CN116908473A - 一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116908473A CN116908473A CN202310878502.3A CN202310878502A CN116908473A CN 116908473 A CN116908473 A CN 116908473A CN 202310878502 A CN202310878502 A CN 202310878502A CN 116908473 A CN116908473 A CN 116908473A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- enzymolysis
- temperature
- trypsin
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 43
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 42
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 31
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 22
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 22
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 21
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 17
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 17
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 17
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 13
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 abstract description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 8
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 8
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 8
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 108010072106 tumstatin (74-98) Proteins 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/55—IL-2
Abstract
本发明提供了一种蛋白‑细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法，通过采用耐高温胰蛋白酶smart digest对待测样品进行高温酶解，并优化了酶解和分析检测过程的工艺参数，使样品中的蛋白和其他杂质在酶解过程中发生变性，省去了常规肽图样品的变性、萃取、干燥、复溶等前处理步骤，缩短了酶切时间，优化液相梯度，降低了液相色谱串联质谱检测的基质效应，显著提高了检测精密度和准确度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
近年来，随着细胞治疗行业的深入发展，细胞治疗的产品丰富多样，其中细胞上偶联蛋白的产品越来越多，如白介素2-血小板偶联产物可用于治疗肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤等。为了实现细胞治疗的精准定量，比如精准定量蛋白-细胞偶联产品中的蛋白含量等等，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的定量分析检测技术。
目前关于细胞上偶联的蛋白的定量，Elisa和流式的技术尚无法对细胞上偶联的蛋白进行比较准确的定量。因此，目前还需要开发可快速、高效和准确的检测蛋白-细胞偶联物中的蛋白含量的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法，通过采用耐高温胰蛋白酶smart digest对待测样品进行酶解，并优化了酶解和分析检测过程的工艺参数，使蛋白在酶解过程中发生变性，省去了常规肽图样品的变性、萃取、变性、萃取、干燥、复溶等前处理步骤，缩短了酶切时间，优化液相梯度，降低了液相色谱串联质谱检测的基质效应，显著提高了检测精密度和准确度。
一方面，本发明提供了一种定量检测蛋白偶联物中的蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括耐高温胰蛋白酶、酶解缓冲液、酶解终止液，所述耐高温胰蛋白酶的酶解温度为70℃以上；所述蛋白偶联物为蛋白与细胞、抗体、抗原、或核酸偶联的产物。
为了能够定量检测蛋白偶联物中的蛋白，首先必须通过肽图分析，在蛋白偶联物中，找到仅存在于目标蛋白(待测蛋白)中，不存在于偶联载体中，且不参与偶联，响应值高的极性适中的肽段作为目标肽段，然后再通过对目标肽段的含量进行分析来实现蛋白偶联物中的蛋白定量。
为获得理想的肽图谱，通常在进行特异性裂解(如酶解)之前或之后，需要对待测蛋白质样品进行预处理。如样品中存在干扰成分、载体蛋白、赋形剂、稳定剂等，还需进行必要的浓缩、分离和纯化。对于复杂的大分子蛋白，其高级结构形成的空间位阻可能阻碍裂解剂到达裂解位点发挥作用，需要进行必要的变性剂处理、二硫键还原以及随后的游离巯基烷基化保护等；单克隆抗体、多亚基糖蛋白以及其他异源多聚体蛋白等蛋白质，裂解处理前可能需要分离重链和轻链、不同亚基，甚至去除糖侧链；在进行上述预处理步骤之后，还应采取必要的步骤去除预处理过程中引入的变性剂、还原剂、酰化试剂等其他试剂。必要时还需验证经过预处理后待测蛋白质的完整性和/或回收率。
可见常规肽图样品的制备过程非常繁琐，包括变性、萃取、干燥、复溶、烷基化、换液等等复杂步骤，而且因为换液等步骤操作繁琐复杂，会导致方法精密度和准确度差等问题。因此通过现有方法来检测定量检测蛋白偶联物中的蛋白步骤复杂，非常耗费人力物力。
本发明经大量研究惊喜地发现，通过采用耐高温胰蛋白酶对待测样本进行高温酶解后，只需离心取上清就可以进行肽图分析，根本无需进行其他任何前处理。其原因可能是耐高温胰蛋白酶对待测样本进行高温(70℃以上)酶解和高速离心后，疏水性肽段和杂质都会沉淀，仅剩其中的部分极性适中的肽段留存在离心后的上清液中，只要能够找到仅存在于目标蛋白中，不存在于偶联载体中，且不参与偶联，响应值高的极性适中的肽段作为目标肽段，就能非常简单轻松地实现蛋白偶联物中的蛋白的定量检测。
所述极性适中的肽段是指能在梯度的20％-80％之间，在C18色谱柱上出峰，在高温酶解过程中不会发生沉淀的肽段。极性强的肽段会因为极性强导致在色谱柱上弱保留甚至不出峰，极性太弱的肽段会因为极性太弱容易在检测过程中或者高速离心的条件下发生沉淀。
所述偶联载体是指能与蛋白发生偶联的细胞、抗体、抗原、核酸和小分子等等，偶联载体通过共价键、氢键、盐桥、范德华力、亲和力、免疫结合等等方式与蛋白结合在一起的产物即为蛋白偶联物。本发明提供的方法和试剂盒适用于任何蛋白偶联物，只要能够找到仅存在于目标蛋白中，不参与偶联，响应值高的极性适中的肽段，就能够通过该方法定量检测蛋白偶联物中的蛋白。
另外，常规的胰蛋白酶酶切时间通常需要4～18h，酶切时间长会导致肽段上发生翻译后修饰等，降低方法准确度；本发明采用耐高温胰蛋白酶的酶切时间短，仅需1h，有助于提高检测结果的准确性。
进一步地，所述蛋白偶联物为蛋白与细胞偶联的产物；所述耐高温胰蛋白酶为smart digest胰蛋白酶。
所述smart digest胰蛋白酶试剂盒为购自thermo fisher，货号60113-101的耐高温胰蛋白酶试剂盒，内含酶解缓冲液和胰蛋白酶。可以理解的是，任何耐高温的、专属性强(酶切赖氨酸C末端，酶切位点专一)的蛋白酶都可以用于本发明提供的方法和试剂盒来实现蛋白偶联物中的蛋白的定量检测。
进一步地，所述蛋白-细胞偶联产物为白介素2-血小板偶联产物。
进一步地，所述酶解终止液为甲酸溶液；所述试剂盒还包括液相色谱流动相，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液。
为了使不同样品间的一致性更好，在特定温度下酶解一定时间后，需要通过添加酶解终止液来终止酶解反应。
另一方面，本发明提供了一种定量检测蛋白-细胞偶联物中的蛋白的方法，采用如上所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
(1)利用smart digest胰蛋白酶对目标蛋白-linker和空白细胞进行高温酶解，离心后取上清，再通过液相色谱串联质谱进行肽图分析，找到仅存在于目标蛋白，且不与细胞偶联的系列肽段；所述高温酶解的温度为70℃以上；
(2)合成步骤(1)确定的系列极性适中肽段，在液相色谱串联质谱上选择响应较高的肽段作为目标肽段；
(3)采用同位素C13和N15合成步骤(2)中的目标肽段作为检测时的同位素内标；
(4)利用smart digest胰蛋白酶对待测样品进行高温酶解，通过同位素内标校正质谱仪器的偏差，分析其中的目标肽段含量，再根据标准曲线计算目标蛋白的含量；所述高温酶解的温度为70℃以上。
进一步地，所述smart digest胰蛋白酶进行酶解的方法为：在样品中加入smartdigest胰蛋白酶和酶解缓冲液进行酶解反应，酶解后加入酶解终止液终止反应；酶解终止液为甲酸溶液。
进一步地，所述酶解的温度为70℃，酶解时间为1小时。
当酶解温度为70℃，目标肽段检测结果的响应度更高，其原因可能是在该温度下蛋白变性的效果更好，所以酶切效率也更高。
进一步地，步骤(1)所述的液相色谱串联质谱进行肽图分析，采用的液相色谱流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，流速为0.3ml/min，梯度洗脱程序为：
虽然最后酶解样品中含有很多的细胞自身的蛋白的酶解肽段，但是利用液相和C18色谱柱对其进行分离，这降低了大部分基质效应；同时本发明通过筛选流动相，优化梯度洗脱程序，肽图分析时各肽段的分离效果更好，降低基质效应，检测结果更加精准。
再一方面，本发明提供了一种序列用于制备白介素2-血小板偶联产物中的白介素2含量检测的目标肽段的用途，所述序列具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明找到一条序列T7可用于白介素2-血小板偶联产物中的白介素2的含量检测，T7具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列。T7序列仅存在于目标蛋白白介素2中，不存在于血小板中，也不参与偶联，而且响应值高，为极性适中的肽段，最适合用于白介素2-血小板偶联产物中的白介素2的含量检测。
再一方面，本发明提供了一种耐高温胰蛋白酶用于制备蛋白偶联物中的蛋白的检测试剂的用途，所述耐高温胰蛋白酶为smart digest胰蛋白酶，酶解温度为70℃以上。
本发明具有以下有益效果：
(1)通过采用耐高温胰蛋白酶smart digest对待测样品进行酶解，省去了常规肽图样品制备中的变性、萃取、干燥、复溶、烷基化、换液等复杂步骤，操作简单，耗时短，检测结果线性好，精密度高；
(2)酶切时间短，仅需1h，有助于提高检测结果的准确性；而常规的胰蛋白酶酶切时间通常需要4～18h，酶切时间长会导致肽段上发生翻译后修饰等，降低方法准确度；
(3)通过筛选流动相，优化梯度洗脱程序，使肽段与其他基质杂质最大限度的分离，降低基质效应，检测结果更加精准；
(4)在0.6-7.2μg蛋白/108个细胞水平上，获得优异的线性相关系数，R2>0.995。
附图说明
图1为实施例1中的肽图总离子流谱图(TIC)；
图2为实施例1中肽段T2-4带一个SMCC的二级谱图；
图3为实施例1中肽段T2-5带一个SMCC的二级谱图；
图4为实施例1中肽段T8-11带一个SMCC的二级谱图；
图5为实施例1中肽段T8-13带一个SMCC的二级谱图；
图6为实施例1中高分辨质谱结果中肽段T6的二级谱图；
图7为实施例1中高分辨质谱结果中肽段T7的二级谱图；
图8为实施例1中肽段T7的三重四级杆的二级离子检测谱图；
图9为实施例1中肽段T6的三重四级杆的二级离子检测谱图；
图10为实施例1中的T7含量的标准曲线；
图11为实施例5中的优化前梯度洗脱程序1获得的肽图；
图12为实施例5中的优化前梯度洗脱程序2获得的肽图；
图13为实施例5中的优化后梯度洗脱程序3获得的肽图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1白介素2-血小板偶联产物中的蛋白定量方法
针对待检测白介素2-linker，空白血小板细胞和白介素2-血小板偶联产物，选择蛋白酶smart digest，对其进行酶解，具体操作步骤：
(1)细胞样品取样过程：在离心管中加入108个白介素2-血小板偶联产物，4000g离心20min，弃掉上清液(例如，取1mL白介素2-血小板偶联产物液体，细胞浓度为6*109个细胞/mL则弃掉上清液400μL，仅剩白介素2-血小板偶联产物400μL，浓度为1*1010个细胞/mL，涡旋至少10min，使全部细胞均匀，取10μL到每支离心管)。
(2)酶解过程：蛋白样品或者细胞样品中(如步骤1)，加入75μL酶解缓冲液(购自thermo fisher，型号60113-101，试剂盒中提供的配套的酶解缓冲液)，6μL smart digest胰蛋白酶(购自thermo fisher，型号60113-101)，用超纯水补足至100μL，70℃酶解1小时，取出，加入2μL 25％甲酸混匀，13000g离心5min，取上清80μL通过液相色谱串联质谱进行肽图分析，其中液相色谱流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序如表1所示。
表1、肽图分析的梯度洗脱程序
| 时间/min | 流速/mL/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 0.3 | 98 | 2 |
| 2 | 0.3 | 98 | 2 |
| 60 | 0.3 | 60 | 40 |
| 64 | 0.3 | 0 | 100 |
| 65 | 0.3 | 90 | 10 |
| 69 | 0.3 | 0 | 100 |
| 70 | 0.3 | 90 | 10 |
| 74 | 0.3 | 0 | 100 |
| 75 | 0.3 | 98 | 2 |
| 90 | 0.3 | 98 | 2 |
利用watersΜNIFI软件进行肽图数据分析，输入理论序列，设置linker修饰的分子式和修饰位点，软件会根据肽段一级分子量信息和二级碎片信息，去和蛋白序列(IL2序列如SEQ ID NO：3所示)进行匹配，进而确定偶联肽段和未偶联肽段，肽图总离子流谱图见图1。图2为白介素2偶联Linker肽段T2-4-SMCC的二级离子谱图，SMCC为磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(T2-4：表示经过酶切后，肽段第2和3个赖氨酸未被酶切，形成的一个肽段)；图3为肽段T2-5带一个SMCC的二级谱图；图4为肽段T8-11带一个SMCC的二级谱图；图5为中肽段T8-13带一个SMCC的二级谱图。
最终选择2条极性适中的具有较高响应值的肽段T6(Seq ID NO.2)和T7(Seq IDNO.1)，且T6和T7均没有检测到偶联linker(分析结果见图6和图7)。23.2min和23.98min分别为T7(FYMPK)和T6(MLTFK)的肽段峰。
T6和T7仅存在于白介素2中，不存在于血小板细胞中，且不属于偶联肽段，信号响应值较高，可以用来定量检测白介素2-血小板偶联产物中的白介素2。
根据软件鉴定结果，T6和T7在白介素2中，经smart digest胰蛋白酶酶切，没有检测到发生漏切的情况，且响应强，肽段本身性质稳定，没有易发生修饰的位点，基本上检测不到甲硫氨酸氧化发生，极性适中。
(3)购买金斯瑞定制，采用化学法方法合成的T6和T7肽段，并分别配制成浓度为0.01mg/mL的样品，在SCIEX API 4000质谱上，分别确定T6和T7的DP(去簇电压)和CE(碰撞电压)，检测结果如图8和图9所示，其中，图8为T7的检测图谱(最终选择定量离子对：685.5，244.2，DP:123，ce:38)，图9为T6的检测图谱(最终选择定量离子对：639.3，294.1，DP:110，ce:38)。通过比较定性离子：T7-244.2的峰高为7.8e6，T6-294.1的峰高为3.2e6，T7的响应是T6的2.5倍，因此最终确定T7为目标肽段。
(4)利用smart digest胰蛋白酶对标准曲线样品、待测样品和加标回收率样品进行高温酶解等处理步骤，后进行仪器分析，根据标准曲线计算样品中目标蛋白的含量，计算样品中T7的加标回收率来确定检测结果的准确度。
a、细胞样品取样：在离心管中加入108个白介素2-血小板偶联产物，4000g离心20min，弃掉上清液，例如，取1mL白介素2-血小板偶联产物液体，细胞浓度为6*109个细胞/mL则弃掉上清液400μL，仅剩白介素2-血小板偶联产物400μL，浓度为1*1010个细胞/mL，涡旋至少10min，使全部细胞均匀，取10μL到每支离心管，冻存于-80℃。
b、标准曲线样品的制备：取上述a的6支空白细胞，编号1-6，在1-6号离心管中分别加入0μg，0.6μg，1.2μg，2.4μg，4.8μg，7.2μg目标蛋白(浓度1.2mg/mL)；
c、待测样品的制备：按照a对样品取样，取4支离心管编号7-8各两支重复，在8号离心管中加入2.4μg目标蛋白(浓度1mg/mL)；
d、高温酶切：在1-8号离心管中加入75μL酶解缓冲液，6μL smart digest胰蛋白酶，最后用超纯水补足至100μL，70℃酶解1小时，取出，加入2μL 25％甲酸混匀，13000g离心5min，取80μL上清液到离心管中，每支离心管加入5μL 0.014μg/μL T7*同位素内标肽段，涡旋混匀，全部加入到液相小瓶；
e、三重四级杆分析：定量离子对：685.5，244.2，DP:123，ce:38；同位素内标的对应的定量离子对：693.4，252.3，DP:123，ce:38；1-6号样品的目标肽段峰面积检测结果如表2所示。
表2、标准曲线样品的检测结果
可见空白细胞对目标离子的干扰约为1％左右，可以忽略不计，这是由于质谱的噪音导致。
以2-6号样品的浓度做横坐标，定量离子对面积比(Area244.2/Area252.3)做纵坐标拟合标准曲线，标准曲线如图12所示，标准曲线方程为y＝0.9136x+0.151，相关系数R2＝0.9993。
分别将7、8号样品的目标肽段的面积代入标曲，计算目标蛋白含量，7、8号样品结果为如表3所示，7号样品的加标回收率为82.7％，完全满足检测要求。
表3、7，8号样品检测结果
实施例2酶解时间对检测结果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行白介素2含量的检测，采用白介素-2和空白血小板混合物模拟白介素2-血小板偶联产物，其中的酶解时间分别为1小时和2小时，考察不同酶解时间对白介素2-血小板偶联产物中的目标肽段T7的响应强度的影响，检测结果如表3所示。
表3、不同酶解时间对检测结果的影响
| Sample Name | Enzyme/μL | T7-244.2Response/1h | T7-244.2Response/2h |
| P+5μg IL2 | 1 | 1.91E+05 | 1.96E+05 |
| P+5μg IL2 | 2 | 3.00E+05 | 3.23E+05 |
| P+5μg IL2 | 4 | 3.92E+05 | 3.85E+05 |
根据表3，当酶解2小时的目标肽段T7的强度并没有比酶解1小时增加，证明1小时酶解已经很充分，延长酶解时间并不会影响肽段T7的检测结果，所以最终选择1小时为酶解时间。
实施例3加酶量对检测结果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行白介素2含量的检测，采用白介素-2和空白血小板混合物模拟白介素2-血小板偶联产物，其中的酶量分别为4、6、8μL，考察不同加酶量对白介素2-血小板偶联产物中的白介素2含量检测结果的影响，检测结果如表4所示。
表4、不同加酶量对检测结果的影响
| Sample Name | Enzyme/μL | T7-244.2 Response |
| P+5μg IL2+4μL Try | 4 | 6.64E+05 |
| P+5μg IL2+6μL Try | 6 | 7.88E+05 |
| P+5μg IL2+8μL Try | 8 | 7.77E+05 |
根据表4，加酶量6μL比4μL显著提高了目标肽段离子的响应，加酶量6μL和8μL则差异不明显，因此认为加酶量6μL已经足够在此细胞量存在下，酶解5μg的蛋白，因此最终选择加酶量6μL。
实施例4肽图分析梯度洗脱程序的筛选
在采用流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液的基础上，还需要考虑不同的梯度洗脱程序，为达到最好的分离度，才能使不同的肽段完全分开，而且较缓的梯度洗脱能使基质更大化的与目标肽段分离，降低基质效应，本实施例分别采用如表6、表7和表8所示的梯度洗脱程序。
表6、优化前的梯度洗脱程序1
表7、优化前的梯度洗脱程序2
| 时间/min | 流速/mL/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 0.8 | 95 | 5 |
| 1 | 0.8 | 95 | 5 |
| 2 | 0.8 | 90 | 10 |
| 8 | 0.8 | 75 | 25 |
| 8.5 | 0.8 | 10 | 90 |
| 8.6 | 0.8 | 90 | 10 |
| 9 | 0.8 | 10 | 90 |
| 9.1 | 0.8 | 95 | 5 |
| 15 | 0.8 | 95 | 5 |
表8、优化后的梯度洗脱程序3
| 时间/min | 流速/mL/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 0.8 | 95 | 5 |
| 1 | 0.8 | 95 | 5 |
| 2 | 0.8 | 85 | 15 |
| 5 | 0.8 | 70 | 30 |
| 5.5 | 0.8 | 10 | 90 |
| 5.6 | 0.8 | 90 | 10 |
| 6 | 0.8 | 10 | 90 |
| 6.1 | 0.8 | 95 | 5 |
| 12 | 0.8 | 95 | 5 |
采用表6的梯度洗脱程序，获得的肽图如图11所示，采用表7的梯度洗脱程序，获得的肽图如图12所示，采用表8的梯度洗脱程序，获得的肽图如图13所示。
从梯度洗脱结果可以看出，采用表8所示的梯度洗脱程序，肽段能够和前后的基质峰分离更加好，可以降低基质效应；梯度更短，更经济，所以选择表8作为最终梯度。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
SEQ ID NO：1
T7的序列
FYMPK
SEQ ID NO：2
T6的序列
MLTFK
SEQ ID NO：3
IL2：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK
KATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
Claims (10)
1.一种定量检测蛋白偶联物中的蛋白的试剂盒，其特征在于，包括耐高温胰蛋白酶、酶解缓冲液、酶解终止液，所述耐高温胰蛋白酶的酶解温度为70℃以上；所述蛋白偶联物为蛋白与细胞、抗体、抗原、或核酸偶联的产物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白偶联物为蛋白与细胞偶联的产物；
所述耐高温胰蛋白酶为smart digest胰蛋白酶。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白-细胞偶联产物为白介素2-血小板偶联产物或白介素15-血小板偶联产物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶解终止液为甲酸溶液；所述试剂盒还包括液相色谱流动相，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液。
5.一种定量检测蛋白-细胞偶联物中的蛋白的方法，其特征在于，采用如权利要求1～4任一项所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
(1)利用smart digest胰蛋白酶对蛋白-细胞偶联物进行高温酶解，离心后取上清，再通过液相色谱串联质谱进行肽图分析，找到仅存在于目标蛋白，且不与细胞偶联的系列肽段；所述高温酶解的温度为70℃以上；
(2)合成步骤(1)确定的系列极性适中的肽段，在液相色谱串联质谱上选择响应较高的肽段作为目标肽段；
(3)采用同位素C13和N15合成步骤(2)中的目标肽段作为检测时的同位素内标；
(4)利用smart digest胰蛋白酶对待测样品进行高温酶解，通过同位素内标校正仪器检测误差，分析其中的目标肽段含量，再根据标准曲线计算目标蛋白的含量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述smart digest胰蛋白酶进行酶解的方法为：在样品中加入smart digest胰蛋白酶和酶解缓冲液进行酶解反应，酶解后加入酶解终止液终止反应；酶解终止液为甲酸溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为70℃，酶解时间为1小时。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的液相色谱串联质谱进行肽图分析，采用流动相包括流动相A和流动相B，所述流流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序为：
9.一种序列用于制备白介素2-血小板偶联产物中的白介素2含量检测的目标肽段的用途，其特征在于，所述序列具有如Seq ID NO.1和/或Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。
10.一种耐高温胰蛋白酶用于制备蛋白偶联物中的蛋白的检测试剂的用途，其特征在于，所述耐高温胰蛋白酶为smart digest胰蛋白酶，酶解温度为70℃以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310878502.3A CN116908473A (zh) | 2023-07-17 | 2023-07-17 | 一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310878502.3A CN116908473A (zh) | 2023-07-17 | 2023-07-17 | 一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116908473A true CN116908473A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88356069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310878502.3A Pending CN116908473A (zh) | 2023-07-17 | 2023-07-17 | 一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116908473A (zh) |
-
2023
- 2023-07-17 CN CN202310878502.3A patent/CN116908473A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107402269B (zh) | 基于scx/sax混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用 | |
| CN110220994B (zh) | 一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法 | |
| CN110850099B (zh) | 一种非疾病诊断目的的血清中c反应蛋白的定值方法 | |
| CN108469495B (zh) | 一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法 | |
| CN111381043B (zh) | 一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用 | |
| WO2023093133A1 (zh) | 一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法和应用 | |
| CN108982737B (zh) | 一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法 | |
| CN111239273A (zh) | 一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法 | |
| CN109541115A (zh) | 唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法 | |
| US20100256011A1 (en) | Selective enrichment of post-translationally modified proteins and/or peptides | |
| EP3035058B1 (en) | Cancer marker screening method through detection of deglycosylation of glycoprotein and hepatocellular cancer marker | |
| CN111777696B (zh) | 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法 | |
| WO2023185840A1 (zh) | 一种基于质谱检测体液样本里中低丰度蛋白的方法 | |
| CN116908473A (zh) | 一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法 | |
| US20110045989A1 (en) | Selective enrichment of n-terminally modified peptides from complex samples | |
| CN116804047A (zh) | 新型冠状病毒疫苗中s蛋白含量的检测方法 | |
| CN111077256A (zh) | 一种结合双向凝胶电泳和质谱鉴定糖蛋白糖链结构的方法 | |
| CN113884561B (zh) | 一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法 | |
| CN116046923B (zh) | 一种血清中降钙素原的定值方法 | |
| CN116559333B (zh) | 一种外泌体表面蛋白绝对定量的方法及其应用 | |
| CN116731121A (zh) | 一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽及其应用 | |
| CN114264739B (zh) | 基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法 | |
| CN115166067B (zh) | 用于相对定量分析猪10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶aldh1l1的肽段组合物及应用 | |
| CN117214350B (zh) | 多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒 | |
| CN111855861B (zh) | 伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |