CN110850099A

CN110850099A - 一种血清中c反应蛋白的定值方法

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Publication number: CN110850099A
Application number: CN201911162764.XA
Authority: CN
Inventors: 宋德伟; 朱文; 陈鸿飞; 李红梅; 孙浩峰; 肖鹏; 刘建仪; 马凌云; 王馨雪
Original assignee: National Institute of Metrology
Current assignee: National Institute of Metrology
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110850099B

Abstract

本发明公开了一种血清中C反应蛋白的定值方法，包括以下步骤：(1)血清C反应蛋白(CRP)的纯化富集；(2)C反应蛋白纯度检测；(3)酶切；(4)C反应蛋白定量分析。该方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，整个实验只需要考虑纯品CRP浓度的准确性，而本发明使用的纯品CRP溶液是国家一级标准物质(由中国计量院研制)，数值可靠、可溯源至SI单位，并且原料是天然CRP，也无需考虑结构的差异，而这也是相较于同位素标记的全蛋白优异的地方。

Description

一种血清中C反应蛋白的定值方法

技术领域

本发明涉及蛋白含量测定技术领域，特别是涉及一种血清中C反应蛋白的定值方法。

背景技术

C反应蛋白是由肝脏释放的五聚体结构的血清蛋白，可用于监测心血管疾病和全身炎症状况，是重要的临床标志物之一。由于其稳定性好，单克隆抗体商品化，因而具有临床应用价值，常用的检测方法有酶联免疫吸附法、免疫投射比浊法和免疫发光法等。但是由于各厂家针对不同的目标物开发方法和试剂，造成测量的偏差很大。因此，亟需研制出CRP的参考测量方法。

同位素稀释质谱法具有灵敏度高、定量测量准确性高、重复性好的特点，是一种权威的定量方法，被广泛应用于蛋白和肽段的含量测定。多年来，许多科学家致力于CRP方法学的研究中。宋德伟等人建立的CRP的IDMS-LC/MS检测方法，是对CRP蛋白进行水解，通过对氨基酸的定量分析，准确测定CRP浓度，使定量结果可溯源至SI单位。同样，日本计量院(NMIJ)开发了一种可溶性重组人CRP有证参考材料CRM 6201-b，其纯度和均匀性均高于人血清纯化物。这两篇文献采用的氨基酸水解法相对比较成熟，其分析测定的干扰较小，但是对样品的纯度要求较高，杂质亦或是样品降解都会对其产生很大的影响，不适用于血清样品。

美国计量院(NIST)Eric L等人通过标准添加法对CRP进行定量，消除了潜在的酶解偏差，并且通过外部校准曲线验证其准确性，但只选择了两条肽段进行定量分析。不同于上述文献采用磁珠富集的方法将CRP从血清样品中提取出来，Caroline Pritchard等人采用高、低 pH两步固相萃取(SPE)工艺，将血清样品中的CRP纯化，而后进行酶解和LC-MS/MS，此方法步骤繁琐，并且回收率低。此外，还有不经过纯化直接酶切进质谱的方法，这一方法很容易产生杂质肽段，不适用于大部分蛋白。这些文献采用的方法都是基于蛋白质被胰蛋白酶酶解成特征肽段。需要肽段在整个消化过程中保持稳定，不发生修饰或降解，并且能够进行质谱分析。但由于酶解效率不同会导致较大的偏差，而且选择多肽段定值可能会导致肽段分不开，而重新选择肽段则需要更大的人力物力。

无论是水解为氨基酸还是酶解为肽段，都没有蛋白的完整结构，而同位素标记的完整蛋白由于结构的相似性，实验过程中产生的偏差会无差别的应用于两种蛋白，无需考虑蛋白纯化、酶切效率以及基质效应。后来，Eric L致力于同位素标记的完整CRP研究中，通过酵母表达系统产生15N标记的rCRP(15N-rCRP)，作为ID-MS的内标，可真实的反应样品的浓度。但是同位素标记的全蛋白产量低，耗时耗力，价格及其昂贵，并且天然蛋白质和其同位素标记的类似物在三级结构上有微小的差异。结构性差异可能导致基质中非特异性结合的相互作用，蛋白质水平的不同导致纯化阶段回收率的不同，此外还涉及结构识别如免疫亲和纯化，或由于基质中自然和标记蛋白质结构的不同，导致降解程度的不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清中C反应蛋白的定值方法。该方法是一种高效、简便、可靠的检测方法，为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种血清中C反应蛋白的定值方法，包括以下步骤：

(1)血清C反应蛋白(CRP)的纯化富集：将磁珠活化，按比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物。在血清样品中加入一定量的磁珠抗体复合物，孵育洗涤；用三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的CRP洗脱下来，-20℃保存使用。

(2)C反应蛋白纯度检测：用SDS-Page电泳法和液相色谱法检测纯度。

SDS-Page电泳法具体为，在CRP溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。

液相色谱法具体为，将CRP样品进质谱，查看质谱图中是否有杂峰；色谱柱为：ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱，2.1mm×150mm，1.7μm；流动相为：A水相：水(0.1％甲酸)， B有机相：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min，进样量20uL。

(3)酶切肽段EK、GK、RK：对血清样品进行亲和纯化；磁珠提取后离心浓缩；加入少量的去离子水复溶；加入尿素、DTT，于37℃变性；加入IAM，避光反应；加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1mol/L以下；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；得到酶切肽段EK、GK、RK。

(4)C反应蛋白定量分析：将酶切好的样品进质谱，通过肽段的浓度推算出C反应蛋白的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算C反应蛋白浓度，以3者平均值定值；

根据肽段EK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-EK＝A_{纯品CRP-L-EK}

根据肽段GK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-GK＝A_{纯品CRP-L-GK}

根据肽段RK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-RK＝A_{纯品CRP-L-RK}

式中:c_CRP为血清样品的浓度；c_CRP-EK、c_CRP-GK、c_CRP-RK为血清CRP酶切肽段EK、GK、 RK的浓度；A_CRP-EK、A_CRP-GK、A_CRP-RK为血清CRP酶切肽段EK、GK、RK的峰面积；A_CRP-L-EK、 A_CRP-L-GK、A_CRP-L-RK为添加到血清样品中的标记肽段L-EK、L-GK、L-RK的峰面积；c_纯品CRP-EK、 c_纯品CRP-GK、c_纯品CRP-RK为空白血清添加已知浓度纯品CRP酶切肽段EK、GK、RK的浓度；A _纯品CRP-EK、A_纯品CRP-GK、A_纯品CRP-RK为纯品酶切肽段EK、GK、RK的峰面积；A_{纯品CRP-L-EK}、A _{纯品CRP-L-GK}、A_{纯品CRP-L-RK}为同时添加到纯品中的标记肽段L-EK、L-GK、L-RK的峰面积；c_纯品CRP为纯品CRP的浓度。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

该方法将CRP的单克隆抗体结合到磁珠(含有磺酸酯键的聚苯乙烯珠子)上，通过免疫吸附的方式提取纯化血清中的CRP，经胰蛋白酶酶切后，用液相色谱串联质谱的方法(LC-MS/MS)对其进行定量分析。该方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，整个实验只需要考虑纯品CRP浓度的准确性，而本发明使用的纯品CRP溶液是国家一级标准物质(由中国计量院研制)，数值可靠、可溯源至SI单位，并且原料是天然CRP，也无需考虑结构的差异，而这一点也是相较于同位素标记的全蛋白优异的地方。

本方法是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的血清中C反应蛋白的定值方法作进一步说明。

附图说明

图1为SDS-page电泳图；

图2为CRP的液相色谱图；

图3为3条肽段在6个不同酶切时间段的响应强度曲线；

图4为胰蛋白酶与蛋白质的比值曲线；

图5为LC-MS/MS质谱图a是总离子流图；b、c分别为L-RK、RK的峰图；d、e分别为L-GK、GK的峰图；f、g分别为L-EK、EK的峰图；

具体实施方式

试剂：

乙腈购自德国Merck公司产品；

超纯水由Millipore纯水系统纯化；

三氟乙酸购自美国Sigma-Aldirich公司；

甲酸购自美国Fisher Scientific公司；

二硫苏糖醇(DTT)购自美国inalco公司；

胰蛋白酶购自美国Promega公司；

Tris、尿素(Urea)购自美国Amresco公司；

碘乙酰胺(Iodoacetamide,IAM)购自美国Inalco公司；

磁珠购自Invitrogen公司；

EK、GK、RK、L-EK、L-GK、L-RK由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(使用MALDI-TOF-MS对酶切后的CRP进行分析，选择质谱响应高、能够分开的三条肽段EK、GK、RK；L-EK、L-GK、L-RK为这三条肽段的同位素标记肽段)。

人血清样品由北京航天总医院制备。

仪器：

液相色谱质谱联用仪：Agilent 6410三重四级杆质谱，美国安捷伦公司；

移液器：德国Eppendorf Research公司；

天平：ME235S型，最小分度值0.01mg，德国Satorius公司；

天平：XP26型，最小分度值0.001mg，瑞典Mettler Toledo公司；

生化分析仪：日立7180。

一种血清中C反应蛋白的定值方法，包括以下步骤：

(1)血清C反应蛋白(CRP)的纯化富集：

通过磁珠亲和纯化作用对血清中的CRP进行提取，其原理是磁珠上的磺酸酯键可与含有氨基或硫基的蛋白反应，也就是磁珠与CRP的单克隆抗体结合，再利用抗原-抗体结合的原理，将血清中的CRP提取出来。

具体为：将磁珠活化，按照抗体：磁珠＝40μg：1mg的比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物，浓度在(1～10)mg/mL；取血清样品于1.5mL的离心管中；加入一定量的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的C反应蛋白结合到磁珠抗体上，去上清(用于后续生化分析仪检测磁珠提取后血清CRP的含量)；用1mL的TBST洗涤磁珠3次；再用1mL的 TBS洗涤1次；加入终浓度为0.1％三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的C反应蛋白洗脱下来，室温旋转孵育1h；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。

(2)磁珠富集效率考察：

在步骤(1)中，用磁珠抗体复合物提取血清中的CRP，收集弃去的血清，用生化分析仪检测其CRP浓度，得到磁珠提取效率。

磁珠富集效率：磁珠的富集效率是测量偏差的潜在来源，必须进行适当的评估。如果单克隆抗体特异性结合不同形式的CRP，或如果有基质效应，阻碍磁珠抗体复合物捕获CRP，所获取的CRP经磁珠富集纯化得到的量将不能反应实际血清中的含量。因此在磁珠富集纯化前后都对血清CRP进行检测。结果如表1所示：

表1生化分析仪检测

表1中数据显示，试剂盒1测得的血清CRP浓度为80.7mg/L，试剂盒2测得的血清CRP浓度为82.4mg/L，试剂盒3测得的血清CRP浓度为86.0mg/L。说明不同厂家的试剂盒针对不同的目标物开发的方法和试剂导致结果差异性较大。磁珠富集后，用生化分析仪检测剩余血清的CRP，结果显示为0mg/L，说明磁珠将血清中的CRP都富集提取了，富集的效率为100％，后续实验无需考虑磁珠富集效率。

(3)C反应蛋白纯度检测：

用SDS-Page电泳法和液相色谱法检测纯度。

SDS-Page电泳法具体为，在CRP溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。结果如图1所示，在Marker约为23kD处出现明显条带，且整个电泳图只有这单一条带，说明该样品纯度很高，且分子量的大小等于理论值，初步说明血清亲和纯化的CRP纯度和浓度都能够满足后续的实验。

再将样品进行液相分析，液相色谱法具体为，将CRP样品进质谱，查看质谱图中是否有杂峰。色谱柱为：ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱，(2.1mm×150mm，1.7μm)；流动相为：A水相：水(0.1％甲酸)，B有机相：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min，进样量20uL。结果如图2所示。在195nm紫外波长下有单一的峰，没有明显的杂质峰，说明样品纯度比较高。

(4)酶切肽段EK、GK、RK：

对血清样品进行亲和纯化，用一点法进行实验。在纯品CRP中添加空白血清，使其对应相应的浓度；磁珠提取后离心浓缩；加入少量的去离子水复溶；加入尿素、DTT，于37℃变性1h，对蛋白质进行变性；恢复常温后，加入IAM，避光反应1h；加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1mol/L以下；按照蛋白和胰蛋白酶质量比10：1加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃孵育24h；加入甲酸终止反应；得到酶切肽段EK、 GK、RK。

对胰蛋白酶的酶切时间、酶与蛋白质的质量比进行优化。对比在16h，24h，30h，36h， 42h，48h这6个时间点的酶切效率，以及胰蛋白酶和CRP的质量比在5:1，10:1，15:1，20:1 这四种情况下的响应面积，从而优化酶切条件。虽然酶切效率没有直接参与到血清CRP的定值当中，但是优化酶切条件有利于提高液质的响应，提高数值的可比性。

不同的酶切条件下，质谱响应强度如下图所示。图3显示3条肽段在6个不同酶切时间段的响应强度，可以看出，EK和GK在第24h的时候强度最大且明显高于其他时间段，而 RK总体趋势平缓，在第42h的时候略高，综合考虑选择第24h的酶切时间最为合适。胰蛋白酶的添加量可以从图4中得出，除了EK在20:1的比例下略高于其他水平，其他在10:1的比例下响应面最高。因此，胰蛋白酶和CRP的比例为10:1最为合适。

使用Agilent 6410型三重四级杆质谱仪查找目标物母离子与子离子，由于本实验使用3 条肽段进行分析，因此必须找到适当的液相条件将肽段分离。

选择3条特征肽段定量蛋白更具有代表性，因此，3条肽段需要找到合适的液质条件将其分开。表2是特征肽段及其标记肽段的质谱条件，表3是能把3条肽段分开的液相条件。色谱柱为：ACQUITY UPLC Pepdide BEH C18柱，(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为：A 水相：水(0.1％甲酸)，B有机相：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min，进样量20uL。在此条件下，纯化后的CRP经胰蛋白酶酶切后进质谱，得到图5，图中显示，三条肽段被清晰地分开了，此外标记肽段和非标记肽段也能区分开。

表2主要质谱参数

表3液质流动相比例

时间/min	0	40	45	46	50	55	60
								A(％)	99	75	50	10	10	99	99
B(％)	1	25	50	90	90	1	1

(5)C反应蛋白定量分析：

将酶切后的样品进质谱，通过肽段的浓度推算出C反应蛋白的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算C反应蛋白浓度，以3者平均值定值；

根据肽段EK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-EK＝A_{纯品CRP-L-EK}

根据肽段GK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-GK＝A_{纯品CRP-L-GK}

根据肽段RK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-RK＝A_{纯品CRP-L-RK}

CRP定量测试结果：分别对3个水平的血清样品进行亲和纯化。设为高浓度组(82mg/L)，中浓度组(12mg/L)，低浓度组(1.5mg/L)，每组设5个平行实验，采用一点法进行实验。由5个平行样品测量结果计算得出特征肽段EK、GK、RK的含量，详细数据见表4。根据上述公式计算得到不同浓度的血清CRP的含量，以及SD值和CV值，单位为(mg/L)。

表4LC-MS定值结果

表4中数据显示，用LC-MS/MS测得高、中、低三种浓度血清CRP的值分别为81.51mg/L ±5.88mg/L(k＝2)，11.93mg/L±0.79mg/L(k＝2)，1.47mg/L±0.09mg/L(k＝2)。与生化分析仪测得值82.40mg/L，12.26mg/L，1.45mg/L接近。此外，高浓度血清的测量方法用标准物质ERM DA474检测其正确性，测得值为41.92mg/L，结果高度一致，因此，该方法是一种高效、简便、可靠的检测方法。

综上所述：

本发明选用磁珠亲和纯化的方法对血清CRP进行前处理。通过磁珠富集纯化，可去除 CRP血清样品中的杂蛋白，对低浓度的血清样品有很好的富集作用，降低检测限，同时纯化后的蛋白，提高信噪比，提高质谱检测的准确性。因此，血清处理前后都用生化分析仪测试其浓度，测试结果显示为0mg/L，说明磁珠提取效率接近100％，证明磁珠富集血清中的蛋白质是一种可靠、方便的富集纯化技术。

此外，本发明还对酶切效率进行了考察。之前有实验用超滤管去除尿素及杂质肽段等小分子，但是回收率很低，对于低丰度蛋白来说质谱响应太低，数据可比性不强。本发明将磁珠富集后的样品离心浓缩后只加入20μL去离子水溶解，加入尿素使终浓度为6M，最适蛋白质变性，在最后加入胰蛋白酶酶解时需要将尿素的含量稀释到1M以下，否则会影响酶的活性。由于之前加入尿素的含量很少，因此终体积不大，肽段浓度相对较高。而这一方法的回收率在75％以上。另外在加入尿素和DTT使蛋白变性这一步，一般采用60℃变性30min。本实验改为37℃变性60min，目的是减少非特异性小分子的产生。

无论是磁珠富集效率还是胰蛋白酶的酶切效率的优化，在本发明中只是为了加强质谱的响应面积，不参与浓度计算。

本发明使用传统的LC-MS/MS方法对血清CRP进行定值。实验原理是通过特征肽段的浓度推算出蛋白质的浓度，而肽段的浓度可以根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示。选用3条肽段计算CRP浓度，以3者平均值定值。在一般实验中，蛋白质的提取率、酶切效率、仪器的稳定性、实验误差等都会影响蛋白质的定量。本发明在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，再将添加空白血清的纯品作为外标，得到血清样品中CRP的浓度。整个实验只需要考虑纯品CRP浓度的准确性，而本发明使用的纯品CRP溶液是国家一级标准物质(由中国计量院研制)，其数值可靠、可溯源至SI单位，并且原料是天然CRP，因此无需考虑其结构的差异，而这一点也是相较于同位素标记的全蛋白优异的地方。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)血清C反应蛋白的纯化富集：将磁珠活化，按比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物；在血清样品中加入一定量的磁珠抗体复合物，孵育洗涤；用三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的CRP洗脱下来，-20℃保存使用；

(2)C反应蛋白纯度检测；

(3)酶切肽段EK、GK、RK：对血清样品进行亲和纯化；磁珠提取后离心浓缩；加入少量的去离子水复溶；加入尿素、DTT，于37℃变性；加入IAM，避光反应；加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1mol/L以下；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；

根据肽段EK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-EK＝A_{纯品CRP-L-EK}

根据肽段GK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-GK＝A_{纯品CRP-L-GK}

根据肽段RK浓度计算CRP浓度，计算公式如下：

A_CRP-L-RK＝A_{纯品CRP-L-RK}

式中:c_CRP为血清样品的浓度；c_CRP-EK、c_CRP-GK、c_CRP-RK为血清CRP酶切肽段EK、GK、RK的浓度；A_CRP-EK、A_CRP-GK、A_CRP-RK为血清CRP酶切肽段EK、GK、RK的峰面积；A_CRP-L-EK、A_CRP-L-GK、A_CRP-L-RK为添加到血清样品中的标记肽段L-EK、L-GK、L-RK的峰面积；c_纯品CRP-EK、c_纯品CRP-GK、c_纯品CRP-RK为空白血清添加已知浓度纯品CRP酶切肽段EK、GK、RK的浓度；A_纯品CRP-EK、A_纯品CRP-GK、A_纯品CRP-RK为纯品酶切肽段EK、GK、RK的峰面积；A_{纯品CRP-L-EK}、A_{纯品CRP-L-GK}、A_{纯品CRP-L-RK}为同时添加到纯品中的标记肽段L-EK、L-GK、L-RK的峰面积；c_纯品CRP为纯品CRP的浓度。

2.根据权利要求1所述的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，将磁珠活化，按照抗体：磁珠＝40μg：1mg的比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物，浓度在1～10mg/mL；所述磁珠为含有磺酸酯键的聚苯乙烯珠子

取血清样品于1.5mL的离心管中；加入一定量的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的C反应蛋白结合到磁珠抗体上，去上清；用1mL的TBST洗涤磁珠3次；再用1mL的TBS洗涤1次；加入终浓度为0.1％三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的C反应蛋白洗脱下来，室温旋转孵育1h；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。

3.根据权利要求2所述的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)中，用SDS-Page电泳法和液相色谱法检测纯度。

4.根据权利要求3所述的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)SDS-Page电泳法具体为，在CRP溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。

5.根据权利要求4所述的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(2)液相色谱法具体为，将CRP样品进质谱，查看质谱图中是否有杂峰；色谱柱为：ACQUITY UPLCPepdide BEH C4柱，2.1mm×150mm，1.7μm；流动相为：A水相：水(0.1％甲酸)，B有机相：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min，进样量20uL。

6.根据权利要求5所述的血清中C反应蛋白的定值方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：对血清样品进行亲和纯化，采用一点法进行实验；在纯品CRP中添加空白血清，使其浓度分别对应相应浓度；磁珠提取后离心浓缩；加入少量的去离子水复溶；加入尿素、DTT，于37℃变性1h，对蛋白质进行变性；恢复常温后，加入IAM，避光反应1h，用于保护氨基酸残基；加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1mol/L以下；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；得到酶切肽段EK、GK、RK。