CN114034791A - 一种利用聚苯乙烯类材料提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法 - Google Patents
一种利用聚苯乙烯类材料提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用聚苯乙烯类材料提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法，包括：向待测样本中加入结合缓冲液，加入聚苯乙烯类材料，得到混悬液；将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次；将所述沉淀Ⅱ制备成蛋白质组/肽段组样品，进行质谱检测。本发明采用聚苯乙烯类材料及相应结合缓冲液，可有效吸附不同种类的血清/血浆蛋白及肽段，实现血清/血浆中低丰度蛋白及肽段的选择性富集，有效避免了质谱鉴定时血清/血浆中高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，可用于各种蛋白质谱鉴定。
Description
技术领域
本发明属于蛋白组学技术领域，具体地，涉及一种利用聚苯乙烯类材料提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法。
背景技术
由于血清/血浆是血液的重要组成部分，里面包含生物体各类组织器官释放的物质，因此潜藏着大量可发掘的生理或病理信息。据推测，血清/血浆中的蛋白质种类超过万种，但是由于目前检测鉴定技术有限，只有很小的一部分蛋白质可被检测出来。由于血清/血浆中含有数十种高丰度蛋白，占了血清/血浆总蛋白量的95％以上，给血浆/血清蛋白的检测分离带来了巨大的挑战。目前，在不去除高丰度蛋白的情况下，通过蛋白质谱技术只能检测到300-400个蛋白，即使通过使用商业化去高丰度抗体试剂盒，也仅能将蛋白鉴定数提高到400～800个。
聚苯乙烯类材料，包括聚苯乙烯、羧基聚苯乙烯、氨基聚苯乙烯以及磺酸基聚苯乙烯材料。聚苯乙烯微球是聚苯乙烯制成的微球，其具有粒径小、比表面积大、吸附性强、易于改性和修饰等特点，因此广泛应用于生物化学、电化学、催化剂、吸附剂、色谱填料、涂料等领域。但是目前利用该类材料来吸附蛋白的相关研究还未见报道。
发明内容
发明目的：针对目前血清/血浆蛋白质及肽段组样品制备方法的局限性，本发明提供了一种利用聚苯乙烯类材料提高蛋白质和或肽段组质谱鉴定数的方法，其中利用聚苯乙烯类材料和相应的结合缓冲液，对血清/血浆蛋白质及肽段组进行定性与定量，能够有效提高鉴定数目。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，包括以下步骤：
S1、向待测样本中加入结合缓冲液，加入聚苯乙烯类材料，得到混悬液；
S2、将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
S3、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次；
S4、将所述沉淀Ⅱ制备成蛋白质组/肽段组样品，进行质谱检测。
优选的，步骤S1中，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组，优选血清/血浆或者组织/细胞样本；所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、甲酸、乙酸、碳酸氢铵、氯化钙、乙腈、氢氧化钠、盐酸、EDTA、SDS、NP-40、CHAPS、吐温、Triton、PEG的中的一种或任意组合，优选为Tris、EDTA的组合缓冲液。
优选的，步骤S1中，所述聚苯乙烯类材料选自聚苯乙烯、羧基聚苯乙烯、氨基聚苯乙烯以及磺酸基聚苯乙烯材料中的一种或几种。优选聚苯乙烯制成的聚苯乙烯微球。
优选的，步骤S2中，所述孵育的条件为：18～37℃下孵育1～120分钟。
优选的，步骤S2中，所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟。
优选的，步骤S3中，所述清洗缓冲液选自步骤S1所使用的结合缓冲液或相应稀释液。
优选的，步骤S3中，所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟；该步骤可重复多次，优选3次。
优选的，步骤S4中，所述蛋白质组样品的制备方法包括如下步骤：
采用还原试剂缓冲液重悬所述沉淀Ⅱ，经反应后加入烷基化巯基的烷基化试剂，再加入测序级的胰蛋白酶及消化缓冲液，经酶解并脱盐即得蛋白质组样品；
所述肽段组样品的制备方法包括如下步骤：
使用解吸附液(优选2％乙腈)重悬所述沉淀II，超声，离心后得上清即为肽段组样品。
进一步优选的：
所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于18～95℃条件下反应0～60分钟，再加入烷基化试剂避光室温反应5～60分钟；
所述消化缓冲液包括氯化钙、碳酸氢铵等，pH值为7.0～8.5；所述胰蛋白酶的加入量为0.1～100ng/μL；所述酶解的条件为：温度为25～37℃，时间为1～16小时；所述脱盐步骤为使用所述聚苯乙烯、SDB柱、C18柱或SP3磁珠进行吸附、清洗及解吸附。
优选的，步骤S4中，所述质谱检测的方法包括：
采用液相色谱-串联质谱法进行检测，使用软件对获得数据进行抽提，获得蛋白及肽段定性定量数据。
所述聚苯乙烯类材料，优选聚苯乙烯制成的聚苯乙烯微球，粒径在50nm～100μm之间，是一种粒径小、比表面积大、吸附性强、易于改性和修饰等的材料。
有益效果：与现有技术相比，本发明采用聚苯乙烯类材料及相应结合缓冲液，可有效应用于吸附不同种类的蛋白及肽段样本，尤其对于血清/血浆样本，可以实现血清/血浆中低丰度蛋白及肽段的选择性富集，有效避免了质谱鉴定时血清/血浆中高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，可用于各种蛋白质谱鉴定，在常规色谱梯度下单针质谱分析可以对大于2000种血清/血浆蛋白进行定性定量分析。本发明方法操作简单，只需要通过孵育-离心-洗脱-离心4个步骤就可完成血清/血浆中低丰度蛋白及肽段的富集，提高检测灵敏度的同时减少人为操作误差。
附图说明
图1为使用聚苯乙烯类材料吸附同一个血浆前后，材料上蛋白胶图，1为聚苯乙烯类材料结合蛋白结果，2为原血浆。
图2为同一样本使用聚苯乙烯类材料处理三重复共鉴定蛋白venn图。
图3为同一样本使用聚苯乙烯类材料处理三重复蛋白定量数据相关性。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1.从冰箱中取出不同血浆样本，每个样本取200μL血浆于37℃解冻，4℃、1,500g离心10分钟，去除底部沉淀后上清转移至新管；
2.取100μL血浆加入100μL结合缓冲液(50mM Tris,10mM EDTA)重悬的聚苯乙烯微球(粒径1μm，CAS号：9003-53-6)，室温孵育10～60分钟；
3.孵育完成后12,000g离心10分钟去掉上清溶液，沉淀用300μL清洗缓冲液试剂(50mM Tris,10mM EDTA)重悬，室温孵育5分钟，12,000g离心5分钟去掉上清；
4.重复步骤3两次；
5.将原血浆及材料结合得到的沉淀加入蛋白电泳Loading Buffer煮沸，上清跑电泳，结果如图1；
6.向平行制备、未跑胶的沉淀加入一定体积含有DTT的缓冲液重悬沉淀，95℃反应1小时；
7.加入一定体积IAM，避光室温反应45分钟；
8.加入消化缓冲液及胰蛋白酶，混匀，37℃酶解过夜；
9.加入过量甲酸溶液，12,000g离心10分钟，上清加入SDB除盐柱，离心，使酶解后肽段结合与于SDB柱上；
10.清洗SDB柱数次并解吸附，得到纯化肽段溶液；
11.冻干纯化肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段；
12.将肽段使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行DDA数据采集；
13.使用MaxQuant软件对质谱数据进行抽提，获得蛋白定性定量结果；
14.在三个人员同时操作，对4个不同来源血浆样品进行处理，每个样品三个平行重复实验，鉴定到肽段及蛋白数如表1所示：
表1的血浆蛋白质组质谱鉴定结果
15.使用聚苯乙烯类材料进行去高峰度同时，与不使用任何处理，直接酶解血浆，及使用抗体去高峰度试剂盒结果进行比较，结果如表2：
表2聚苯乙烯类处理、直接酶解鉴定、去高峰度抗体试剂盒鉴定蛋白和肽段数量结果
16.以SAMPLE1举例，人员3操作的三重复鉴定到的蛋白进行共鉴定分析，共鉴定蛋白数如图2，蛋白定量数据相关性如图3；
结论：
1.通过图1，可以看出聚苯乙烯类材料能够较好去除高丰度蛋白；
2.通过表1可以看出，每个样本多个重复之间具有较高相似度，不同来源的血浆样本鉴定数也较为类似，不同人操作结果相似，所以鉴定结果蛋白数在2000左右，肽段数在10000左右，因而聚苯乙烯类材料方法学稳定；
3.通过与没有处理的血浆样本进行比较，没有处理的血浆蛋白鉴定数只有300+，肽段只有2000左右，使用去高峰度抗体试剂盒，鉴定肽段在3000-4000，鉴定蛋白数在600-800，都远小于聚苯乙烯类材料的结果；
4.通过共鉴定蛋白分析及蛋白定量数据相关性分析，说明使用聚苯乙烯类材料对单个样本的蛋白富集结果十分稳定，具有高度重现性。
实施例2
为证明使用本材料可以在蛋白水平或者肽段水平进行微量样本的富集以及酶解脱盐等过程，用以替代现有的传统SP3混合磁珠材料。本实例使用SP3混合材料作为对照组，使用实施例1中的聚苯乙烯材料为载体，对Hela细胞蛋白及肽段提取物进行了蛋白组学分析实验：
使用Hela细胞提取蛋白标准品为例：
1.分别取两份100μg溶于40uL缓冲液(4％SDS，100mMTris，pH 8.0)中的Hela细胞蛋白样品，进行还原烷基化反应；
2.分别加入10μL储存的10μg/μL SP3混合beads以及同等数量的聚苯乙烯微球(粒径在50nm～100μm之间，CAS号：9003-53-6)，再加入150uL缓冲液及200uL乙腈作为结合缓冲液，轻轻震荡混匀，室温反应8min；
3.使用离心机12,000g离心5min之后，轻轻吸弃上清，避免接触到beads/材料；加入200μL 70％乙醇，轻轻震荡混匀，12,000g离心5min，轻轻吸弃上清，重复该步骤；
4.加入180μL 100％乙腈，轻轻震荡混匀，瞬离，轻轻吸弃上清，自然挥干30s；
5.加入适量消化缓冲液及胰蛋白酶，37℃酶解过夜，得SP3酶解的肽段产物(A)和聚苯乙烯材料的酶解肽段产物(B)；
6.取SP3酶解的肽段产物(A)加入聚苯乙烯材料进行如下操作，用枪洗打轻轻混匀beads/材料，加入终浓度至少为95％的乙腈作为结合缓冲液，轻轻震荡混匀，室温孵育5min；12,000g离心5min，轻轻吸弃上清，避免接触到beads/材料；分别加入180μL乙腈，轻轻震荡混匀，瞬离，轻轻吸弃上清，加入适量体积2％乙腈，瞬离2s，用枪头将管壁上的beads/材料轻轻推入溶液中，轻轻震荡混匀，超声30s；瞬离2s，轻轻吸上清至新的离心管；12,000g离心5min，轻轻吸出上清，得SP3酶解脱盐后的肽段产物(C)；
7.取上述SP3酶解的肽段产物(A)、聚苯乙烯材料的酶解肽段产物(B)以及单独100μg的SP3酶解脱盐后的肽段产物(C)并加入聚苯乙烯材料进行如下操作，用枪洗打轻轻混匀beads/材料，加入终浓度至少为95％的乙腈作为结合缓冲液，轻轻震荡混匀，室温孵育5min；12,000g离心5min，轻轻吸弃上清，避免接触到beads/材料；分别加入180μL乙腈，轻轻震荡混匀，瞬离，轻轻吸弃上清；
8.加入适量体积2％乙腈，瞬离2s，用枪头将管壁上的beads/材料轻轻推入溶液中，轻轻震荡混匀，超声30s；瞬离2s，轻轻吸上清至新的离心管；12,000g离心5min，轻轻吸出上清至上样瓶中，上机检测。
9.将肽段使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行DDA数据采集；
10.使用MaxQuant软件对质谱数据进行抽提，获得定性定量结果，结果如表3：
表3聚苯乙烯类材料对比SP3混合材料在蛋白和肽段水平富集质谱检测结果
结论：
通过对比SP3混合磁珠材料与聚苯乙烯材料分别在蛋白和肽段水平对Hela标准品进行富集之后质谱检测结果，发现单独聚苯乙烯的材料可以替代传统的氨基和羧基修饰的SP3的混合材料，作为进行蛋白和肽段水平的富集的常规蛋白质谱分析手段。
Claims (9)
1.一种蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向待测样本中加入结合缓冲液，加入聚苯乙烯类材料，得到混悬液；
S2、将所述混悬液孵育后，进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
S3、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重复该步骤数次；
S4、将所述沉淀Ⅱ制备成蛋白质组/肽段组样品，进行质谱检测。
2.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组；所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、甲酸、乙酸、碳酸氢铵、氯化钙、乙腈、氢氧化钠、盐酸、EDTA、SDS、NP-40、CHAPS、吐温、Triton、PEG的中的一种或任意组合，优选为Tris、EDTA的组合缓冲液。
3.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样本选自血清/血浆或者组织/细胞样本。
4.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，所述聚苯乙烯类材料选自聚苯乙烯、羧基聚苯乙烯、氨基聚苯乙烯以及磺酸基聚苯乙烯材料中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述孵育的条件为：18～37℃下孵育1～120分钟；所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟。
6.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述清洗缓冲液选自步骤S1所使用的结合缓冲液或相应稀释液；所述高速离心的条件如下：离心力为8,000～22,000g，温度为2～8℃，时间为5～120分钟；该步骤重复3次。
7.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述蛋白质组样品的制备方法包括如下步骤：
采用还原试剂缓冲液重悬所述沉淀Ⅱ，经反应后加入烷基化巯基的烷基化试剂，再加入测序级的胰蛋白酶及消化缓冲液，经酶解并脱盐即得蛋白质组样品；
所述肽段组样品的制备方法包括如下步骤：
使用解吸附液重悬所述沉淀II，超声，离心后得上清即为肽段组样品。
8.根据权利要求7所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于：
所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于18～95℃条件下反应0～60分钟，再加入烷基化试剂避光室温反应5～60分钟；
所述消化缓冲液包括氯化钙、碳酸氢铵等，pH值为7.0～8.5；所述胰蛋白酶的加入量为0.1～100ng/μL；所述酶解的条件为：温度为25～37℃，时间为1～16小时；所述脱盐步骤为使用所述聚苯乙烯、SDB柱、C18柱或SP3磁珠进行吸附、清洗及解吸附。
9.根据权利要求1所述的蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，其特征在于，步骤S4中，所述质谱检测的方法包括：
采用液相色谱-串联质谱法进行检测，使用软件对获得数据进行抽提，获得蛋白及肽段定性定量数据。
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