일부 추가의 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터는 적어도 약 100 KDa의 컷오프를 가질 수 있다. 분자량 컷오프 필터는 여러 상업적 공급업체, 예를 들어 Microcon, Millipore, Centrisart, Sartorius, Amicon Ultra, Millipore, Vivaspin, 및 Sartorius로부터 구입할 수 있다. 분자량 컷오프 필터는 요구된 분자량 컷오프, 작동 조건, 여과된 샘플의 농도 또는 여과된 샘플의 구성성분을 기준으로 선택될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계 및 여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "가수분해제"는 단백질의 소화를 수행할 수 있는 다수의 상이한 제제 중 임의의 하나 또는 조합을 지칭한다. 효소적 소화를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예는 트립신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 외막 프로테아제 T (OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스 (IdeS)의 면역글로불린-분해 효소, 키모트립신, 펩신, 서모리신, 파파인, 프로나제, 및 아스퍼질러스 사이토이(Aspergillus Saitoi) 유래 프로테아제를 포함한다. 비효소적 소화를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예는 고온, 마이크로파, 초음파, 고압, 적외선, 용매 (비제한적인 예는 에탄올 및 아세토니트릴), 고정화 효소 소화(immobilized enzyme digestion; IMER), 자성 입자 고정화 효소, 및 온칩(on-chip) 고정화 효소의 사용을 포함한다. 단백질 소화에 사용가능한 기법을 논의하는 최근 리뷰는 Switazar 등, "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (Linda Switzar, Martin Giera & Wilfried M. A. Niessen,　Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments, 12　Journal of Proteome Research　1067-1077 (2013))를 참조한다. 가수분해제 중 하나 또는 조합은 서열-특이적 방식으로, 단백질 또는 폴리펩티드의 펩티드 결합을 절단하여, 예측가능한 더 짧은 펩티드 집합을 생성할 수 있다.

용어 가수분해제 대 단백질의 비율 및 소화에 필요한 시간은 적절하게 선택되어 단백질의 소화를 달성할 수 있다. 효소 대 기질 비율이 부적절하게 높을 시, 상대적으로 높은 소화율은 펩티드가 질량 분석계로 분석되는 데 충분한 시간을 허용하지 않을 것이며, 서열 범위(sequence coverage)는 훼손될 것이다. 반면에, 낮은 E/S 비율은 긴 소화를 필요로 하고, 따라서 데이터 획득 시간이 길어진다. 효소 대 기질 비율은 약 1:0.5 내지 약 1:200의 범위일 수 있다. 본원에 사용된 용어, "소화"는 단백질의 하나 이상의 펩티드 결합의 가수분해를 지칭한다. 적절한 가수분해제, 예를 들어 효소적 소화 또는 비효소적 소화를 사용하여 샘플에서 단백질의 소화를 수행하는 여러 접근법이 있다.

샘플에서 단백질의 소화를 위해 널리 인정되는 방법 중 하나는 프로테아제의 사용이 포함된다. 많은 프로테아제가 이용가능하며 이들 각각은 특이성, 효율성, 및 최적의 소화 조건 측면에서 그 자체의 특성을 갖는다. 프로테아제는 펩티드 내의 비-말단 또는 말단 아미노산을 절단하는 프로테아제의 능력을 기반으로 분류된, 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 둘 다를 지칭한다. 대안적으로, 프로테아제는 또한 촉매작용의 메커니즘에 따라 분류된, 6가지 별개의 분류 - 아스파르틱, 글루타믹, 및 메탈로프로테아제, 시스테인, 세린, 및 트레오닌 프로테아제를 지칭한다. 용어 "프로테아제" 및 "펩티다제"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.

상기 방법은 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계 외에도, 숙주세포 단백질을 환원시키는 단계, 숙주세포 단백질을 알킬화시키는 단계, 숙주세포 단백질을 완충시키는 단계, 및/또는 샘플 매트릭스를 탈염시키는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 원하는 대로 임의의 적합한 방식으로 달성될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 숙주세포 단백질을 단백질 환원제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질 환원제"는 단백질에서 이황화 가교의 환원에 사용되는 제제를 지칭한다. 단백질을 환원시키는데 사용되는 단백질 환원제의 비제한적인 예는 디티오트레이톨 (DTT), β-메르캅토에탄올, 엘만 시약, 히드록실아민 하이드로클로라이드, 소듐 시아노보로하이드라이드, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP-HCl), 또는 이들의 조합이다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 선택적으로 숙주세포 단백질을 단백질 알킬화제에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "단백질 알킬화제"는 단백질에서 특정 유리 아미노산 잔기를 알킬화하기 위해 사용되는 제제를 지칭한다. 단백질 알킬화제의 비제한적인 예는 요오드아세트아미드 (IOA), 클로로아세트아미드 (CAA), 아크릴아미드 (AA), N-에틸말레이미드 (NEM), 메틸 메탄티오설포네이트 (MMTS), 및 4-비닐피리딘 또는 이들의 조합이다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계 및 상향식 또는 샷건 프로테오믹스(shotgun proteomics) 접근법을 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

종래의 상향식 접근법 실험에서, 단백질은 특성화되기 위해 작은 폴리펩티드로 소화될 수 있다. 그 다음 펩티드 혼합물은 질량분석기기 분석에 적용될 수 있다. 펩티드 확인은 폴리펩티드 단편화로부터 유래된 질량 스펙트럼을 단백질의 인실리코(in silico) 소화로부터 생성된 이론적인 질량 스펙트럼과 비교함으로써 추가로 수행될 수 있다. 그 다음 단백질 추론은 단백질에 대한 펩티드 서열을 지정함으로써 달성된다.

일반적인 펩티드 맵핑 워크플로우는 단백질 변성, 시스테인 잔기의 환원 및 알킬화, 단백질분해 소화, 및 탠덤 질량분석기기 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피 분석을 위한 단계를 포함할 수 있다 (Pavel V. Bondarenko 등,　Mass measurement and top-down HPLC/MS analysis of intact monoclonal antibodies on a hybrid linear quadrupole ion trap-orbitrap mass spectrometer, 20　Journal of the American Society for Mass Spectrometry　1415-1424 (2009); James H. Bourell 등,　Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Recombinantly Engineered Antibody Fragments, 66　Analytical Chemistry　2088-2095 (1994); Wei Zhang 등,　Complete disulfide bond assignment of a recombinant immunoglobulin G4 monoclonal antibody, 311　Analytical Biochemistry　1-9 (2002); Daniel J. Kroon 등,　Rapid profiling of carbohydrate glycoforms in monoclonal antibodies using MALDI/TOF mass spectrometry, 13　Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis　1049-1054 (1995); B. W. Gibson & K. Biemann,　Strategy for the mass spectrometric verification and correction of the primary structures of proteins deduced from their DNA sequences., 81　Proceedings of the National Academy of Sciences　1956-1960 (1984); Dirk Chelius, Douglas S. Rehder & Pavel V. Bondarenko,　Identification and Characterization of Deamidation Sites in the Conserved Regions of Human Immunoglobulin Gamma Antibodies, 77　Analytical Chemistry　6004-6011 (2005); Neil Kelleher,　Top-down proteomics; 76　ANALYTICAL CHEMISTRY　197A-203A (2004); Yuan Mao 등,　Top-Down Structural Analysis of an Intact Monoclonal Antibody by Electron Capture Dissociation-Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-Mass Spectrometry, 85　Analytical Chemistry　4239-4246 (2013); Yury O. Tsybin 등,　Structural Analysis of Intact Monoclonal Antibodies by Electron Transfer Dissociation Mass Spectrometry, 83　Analytical Chemistry　8919-8927 (2011); Luca Fornelli 등,　Analysis of Intact Monoclonal Antibody IgG1 by Electron Transfer Dissociation Orbitrap FTMS, 11　Molecular & Cellular Proteomics　1758-1767 (2012); Catherine A. Srebalus Barnes & Amareth Lim,　Applications of mass spectrometry for the structural characterization of recombinant protein pharmaceuticals, 26　Mass Spectrometry Reviews　370-388 (2007)). 액체 크로마토그래피 및 질량분석기기 장치의 급속한 발전으로 인해, 이 펩티드 맵핑 방법은 이제 정례적으로 거의 완전한 서열 범위를 생성할 수 있고, 따라서 단클론성 항체 동일성을 검증하기 위한 효과적인 접근법이 되었다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 숙주세포 단백질을 여과하는 단계 및 질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "질량 분석계"는 특정 분자 종을 확인하고 이의 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 상기 용어는 폴리펩티드 또는 펩티드가 검출 및/또는 특성화를 위해 용출될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미한다. 질량 분석계는 이온 공급원(ion source), 질량 분석기, 및 검출기의 3가지 주요 부분을 포함할 수 있다. 이온 공급원의 역할은 기상(gas phase) 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자 또는 클러스터는 기상으로 운반되고 동시에 (전기분무 이온화에서와 같이) 또는 별도의 공정을 통해 이온화될 수 있다. 이온 공급원의 선택은 적용에 따라 크게 달라진다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석계는 탠덤 질량 분석계일 수 있다.

본원에 사용된 용어, "탠덤 질량 분석법"은 질량 선택 및 질량 분리의 다중 단계를 사용함으로써 샘플 분자에 대한 구조 정보를 얻는 기법을 포함한다. 전제조건은 샘플 분자가 기상으로 운반되어 온전하게 이온화될 수 있고 첫번째 질량 선택 단계 후 일부 예측가능하고 제어가능한 방식으로 분해되도록 유도될 수 있다는 것이다. 다단계 MS/MS, 또는 MSⁿ은, 의미있는 정보를 얻을 수 있거나 단편 이온 신호가 검출가능한 한, 먼저 전구체 이온 (MS²)을 선택하고 단리하여, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온 (MS³)을 단리하여, 이를 단편화하고, 2차 단편 (MS⁴)을 단리하는 등에 의해 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 매우 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 적용을 위해 결합하는 분석기는 다수의 다양한 인자, 예컨대 감도, 선택성, 및 속도 뿐만 아니라, 크기, 비용, 및 가용성에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 2가지 주요 카테고리는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 또한 탠덤-인-타임 분석기가 공간 내에서 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 결합된 하이브리드도 있다. 탠덤-인-스페이스 질량 분석계는 이온 공급원, 전구체 이온 활성화 장치, 및 적어도 2개의 비포착(non-trapping) 질량 분석기를 포함한다. 특정 m/z 분리 기능은 기기의 한 섹션에서 이온이 선택되고, 중간 영역에서 해리된 다음, m/z 분리 및 데이터 습득을 위해 생성 이온이 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다. 탠덤-인-타임에 있어서, 이온 공급원에 생성된 질량 분석계 이온은 동일한 물리적 장치에 포획되고, 단리되며, 단편화되고, m/z 분리될 수 있다.

질량 분석계로 확인된 펩티드는 온전한 단백질 및 번역 후 변형을 대표하는 대리로 사용할 수 있다. 이들은 실험적 및 이론적 MS/MS 데이터를 연관시켜 단백질 특성화에 사용할 수 있으며, 후자는 단백질 서열 데이터베이스에서 가능한 펩티드로부터 생성된다. 상기 특성화는 단백질 단편의 아미노산 시퀀싱, 단백질 시퀀싱 결정, 단백질 드노보(de novo) 시퀀싱 결정, 번역 후 변형 위치파악, 또는 번역 후 변형 확인, 또는 비교가능성 분석, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어, "데이터베이스"는 데이터베이스(들)의 모든 가능한 서열에 대해 해석되지 않은 MS-MS 스펙트럼을 검색할 수 있는 가능성을 제공하는 생물정보학 도구를 지칭한다. 이러한 도구의 비제한적인 예는 Mascot (http://www.matrixscience.com), Spectrum Mill (http://www.chem.agilent.com), PLGS (http://www.waters.com), PEAKS (http://www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx (http://www.phenyx-ms.com), Sorcerer (http://www.sagenresearch.com), OMSSA (http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem (http://www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (http://www. http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (https://www.proteinmetrics.com/products/byonic) 또는 Sequest (http://fields.scripps.edu/sequest)이다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 결합될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학물질 혼합물이 정지된 액상 또는 고상 주위 또는 위로 흐를 때 화학물질 실체의 차등 분포의 결과로 구성요소로 분리될 수 있는 공정을 지칭한다. 크로마토그래피의 비제한적인 예는 종래의 역상 (RP), 이온교환 (IEX) 및 순상 크로마토그래피 (NP)를 포함한다. 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 및 이온성 상호작용이 각각 지배적인 상호작용 모드인, RP, NP 및 IEX 크로마토그래피와 달리, 혼합-모드 크로마토그래피는 이러한 상호작용 모드 중 2가지 이상의 조합을 이용할 수 있다. 여러 유형의 액체 크로마토그래피, 예컨대, 고해상 액체 크로마토그래피 (rapid resolution liquid chromatography; RRLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 (ultra performance liquid chromatography; UPLC), 초고속 액체 크로마토그래피 (ultra-fast liquid chromatography; UFLC) 및 나노 액체 크로마토그래피 (nano liquid chromatography; nLC)는 질량 분석계와 함께 사용할 수 있다. 크로마토그래피 방법 및 원리에 대한 더 자세한 내용은, Colin 등 (Colin F. Poole 등,　Liquid chromatography fundamentals and instrumentation　(2017))을 참조한다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 하향식 프로테오믹스 접근법을 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법은 천연-MS를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

하향식 프로테오믹스 접근법에서, 온전한(intact) 단백질을 분석할 수 있다. 하향식 MS는 사전 지식 없이도 하나의 스펙트럼 ("조감도")에서 모든 유형의 PTM (예를 들어, 인산화, 단백질분해, 아세틸화) 및 서열 변이체 (예를 들어, 돌연변이, 다형성, 대안적으로 접합된 동형 단백질(isoform))를 동시에 검출하여 전체 단백질에 대한 포괄적인 서열 정보를 제공할 수 있다 (Neil L. Kelleher 등,　Top Down versus Bottom Up Protein Characterization by Tandem High-Resolution Mass Spectrometry, 121　Journal of the American Chemical Society　806-812 (1999); B. T. Chait,　CHEMISTRY: Mass Spectrometry: Bottom-Up or Top-Down?, 314　Science　65-66 (2006); Zachery R. Gregorich & Ying Ge,　Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities, 14　Proteomics　1195-1210 (2014)).

일부 예시적인 구현예에서, 숙주세포 단백질은 약 4.5 내지 약 9.0 범위의 pI를 가질 수 있다. 하나의 예시적인 특정 구현예에서, pI는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 또는 약 9.0일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질의 유형은 적어도 두 가지일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질의 농도는 약 0.05 ppm 미만일 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질의 농도는 약 0.05 ppm 미만, 약 1 ppm 미만, 약 2 ppm 미만, 약 3 ppm 미만, 약 4 ppm 미만, 약 5 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 30 ppm 미만, 약 40 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 60 ppm 미만, 약 70 ppm 미만, 약 80 ppm 미만, 약 90 ppm 미만, 약 100 ppm 미만, 약 150 ppm 미만, 약 200 ppm 미만, 약 250 ppm 미만, 약 300 ppm 미만, 약 350 ppm 미만, 약 400 ppm 미만, 약 450 ppm 미만, 약 500 ppm 미만, 약 550 ppm 미만, 약 600 ppm 미만, 약 650 ppm 미만, 약 700 ppm 미만, 약 750 ppm 미만, 약 800 ppm 미만, 약 850 ppm 미만, 약 900 ppm 미만, 약 950 ppm 미만, 또는 약 1000 ppm 미만일 수 있다.

다른 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스는 생물공정의 임의의 단계, 예컨대 배양 세포 배양액 (CCF), 수확된 세포 배양액 (HCCF), 공정 성능 적격성평가 (PPQ), 다운스트림 공정의 임의의 단계, 약물 용액(DS), 또는 최종 제형화된 생성물을 포함하는 완제의약품(drug product; DP)으로부터 수득할 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 구현예에서, 샘플은 정화, 크로마토그래피 정제, 바이러스 불활성화 또는 여과의 다운스트림 공정의 임의의 단계로부터 선택될 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 완제의약품은 임상, 운송, 보관, 또는 취급 중의 제조된 완제의약품으로부터 선택될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질(들)을 확인하는 방법은 적합한 온도에서 N-라우로일사르코신 또는 소듐 데옥시콜레이트 또는 둘 다를 사용하여 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 것을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 숙주세포 단백질은 숙주세포 단백질을 산성 또는 염기성 pH에 노출시킴으로써 해리될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 숙주세포 단백질은 숙주세포 단백질을 산성 pH, 예를 들어, 약 0, 또는 약 0.5, 또는 약 1, 또는 약 1.5, 또는 약 2, 또는 약 2.5, 또는 약 3, 또는 약 3.5, 또는 약 4, 또는 약 4.5, 또는 약 5, 또는 약 5.5, 또는 약 6의 pH에 노출시킴으로써 해리될 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 숙주세포 단백질은 숙주세포 단백질을 염기성 pH, 예를 들어, 약 8, 또는 약 8.5, 또는 약 9, 또는 약 9.5, 또는 약 10, 또는 약 10.5, 또는 약 11, 또는 약 11.5, 또는 약 12, 또는 약 12.5, 또는 약 13, 또는 약 13.5, 또는 약 14의 pH에 노출시킴으로써 해리될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질(들)을 확인하는 방법은 숙주세포 단백질을 알킬화하는 것을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질(들)을 확인하는 방법은 선택적으로 숙주세포 단백질을 갖는 용액을 탈염하는 단계를 포함할 수 있다. 탈염은 투석, 한외여과, 탈염 크로마토그래피 컬럼, 겔 여과 컬럼, 원심 한외여과 또는 이들의 조합을 사용하여 수행할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 해리 조건하에서 샘플을 소화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 샘플은 가수분해제를 사용하여 소화될 수 있으며, 상기 가수분해제는 아스퍼질러스 사이토이(Aspergillus Saitoi) 유래 프로테아제, 엘라스타아제, 서브틸리신, 프로테아제 XIII, 펩신, 트립신, Tryp-N, 키모트립신, 아스퍼질로펩신 I, LysN 프로테아제 (Lys-N), LysC 엔도프로테이나제 (Lys-C), 엔도프로테이나제 Asp-N (Asp-N), 엔도프로테이나제 Arg-C (Arg-C), 엔도프로테이나제 Glu-C (Glu-C) 또는 외막 단백질 T (OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스 (IdeS)의 면역글로불린-분해 효소, 서모리신, 파파인, 프로나제, V8 프로테아제 또는 생물학적 활성 단편 또는 이의 동족체 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 가수분해제를 함유하는 용액의 농도는 약 0.1 μg/μL 내지 약 100 μg/μL일 수 있다. 일 구현예에서, 용액의 농도는 약 0.1 μg/μL, 또는 약 0.2 μg/μL, 또는 0.5 μg/μL, 또는 약 1 μg/μL, 또는 약 2 μg/μL, 또는 약 3 μg/μL, 또는 약 4 μg/μL, 또는 약 5 μg/μL, 또는 약 10 μg/μL, 또는 약 15 μg/μL, 또는 약 20 μg/μL, 또는 약 25 μg/μL, 또는 약 30 μg/μL, 또는 약 35 μg/μL, 또는 약 40 μg/μL, 또는 약 45 μg/μL, 또는 약 50 μg/μL, 또는 약 60 μg/μL, 또는 약 70 μg/μL, 또는 약 80 μg/μL, 또는 약 90 μg/μL, 또는 약 100 μg/μL일 수 있다. 샘플에서 단백질의 농도는 약 0.1 μg/μL 내지 약 100 μg/μL 범위일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 상기 가수분해제 대 숙주세포 단백질의 중량비는 약 1:0.1 내지 약 1:50의 범위일 수 있다. 예를 들어, 가수분해제 대 숙주세포 단백질의 비율 (w/w)은 약 1:0.5, 또는 약 1:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5, 또는 약 1:10, 또는 약 1:15, 또는 약 1:20, 또는 약 1:25, 또는 약 1:30, 또는 약 1:35, 또는 약 1:40, 또는 약 1:45 또는 약 1:50일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질(들)을 확인하는 방법은 분자량 컷오프 필터를 사용하여 숙주세포 단백질을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 여과된 숙주세포 단백질은 해리시켜 여과할 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 구현예에서, 여과된 숙주세포 단백질은 해리 없이 여과할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터의 분자량 필터는 약 30 KDa 초과일 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터의 분자량 필터는 약 30 KDa 초과, 약 35 KDa 초과, 약 40 KDa 초과, 약 45 KDa 초과, 약 50 KDa 초과, 약 55 KDa 초과, 약 60 KDa 초과, 약 65 KDa 초과, 약 70 KDa 초과, 약 75 KDa 초과, 약 80 KDa 초과, 약 85 KDa 초과, 약 90 KDa 초과, 약 95 KDa 초과, 약 100 KDa 초과, 약 110 KDa 초과, 약 120 KDa 초과, 약 130 KDa 초과, 약 140 KDa 초과, 약 150 KDa 초과, 약 160 KDa 초과, 약 170 KDa 초과, 약 180 KDa 초과, 약 190 KDa 초과, 약 200 KDa 초과일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 숙주세포 단백질을 여과하는 단계는 숙주세포 단백질을 적어도 약 5배 농축시킨다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 상기 숙주세포 단백질의 농축은 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 95배, 적어도 약 100배, 적어도 약 105배, 적어도 약 110배, 적어도 약 115배, 적어도 약 120배, 적어도 약 125배, 적어도 약 130배, 적어도 약 135배, 적어도 약 140배, 적어도 약 145배, 적어도 약 150배, 적어도 약 155배, 적어도 약 160배, 적어도 약 165배, 적어도 약 170배, 적어도 약 175배, 적어도 약 180배, 적어도 약 185배, 적어도 약 190배, 적어도 약 195배, 또는 적어도 약 200배이다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질(들)을 확인하는 방법은 질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석계용 이온 공급원은 전기분무 주입 셋업일 수 있다. 일부 다른 예시적인 구현예에서, 질량 분석기용 질량 분석기는 비행시간 (Time-of-Flight; TOF), 자기/전기 섹터, 사중극자 질량 필터 (Q), 사중극자 이온 트랩 (QIT), 오비트랩 (orbitrap), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 (FTICR), 가속기 질량 분석 (AMS), 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 전기분무 주입 셋업은 질량 분석계와 온라인일 수 있다. 전기분무 주입 셋업은 전기분무 방출기, 분무 가스, 및/또는 ESI 전원 공급 장치를 포함할 수 있다. 전기분무 방출기는 탄소-코팅된 주입 팁을 가질 수 있다. ESI 전원 공급 장치는 질량 분석계 샘플 오리피스가 0 kV로 유지되는 동안 전기분무 방출기의 탄소-코팅된 주입 팁에 양/음의 전압을 인가할 수 있으며, 이는 방출기의 최종 샘플과 질량 분석계의 접지된 오리피스 사이에 강한 정전기장을 생성하고, 이로 인하여 전기분무를 생성한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 양의 전압은 전기분무 방출기의 탄소-코팅된 주입 팁에 인가될 수 있다. 전기분무 방출기의 탄소-코팅된 주입 팁에 인가된 양의 전압은 약 0.5 kV, 약 1 kV, 약 1.4 kV, 약 2 kV, 약 3 kV, 또는 약 4 kV로부터 선택될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피에 결합될 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 질량 분석계는 나노 액체 크로마토그래피에 결합될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 액체 크로마토그래피에서 단백질을 용출하기 위해 사용되는 이동상은 질량 분석계와 호환될 수 있는 이동상일 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 포름산암모늄, 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 예시적인 구현예에서, 질량 분석계는 나노스프레이를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석계는 단백질을 특성화하기 위한 탠덤 질량 분석계일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 상기 방법의 검출 한계는 적어도 약 0.5 ppm일 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 상기 검출 한계는 적어도 약 0.5 ppm 미만, 적어도 약 1 ppm 미만, 적어도 약 2 ppm 미만, 적어도 약 3 ppm 미만, 적어도 약 4 ppm 미만, 적어도 약 5 ppm 미만, 적어도 약 10 ppm 미만, 적어도 약 20 ppm 미만, 적어도 약 30 ppm 미만, 적어도 약 40 ppm 미만, 적어도 약 50 ppm 미만, 적어도 약 60 ppm 미만, 적어도 약 70 ppm 미만, 적어도 약 80 ppm 미만, 적어도 약 90 ppm 미만, 적어도 약 100 ppm 미만, 적어도 약 150 ppm 미만, 적어도 약 200 ppm 미만, 적어도 약 250 ppm 미만, 적어도 약 300 ppm 미만, 적어도 약 350 ppm 미만, 적어도 약 400 ppm 미만, 적어도 약 450 ppm 미만, 적어도 약 500 ppm 미만, 적어도 약 550 ppm 미만, 적어도 약 600 ppm 미만, 적어도 약 650 ppm 미만, 적어도 약 700 ppm 미만, 적어도 약 750 ppm 미만, 적어도 약 800 ppm 미만, 적어도 약 850 ppm 미만, 적어도 약 900 ppm 미만, 적어도 약 950 ppm 미만, 또는 적어도 약 1000 ppm 미만일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 분자량 컷오프 필터를 사용하여 숙주세포 단백질을 여과하는 단계를 포함하는 방법은 분자량 컷오프 필터를 사용하여 숙주세포 단백질을 여과하는 단계를 포함하지 않는 방법보다 적어도 약 5배 더 높은 검출 한계를 가질 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 상기 검출 한계는 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 95배, 적어도 약 100배, 적어도 약 105배, 적어도 약 110배, 적어도 약 115배, 적어도 약 120배, 적어도 약 125배, 적어도 약 130배, 적어도 약 135배, 적어도 약 140배, 적어도 약 145배, 적어도 약 150배, 적어도 약 155배, 적어도 약 160배, 적어도 약 165배, 적어도 약 170배, 적어도 약 175배, 적어도 약 180배, 적어도 약 185배, 적어도 약 190배, 적어도 약 195배, 또는 적어도 약 200배 더 높을 수 있다.

본 발명은 임의의 전술한 숙주세포 단백질(들), 가수분해제(들), 단백질 해리제(들), 단백질 알킬화제(들), 확인에 사용되는 기구(들), 및 분자량 컷오프 필터(들)에 제한되지 않으며, 임의의 숙주세포 단백질(들), 가수분해제(들), 단백질 해리제(들), 단백질 알킬화제(들), 확인에 사용되는 기구(들), 및 분자량 컷오프 필터(들)은 임의의 적합한 수단에 의해 선택될 수 있음이 이해된다.

숫자 및/또는 문자로 본원에 제공된 바와 같은 방법 단계의 연속적인 라벨링은 방법 또는 이의 임의의 구현예를 특정 지시된 순서로 제한하는 것을 의미하지 않는다.

특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함한 다양한 간행물이 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된다. 이들 인용된 참고문헌 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 본원에 포함된다.

본 개시는 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이며, 이는 본 개시를 보다 상세하게 기술하기 위해 제공된다. 이들은 예시를 위한 것이며 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

재료. 모든 화학물질은 고순도이며 상업적 출처로부터 수득하였다. LC-MS 등급 크로마토그래피 용매는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. 단클론성 항체 (mAb1, 이하) 및 스파이킹된(spiked) CHO 단백질은 Regeneron (Tarrytown, NY)에 의해 생산되었다. 소듐 데옥시콜레이트 (SDC) 및 소듐 라우로일 사르코시네이트 (SLS) 및 클로로아세트아미드 (CAA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis MO)에서 구입하였다. 트리스-(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP)은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. NIST 단클론성 항체 표준물질 RM 8670은 국립표준기술원 (National Institute of Standards and Technology)으로부터 얻었다.

샘플 준비 및 단백질 소화. 치료 항체를 100mM Tris-HCl, pH 8.0에 12mM SDC 및 12mM SLS를 함유하는 변성 완충액 100μl에 용해시켰다. 변성된 단백질을 Amicon μltra-0.5, 50KDa 필터 (Millipore sigma)에 로딩한 다음, 13,000 rpm에서 8분 동안 원심분리하여 수집 튜브로부터 항체 고갈된 샘플을 수득하였다. 항체 고갈된 샘플을 환원시키고 95℃에서 5분 동안 10 mM TCEP 및 40 mM CAA로 알킬화시켰다. 알킬화된 단백질을 100mM Tris-HCl, pH8.0으로 5배 희석하고, 37℃에서 밤새 1:20 (w/w)의 효소-대-단백질 비율로 소화시켰다. 소화된 펩티드를 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 1% TFA의 최종 농도까지 산성화하고, 500μl의 에틸 아세테이트를 500μl의 소화된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2분 동안 쉐이킹한 다음, 13,200 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 수성상 및 유기상을 수득하였다. 수성상을 수집하고 스피드백으로 건조시켰다. 건조된 펩티드 혼합물을 0.1% TFA로 재현탁시킨 다음, GL-Tip™ SDB 탈염 팁 (GL science, Japan)을 사용하여 탈염하였다.

NIST 표준물질 직접적 소화. 100μg의 NIST 표준물질을 스피드백으로 건조시킨 다음, 8M 우레아(urea) 및 10mM DTT를 함유하는 20 μl의 변성/환원 완충액으로 재구성하였다. 단백질을 변성시키고 37℃에서 30분 동안 환원시킨 다음, 암실에서 50 mg/ml의 요오드아세트아미드 6μl와 30분 동안 인큐베이션하였다. 알킬화된 단백질을 37℃에서 밤새 0.1ug/μl의 트립신 100μl로 소화시켰다. 펩티드 혼합물을 5μl의 10% TFA로 산성화시켰다. 샘플을 0.4ug/μl로 희석하고, LC-MS/MS 분석을 위해 2μl 주입하였다.

LC-MS/MS 분석. 펩티드 혼합물을 10μl의 0.1% 포름산 (FA)에 용해시키고, μltimate nano LC (Thermo Fisher Scientific)에 8μl 주입하였다. 펩티드를 25 cm 컬럼 (0.075mm) C18 컬럼 (2.0um, 100 Å) (Thermo Fisher Scientific) 상에서 분리하였다. 이동상 완충액은 초순수(ultra-pure water) 중 0.1% FA (완충액 A)와 80% ACN 중 0.1% FA의 용출 완충액 (완충액 B)으로 구성되어 있으며, 300nl/분(min)의 유속으로 2%-25%의 완충액 B에 대한 선형 구배를 100분 동안 실행한다. μltimate 3000 nanoLC는 Q-Exactive HFX 질량 분석계 (Thermo Fisher Scientific)와 결합되었다. 질량 분석계는 각 전체 MS 스캔 (m/z 375-1500에서, 120,000 분해능으로)의 경우 AGC 3e6, 최대 주입 시간 60 ms, 그리고 MS/MS 이벤트 (m/z 200-2000에서, 30,000 분해능으로)의 경우 AGC 1e5, 최대 주입 시간 60 ms에 대해 10개의 가장 강한 이온이 정규화된 충돌 에너지 (NCE) 27%로 더 높은 에너지 충돌 해리 (HCD) 단편화를 받는 데이터 종속 모드에서 작동되었다.

PRM 분석. 샘플을 8 μL의 0.1% 포름산에 용해시키고 0.5-1ug의 샘플을 μltimate 3000 nanoLC 시스템에 주입하였다. 용리액은 25 cm 컬럼 (0.075mm) C18 컬럼 (2.0um, 100Å)을 사용하여 질량 분석계에 도입되었다. 이동상 완충액은 물 중의 0.1% 포름산과 80% ACN (완충액 B) 중의 0.1% 포름산 (완충액 A) 용리 완충액으로 구성되어 있다. LC 유속은 300nl/분이었다. 구배는 100분 선형 구배에 대해 2-25% 완충액 B로 설정되었다. 샘플은 Q Exactive HFX (Thermo, Germany)에서 획득하였다. 각 샘플은 2 m/z의 단리 윈도우로 병렬 반응 모니터링 (PRM) 하에 분석되었다. 모든 실험에서, m/z 200에 대한 120,000 분해능 (AGC 표적 1e6, 최대 주입 시간 60 ms, m/z 350-2000)의 전체 질량 스펙트럼에 이어 30,000 분해능 (AGC 표적 1e5, 최대 주입 시간 100 ms)의 시간 예정된 PRM 스캔이 뒤따랐다. 더 높은 에너지 충돌 해리 (HCD)는 27eV 정규화된 충돌 에너지와 함께 사용되었다.

치료 항체는 대략 150KDa의 분자량을 갖는 HCP와 비교하여 폴리펩티드 사슬의 두 부분으로 구성된 상대적으로 큰 분자이다. 예시적인 구현예에 따른 분리 모식도는 도 1에 도시되어 있다. 소듐 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코시네이트 칵테일 완충액은 막 단백질에 대한 강한 용해성으로 인해 막 단백질 소화에 원래 주로 사용되었다 (Takeshi Masuda, Masaru Tomita & Yasushi Ishihama,　Phase Transfer Surfactant-Aided Trypsin Digestion for Membrane Proteome Analysis, 7　JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH　731-740 (2008)). 이 변성 완충액은 강한 변성제일 뿐만 아니라 MS 분석 전에 쉽게 제거될 수 있기 때문에, 상기 방법에 채택되었다. 그러나, 다른 변성제 또한 사용할 수 있다. 변성 후 여과를 적용하는 경우, 대부분의 항체는 필터 멤브레인을 통과하지 못하지만, 대다수의 HCP는 크기가 더 작기 때문에 멤브레인을 자유롭게 통과할 수 있다. 따라서, 변성된 항체 및 관련 HCP는 이들의 분자 크기를 기반으로 분리되었다.

실시예 1.

선택된 변성제의 여과 효율을 가장 일반적으로 사용되는 변성 조건인 5% 아세트산 중 우레아와 비교하였다. 여과 전후에, 총 단백질 양은 Nanodrop (Thermo Fisher Scientific)으로 측정하였다. 1.5 mg의 항체 샘플을 5% 아세트산 중 8M 우레아가 포함된 100K MW 컷오프 필터를 통과시켰을 시, 최종 펩티드 양은 150 μg으로 측정되었으며, 확인된 총 단백질의 큰 개선은 없었다. 변성제로 우레아를 사용하면, 단백질 제거율이 90%에 불과하여 샘플의 복잡성이 크게 완화되지 않았다. 총 HCP가 100 ppm 미만임을 고려해 볼 때, 상대적 항체 수준은 여전히 총 HCP보다 적어도 3 차수 더 높았다. 대조적으로, 변성제인 SDC+SLS 칵테일은 여과 효율을 크게 개선시켰다. SDC+SLS 보조 여과 후, 샘플 양은 4 μg까지 감소되었고 확인된 단백질의 수는 26개로 증가하였다 (표 1). 모든 항체가 여과에 의해 제거될 수 있다고 가정하면, 남은 단백질은 HCP만 될 것이며 양은 대략 0.15 μg이어야 한다. 결과는 이 특정 항체의 경우, 100K MW 컷오프 멤브레인으로부터 이탈된 다량의 mAb가 여전히 있고, 따라서, mAb의 우회(bypass)를 더 최소화하기 위해 최적화가 필요함을 시사하였다.

표 1.

실시예 2.

필터로부터 mAb의 이탈을 제한하고자, MW 컷오프 크기 50K를 갖는 필터를 평가하였다. 또한, 여과 분리에 대한 원심분리 속도 (13,000, 7,000 rpm)의 영향도 평가하였다. 총 4가지 조건을 이용하여 이러한 2가지 요인의 효과 결과를 표 2에 나타내었다. 속도가 13,000 rpm인 경우 8분을 적용하였고, 한편 7000 rpm의 경우 샘플의 최종 용액이 동일한 부피에 도달하도록 15분을 사용하였다. 샘플의 총량은 4가지 조건 모두에서 여과 후 1.5 mg에서 16 μg 미만으로 실질적으로 감소하여, 여과에 의해 약 100배의 샘플 제거를 나타낸다. 항체 mAb1가 사용된 경우, 100K 필터와 비교하여, 50K 필터는 최종 펩티드 양이 1 μg 미만으로 상당히 더 많은 양의 항체를 차단하였다. 8분간 13,000 rpm의 50K 필터가 최상의 조건이었고, 결과적으로 높은 신뢰도로 가장 높은 총 단백질 확인이 이루어졌다 (표 2).

표 2.

50K 필터를 사용하여 13,000 rpm으로 8분 동안 수행된 여과에 대해, 도 2 및 3은 각각 여과 전과 후의 샘플의 총 이온 크로마토그래피를 보여주었다. 여과 후 동일한 양의 샘플 주입으로, 여과된 샘플의 질량 스펙트럼은 여과 전보다 훨씬 더 깨끗하였으며(도 2 및 도 3), 이는 샘플의 급격한 감소를 시사한다. 샘플 감소는 개별 항체 피크의 XIC 프로파일에서도 볼 수 있다. 예를 들어, 여과 처리된 샘플과 비교하여, 여과 없이 546.60³⁺의 m/z를 갖는 피크의 XIC는 전형적인 우측 "샤크 핀" 모양으로 정점 유지에서 상당한 감소를 보여 샘플의 상당한 과부하를 나타내었다 (도 4). 전체 주입량은 거의 동일하고, 따라서, 이는 여과 방법에 의해 샘플 내 항체가 급격하게 감소하여, 상대적으로 항체가 적지만 HCP가 더 많은 샘플이 생성됨에 유의해야 한다. 따라서, HCP의 확인이 현저하게 개선되었다.

실시예 3.

여과 공정에서 발생하는 샘플 감소 또는 역 HCP 농축의 정확한 양을 평가하기 위해, 표적화 MS 접근법으로 병렬 반응 모니터링 (PRM)을 수행하여 필터 방법에 의한 HCP 농축 인자를 계산하였다. 여과 전후에 개별 HCP 펩티드 대 항체 펩티드 (mAb1의 경우)의 상대적 존재비를 비교함으로써, HCP 농축 인자를 계산할 수 있다. 도 5는 하나의 HCP 펩티드 LAYINPDLAEEK의 PRM 신호 변화를 보여준다. 100배 이상의 신호 증가가 관찰되었으며, 항체를 여과함으로써 상대적 존재비가 14 ppm에서 1628 ppm으로 증가하였다 (도 5). 필터로 대부분의 항체를 제거함으로써, 여과된 용액의 농도 범위가 크게 감소하여 HCP의 상대적 농도가 훨씬 높아지고, 따라서 후속 MS 분석에서 가시화할 수 있다.

실시예 4.

HCP 확인 방법의 검출 한계를 평가하기 위해, 스파이크-인 실험을 수행하였다. 0.1 내지 200 ppm 범위의 다양한 농도를 갖는 11개의 CHO 단백질 및 1개의 인간 단백질을 포함하는 열두개 (12)의 단백질을 HCP 수준이 매우 낮은 하나의 정제된 단클론성 항체 (mAb1)에 스파이킹하였다. MW 컷오프 필터의 크기 효과에 대한 평가가 수행되고 있었기 때문에, 12개의 선택된 단백질은 농도 뿐만 아니라 분자량/크기 또한 14.6 KDa 내지 86.5 KDa 범위로 다양하였다 (표 3). 결과는 M.W 컷오프 여과가 적용되는 경우 크기가 중요하다는 것을 보여주었다. PLBD2 및 인간 PCSK9는 각각 65.5 및 74.3 KDa의 크기를 갖는 단백질로, 50 KDa 컷오프를 훨씬 넘는다. 50 KDa 컷오프 여과 후, 두 단백질 모두 검출되지 않았다. 그러나, 더 큰 분자, 예를 들어, 글루타치온 S-전이효소 Mu6 (86.5 KDa)의 양이 매우 많은 경우, 단백질은 M.W 컷오프 분자량보다 크더라도 필터를 통과할 수 있다. 이는 또한 항체가 필터 차단에서 항상 살아남을 수 있는 이유를 설명할 수 있다. 낮은 수준의 스파이크-인 단백질의 경우, 4개의 고유한 펩티드가 있는 0.5 ppm의 산성 세라미다제인 반면 1 ppm의 트렌스티레틴의 경우 1개의 고유한 펩티드만 검출되었다. 통상적으로 샷건 프로테오믹스 분석에서, 작은 크기를 갖는 단백질이 큰 단백질보다 훨씬 적은 펩티드를 생성한다는 사실로 인해 작은 크기의 단백질은 더 검출될 가능성이 적다. 이러한 높은 신뢰도 확인에 대한 또 다른 근거는 산성 세라미다제로부터의 일부 특이적 트립신 펩티드의 높은 이온화 효율에 기여할 수 있다. 그럼에도 불구하고, HCP 확인 방법은 여과 방법의 검출 한계가 0.5 내지 1 ppm 범위임을 입증한다.

표 3.

실시예 4.

NIST 표준물질을 사용하여 중복 실험을 수행하여 상기 방법의 재현성을 평가하였다. 전체적으로, 97%의 단백질에 해당하는 326개의 단백질 및 94%의 펩티드에 해당하는 1118개의 펩티드가 두 실행에서 각각 확인되었다(도 6). 고도로 반복가능한 결과는 또한 HCP 연구에서 중요한 단백질 확인에 대한 높은 신뢰도를 나타낸다. 무-표지(label-free) 정량화를 수행하여 두 실행 모두에서 각 펩티드의 상대적인 양을 정량화하였으며, 0.97 이상의 피어슨 상관관계를 나타내는 이 방법은 변동 없이 고도로 재현가능하다 (도 7).

실시예 5.

많은 강력한 질량분석기기 기반 접근법은, 다른 연구자가 사용할 수 없는 특정 바이오 의약품의 HCP를 특성화하기 위해 발표되었고, 따라서 상이한 방법을 통해 결과를 직접 비교하는 것은 거의 불가능하다. 최근에, Doneanu 등 (상기) 및 Huang 등 (상기)은 모두 NIST 항체 표준물질 RM 8670에 이들의 방법을 적용하여, 각각 14개 및 59개의 높은 신뢰도 HCP를 확인하였다. 직접적인 비교를 용이하게 하고자, NIST RM 8670 표준물질에서 HCP를 특성화하는 HCP 확인 방법을 수행하였다. 164개의 마우스 단백질은 높은 신뢰도 (2개 이상의 펩티드) 및 위양성률(false positive rate) ≤0.01로 확인되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, Doneanu 등 (상기) 및 Huang 등 (상기)에 의해 각각 검출된 HCP 14개 중 13개 및 59개 중 45개가 확인되었다. 이러한 방법에 의해 미확인된 단백질은 분자량이 50 KDa보다 크거나 존재비가 낮은 모호한 표적이다 (표 4). 요약하면, HCP 확인 방법으로 확인된 NIST 항체 표준물질에서 119개의 마우스 HCP는 이전 두 연구에서 보고되지 않았다. 이들 중에서, 119개 단백질 중 38개는 5개 이상의 고유한 펩티드를, 그리고 90개는 ≥ 3개의 펩티드를 포함한다.

표 4.

실시예 6.

NIST에서 공지된 신규 HCP의 검증은 병렬 반응 모니터링(parallel reaction monitoring)에 의해 수행되었다.

HCP 확인 방법으로 발견된 표적을 검증하기 위해, 확인된 27개의 NIST HCP를 무작위로 선택하여 PRM 분석을 하였다. 여과 처리 전후에 이들 HCP의 펩디드 신호를 비교함으로써, 상기 방법의 개선된 효율과 함께 이들 단백질의 검증이 제공되었다. 선택된 모든 표적은 HCP 확인 방법에 의해 2 내지 120배 농축된 것으로 확인되었다 (표 5 및 표 6). 표 5는 다른 두 연구에 의해 확인된 표적을 나열한다. 선택된 표적의 70%는 Huang 등의 결과와 일치하는, 직접적 소화 샘플에서 1 ppm보다 높은 것으로 측정되었으며 (상기), 이는 표적의 80% 이상이 1 ppm 이상인 것으로 확인되었다. 표 6은 HCP 확인 방법으로만 검출된 새로운 표적을 나열한다. 결과는 분명히 급격하게 개선된 효율을 보여주었다. 측정된 대부분의 단백질은 여과 처리 전 0.5 ppm 미만이었다. 그러나 여과 후, 단백질의 상대적 농도가 증가하여 쉽게 검출될 수 있었다. 이러한 존재비가 낮은 단백질에 대한 개선된 효율은 현저하며, 대부분은 100배 이상, 그리고 일부는 1000배 개선되었다. 존재비가 낮은 표적이 훨씬 더 많이 확인되었다는 사실은 이 방법의 핵심 요소인 동적 범위의 감소에 대한 중요성을 시사한다. 항체 및 이의 관련 HCP에 의해 구성된 동적 범위는 대략 8 차수에서 5차수로 3차수 감소하였고, 이에 따라 HCP 신호를 확대하였다.

상기 예는 하나의 단일 단계의 분자량 컷오프 여과에 뒤이어 기본 프로테오믹스 접근법, 예컨대, 샷건 프로테오믹스를 적용하여 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 HCP를 확인하는 간단하고 강력한 방법을 제시한다. 이 절차는 샘플 매트릭스에서 대부분의 관심 단백질을 제거하는 데 성공적으로 사용할 수 있으며, 따라서 샘플 매트릭스의 동적 범위를 극적으로 감소시켜 존재비가 낮은 HCP의 검출을 훨씬 더 개선하였다.

표 5.

표 6.

Claims

관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
해리된 숙주세포 단백질을 분자량 컷오프 필터를 사용하여 여과하는 단계;
여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계; 및
숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 해리는 단백질 해리제를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 여과된 숙주세포 단백질을 단백질 환원제에 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 여과된 숙주세포 단백질을 단백질 알킬화제에 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 여과된 숙주세포 단백질을 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 숙주세포 단백질을 약 8분 동안 약 13000 rpm에서 원심분리하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 관심 단백질은 항체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 관심 단백질은 치료 항체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 숙주세포 단백질의 확인은 질량 분석계를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 결합된 것인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템은 나노 액체 크로마토그래피 시스템인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 질량 분석계는 탠덤 질량 분석계인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질 해리제는 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 것인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질 해리제는 N-라우로일사르코신을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 가수분해제는 트립신인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 단백질 환원제는 TCEP인, 방법.
제4항에 있어서, 상기 단백질 알킬화제는 CAA인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 분자량 컷오프 필터는 약 100 KDa의 컷오프를 갖는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 분자량 컷오프 필터는 약 50 KDa의 컷오프를 갖는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 해리제는 분해성인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포 단백질의 검출 한계가 적어도 약 1 ppm인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배로 농축시키는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포 단백질의 검출 한계는 분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계를 포함하지 않는 다른 방법의 검출 한계보다 적어도 약 5배 더 큰 것인, 방법.
관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계; 및
숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배로 농축시키는 것인, 방법.
제25항에 있어서, 상기 숙주세포 단백질의 확인은 질량 분석계를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
단백질 해리제를 사용하여 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계; 및
숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
단백질 해리제를 사용하여 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계; 및
질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
단백질 해리제를 사용하여 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계로, 상기 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배로 농축시키는 것인 단계; 및
숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
단백질 해리제를 사용하여 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계로, 상기 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배로 농축시키는 것인 단계; 및
질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
단백질 해리제를 사용하여 관심 단백질로부터 숙주세포 단백질을 해리시키는 단계;
분자량 컷오프 필터를 사용하여 해리된 숙주세포 단백질을 여과하는 단계로, 상기 여과하는 단계는 해리된 숙주세포 단백질을 적어도 약 50배로 농축시키는 것인 단계;
여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계; 및
질량 분석계를 사용하여 숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
숙주세포 단백질을 갖는 샘플 매트릭스를 단백질 해리제에 접촉시키는 단계;
해리된 숙주세포 단백질을 분자량 컷오프 필터를 사용하여 여과하는 단계;
여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계; 및
숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.
샘플 매트릭스에서 숙주세포 단백질을 확인하는 방법으로서,
숙주세포 단백질 및 관심 단백질을 갖는 샘플 매트릭스를 단백질 해리제에 접촉시키는 단계로, 상기 단백질 해리제는 관심 단백질을 변성시키는 것인 단계;
숙주세포 단백질을 분자량 컷오프 필터를 사용하여 여과하는 단계;
여과된 숙주세포 단백질을 가수분해제에 접촉시키는 단계; 및
숙주세포 단백질을 확인하는 단계:를 포함하는 방법.