CN111766324A - 一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法。所述特征肽包括水牛和奶牛的特征肽,其中水牛奶的特征肽氨基酸序列为HQGLPQGVLNENLLR和LAEEQLHSMK,牛奶的特征肽氨基酸序列为QVLSNTVPAK。使用本发明特征肽组合通过高效液相色谱‑质谱联用技术能够定性水牛奶粉中的牛奶粉掺假,具有较好的灵敏度,并且本发明选择蛋白中的特征肽段作为检测物质,适用于变性蛋白的检测,因此可以满足同时检测样品中的变性蛋白与非变性蛋白,保证了方法的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法,属于食品质量安全检测领域。
背景技术
水牛奶营养丰富,其干物质、乳脂肪、乳蛋白、矿物质、维生素等主要营养成分均高于牛奶,且生物活性肽、共轭亚油酸、神经苷节脂、低聚戊糖等含量丰富,是人类优良食物的来源。因此水牛奶也逐渐受到消费者的青睐。然而水牛奶的产量较低且受到季节性变化的影响,导致水牛奶原料成本较高。因此受到经济利益驱使,价格较低、产量较高的牛奶粉掺入水牛奶粉的掺假现象出现。这种掺假行为不仅损害消费者的合法权益,掺入的牛奶更会对牛奶过敏消费者的健康造成威胁。
现阶段定性鉴别水牛奶和牛奶的方法主要有基于DNA检测的PCR法和基于高效液相色谱的指纹图谱法。
申请号为201810540219.9的中国发明专利公开了一种检测畜类源性成分的三重荧光PCR引物组、试剂盒及检测方法,其主要是通过提取样品中DNA,然后利用专利中给出的引物、探针组合物或试剂盒对DNA进行PCR扩增,收集荧光信号,可以实现对绵羊、山羊、羚羊和家牛、水牛、牦牛的6种畜类的准确检测。此方法操作简单,具有较好的特异性,标准误差小,检测时间短等优点。但PCR方法也存在明显的缺陷,由于PCR法基于指数扩增的检测机理,其检测误差较大,同时奶中的DNA主要来自白细胞与脱落的乳腺细胞,这与动物的品种,饲养,健康条件以及生理期有关,所以奶中的DNA含量不稳定,不好建立标准化的检测方法。
申请号为201910482656.4的中国发明专利公开了一种鉴定水牛乳中掺假的检测方法,此方法通过去除水牛乳中的脂肪,然后将样品通过高效液相色谱进行检测得到指纹图谱,可以区分水牛乳中是否掺有奶牛乳。此方法具有良好的重现性和专属性,能够得到样品间具有代表性的指纹图谱可以快速分析是否掺假。但对于基于高效液相色谱的指纹图谱技术来说,实验室条件、仪器设备的不同对检测的标准化和规范化带来一定的阻碍。
液相色谱-质谱联用技术法已经成为物种鉴定的主要方法之一。此种鉴定方法灵敏度高,特异性好。该方法通过比对选择特异性多肽作为生物标记物,对不同物种来源的食物进行溯源调查。许多文献报道了利用该方法进行肉类,乳制品和阿胶等进行了定性鉴定,但未见关于水牛奶的蛋白层次定性鉴定方面的研究。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合。使用该特征肽组合可以准确检测水牛奶中牛奶的掺假,具有较高的特异性、灵敏度。
一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及,包括水牛奶特征肽和牛奶特征肽,其中水牛奶的特征肽氨基酸序列为LDSESAPLR和TPEDNLEIILR,牛奶的特征肽氨基酸序列为QVLSNTVPAK。
本发明是通过以下的技术方案实现的:
(1)对采集得到的水牛奶和牛奶进行冷冻干燥,所得到的冻干奶粉进行复溶;
(2)对复溶所得到的纯乳品进行测定蛋白浓度测定;
(3)取一定量的蛋白进行蛋白变性处理,使用胰蛋白酶酶解;
(4)酶解所得到的肽段用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测。
优选的,所述的复溶按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20(w/v)涡旋混匀,在40℃水浴中震荡30 min。
优选的,所述取一定量蛋白约200 µg。
优选的,使用DTT进行变性,加入10 µL 120 mL DTT(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl, pH8.5缓冲液中)涡旋混匀后37℃反应1 h。
优选的,使用10 µL 600 mM IAA(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl, pH8.5缓冲液中)避光室温反应15 min。
优选的,高效液相色谱的条件为:色谱柱:XBridge Peptide BEH C18 Column,300Å, 3.5µm,4.6mm×150mm;流动相 A 为 0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液;流动相 B 为 0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液;流速 0.4 mL/min;柱温 40℃,进样体积 10 µL。
优选的,质谱条件为:ESI 正离子扫描参数:气帘气(CUR)压力 35 psi,碰撞气(CAD):Medium,离子化电压 4500 V,离子源温度 500℃,雾化气(GS1)65 psi,辅助气(GS2)50 psi;正离子扫描MRM模式:MRM检测窗口120 s,扫描时间3 s。
与现有技术相比,本发明有益效果在于:
(1)本发明通过高分辨质谱筛选得到水牛奶和牛奶的特异性肽段,可以实现对水牛奶中牛奶掺假的快速检测。该方法具有高灵敏度,高特异性的优点;
(2)本发明选择蛋白中的特异性肽段作为检测物质,适用于变性蛋白的检测,因此可以满足同时检测样品中的变性与非变性蛋白,保证了方法的准确性。
附图说明
图1为水牛奶肽段提取离子流色谱图。
图2为牛奶肽段提取离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法,检测方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法,检测方法等。
实施例1特征肽段的筛选和确定。
将取来的奶样冷冻干燥后,分别取200 mg水牛奶粉和牛奶粉进行复溶,加入4 mL水后涡旋混匀,在40℃水浴中震荡30 min。
将每个样品取100 µL进行25倍稀释,使用定量荧光方法测定蛋白质含量。根据Qubit蛋白测定试剂盒的说明,所有测定试剂必须在室温下操作。每个样品制备200 µLQubit工作溶液,该溶液以Qubit试剂与Qubit缓冲液的比例为1:200制备。将10 µL三种标准液与190 µL Qubit工作溶液混合。此外,将5 µL样品溶液添加到195 µL Qubit工作溶液中。在室温下孵育15分钟后,在Qubit 3.0荧光计系统中进行测试。
根据所测得样品蛋白浓度,每个样品取200 µg蛋白至1.5 mL棕色管中,用MS水定容至200 µL,加入10 µL 120 mL DTT(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl, pH8.5缓冲液中)涡旋混匀后37℃反应1 h。反应结束后加入10 µL 600 mM IAA(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl,pH8.5缓冲液中)避光室温反应15 min。结束后将所有溶液移取到含膜(10 KDa)离心管中,12000×g离心10 min,加入100 µL MS水后再次离心。此步骤重复三次,洗掉膜上盐分。将收集管中的离心废液倒掉,并水洗三次。
加入100 µL ABC(50 mM)溶液,加入4 µL胰蛋白酶溶液,37℃水浴条件下过夜膜上酶切。酶切后12000×g离心15min,加100 µL ABC(25mM)溶液,再次离心。此步骤重复三次。弃掉膜,收集管放入真空干燥机进行旋干。干燥后加入100 µL MS水再次进行干燥。此步骤重复三次。用100 µL A相(98%质谱水+2%乙腈+0.1%甲酸)进行复溶,涡旋混匀,12000×g离心15 min,取上层液体80 µL置于液相小瓶中进行上样。
将QTOF得到的结果文件,以及根据各物种名称在Uniprot数据库检索水牛关键词:bubalus bubalis和奶牛关键词:Bos taurus,下载蛋白数据库导入ProteinPilot 5.0软件进行搜库后得到所有肽段列表,选取响应高、得分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段。将所有肽段进行物种间的对比,去除相同序列的肽段。将筛选剩下的肽段使用SKYLINE软件进行理论肽段信息构建,并与二级质谱图进行比对,选响应值较高的离子峰,得到候选特异性肽段信息。其中保留时间默认为20 min。
将得到的候选特异性肽段信息使用QTRAP5500的MRM模式进行验证,根据得到的离子色谱图确定物种特异性肽段,最终确定了水牛奶的特征肽为LDSESAPLR和TPEDNLEIILR,牛奶的特征肽为QVLSNTVPAK,其质谱参数见表1。
表1:特征肽段的MRM检测参数
实施例2检测试验。
检测试验样品来自市场的两种水牛奶粉和三种牛奶粉。前处理所有步骤直至进入质谱分析前都与实施例1中相同。为了验证实验结果的可靠性和灵敏度,在所采集的可靠冻干水牛奶粉中加入0.1%、0.2%、0.3%、0.5%和1%的牛奶粉。一共十个样品进行前处理。前处理注意不要使奶粉相互接触,以免发生污染。样品处理结束后将表1检测参数输入到QTRAP5500的MRM模式窗口中,进行质谱检测。质谱分析结束后提取特异性肽段的离子流色谱图,提取出则表示有这类物种的存在。检测结果显示,市售样品的水牛奶粉中均能提取到水牛特异性肽段,未提取到牛特异性肽段,牛奶粉中均能提取到牛特异性肽段。这表明特异性肽段具有良好的稳定性和特异性。模拟掺假的样品中均能检测到牛奶粉的存在,可以证明此方法的检测线至少为0.1%,具有高灵敏度。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 水牛(Bubalus arnee)
<400> 1
His Gln Gly Leu Pro Gln Gly Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 水牛(Bubalus arnee)
<400> 2
Leu Ala Glu Glu Gln Leu His Ser Met Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 奶牛(Bos taurus)
<400> 3
Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys
1 5 10
Claims (8)
1.一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合,其特征在于,包括水牛奶特征肽和牛奶特征肽,其中水牛奶的特征肽氨基酸序列为HQGLPQGVLNENLLR和LAEEQLHSMK,牛奶的特征肽氨基酸序列为QVLSNTVPAK。
2.一种检测水牛奶中掺入牛奶的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)对采集得到的水牛奶和牛奶进行冷冻干燥,所得到的冻干奶粉进行复溶;
(2)对复溶所得到的纯乳品进行测定蛋白浓度测定;
(3)取一定量的蛋白进行蛋白变性处理,使用胰蛋白酶酶解;
(4)酶解所得到的肽段用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测。
3.如权利要求2所述方法,其特征在于,按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20(w/v)涡旋混匀,在40℃水浴中震荡30 min。
4.如权利要求2所述方法,其特征在于,使用Qubit蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度测定。
5.如权利要求2所述方法,其特征在于,取约200 µg蛋白进行变性处理,加入DTT反应后加入IAA进行避光反应。
6.如权利要求2所述方法,其特征在于,使用胰蛋白酶按照蛋白与酶的比例为20:1的比例进行酶切。
7.如权利要求2所述方法,其特征在于,高效液相色谱的条件为:色谱柱:XBridgePeptide BEH C18 Column,300Å,3.5µm,4.6mm×150mm;流动相 A 为 0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液;流动相 B 为 0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液;流速 0.4 mL/min;柱温 40℃,进样体积 10 µL。
8.如权利要求2所述方法,其特征在于,质谱条件为:ESI 正离子扫描参数:气帘气(CUR)压力 35 psi,碰撞气(CAD):Medium,离子化电压 4500 V,离子源温度 500℃,雾化气(GS1)65 psi,辅助气(GS2)50 psi;正离子扫描MRM模式:MRM检测窗口120 s,扫描时间3 s。
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