CN114264739B - 基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种掺假羊乳的鉴别方法，具体涉及一种基于特征性成分α3’‑半乳糖基乳糖及N‑乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法。首先通过反相高效液相色谱技术定性定量比较了羊乳和牛乳寡糖中α3’‑半乳糖基乳糖(α3’‑GL)和N‑乙酰葡糖胺基乳糖的差异；然后针对不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’‑GL和N‑乙酰葡糖胺基乳糖的含量建立了线性回归方程；最后利用线性回归方程对市售的羊乳制品进行掺假检测，为进一步发展掺假羊乳的鉴别技术提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种掺假羊乳的鉴别方法，具体涉及一种基于α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法。
背景技术
羊乳营养丰富，具有易消化吸收，低致敏等优点。研究发现，羊乳中几种主要过敏源蛋白的占比低于牛乳，如：αS1-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，且乳糖的含量低于牛乳，更适合乳糖不耐受人群食用。我国奶山羊资源有限，奶山羊泌乳期短，产量低，且羊乳的价格远高于牛乳，这导致不法商贩在利益的驱动下将牛乳或者水掺入羊乳中以此牟利。这种掺假行为损害了消费者的利益和市场秩序，影响了乳品产业健康发展。因此，建立一种高效精准的检测体系用于鉴别羊乳掺假现象尤为重要。
目前，羊乳制品掺牛乳最常见的形式是用部分牛乳代替羊乳或者将牛乳清粉掺入羊乳中。由于羊乳和牛乳的营养成分存在差异，如：蛋白质、脂肪、和DNA分子等，因此上述物质可作为羊乳掺假牛乳的研究基质。现阶段，羊乳掺假牛乳的检测方法主要以蛋白质检测、核酸检测以及脂肪酸检测为主。
基于蛋白质掺假检测的技术手段主要有电泳分析法和酶联免疫吸附法等。电泳分析法的成本低、可操作性强，但重现性差；酶联免疫吸附法灵敏度高，特异性强，但特异性抗体制备存在困难，且成本高；与此同时，以蛋白质为基质的检测方法也存在一定局限性：第一，对于羊乳掺假牛乳清粉的乳制品来说，由于乳清粉中不含有酪蛋白成分，造成该方法的普适性受限；第二，对于经高温处理的乳制品来说，由于部分蛋白质会因高温发生变性，导致该方法缺乏准确性。
基于核酸检测的技术手段主要有PCR技术、qPCR技术和等温扩增技术等。PCR技术特异性、灵敏度高，但只能定性不能定量分析；qPCR技术不仅特异性强、灵敏度高，而且可以定性定量分析，但探针成本较高、操作步骤复杂。
基于脂肪酸检测的技术手段主要有气相色谱法，该方法检测灵敏度低，同时并不适用于羊乳中掺入脱脂牛乳的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，以克服现有以蛋白质为基质的检测方法存在普适性及准确性较低、电泳分析法存在的重现性差、酶联免疫吸附法存在成本高、PCR技术不能定量分析、qPCR技术成本较高、操作步骤复杂、基于脂肪酸检测存在的检测灵敏度低，同时不适用于羊乳中掺入脱脂牛乳的检测等问题。
哺乳动物乳汁中的营养成分由乳糖、脂质、蛋白质和低聚糖等组成，其中寡糖是除乳糖和脂质外的第三大类固形物，由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸等六种单糖残基组成，并以不同糖苷键构成丰富的结构类型。不同种类哺乳动物的乳汁中寡糖的含量和种类存在较大差异，牛乳中寡糖的含量为30-60mg/L，而羊乳中寡糖的含量是牛乳的4—10倍(0.25-0.30g/L)。在研究过程中，我们发现羊乳中特征性寡糖半乳糖基乳糖含量最高，约占85％，并发现该糖链具有五种同分异构体，分别为：β6'-GL,α6'-GL,β4'-GL,α3'-GL和β3'-GL，这几种寡糖的含量分布在羊乳和牛乳中存在显著性差异，此外，在牛乳中检测到特征性寡糖N-乙酰葡糖胺基乳糖，该糖链在羊乳中是微量。同时，经过检索，目前以特征性寡糖为基质对掺假羊乳鉴别的研究还未见报道。
本发明首先对乳寡糖进行高效分离分析，并定性定量比较了不同掺假程度下羊乳和牛乳中特征性寡糖半乳糖基乳糖异构体以及N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，建立了一种基于特征性成分α3’-GL及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳的鉴别方法，为乳寡糖的应用提供新方向，为掺假羊乳鉴别方法的开发提供新思路。
本发明的技术方案是提供一种基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、使用高效液相色谱技术对纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖进行定性定量分析；
步骤2、基于步骤1的定性定量分析结果，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程；
步骤3、根据步骤2建立的线性回归方程，确定待测羊乳中是否掺假牛乳及掺假程度。
进一步地，骤1具体为：
步骤1.1、通过离心、醇沉和石墨碳柱分离除去纯羊乳、纯牛乳中的脂肪、蛋白质和大量乳糖，获得游离寡糖；
步骤1.2、对游离寡糖进行AEAB衍生化标记；
步骤1.3、基于HPLC分离分析方法，利用反相C18柱对纯羊乳和纯牛乳中游离寡糖衍生物进行分离分析，获得等体积的纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量。
进一步地，步骤2具体为：
步骤2.1、制作不同添加比例的牛乳和羊乳混合物；
步骤2.2、利用步骤1的方法，对上述等体积混合物中游离寡糖衍生物进行分离纯化，获得其中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量；
步骤2.3、基于步骤1及步骤2.2的结果，建立含有不同百分比牛乳的羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量线性回归方程。
进一步地，步骤2.3具体为：
步骤2.31、分别对等体积纯羊乳和纯牛乳中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行积分；
步骤2.32、将纯羊乳中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积和纯牛乳中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积；将纯羊乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积和纯牛乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积；
步骤2.33、计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积的比值；计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值；
步骤2.34、利用不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积的比值，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖含量的线性回归方程；
利用不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程。
进一步地，步骤2.34中：
不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖含量的线性回归方程为：y＝-0.4662x+0.7339；其中x为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物，y为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积的比值；
不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程为：y＝0.988x-0.0143；其中x为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物，y为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值；
上述两种线性回归方程的R2＞0.99。
进一步地，基于HPLC分离分析方法条件为：
在25℃下使用4.6mm×250mm的COSMOSILC18柱，紫外检测波长为330nm，流速1.0mL.min-1，进样量10μL；溶剂A：100％乙腈；溶剂B：含0.1％的三氟乙酸水溶液；优化后的洗脱梯度：t＝0min，2％A，98％B；t＝40min，2％A，98％B。
进一步地，步骤3具体为：
步骤3.1、判断待鉴别羊乳中是否添加功能性寡糖；若是，则执行步骤3.2，否则，执行步骤3.4；
步骤3.2、判断功能性寡糖对α3’-半乳糖基乳糖的定量是否有影响，若是，则执行步骤3.3，否则执行步骤3.4；
步骤3.3、利用步骤1的方法，检测待鉴别羊乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，根据步骤2建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，计算待鉴别羊乳中掺入牛乳的比例，获得是否掺假牛乳及掺假程度；
步骤3.4、利用步骤1的方法，检测待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖和/或N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，根据步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖和/或N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，计算掺入牛乳的比例，获得是否掺假牛乳及掺假程度。
进一步地，步骤3.1之前还包括：
若待鉴别羊乳的HPLC色谱图显示，无牛乳掺入，根据步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖的线性回归方程，检测羊乳含量，若羊乳含量小于100％，则认为该羊乳中掺水；
若待鉴别羊乳的HPLC色谱图显示，有牛乳掺入，则执行步骤3.1。
进一步地，步骤3.1具体为：若α3’-半乳糖基乳糖的含量大于纯羊乳中的含量，则根据ESI-MS检测判断待鉴别羊乳中是否添加功能性寡糖；若是，则执行步骤3.2，否则，执行步骤3.4。
进一步地，步骤3.4中还包括根据待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖的含量，判断待鉴别羊乳中是否存在掺水现象的过程；
步骤3.41、利用步骤1的方法，检测待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，根据步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，计算掺入牛乳的比例，获得是否掺假牛乳及掺假程度；
步骤3.42、根据掺入牛乳的比例，基于步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖含量的线性回归方程，计算α3’-半乳糖基乳糖含量；
步骤3.43、若步骤3.41检测待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖的含量值小于步骤3.42计算的α3’-半乳糖基乳糖含量，则认为待鉴别羊乳中掺水。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次建立了一种基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖(α3’-GL)及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳的鉴别方法。首先使用高效液相色谱技术对羊乳和牛乳游离寡糖中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖进行定性定量分析；然后制作了不同添加比例的羊乳和牛乳混合物，并利用高效液相色谱结合多级串联质谱技术对不同混合样品中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖进行了定量分析，并制定了相关寡糖的线性回归曲线；最后利用线性回归曲线对商业化羊乳制品进行了掺假现象的鉴别。
结果显示，羊乳和牛乳寡糖中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量呈显著性差异，羊乳中α3’-GL的含量约为牛乳的3倍，牛乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量是大量，而羊乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量是微量；两种寡糖的含量与不同添加比例的羊乳和牛乳混合物呈线性关系，最低检测限为羊乳中掺假2％的牛乳；对于没有添加功能性寡糖的羊乳制品来说，可以根据α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量来准确判断商品是否掺假牛乳及掺假程度，而对于添加了多种低聚半乳糖的羊乳制品来说，可以通过N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量来确定商品中是否掺假牛乳及掺假程度。该结果为羊乳特征性寡糖的应用与开发奠定了基础，为羊乳制品的掺假研究提供了新思路，对进一步完善羊乳制品安全检测技术体系以及保障羊乳制品市场的良性发展具有参考和借鉴意义。
2、本发明检测方法普适性高、准确性较高、重现性好、成本低、定量分析、检测灵敏度高，同时适用于羊乳中掺入脱脂牛乳或者掺水的检测。
附图说明
图1为纯羊乳和纯牛乳游离寡糖AEAB衍生物的HPLC色谱图；
其中图A为纯羊乳游离寡糖AEAB衍生物的HPLC色谱图；图B为纯牛乳游离寡糖AEAB衍生物的HPLC色谱图；图中a为α3’-半乳糖基乳糖，b为N-乙酰葡糖胺基乳糖；
图2为全甲基化N-乙酰葡糖胺基乳糖的ESI-MSn图谱；
图3为不同添加比例的羊乳和牛乳混合物游离寡糖衍生物的HPLC色谱图；其中A为100％羊乳，B为80％羊乳，20％牛乳，C为65％羊乳，35％牛乳，D为50％羊乳，50％牛乳，E为35％羊乳，65％牛乳；F为20％羊乳，80％牛乳；G为100％牛乳；图中a为α3’-半乳糖基乳糖，b为N-乙酰葡糖胺基乳糖；
图4为不同添加比例羊乳和牛乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖线性回归曲线；
图5为八种商业化羊乳制品中寡糖衍生物的HPLC色谱图；其中a为α3’-半乳糖基乳糖，b为N-乙酰葡糖胺基乳糖。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。
本实施例羊乳(莎能奶山羊)来源于陕西省渭南市富平县奶山羊养殖基地、牛乳(hesitant)来源于陕西省西安市阎良区奶山羊养殖基地；AEAB按照之前报道的方法在实验室自主合成；石墨碳固相萃取小柱(150mg/4mL)购买于西蒙-奥德里奇生物制品有限公司；其他有机试剂均为分析级；8种商品化的羊乳制品(液态羊乳、羊乳粉)购买于线上及线下门店。
本实施例首先通过反相高效液相色谱技术定性定量比较了纯羊乳和纯牛乳寡糖中α3’-半乳糖基乳糖(α3’-GL)和N-乙酰葡糖胺基乳糖的差异，结果证明α3’-GL在羊乳中的含量约为牛乳的3倍，N-乙酰葡糖胺基乳糖在羊乳中是微量，在牛乳中是大量；然后针对不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程；最后利用建立的线性回归方程，对八种市售的羊乳制品进行掺假检测。
以下结合附图对各个步骤进行详细说明：
在使用高效液相色谱对纯羊乳、纯牛乳中游离寡糖进行分离分析之前，首先通过低温离心、醇沉和石墨碳柱分离除去乳中的脂肪、蛋白质和大量乳糖。然后分别对羊乳、牛乳中游离寡糖进行AEAB衍生化标记，再结合反相C18柱对它们进行分离纯化。具体如下：
首先分别吸取1mL纯羊乳和纯牛乳于4mL离心管中，13000r/min 4℃离心20min，除去上层脂肪，再加入2倍体积乙醇，13000r/min 4℃，离心20min，弃去下层蛋白沉淀，收集上清游离寡糖，干燥备用。然后，将干燥后的样品溶于1mL双蒸水中，利用石墨碳柱除去大量乳糖，获得纯羊乳和纯牛乳中的游离寡糖，干燥备用。
然后分别对纯羊乳、纯牛乳中的游离寡糖进行AEAB衍生化标记，具体采用如下方法：
首先将1mL乳汁的游离寡糖溶解于20μL溶液A(8.8mg AEAB·2HCl溶于100μLDMSO/AcOH(v/v＝7/3))和20μL溶液B(6.4mg氰基硼氢化钠溶于100μLDMSO/AcOH(v/v＝7/3))混合溶液中，充分溶解后置于65℃水浴锅中反应2h，待反应结束后，再加入大于反应液10倍体积的乙腈进行沉淀，重复3-5次以除去多余的标记试剂AEAB。最后收集沉淀并溶于水用于HPLC的分离分析。
最后，使用高效液相色谱，结合反相C18柱对游离寡糖AEAB衍生物进行分离纯化，分离条件具体如下：
在25℃下使用4.6mm×250mm的COSMOSILC18柱，紫外检测波长为330nm，流速1.0mL.min-1，进样量10μL；溶剂A：ACN；溶剂B：含0.1％的三氟乙酸水溶液；优化后的洗脱梯度：t＝0min，2％A，98％B；t＝40min，2％A，98％B。
图1中A和B分别显示了在相同的洗脱条件下分离等体积纯羊乳和纯牛乳中游离寡糖AEAB衍生物的HPLC色谱图，结果显示，羊乳特征性寡糖半乳糖糖基乳糖异构体α3’-GL的相对含量是牛乳的3倍，而牛乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的相对含量显著高于羊乳，且该糖链在羊乳中的含量近乎不计。
为了进一步确定N-乙酰葡糖胺基乳糖的精细结构信息，本发明利用全甲基化分析结合多级串联质谱技术对其进行结构表征，具体如下：
乙酰化：向上述冷冻干燥后的N-乙酰葡糖胺基乳糖衍生物中加入1mL饱和NaHCO3溶液，振荡摇匀，碎冰中预冷15min。再加入15μL乙酸酐于冰浴中继续反应10min，重复3次，以确保N-乙酰化反应完全。再将上述溶液通过预处理过的1mL Dowex50W×8阳离子柱(H+型)，水洗5个柱体积。最后收集洗脱液，冷冻干燥备用。
全甲基化：取1粒NaOH置于研钵中，加入1mL DMSO快速研磨至无明显NaOH颗粒存在，分别吸取400μL DMSO与NaOH悬浊混合液和100μL碘甲烷于乙酰化后的样品中，避光震荡1h，然后加500μL水终止反应，再加入500μL二氯甲烷，13000r/min离心3min，弃上清，收集有机相并加入500μL0.5M NaCl萃取3-5次以除去多余杂质，最后冷冻干燥，复溶于50％的甲醇溶液用于ESI-MS/MSn检测分析。
结构解析采用ESI-MS系统。ESI-MS质谱分析用离子阱质谱仪(LTQ-XL；TealMealSeo，San若泽，CA，美国)，参数设置条件：设定喷雾电压(4千伏)、辅助气体流量(5ARB)、鞘气体流量(40ARB)、加热毛细管温度(380℃)、电压(37V)和管透镜电压(250V)。ESI-MS系统采用了正态MS片段与基于数据相关采集(DDA)的MS/MS之间的快速转换模式。对于基于MS/MS的DDA，选择一个顶离子，将归一化碰撞能量设为30v，最低信号强度设为500。用于MS和MS相关MS/MS的其他参数与上述参数相同。数据采集使用Xcalibur软件(ThermoScientific)，并用GlycoWorkbench软件进行分析。N-乙酰葡糖胺基乳糖的ESI-MSn图谱如图2所示。
为了建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，本发明制作了不同添加比例的羊乳和牛乳混合物，具体比例可以是：(0％，20％、35％、50％、65％、80％，100％，v/v)牛乳的羊乳混合物。使用高效液相色谱，对它们的α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖进行了定量分析。具体分析过程与使用高效液相色谱对纯羊乳、纯牛乳中游离寡糖进行分离分析方法相同。该步骤也可以直接与对纯羊乳、纯牛乳中游离寡糖进行分离分析同步进行。
结果如图3所示，图3中同时示出了纯羊乳、纯牛乳中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，发现随着羊乳中添加牛乳的含量逐渐增大，羊乳和牛乳混合物中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的相对含量呈明显的梯度变化，其中α3’-GL的含量逐渐降低，而N-乙酰葡糖胺基乳糖呈相反的变化趋势。
接下来，本发明基于纯羊乳和纯牛乳中游离寡糖的HPLC色谱图，首先分别对纯羊乳和纯牛乳中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行积分；
然后，将纯羊乳中α3’-GL的峰面积和纯牛乳中α3’-GL的峰面积进行加合，将加和后的峰面积定义为α3’-GL的总峰面积；将纯羊乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积和纯牛乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行加合，将加和后的峰面积定义为N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积；
最后，计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-GL的峰面积与上述α3’-GL的总峰面积的比值；计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值；并建立了相应线性回归方程。α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的线性回归方程分别为：y＝-0.4662x+0.7339和y＝0.988x-0.0143，且两种线性回归方程的R2＞0.99(图4)，其中x为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物，y分别为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-GL的峰面积与上述α3’-GL的总峰面积的比值及不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值。通过回归方程计算，发现该方法的最低检测限为羊乳中掺入2％的牛乳，而市场中为了达到一定经济效益掺假都在10％以上。
基于上述线性回归方程，通过下述方法实现商业化羊乳制品中α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的检测：
选取了8种商业化的羊乳制品，测定了它们α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量。具体测定过程与使用高效液相色谱对纯羊乳、纯牛乳中游离寡糖进行分离分析方法相同。其中样品1-5为五种商业化液态羊乳，样品6-8为三种商业化羊乳粉。图5显示了这8种市售羊乳制品α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的HPLC色谱图。对于样品1、2，根据N-乙酰葡糖胺基乳糖的回归方程可计算出掺入牛乳的比例分别为15％、10％，但α3’-GL的含量并未达到羊乳中应有含量(85％，90％)，推测这两种产品可能存在掺水现象，除此之外由于样品2的HPLC色谱图与标准羊乳相比更为复杂，本实施例借助了ESI-MS检测，发现样品2中加入了功能性低聚糖(低聚半乳糖等)；对于样品3、4，根据HPLC色谱图并未发现牛乳掺假现象，通过α3’-GL的回归方程进行羊乳含量的测定，结果显示样品3中羊乳的含量不足10％，样品4中羊乳的含量约为30％，推测这两种商业化液态羊乳可能存在掺水现象；对于样品5、6、8，通过α3’-GL的回归方程来对五种样品进行掺假现象的鉴别，结果显示，样品5、6和8中羊乳所占比例为57％、51％和24％，通过ESI-MS检测，发现在这三种样品中也含有一系列的低聚糖；对于样品7，该样品的HPLC色谱图较为复杂，并且α3’-GL的含量大于100％羊乳中α3’-GL的含量，借助ESI-MS检测，发现该商品存在多种半乳糖基乳糖的同分异构体，推测商品中可能添加了麦芽糊精、低聚半乳糖或者低聚果糖等功能性成分，这会对α3’-GL的含量产生影响，因此采用N-乙酰葡糖胺基乳糖的线性回归方程来对该商品进行掺假程度的鉴定，结果显示商品3的牛乳掺假比例约为27％。
在这8种市售的羊乳制品中，样品1、3、4中并未掺入其他的功能性低聚糖，可以根据α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的洗脱峰面积来鉴别羊乳制品的掺假情况，样品2、5、6、8中掺入了功能性低聚糖，但种类有限，并未影响对α3’-GL和N-乙酰葡糖胺基乳糖的定量，而样品7加入的益生元成分复杂，含有多种半乳糖基乳糖的同分异构体，导致不能选择α3’-GL来判断掺假现象，因此通过测定N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量来判断羊乳制品中是否掺入牛乳。
Claims (8)
1.一种基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、使用高效液相色谱技术对纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖进行定性定量分析；
步骤1.1、通过离心、醇沉和石墨碳柱分离除去纯羊乳、纯牛乳中的脂肪、蛋白质和大量乳糖，获得游离寡糖；
步骤1.2、对游离寡糖进行AEAB衍生化标记；
步骤1.3、基于HPLC分离分析方法，利用反相C18柱对纯羊乳和纯牛乳中游离寡糖衍生物进行分离分析，获得等体积的纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量；
步骤2、基于步骤1的定性定量分析结果，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程；
步骤3、根据步骤2建立的线性回归方程，确定待测羊乳中是否掺假牛乳及掺假程度；
步骤3.1、判断待鉴别羊乳中是否添加功能性寡糖；若是，则执行步骤3.2，否则，执行步骤3.4；
步骤3.2、判断功能性寡糖对α3’-半乳糖基乳糖的定量是否有影响，若是，则执行步骤3.3，否则执行步骤3.4；
步骤3.3、利用步骤1的方法，检测待鉴别羊乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，根据步骤2建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，计算待鉴别羊乳中掺入牛乳的比例，获得是否掺假牛乳及掺假程度；
步骤3.4、利用步骤1的方法，检测待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖和/或N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，根据步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖和/或N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，计算掺入牛乳的比例，获得是否掺假牛乳及掺假程度。
2.根据权利要求1所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤2具体为：
步骤2.1、制作不同添加比例的牛乳和羊乳混合物；
步骤2.2、利用步骤1的方法，对等体积混合物中游离寡糖衍生物进行分离纯化，获得其中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量；
步骤2.3、基于步骤1及步骤2.2的结果，建立含有不同百分比牛乳的羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量线性回归方程。
3.根据权利要求2所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤2.3具体为：
步骤2.31、分别对等体积纯羊乳和纯牛乳中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行积分；
步骤2.32、将纯羊乳中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积和纯牛乳中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积；将纯羊乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积和纯牛乳中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积；
步骤2.33、计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积的比值；计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值；
步骤2.34、利用不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积的比值，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖含量的线性回归方程；
利用不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程。
4.根据权利要求3所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤2.34中：
不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖含量的线性回归方程为：y＝-0.4662x+0.7339；其中x为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物，y为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3’-半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3’-半乳糖基乳糖的总峰面积的比值；
不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程为：y＝0.988x-0.0143；其中x为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物，y为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N-乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N-乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值；
两种线性回归方程的R2＞0.99。
5.根据权利要求4所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，基于HPLC分离分析方法条件为：
在25℃下使用4.6mm×250mm的COSMOSILC18柱，紫外检测波长为330nm，流速1.0mL.min-1，进样量10μL；溶剂A：ACN；溶剂B：含0.1％的三氟乙酸水溶液；优化后的洗脱梯度：t＝0min，2％A，98％B；t＝40min，2％A，98％B。
6.根据权利要求5所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤3.1之前还包括：
若待鉴别羊乳的HPLC色谱图显示，无牛乳掺入，根据步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖的线性回归方程，检测羊乳含量，若羊乳含量小于100％，则认为该羊乳中掺水；
若待鉴别羊乳的HPLC色谱图显示，有牛乳掺入，则执行步骤3.1。
7.根据权利要求6所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤3.1具体为：若α3’-半乳糖基乳糖的含量大于纯羊乳中的含量，则根据ESI-MS检测判断待鉴别羊乳中是否添加功能性寡糖；若是，则执行步骤3.2，否则，执行步骤3.4。
8.根据权利要求7所述的基于特征性成分α3’-半乳糖基乳糖及N-乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤3.4中还包括根据待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖的含量，判断待鉴别羊乳中是否存在掺水现象的过程；
步骤3.41、利用步骤1的方法，检测待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖和N-乙酰葡糖胺基乳糖的含量，根据步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中N-乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程，计算掺入牛乳的比例，获得是否掺假牛乳及掺假程度；
步骤3.42、根据掺入牛乳的比例，基于步骤1建立的不同添加比例的羊乳、牛乳混合物与其中α3’-半乳糖基乳糖含量的线性回归方程，计算α3’-半乳糖基乳糖含量；
步骤3.43、若步骤3.41检测待鉴别羊乳中α3’-半乳糖基乳糖的含量值小于步骤3.42计算的α3’-半乳糖基乳糖含量，则认为待鉴别羊乳中掺水。
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