CN114354814A

CN114354814A - 一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物

Info

Publication number: CN114354814A
Application number: CN202210038128.1A
Authority: CN
Inventors: 韩荣伟; 解书斌; 孙雪恒; 王军; 都启晶; 范荣波; 杨永新; 姜洪宁; 于忠娜
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-01-13
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明提供一种用于检测羊乳制品(高温灭菌羊奶、羊奶粉)中掺假牛乳的小分子标记物方法，包括：1)将适量羊乳制品离心去除脂肪后置于容器中，加入适量有机酸，离心提取上清液后冻干；2)加入小分子物质萃取液，离心分离上清液；3)干燥后用50％甲醇溶液复溶，高分辨液相色谱串联质谱测定，4)维生素H可用于检测高温灭菌羊奶和羊奶粉中掺假牛乳源成分的标记物，检测水平为0.1％。本检测方法利用高分辨液相色谱串联质谱检测羊乳制品中的小分子标记物对羊乳制品掺假牛乳进行定性和定量，方法简单，分析速度快，灵敏度高。

Description

一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物

技术领域

本发明属于乳品检测分析技术领域，具体要求涉及一种基于小分子标记物鉴别羊乳制品掺假牛乳的精准方法，特别涉及一种用高分辨率质谱仪测定羊乳制品掺假牛乳的小分子标记物的高灵敏度检测方法。

背景技术

羊乳具有蛋白含量高、致敏性低、易于消化吸收等优点，被国际营养学界称为乳中之王。然而其产量低、价格高，为获取高额利润，市场时常出现羊乳掺假牛乳现象，牛乳过敏人群饮用后，牛奶中的过敏原会导致机体的生理功能紊乱，并可能引起组织损伤，从而导致一系列的临床症状，对消费者健康造成影响。此外，乳品掺假为不法分子谋取非法利益的同时，也损害了消费者的合法权益。

目前对羊乳中掺假牛乳的检测方法主要是基于DNA的PCR法和基于蛋白质组学的质谱法，在申请号为CN201610363584.8的中国专利申请中公开了一种羊乳粉中牛乳成分检测方法，其是通过普通PCR 对掺假模型进行分级，利用荧光定量PCR获得处于各个相应等级的 Ct值与掺假比例的关系式，之后通过普通PCR确定待检样品的等级，然后对待检样品进行荧光定量PCR获取Ct值，代入到相应级别的关系方程中从而计算出羊乳粉中牛乳成分的百分含量。虽然基于DNA 的PCR扩增方法具有快速、简便的特点，但也存在准确率低的缺陷，由于乳粉中DNA来源于体细胞，体细胞数量的多少对DNA的制备有明显的影响，因此，导致这种基于DNA的方法检测掺假时存在误差大的缺陷。在申请号为CN201611082298.0的中国专利申请中，公开了一种测定羊乳粉中牛乳粉掺假比例的方法，通过向待测样品中加入内标羊乳特征肽和内标牛乳特征肽，测定不同掺假比例中内标羊乳特征肽和内标牛乳特征肽与其对应内标特征肽的比值制成标准曲线，进而通过待测样品峰面积比，即可求得羊乳与牛乳的比例，但由于该方法需要添加蛋白酶对乳粉蛋白进行酶解，酶的添加量和酶解温度以及时间都会对产生的肽段造成影响，进而影响其准确性和灵敏度。

发明内容

针对上述现有技术检测羊乳制品存在的不足和缺点，例如，需要添加额外的对结果可能影响的试剂，本发明提供了一种基于高分辨液相色谱串联质谱的既能够用于热处理的羊乳掺假牛乳的检测，也适用于羊乳粉中牛乳掺假的检测方法。

一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的前处理方法，包括：

1)将适量羊乳制品的液态待测乳样去除脂肪后置于容器中；

2)加入适量有机酸，离心提取上清液后冻干；

3)分别加入适量有机溶剂和有机酸，震荡提取上清液后冻干；

4)加入适量混合液，离心提取上清液后即得待测液；

所述混合液为50％甲醇-水溶液，优选地，所述混合液由等体积的甲醇与水溶液混合配制而成。

在根据本发明的一个实施方案中，所述标准品为2-氯苯丙氨酸；所述有机酸为乙酸。

在根据本发明的一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙醇、乙腈。

在根据本发明的一个实施方案中，所述振荡是于4℃摇床中以 750-1000rpm振荡处理。

本发明还提供了利用上述前处理方法在检测羊乳制品掺假牛乳的中的应用。

本发明还提供了一种利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，包括：

a)通过权利要求1-4中任一项所述的前处理方法对羊乳制品样品进行前处理，获得待测液；

b)使用液相质谱仪测定所述待测液和羊乳对照品中的小分子标记物；

c)通过小分子标记物的测定结果确定羊乳制品样品是否掺加牛乳；

所述小分子标记物为维生素H；

当羊乳制品为高温灭菌羊奶或羊粉时，优选维生素H为特征小分子标记物。在根据本发明的一个实施方案中，还包括：

d)若步骤c)确定羊乳制品样品中掺加牛乳，则基于测定得到的小分子标记物计算羊乳制品样品中的牛乳含量。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的小分子标记物的测定是以羊乳制品为比较组，牛乳制品中对应小分子标记物的差异倍数(FC) 和P值(P<0.05)确定的；

优选地，基于Compound discoverer软件对质谱图谱和数据处理后计算得到差异位数和P值。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的高分辨液相色谱串联质谱的液相色谱条件为：

流动相A为0.2％甲酸。流动相B为乙腈。优选地，梯度浓度为：

0～2min(100％A)

2～12min(100％～0％A)

12～16min(0％A)

16～16.1min(80～100％A)

16.1～18min(100％A)

进样量为5μL，流速为0.2mL/min，柱温为30℃。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的高分辨液相色谱串联质谱的质谱条件为：

离子源：ESI；

扫描方式：正离子；

喷雾电压：3200V；

离子传输管温度：320℃；

正离子的扫描质量范围：100-1000(m/z)；

自动增益控制(AGC)靶：200,000；

最大离子注入时间：50ms。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的检测方法以牛乳制品中的小分子作为标记物，对羊乳制品掺假牛乳进行检测分析，方法简单，分析速度快，灵敏度高。对于弥补和加强羊乳中掺假牛乳的检测方法，保障消费者健康和权益具有重要的意义。

附图说明

图1为高温灭菌羊奶、牛奶以及羊奶粉、牛奶粉的小分子标记物质谱图；

图2为掺假高温灭菌羊奶中差异标记物维生素H的掺假比例与差异倍数的线性关系图；

图3为掺假羊奶粉中差异标记物维生素H的掺假比例与差异倍数的线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。

实施例1羊乳掺假牛乳中小分子标记物的测定

取1mL羊、牛乳样品至1.5mL离心管，加10μL浓度为3mg/mL 的2-氯苯丙氨酸作为内标，和30μL 33％乙酸用于沉淀蛋白和调节pH 值，涡旋静置，于4℃，10000×g，离心15-20min。小心吸取全部上清液，转移至2mL离心管冻干，加2mL 90％乙醇、5μL乙腈和 30μL33％乙酸，振荡混匀，放置摇床4℃振荡(750-1000rpm)5h。于4℃，10000×g，离心15min。吸取所有上清液，冻干。复溶至 100μL纯水+甲醇(1:1)中，涡旋混匀，10000×g，离心15-20min, 取上清测定。

其中不同种类乳样前处理方法为：

高温灭菌乳样品处理：将生牛奶以及生羊奶在90℃下加热15min，随后在4℃，4000×g，离心30min获得脱脂乳。

奶粉样品处理：将牛奶及羊奶冻干后，乳粉和水按照1：8复溶后在4℃，4000×g，离心30min获得脱脂乳。

(2)高分辨液相色谱串联质谱测定：

建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定羊乳以及牛乳制品。

液相条件为：

流动相为0.2％甲酸和乙腈，梯度洗脱，0～2min，0％乙腈；2～8min， 0％～100％乙腈；8～12min，100％乙腈；12～14min，100％～0％乙腈；进样量为5μL，流速为0.2mL/min，柱温为30℃。

质谱条件为：

离子源：ESI；扫描方式：正离子；喷雾电压：3200V；离子传输管温度：320℃；正离子的扫描质量范围：100-1000(m/z)；自动增益控制(AGC)：200，000；最大离子注入时间：50ms。

(3)使用Compound discoverer软件对质谱文件根据不同数据库进行搜索，并对牛乳制品以及羊乳制品的高分辨液相色谱串联质谱数据进行定性和定量；以纯羊乳制品作为比较组，根据差异倍数(FC) 以及P值(P<0.05)筛选牛乳制品中的小分子标记物。

检测图谱如图1所示，具体地：

a)高温灭菌羊奶掺假高温灭菌牛奶的差异小分子标记物和检出限。

数据分析发现维生素H在高温灭菌羊奶和牛奶之间存在显著差异，且FC值大于2，因此维生素H可以用于鉴别高温灭菌羊奶中的牛奶掺假。

d)羊奶粉掺假牛奶粉的差异小分子标记物和检出限

数据分析进一步发现维生素H在羊奶粉和牛奶粉之间存在显著差异，且FC值大于2，因此维生素H可以用于羊奶粉中的牛奶粉掺假。

以2-氯苯丙氨酸为内标物，利用以下定量公式，对奶中的表征因子维生素H进行定量分析。

其中A_s和A_r分别为内标物和对照品的峰面积，m_s和m_r分别为加入内标物和对照品的量；

A_i和A_s分别为维生素H和内标物的峰面积，m_s为加入内标物的量。

实施例2方法验证

对于高温灭菌羊奶，将牛奶按照0.1％、1％、10％、20％、50％的比例(v/v)加入到羊乳奶中，混合均匀后于90℃下加热15min 进行高温灭菌处理，待乳样冷却后，4℃，5000×g，离心15-20min 并除去上层脂肪，收集脱脂乳等待进一步检测。

对于羊奶粉，将牛奶粉按照0.1％、1％、10％、20％、50％的比例 (w/w)加入到羊奶粉中，掺假乳粉和水按照1：8复溶后，4℃， 5000×g，离心15-20min并除去上层脂肪，收集脱脂乳等待进一步检测。

取1mL掺假羊、牛乳样品至1.5mL离心管，加10μL浓度为3 mg/mL的2-氯苯丙氨酸作为内标，和30μL 33％乙酸用于沉淀蛋白和调节pH值，涡旋静置，于4℃，10000×g，离心15-20min。小心吸取全部上清液，转移至2mL离心管冻干，加2mL 90％乙醇、5μL 乙腈和30μL33％乙酸，振荡混匀，放置摇床4℃振荡(750-1000rpm) 5h。于4℃，10000×g，离心15min。吸取所有上清液，冻干。复溶至100μL纯水+甲醇(1:1)中，涡旋混匀，10000×g，离心15-20min,取上清测定。

液相条件为：

质谱条件为：

离子源：ESI；扫描方式：正离子；喷雾电压：3200V；离子传输管温度：320℃；正离子的扫描质量范围：100-1000(m/z)；自动增益控制(AGC)靶：200，000；最大离子注入时间：50ms。

使用Compound discoverer软件对质谱文件根据不同数据库进行搜索，并对掺假羊乳制品的高分辨液相色谱串联质谱数据进行定性和定量；以纯羊乳制品作为比较组，分析掺假羊乳制品中维生素H的差异倍数(FC)以及P值(P<0.05)。

以维生素H作为标记物，与未掺假的高温灭菌羊奶相比，不同掺假比例的高温灭菌羊奶存在显著差异。当高温灭菌羊奶的掺假比例为0.1％、1％、10％、20％、50％时，差异倍数分别为2.0、6.8、59.1、 112.3、226.5。

以维生素H作为标记物，与未掺假的羊奶粉相比，不同掺假比例的羊奶粉存在显著差异。当羊奶粉的掺假比例为0.1％、1％、10％、 20％、50％时，差异倍数分别为2.0、6.1、43.1、115.2、255.5。

以纯羊乳制品为比较组，掺假高温灭菌羊奶以及掺奶粉中维生素 H的差异倍数与掺假比例的线性关系如图2、图3所示。

根据以上检测结果，证明了以小分子物质维生素H为生物标记物，可以对羊乳制品的牛乳掺假进行有效鉴定。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。

Claims

1.一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物，其特征在于，包括：

1)将适量羊乳制品的离心去除脂肪后置于容器，加入适量有机酸，离心提取上清液后冻干；

2)加入小分子物质萃取液，离心分离上清液；

3)干燥后用50％甲醇溶液复溶，高分辨液相色谱串联质谱测定。

2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述标准品为2-氯苯丙氨酸；所述有机酸为乙酸。

3.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醇、乙腈。

4.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述振荡是于4℃摇床中以750–1000rpm振荡处理。

5.如权利要求1-4中任一项所述的前处理方法在检测羊乳制品掺假牛乳的中的应用。

6.一种利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，其特征在于，包括：

b)使用高分辨液相色谱串联质谱仪测定所述待测液和羊乳对照品中的小分子标记物；

所述小分子标记物为维生素H。

7.如权利要求6所述的利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，其特征在于，还包括：

8.如权利要求6所述的利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，其特征在于，所述的小分子标记物的测定是基于羊乳制品样品中对应小分子标记物的差异倍数(FC)和P值(P<0.05)确定的；

优选地，基于Compound discoverer软件对质谱图谱和数据处理后计算得到差异倍数和P值。

9.如权利要求6所述的利用小分子标记物检测羊乳制品掺假牛乳的测定方法，其特征在于，所述的高分辨液相色谱串联质谱的液相色谱条件为：