CN113945649A - 不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物及其筛选方法和应用，属于食品检验技术领域。本发明采用高效液相色谱‑高分辨质谱采集已知不同加工工艺的牛奶的多肽色谱峰，提取色谱峰的特征峰信息，对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为蛋白组生物标志物。采用本申请的筛选方法筛选得到26种蛋白组生物标志物，这26种蛋白组生物标志物能够用于能够用于区分巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌。
Description
技术领域
本发明涉及食品检验技术领域，具体涉及不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物及其筛选方法和应用。
背景技术
牛奶可作为人体提供重要营养的来源，提供蛋白质、维生素、脂肪和钙等物质。即使来源于正常健康乳腺的牛奶样品，也会含有许多微生物和细菌菌群，尤其是其中的致病菌会严重威胁到人体健康，故为防止疾病的发生、致病菌的危害和微生物引起的牛奶变质，生乳通常要经过热处理工艺后才能食用，并且牛奶通过杀菌处理和无菌包装后易于储藏运输。市售牛奶通常采用均质后高温杀菌以延长保质期，根据杀菌工艺不同可分为巴氏杀菌奶(PasteurizedMilk，Pa)、延长货架期奶(Extended ShelfLife Milk，ESL)和超高温灭菌奶(Ultra-high Temperature Sterilized Milk，UHT)方式进行热处理。热处理对牛奶及其成分的影响程度与所施加的热负荷有关，牛奶中的热诱导除了会改变其感官外，还会降低其营养价值如：牛奶受热导致维生素降解、乳清蛋白变性、蛋白质的胺基被乳糖及其分解产物修饰。因此，乳制品的热加工监测是非常重要的。
传统方法检测牛奶加热程度主要集中在监测一些特定物质，如天然酶活性、乳蛋白变性程度、乳果糖、糠氨酸等物质含量。通常对碱性磷酸酶(碱性磷酸酶和乳过氧化物酶)采用光谱法和荧光法进行测试，以区分巴氏杀菌和超高温热处理的热负荷。通过酶法或高效液相色谱法(HPLC)测定乳果糖的含量，以区分高热负荷处理的直接或间接加热UHT奶。糠氨酸是由乳蛋白质在高温条件下与乳糖发生美拉德反应所产生，广泛用作反映牛奶加工热负荷的美拉德反应的标记化合物。通过不同的色谱、电泳和免疫化学方法对乳清蛋白、β-乳球蛋白的变性进行监测，作为不同类型加热牛奶的标记。
目前，蛋白质组学技术逐步应用于牛奶热加工相关的生物标志物的检测。蛋白质组学技术研究表明巴氏杀菌奶中蛋白质含量及组成无明显变化，UHT奶中α-乳白蛋白、β-酪蛋白变异体、κ-酪蛋白和免疫球蛋白含量的降低。上述报道的生物标志物仅限于巴氏奶和UHT奶的检测，无法区分巴氏奶和ESL奶，更不能将巴氏杀菌奶、ESL奶和UHT奶区分开来。
发明内容
本发明的目的在于提供不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物及其筛选方法和应用，本发明采用蛋白组学技术成功获得不同加工工艺牛奶中蛋白组生物标志物，该蛋白组生物标志物能够用于区分巴氏杀菌奶、UHT奶和ESL奶。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
1)提供已知不同加工工艺的牛奶作为标准样品，分别提取所述标准样品的多肽，得到多种多肽标准样品，所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；
2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述多种多肽标准样品的色谱峰；
3)提取所述色谱峰的特征峰信息；
4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为蛋白组生物标志物；
所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；
所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
优选的，步骤1)中所述提取的方法包括以下步骤：分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体，所述第一离心的转速为10000～13000g，所述第一离心的时间为10～30min；
采用酸性物质调节所述下层液体的pH值至4.5～4.6后进行第二离心，取上清液，所述酸性物质为盐酸或醋酸，所述第二离心的转速为10000～13000g，所述第二离心的时间为10～30min；
将所述上清液在固相萃取柱上进行固相萃取，得到萃取液，所述固相萃取柱为HLB；所述HLB的规格为Oasis，60mg/3mL；
用洗脱剂洗脱所述萃取液，得到洗脱液，所述洗脱剂包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种；
对所述洗脱液进行干燥后复溶，将得到的复溶体系进行微孔过滤膜过滤，滤液含有多肽，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
优选的，步骤2)中所述高效液相色谱的条件包括：流动相为流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；
所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；
所述梯度洗脱的流速为300μL/min
所述梯度洗脱的程序为：
优选的，步骤2)中，所述的高分辨质谱的条件包括：
模式：数据依赖性采集模式；
离子源：电喷雾离子源；
数据采集范围m/z为50～2000Da；
喷雾电压为4500～6000V；去簇电压为20～120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～550℃；碰撞能为35±15eV。
优选的，步骤3)中所述特征峰信息包括：峰强度大于100cps且信噪比＞3。
优选的，步骤3)中提取所述色谱峰的特征峰信息包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个多肽色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；设置峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa。
优选的，步骤4)中对所述特征峰信息进行数据处理包括以下步骤：
41)将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，缺失值≤50％的特征峰信息用该多肽在所有牛奶样品中的最小值的一半来填充缺失值，进行缺失值的填充和归一化处理，得到预处理数据；
42)将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。
优选的，步骤4)中利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为生物标志物的条件包括：变量重要性＞1，变化倍数＞2或＜0.5，P值＜0.01且假发现率＜0.05。
本发明还提供了上述方案所述筛选方法筛选得到的不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物，包括如下表中所述蛋白中的一种或几种；
注：所述“—”表示未定性出的肽段序列，用离子信息直接作为生物标志物。
本发明还提供了上述方案所述的蛋白组生物标志物在区分不同加工工艺的牛奶中的应用，所述不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
本发明提供了一种不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：分别提取不同加工工艺的牛奶的多肽；采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述多肽的色谱峰；提取所述色谱峰的特征峰信息；对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为蛋白组生物标志物。采用本申请的筛选方法能够筛选得到判别牛奶加工工艺的蛋白组生物标志物，并确定蛋白组生物标志物在不同加工工艺牛奶中的含量，基于本发明的蛋白组生物标志物能够建立基于蛋白组技术的不同加工工艺奶的综合检测方法，来区分巴氏杀菌奶、UHT奶和ESL奶，进而为企业产品监测以及行业监管提供技术支持。本发明提供的筛选方法采用高分辨四极杆飞行时间质谱仪进行，准确性高，易操作，可同时处理大批量样品，并且对不同加工工艺牛奶样品的多肽进行全面分析，实现乳品高通量检测，极大提高了样品的检测效率。本发明的筛选方法方便、灵敏、精确，能够实现对不同加工工艺牛奶的快速自动化判别，极大提高样品检测效率。
附图说明
图1牛奶样品PCA评分图(QC，质控样品n＝13；Pa，巴氏杀菌牛奶n＝29；ESL，延长货架期牛奶n＝9；U，UHT，超高温灭菌牛奶n＝20)；
图2(a)巴氏杀菌奶和延长货架期奶的OPLS-DA得分图；
图2(b)延长货架期奶和超高温灭菌奶的OPLS-DA得分图；
图2(c)巴氏杀菌奶和超高温灭菌奶的OPLS-DA得分图；
图3(a)巴氏杀菌奶和延长货架期奶的S-plot图；
图3(b)延长货架期奶和超高温灭菌奶的S-plot图；
图3(c)巴氏杀菌奶和超高温灭菌奶的S-plot图；
图4不同杀菌工艺牛奶26个差异性标志物响应强度箱型图。
具体实施方式
本发明提供了一种不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
1)提供已知不同加工工艺的牛奶作为标准样品，分别提取所述标准样品的多肽，得到多种多肽样品；
2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述多种多肽样品的色谱峰；
3)提取所述色谱峰的特征峰信息；
4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为蛋白组生物标志物；
所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；
所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；
所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
本发明首先提供已知不同加工工艺的牛奶作为标准样品，分别提取所述标准样品的多肽，得到多种多肽样品。
在本发明中，所述提取不同加工工艺的牛奶的多肽的方法优选的包括以下步骤：分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体，所述第一离心的转速为10000～13000g，所述第一离心的时间为10～30min；
采用酸性物质调节所述下层液体的pH值至4.5～4.6后进行第二离心，取上清液，所述酸性物质为盐酸或醋酸，所述第二离心的转速为10000～13000g，所述第二离心的时间为10～30min；
将所述上清液在固相萃取柱上进行固相萃取，得到萃取液，所述固相萃取柱为HLB；所述HLB的规格为Oasis，60mg/3mL；
用洗脱剂洗脱所述萃取液，得到洗脱液，所述洗脱剂包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种；
对所述洗脱液进行干燥后复溶，将得到的复溶体系进行微孔过滤膜过滤，滤液含有多肽，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
在本发明中，所述第一离心和第二离心的转速独立优选为12000g；所述第一离心和第二离心的的时间独立优选为15～20min；所述微孔过滤膜的孔径优选0.22μm；所述溶剂优选的包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种，更优选为甲醇。在本发明中，对所述不同加工工艺的牛奶离心的作用是除去牛奶中的脂肪，离心后的上层为脂肪层。
得到不同加工工艺的牛奶的多肽后，本发明采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集不同加工工艺的牛奶的多肽的色谱峰。
在本发明中，所述高效液相色谱分离的条件优选的包括：流动相为流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；
所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；
色谱柱为Xbridge BEH300 C18(100mm×2.1mm，粒径3.5μm)；流速为0.3mL/min，进样量为5μL，柱温40℃；
所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液，优选为0.1％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液，优选为0.1％的甲酸乙腈溶液；所述洗脱程序为：
在本发明中，所述的高分辨质谱的条件包括：
模式：数据依赖性采集模式；
离子源：电喷雾离子源；
数据采集范围m/z为50～2000Da；
喷雾电压为4500～6000V，优选5500V；去簇电压为20～120V，优选70V；气帘气压力(Curtain Gas，CUR)为15～40psi，优选30psi；喷雾气压力为15～70psi，优选45psi；加热辅助气压力为0～70psi，优选65psi；离子源温度(Temperature，TEM)为450～550℃，优选550℃；碰撞能为35±15eV；
在本发明中，所述高分辨质谱优选为高分辨飞行时间质谱。
在本发明具体实施过程中，进行高分辨质谱采用的仪器为UPLC-ESI-TOF质谱仪。
采集到不同加工工艺的牛奶的多肽的色谱峰后，本发明提取所述色谱峰的特征峰信息。
在本发明中，提取所述色谱峰的特征峰信息优选的包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个多肽色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；提取的特征峰的参数：质量数范围为50～2000Da；质量宽度为0.01～0.03Da，优选为0.02Da；和/或，除去所述色谱峰的强度低于100counts或信噪比低于3的信号。
在本发明具体实施过程中，所述高分辨质谱数据提取软件为Peakview2.2软件(ABSciex，美国)，所述Peakview 2.2软件对UPLC-ESI-TOF质谱仪收集的原始数据进行预处理(用于噪声设置、基线校正、峰值检测和校准)从中提取特征离子，设置参数：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa，选择峰强度大于100cps且信噪比(S/N)＞3的色谱峰。扫描每个多肽色谱峰以检测其模型离子及其峰形，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积。
提取到所述色谱峰的特征峰信息后，本发明对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为生物标志物。
在本发明中，对所述特征峰信息进行数据处理优选的包括以下步骤：将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，缺失值≤50％的特征峰信息用该多肽在所有牛奶样品中的最小值的一半来填充缺失值，进行缺失值的填充和归一化处理，得到预处理数据；将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。
在本发明中，所述数据分析软件优选的包括SPSS 22.0和SIMCA-P。
在本发明中，所述分析模型优选的选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
在本发明中，利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为生物标志物的条件优选的包括：变量重要性(VIP)＞1，变化倍数(Fold Change)＞2或＜0.5，P值＜0.01且假发现率(FDR)＜0.05的峰值。
本发明还提供了上述方案所述筛选方法筛选得到的不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的多肽中的一种或几种。
在本发明中，所述不同加工工艺牛奶中存在26种生物标志物如下表所示：
注：所述“—”表示未定性出的肽段序列，可用离子信息直接作为生物标志物。
本发明还提供了上述方案所述的蛋白组生物标志物在区分不同加工工艺的牛奶中的应用，所述不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
本发明的一些实施例中，用于筛选不同加工工艺牛奶差异性多肽的奶样是采用新希望乳业有限公司提供的29个巴氏杀菌奶、9个ESL奶和20个UHT奶，作为训练集；而用于验证不同加工工艺的奶样购买自超市的不同品牌的9个巴氏杀菌奶和15个UHT奶，作为测试集。发明的一些优选实施例如下：
1)样品的制备：
将所述的牛奶样品离心脱脂(12000g，4℃，下30min离心)，去除上层脂肪层。吸取2mL下层清液用20％(v/v)醋酸溶液酸化至pH为4.6，并通过离心(10000g，4℃，30min)析出酪蛋白。固相萃取柱提前用3mL甲醇和3mL超纯水预处理，将上述清液加载到Waters的SPE柱(Oasis HLB，60mg/3mL)，用3mL 10％甲醇水(v/v)淋洗，吹干。使用3mL纯甲醇从柱中洗脱肽。收集洗脱，于40℃氮吹至干。用0.1％甲酸水(v/v)将所得残留物复溶定容至1mL，震荡5min。通过0.22μm注射器过滤器至进样小瓶，上机检测。
2)数据的采集和预处理：利用超高效液相色谱串联高分辨四极杆飞行时间质谱仪分别检测Pa奶、ESL奶和UHT奶，采集原始数据；对原始数据进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，从中提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰以检测其模型离子及其峰形，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积。此外，多维统计模型建立之前，需要将峰面积作为变量进行去除缺失值和归一化处理。
3)数据分析：对获得的峰面积结果进行无监督的主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘方差的分析(OPLS-DA)，结合单因素方差分析，将VIP值，P值，FDR值和Foldchanged值作为筛选差异变量的标准，最终筛选出可鉴别三类品种奶的表征因子，并通过筛选的表征因子对超市购买样品进行判别。
实施例1
奶样的采集与制备
从新希望乳业有限公司收集不同批次的的29个巴氏杀菌奶、9个ESL奶和20个UHT奶作为训练集，购买自超市的不同品牌的9个巴氏杀菌奶和15个UHT奶，作为测试集，对其进行分装并保存在-20℃冰箱备用。将所述的牛奶样品离心脱脂(12000g，4℃，30min)，去除上层脂肪层。吸取2mL下层清液用20％(v/v)醋酸溶液酸化至pH为4.6，并通过离心(10000g，4℃，30min)析出酪蛋白。固相萃取柱提前用3mL甲醇和3mL超纯水预处理，将上述清液加载到Waters的SPE柱(Oasis HLB，60mg/3mL)，用3mL 10％甲醇水(v/v)淋洗，吹干。使用3mL纯甲醇从柱中洗脱肽。收集洗脱，于40℃氮吹至干。用0.1％甲酸水(v/v)将所得残留物复溶定容至1mL，震荡5min。通过0.22μm注射器过滤器至进样小瓶，上机检测。
数据的采集
利用超高效液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱仪对上述待测奶样进行检测。
实验所用的超高效液相色谱仪器，仪器型号为ExionLC AC(美国AB SCIEX公司)，色谱柱为Xbridge BEH300 C18(100mm×2.1mm，粒径3.5μm)(美国Waters公司)。采用的流动相A为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液。流速0.3mL/min，进样量为5μL，柱温40℃。
洗脱梯度为：
实验所用的高分辨四级杆飞行时间质谱仪，仪器型号为TripleTOF 6600(美国ABSCIEX公司)，数据采集范围m/z：50-2000Da，采用数据依赖性采集模式(IDA)，动态背景扣除，采用电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式采集，喷雾电压为5000V；去簇电压为80V；气帘气压力(Curtain Gas，CUR)为35psi；喷雾气压力为50psi；加热辅助气压力为50psi；离子源温度(Temperature，TEM)为500℃；碰撞能为35±15eV。
数据的预处理和特征提取
利用高分辨质谱数据提取软件Peakview 2.2(美国AB SCIEX公司)，对检测到的全部色谱峰进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，从中提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰以检测其模型离子及其峰形，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积。设置参数：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa，选择峰强度大于100cps且信噪比(S/N)＞3的色谱峰。将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，缺失值≤50％的特征峰信息用该多肽在所有牛奶样品中的最小值的一半来填充缺失值，进行缺失值的填充和归一化处理，得到预处理数据。最终，将预处理后的数据导入数据分析软件SPSS 22.0和SIMCA-P中，进行可视化分析。
数据分析
作为多变量统计分析的重要手段，无监督的主成分分析(PCA)和有监督正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)应用在鉴别不同加工工艺牛奶当中。
如图1所示，在PCA模型中，R2X(cum)和Q2(cum)是评价主成分分析模型质量的主要指标，R2X(cum)为模型拟合优度的参数，Q2(cum)为模型预测优度的参数，通常R2X(cum)和Q2(cum)大于0.5表示所建模型可靠且预测率高。将预处理后的质谱数据导入SIMCA-P后建立PCA判别模型，所建模型的R2X(cum)和Q2(cum)分别为0.709和0.616，满足要求表明模型拟合稳定可靠，预测性高。在PCA模型中，质控样品(QC)在得分图中聚集度很高，说明前处理和仪器状态良好，分析方法可靠、准确；其次，绝大多数样品都落在95％的置信区间当中，且三组样品分离趋势明显，说明两组样品在多肽上差异明显。
在OPLS-DA模型中，R2X(cum)、R2Y(cum)分别是表示模型对X和Y矩阵的解释能力，Q2Y(cum)表示模型的预测能力，R2Y(cum)和Q2Y(cum)值越接近1，说明模型越稳定可靠。通常用两组数据建立OPLS-DA模型中以寻找组间物质的差异。如图2(a)(b)(c)所示，三类牛奶样品两两进行比较建立OPLS-DA模型。图2(a)表示巴氏杀菌奶和ESL奶的OPLS-DA得分图，模型R2Y(cum)和Q2Y(cum)分别为0.987和0.955；图2(b)表示ESL奶和UHT奶的OPLS-DA得分图，模型R2Y(cum)和Q2Y(cum)分别为0.987和0.945；图2(c)表示巴氏杀菌奶和UHT奶的OPLS-DA得分图，模型R2Y(cum)和Q2Y(cum)分别为0.992和0.982。说明三个模型的均具有良好的预测能力(Q2>0.5)。
基于OPLS-DA模型的S-plot图筛选区分不同加工工艺牛奶的生物标记物，图3表示变量的协方差和相关性信息的总和，通常是离中心越远的点，对分类的影响越大，同时结合变量的重要性(variable importance in the projection，VIP)大于1的原则，筛选出一系列的差异性的生物标志物，然后结合单因素方差分析(T-test，SPSS 22.0)检验后，最终筛选出26个差异肽，不同加工工艺牛奶中26种生物标志物在不同加工工艺条件下的变化倍数列于下表中：
为直观查看标志物变化趋势使用GraphPad Prism 7对Pa奶、ESL奶和UHT奶中26个差异性标志物的响应强度绘制箱型图(图4所示)。图中横坐标表示三类不同加工工艺牛奶，纵坐标表示响应强度，不同字母表示差异显著。由此可看出，绝大多数肽在UHT奶中含量最高，ESL次之，Pa奶中含量最低，且26个标志物在三类奶中含量差异显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物及其筛选方法和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro
1 5 10 15
Leu Trp
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser
1 5 10 15
Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
20
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser
1 5 10 15
Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
20
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser
1 5 10 15
Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
20
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser
1 5 10 15
Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
20
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
1 5 10 15
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys
1 5 10 15
Thr Thr Met Pro Leu Trp
20
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
1 5 10
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro
1 5 10 15
Leu Trp
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val
1 5
Claims (10)
1.一种不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
1)提供已知不同加工工艺的牛奶作为标准样品，分别提取所述标准样品的多肽，得到多种多肽标准样品，所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；
2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述多种多肽标准样品的色谱峰；
3)提取所述色谱峰的特征峰信息；
4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为蛋白组生物标志物；
所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；
所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述提取的方法包括以下步骤：分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体，所述第一离心的转速为10000～13000g，所述第一离心的时间为10～30min；
采用酸性物质调节所述下层液体的pH值至4.5～4.6后进行第二离心，取上清液，所述酸性物质为盐酸或醋酸，所述第二离心的转速为10000～13000g，所述第二离心的时间为10～30min；
将所述上清液在固相萃取柱上进行固相萃取，得到萃取液，所述固相萃取柱为HLB；所述HLB的规格为Oasis，60mg/3mL；
用洗脱剂洗脱所述萃取液，得到洗脱液，所述洗脱剂包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种；
对所述洗脱液进行干燥后复溶，将得到的复溶体系进行微孔过滤膜过滤，滤液含有多肽，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中所述高效液相色谱的条件包括：流动相为流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；
所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；
所述梯度洗脱的流速为300μL/min
所述梯度洗脱的程序为：
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高分辨质谱的条件包括：
模式：数据依赖性采集模式；
离子源：电喷雾离子源；
数据采集范围m/z为50～2000Da；
喷雾电压为4500～6000V；去簇电压为20～120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～550℃；碰撞能为35±15eV。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在，步骤3)中所述特征峰信息包括：峰强度大于100cps且信噪比＞3。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中提取所述色谱峰的特征峰信息包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个多肽色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；设置峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)中对所述特征峰信息进行数据处理包括以下步骤：
41)将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，缺失值≤50％的特征峰信息用该多肽在所有牛奶样品中的最小值的一半来填充缺失值，进行缺失值的填充和归一化处理，得到预处理数据；
42)将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)中利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性多肽作为生物标志物的条件包括：变量重要性＞1，变化倍数＞2或＜0.5，P值＜0.01且假发现率＜0.05。
9.权利要求1～8任意一项所述筛选方法筛选得到的不同加工工艺的牛奶的蛋白组生物标志物，包括如下表中所述蛋白中的一种或几种；
注：所述“—”表示未定性出的肽段序列，用离子信息直接作为生物标志物。
10.权利要求9所述的蛋白组生物标志物在区分不同加工工艺的牛奶中的应用，所述不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
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