CN116731121A - 一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽及其应用，涉及食品检测技术领域。本发明通过蛋白质组学方法筛选出了鸡肉的定量特征多肽NLQQEIADLTEQIAEGGK、SAMLQLAVTEIEK和DQGTFEDFVEGLR，可经液相色谱串联质谱联用仪(LC‑MS/MS)检测，实现各类复杂基质的肉及肉制品中的鸡肉定性和定量检测。经试验证实，利用本发明所述的鸡肉定量特征多肽对肉制品中的鸡肉含量进行检测，回收率达到82.56％‑90.19％，具有特异性强、准确率高的优势，为顺应市场需求、规范行业标识、维护市场公平提供了强有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽及其应用。
背景技术
近年来，食品欺诈受到越来越多的关注，该问题不仅扰乱正常市场秩序，而且对消费者的经济利益和健康安全造成严重危害。其中，肉制品掺假是一类重要的食品欺诈类型。肉制品消费人群广，产品类型多，加工工艺复杂，产品价格跨度大，部分不法商家在利益驱动下用较便宜的肉类/非肉蛋白替代价格更高的肉类。鸡肉作为一种价格低廉的原料，较易成为替代其他物种的肉类。且由于产品中的肉类成分的质地和形态在加工后均已改变，较难辨别出原料肉成分，亟需快速准确的检测方法鉴别肉及肉制品中的肉类成分。随着人民群众对美好生活的需求日益增长，肉制品消费更加注重质量和营养，部分生产企业推出标称某种肉类成分含量的产品，如标称牛肉含量超过90％的牛肉丸子等。因此，为最大限度保护消费者利益，规范行业发展，维护市场公平，加强标识监管，亟需建立肉制品中极易被用于替代其他成分的鸡肉定量检测方法。
基于质谱技术测定特征多肽的方法已被广泛应用于食品真伪鉴定中，该类方法具有高热稳定性、高灵敏度、高通量等优点。但目前并未实现各类复杂基质的肉及肉制品中的鸡肉的定量检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽，检测特异性强、准确率高。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽，所述定量特征多肽信息如下表1：
表1鸡肉的定量特征多肽信息
| 多肽序列 | 母离子(m/z) | 子离子(m/z) | 碰撞能量(V) |
| NLQQEIADLTEQIAEGGK | 653.000 | 461.235/702.377/831.422 | 25 |
| SAMLQLAVTEIEK | 716.892 | 718.398/789.434/902.519 | 26 |
| DQGTFEDFVEGLR | 756.853 | 244.093/964.473/1111.542 | 27 |
。
本发明还提供了一种检测肉制品中鸡肉含量的方法，所述方法包括如下步骤：
提取待测肉制品中的蛋白质，经还原、烷基化、酶解、除盐后利用液相色谱串联质谱检测上述的定量特征多肽，依据标准曲线即可测定待测肉制品中的鸡肉含量。
优选的，所述提取待测肉制品中的蛋白质用提取液进行提取，所述提取液包括如下浓度的组分：7mol/L尿素、2mol/L硫脲和0.05mol/LTris-HCl溶液；所述提取液的pH值为8.0。
优选的，所述还原的试剂为浓度50mmol/L的二硫苏糖醇溶液；所述烷基化的试剂为浓度100mmol/L的碘乙酰胺溶液。
优选的，所述酶解在pH为8.0的25mmol/LTris-HCl溶液中进行；所述酶解的酶为1mg/mL的胰蛋白酶。
优选的，采用C18固相萃取柱进行所述除盐。
优选的，所述液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，柱温40℃，进样体积为10μL，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为0.1％甲酸-乙腈溶液，流速为0.2mL/min；色谱梯度为：0min，97％A相、3％B相；0.2min，90％A相、10％B相；16min，60％A相、40％B相；17min，20％A相、80％B相；19.5min，20％A相、80％B相；19.6min，97％A相、3％B相；25min，97％A相、3％B相。
优选的，所述质谱的条件为：离子源为ESI源，检测方式为MRM，扫描方式为正离子模式；离子源参数条件为：毛细管电压3.5kv，毛细管温度270℃，辅助气流速15Arb，辅助气温度380℃，鞘气流速45Arb，碰撞气压力1.5mTorr，分辨率0.7。
优选的，所述定量特征多肽信息通过如下步骤筛选得到：
提取纯鸡肉中的蛋白质，经还原、烷基化、酶解、除盐后进行高分辨质谱检测，获得的高分辨质谱图经蛋白质组学软件分析、Skyline软件分析、LC-MS/MS验证以及标准曲线的绘制、回收率的考察，最终筛选获得所述定量特征多肽信息。
本发明还提供了上述的鸡肉定量特征多肽在检测肉制品鸡肉含量中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽，通过蛋白质组学方法筛选出了鸡肉的定量特征多肽NLQQEIADLTEQIAEGGK、SAMLQLAVTEIEK和DQGTFEDFVEGLR，可经液相色谱串联质谱联用仪(LC-MS/MS)检测，实现各类复杂基质的肉及肉制品中的鸡肉定性和定量检测。经试验证实，利用本发明所述的鸡肉定量特征多肽对肉制品中的鸡肉含量进行检测，回收率达到82.56％-90.19％，具有特异性强、准确率高的优势，为顺应市场需求、规范行业标识、维护市场公平提供了强有力的技术支持。
附图说明
图1为实施例3香肠样品三种鸡肉定量特征多肽的MRM质谱图。
图2为纯鸡肉的样品(左)与香肠样品(右)的总离子流图。
具体实施方式
本发明提供了一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽，所述定量特征多肽信息如下：
表1鸡肉定量特征多肽信息
| 多肽序列 | 母离子(m/z) | 子离子(m/z) | 碰撞能量(V) |
| NLQQEIADLTEQIAEGGK | 653.000 | 461.235/702.377/831.422 | 25 |
| SAMLQLAVTEIEK | 716.892 | 718.398/789.434/902.519 | 26 |
| DQGTFEDFVEGLR | 756.853 | 244.093/964.473/1111.542 | 27 |
。
本发明中，所述鸡肉定量特征多肽1：NLQQEIADLTEQIAEGGK(SEQ ID NO.1)，来源于蛋白Myosin heavy chain，氨基酸序列为：天冬酰胺-亮氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-谷氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸，包含18个氨基酸；分子量为1957.13Da，在质谱扫描时，可带3个电荷，母离子(m/z)为653.000。
本发明中，所述鸡肉定量特征多肽2：SAMLQLAVTEIEK(SEQ ID NO.2)，来源于蛋白Troponin I，氨基酸序列为：丝氨酸-丙氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-赖氨酸，包含13个氨基酸；分子量为1432.7Da，在质谱扫描时，可带2个电荷，母离子(m/z)为716.892。
本发明中，所述鸡肉定量特征多肽3：DQGTFEDFVEGLR(SEQ ID NO.3)，来源于蛋白Myosin light chain，氨基酸序列为：天冬氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-谷氨酸-甘氨酸-亮氨酸-精氨酸，包含13个氨基酸；分子量为1512.6Da，在质谱扫描时，可带2个电荷，母离子(m/z)为756.853。
本发明中，所述鸡肉定量特征多肽是利用蛋白质组学软件分析纯鸡肉样品的高分辨质谱图，通过搜索UniProt蛋白数据库，从中筛选出鸡肉特异性多肽。经Skyline软件分析，得到筛选特异性多肽的离子对信息，并经过LC-MS/MS进行验证。后续通过标准曲线的绘制以及回收率情况，进一步筛选出鸡肉定量特征多肽，并得到相应的鸡肉的含量。
本发明还提供了一种检测肉制品中鸡肉含量的方法，所述方法包括如下步骤：
提取待测肉制品中的蛋白质，经还原、烷基化、酶解、除盐后利用液相色谱串联质谱检测上述的定量特征多肽，依据标准曲线即可测定待测肉制品中的鸡肉含量。
本发明中，所述提取待测肉制品中的蛋白质优选的用提取液进行提取，所述提取液优选的包括如下浓度的组分：7mol/L尿素、2mol/L硫脲和0.05mol/L Tris-HCl溶液；所述提取液的pH值为8.0。本发明中，所述肉制品与提取液的质量体积比优选为2g/20mL；所述肉制品在进行检测前优选经过打样器处理，使肉制品完全均匀搅碎。
本发明将提取得到的蛋白质进行还原；所述还原的试剂优选为浓度50mmol/L的二硫苏糖醇溶液；所述还原的温度优选为56℃，所述还原的时间优选为60min。本发明中，所述烷基化的试剂优选为浓度100mmol/L的碘乙酰胺溶液；所述烷基化优选的在暗处进行，所述烷基化的时间优选为30min。本发明所述还原的目的是：还原蛋白质氨基酸序列之间的二硫键，打开蛋白质的三维结构，裸露酶切位点，便于后续酶解反应。本发明所述烷基化步骤的目的是：使打开的二硫键基团发生乙酰化反应，避免二硫键再次形成。
本发明烷基化后的产物进行酶解；所述酶解优选的在pH为8.0的25mmol/LTris-HCl溶液中进行；所述酶解的酶优选为1mg/mL的胰蛋白酶；所述酶解的温度优选为37℃，所述酶解的时间优选为12h。本发明中，所述酶解后优选的进行终止反应；所述终止的试剂优选为乙酸。本发明所述酶解的目的是：使蛋白按照一定的规律进行断裂，成为短链多肽。
本发明酶解后的产物进行除盐；所述除盐优选的采用C18固相萃取柱进行；所述C18固相萃取柱在使用前优选的采用3mL乙腈、3mL0.5％的乙酸溶液进行活化平衡。本发明中，所述C18固相萃取柱中淋洗的溶液优选为体积百分含量为0.5％的乙酸溶液；洗脱的溶液优选为乙腈-0.5％(体积百分含量)乙酸溶液；所述乙腈-0.5％乙酸溶液中乙腈和乙酸的体积比优选为6:4。
本发明中，所述液相色谱的条件优选为：色谱柱为C18柱，柱温40℃，进样体积为10μL，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为0.1％甲酸-乙腈溶液，流速为0.2mL/min；色谱梯度为：0min，97％A相、3％B相；0.2min，90％A相、10％B相；16min，60％A相、40％B相；17min，20％A相、80％B相；19.5min，20％A相、80％B相；19.6min，97％A相、3％B相；25min，97％A相、3％B相。
本发明中，所述质谱的条件优选为：离子源为ESI源，检测方式为MRM，扫描方式为正离子模式；离子源参数条件为：毛细管电压3.5kv，毛细管温度270℃，辅助气流速15Arb，辅助气温度380℃，鞘气流速45Arb，碰撞气压力1.5mTorr，分辨率0.7。
本发明中，所述定量特征多肽信息优选的通过如下步骤筛选得到：
提取鸡肉标准品中的蛋白质，经还原、烷基化、酶解、除盐后进行高分辨液相-质谱检测，获得的高分辨质谱图经蛋白质组学软件分析、Skyline软件分析、LC-MS/MS验证以及标准曲线的绘制即可筛选获得所述定量特征多肽信息。
本发明还提供了上述的鸡肉定量特征多肽在检测肉制品鸡肉含量中的应用。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.样品前处理
(1)称取肉制品样品2g于50mL离心管中，加入20mL提前预冷的蛋白提取液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、0.05mol/LTris-HCl溶液，pH 8.0)，冰水浴条件下均质，4℃下12000rpm离心20min，得到含有肉制品蛋白的上清；
(2)吸取200μL步骤(1)所述上清，加入30μL 50mmol/L的二硫苏糖醇溶液，涡旋混匀后，于56℃下反应60min；冷却至室温后，加入30μL 100mmol/L碘乙酰胺溶液，涡旋混匀后，于暗处反应30min；
(3)在步骤(2)所得产物中加入1.8mL浓度为25mmol/LpH为8.0的Tris-HCl溶液和60μL的1mg/mL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀后，于37℃下过夜反应；待反应结束后，加入15μL乙酸终止反应，待净化；
(4)C18固相萃取柱以此用3mL乙腈、3mL0.5％的乙酸溶液活化平衡后，上样(样品为步骤(3)所得产物)，用3mL 0.5％乙酸溶液淋洗，抽干后，用2mL乙腈-0.5％乙酸溶液(其中，乙腈和乙酸的体积比6:4)洗脱；涡旋混匀后，用0.22μm滤膜过滤，得到待测液。
实施例2
标准曲线的制备
(1)称取纯鸡肉2g，加入20mL蛋白提取溶液，均质后12000r/min离心20min，分别取上清液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL至5个离心管，后续处理步骤同实施例1，即得含不同浓度梯度的鸡肉标准工作溶液。
(2)液相色谱串联质谱检测
液相色谱条件：
a)色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm,填料粒径1.9μm；
b)柱温：40℃；
c)进样体积：10μL；
d)流速：0.2mL/min；
e)流动相：A：0.1％甲酸溶液，B：0.1％甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱程序如表2。
表2液相色谱流动相梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A，％ | 流动相B，％ |
| 0 | 97 | 3 |
| 0.2 | 90 | 10 |
| 16 | 60 | 40 |
| 17 | 20 | 80 |
| 19.5 | 20 | 80 |
| 19.6 | 97 | 3 |
| 25 | 97 | 3 |
质谱条件：
a)离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
b)检测方式：多反应监测(MRM)；
c)扫描方式：正离子模式；
d)离子源参数条件：毛细管电压3.5kⅴ；毛细管温度：270℃；辅助气流速：15Arb；辅助气温度：380℃；鞘气流速：45Arb；碰撞气压力：1.5mTorr；分辨率：0.7。
(3)根据标准曲线制备方法以及前处理过程，标准曲线的浓度，用外标法评估校准曲线的线性，具体结果如表3所示。
表3 5点校准曲线的线性回归方程
注：y为鸡肉定量多肽的峰面积，x为鸡肉特异性定量多肽含量。
可以看出，本发明所述三种定量特征多肽的校准曲线的线性良好，R2均大于0.99。
实施例3
检测实例
模拟样品制备：按照常规香肠的生产工艺，制备含有已知含量的鸡肉模拟样品，其中鸡肉含量为40g/100g。
按照实施例1步骤对香肠进行预处理，得到香肠待测液；并按照实施例2液相色谱串联质谱方法对待测液进行检测，对香肠中鸡肉进行定性和定量分析。
(1)定性分析
利用实施例2所述3条鸡肉定量特征多肽进行定性分析，每个鸡肉定量特征多肽包含1个母离子，3个子离子，在相同实验条件下，样品中待测多肽与标准样品保留时间比相对偏差在±2.5％；多肽的3个子离子的保留时间一致，则可判定为存在鸡肉成分。对香肠样品检测的结果如图1-2。
由图1和图2可知，每条多肽所筛选的3个子离子碎片均有较强的响应强度，并且保留时间在±2.5％范围内，与纯鸡肉所测定的色谱图的保留时间完全一致，由此认定样品中含有鸡肉。
(2)定量分析
采用液相色谱串联质谱检测香肠待测液，然后将得到的特征多肽的峰面积代入标准曲线的线性回归方程(表3)中，计算得到样品中的鸡肉的质量浓度C，根据公式：
X＝(C×V×f)/(m×1000)×100％；
其中，C-由标准曲线得到的多肽样品对应的鸡肉浓度，单位mg/mL；
V-待测样品溶液的上机体积，单位mL；本实施例中为2mL；
f-样品稀释倍数；本实施例中为(20mL×1000μL/mL)/(200μL)；
m-待测肉制品的称样量，单位g；本实施例中为2g；
计算得到待测肉制品中鸡肉的含量X，单位g/100g，结果如表4所示。
表4香肠待测液中鸡肉含量计算结果
可见，采用本发明所述鸡肉定量特征进行检测的回收率为82.56％～90.19％，多鸡肉含量的检测准确度高。
对比例1
将鸡肉定量特征多肽替换为VTFQLPAER(SEQ ID NO.4)，氨基酸序列为：缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸，来源蛋白为Myosinheavy chain，分子量为1060.22Da，质谱中带2个电荷，母离子为530.793。
采用实施例1-2相同的方法，得到VTFQLPAER的回归方程，将模拟香肠样品(与实施例3香肠模拟样品相同)采用实施例1的处理方式，按照实施例2液相色谱串联质谱方法对待测液检测，根据VTFQLPAER的回归方程，得到实施例3模拟香肠样品中的鸡肉含量。
通过测定，模拟香肠样品的鸡肉含量为18.6g/100g，回收率为46.5％。整体测定的结果偏低。可见，本发明三种鸡肉定量特征多肽相对于VTFQLPAER，用于检测肉制品中鸡肉含量具有特异性，且具有更高的准确度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种测定肉制品中鸡肉含量的定量特征多肽，其特征在于，所述定量特征多肽信息如下：
。
2.一种检测肉制品中鸡肉含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
提取待测肉制品中的蛋白质，经还原、烷基化、酶解、除盐后利用液相色谱串联质谱检测权利要求1所述的定量特征多肽，依据标准曲线即可测定待测肉制品中的鸡肉含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取待测肉制品中的蛋白质用提取液进行提取，所述提取液包括如下浓度的组分：7mol/L尿素、2mol/L硫脲和0.05mol/LTris-HCl溶液；所述提取液的pH值为8.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述还原的试剂为浓度50mmol/L的二硫苏糖醇溶液；所述烷基化的试剂为浓度100mmol/L的碘乙酰胺溶液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶解在pH为8.0的25mmol/L Tris-HCl溶液中进行；所述酶解的酶为1mg/mL的胰蛋白酶。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用C18固相萃取柱进行所述除盐。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，柱温40℃，进样体积为10μL，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为0.1％甲酸-乙腈溶液，流速为0.2mL/min；色谱梯度为：0min，97％A相、3％B相；0.2min，90％A相、10％B相；16min，60％A相、40％B相；17min，20％A相、80％B相；19.5min，20％A相、80％B相；19.6min，97％A相、3％B相；25min，97％A相、3％B相。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质谱的条件为：离子源为ESI源，检测方式为MRM，扫描方式为正离子模式；离子源参数条件为：毛细管电压3.5kv，毛细管温度270℃，辅助气流速15Arb，辅助气温度380℃，鞘气流速45Arb，碰撞气压力1.5mTorr，分辨率0.7。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量特征多肽信息通过如下步骤筛选得到：
提取纯鸡肉中的蛋白质，经还原、烷基化、酶解、除盐后进行高分辨质谱检测，获得的高分辨质谱图经蛋白质组学软件分析、Skyline软件分析、LC-MS/MS验证以及标准曲线的绘制、回收率的考察，最终筛选获得所述定量特征多肽信息。
10.权利要求1所述的鸡肉定量特征多肽在检测肉制品鸡肉含量中的应用。
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