CN101613408B - 乳清蛋白的分离和测定方法 - Google Patents

Abstract

一种分离和测定牛乳清蛋白的方法，它包括对乳清蛋白进行预处理、用以1.7μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒为填料的超高效液相色谱柱将试样中的牛乳α-乳白蛋白和牛乳βa-乳球蛋白、牛乳βb-乳球蛋白完全分离和用质谱仪进行区间扫描，对未变性的上述牛乳白蛋白和牛乳球蛋白进行定量。在该方法中，添加人α-乳白蛋白作为内标。使用本发明的方法，可以准确测定各种食品中的未变性的上述三种牛乳清蛋白的含量，而且前处理简单、灵敏度高、检测速度快和选择性好。

Description

乳清蛋白的分离和测定方法

技术领域

本发明涉及一种乳清蛋白的分离和测定方法。更具体地说，涉及一种能够高效地将牛乳和乳制品中的牛乳白蛋白和牛乳球蛋白完全分离并定量测定的方法。

背景技术

一般牛乳中含2.2％～4.4％的蛋白质，主要为酪蛋白、乳清蛋白、脂肪球膜蛋白等。乳清蛋白含量仅次于酪蛋白，占牛乳中蛋白质含量的18％～20％，其包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等及一些生长因子，其中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是乳清蛋白的主要成分，约占其75％。因此，对牛乳和牛乳制品中的乳清蛋白准确定量对于牛乳和牛乳制品的质量评价和控制具有重要的意义。

现有的乳清蛋白的检测方法有：聚丙烯酰胺平板凝胶电泳法(SDS-PAGE)、毛细管凝胶电泳法(CGE)、高效液相色谱法(包括反相色谱法和凝胶色谱法)和液相色谱质谱联用法(LC-MS)。

毛细管凝胶电泳(CGE)是将平板凝胶电泳在毛细管中实现。CGE分离变性蛋白依赖于带不同负电荷的蛋白质在电场中迁移速度的不同得以实现，不需要染色，蛋白的检测通过紫外吸收来完成定量检测。然而，CGE受到毛细管短、电压等限制，不能很好地分离分子量差别很小的蛋白，同时灵敏度较低。聚丙烯酰胺平板凝胶电泳法(SDS-PAGE)一直以来在生化领域被广泛应用于分离蛋白质、寡核苷酸等生物大分子。它的定量是通过扫描经染色后的蛋白质在凝胶上的染色程度来实现的。虽然该方法能够分离各种乳清蛋白，但其操作步骤复杂，检验周期长，邻近带型的界面不清楚，不同批次间的染色和脱色存在误差，很难获得良好的重现性，因此只能半定量，从而限制了其使用。

反相高效液相色谱法(RP-HPLC)采用紫外吸收来进行定量。但由于蛋白质分子量一般都在万级以上，很多有亚基结构，立体构型及复杂构象，与流动相、固定相及样品中的其它成分甚至蛋白质本身都可能存在多种复杂的相互作用，会造成谱带扩散、峰形拖尾等问题，甚至发生变性和不可逆吸附，引起回收率和分辨率降低，并且随着蛋白质体积和疏水性的增加，纯化难度也会增加。

凝胶色谱(GPC)是一种物理性分离方式。GPC分离蛋白依赖于不同分子量的蛋白质在色谱柱中迁移速度不同而实现分离，不需要变性、染色，蛋白的检测通过280nm的紫外吸收来实现，所以在蛋白的定量分析上更可靠。在乳清蛋白中，β-乳球蛋白(β-Lg)的分子量较α-乳白蛋白(α-La)大4000道尔顿左右，在GPC中可以实现分离，并且运用紫外吸收来定量。但GPC受到分辨率低的限制，不能同时很好地分离分子量差别较小的蛋白质，例如牛β-乳球蛋白(β-Lg)的两个主要遗传变异体βb-乳球蛋白(βb-Lg)和βa-乳球蛋白(βa-Lg)的分子量分别为18276.9道尔顿和18362.9道尔顿，两者仅差90道尔顿左右，因此无法通过GPC进行有效分离。

液相色谱质谱联用技术(LC-MS)是近十年来兴起的新技术，与其他色谱方法比起来具有更高的选择性和灵敏度。Czerwenka等采用LC-MS联用方法测定牛乳和乳制品中β-牛乳球蛋白的含量，选用ESI(+)，全扫描的提取离子方式。但Czerwenka等只测定了总的牛β-乳球蛋白含量，未涉及牛乳中α-乳白蛋白的分离和定量(参见Christoph C.et al，Analytical Chemistry，2007，79(14)，5165-5172)。

因此，本领域需要一种能够高效将牛乳和乳制品中的牛乳白蛋白和牛乳球蛋白完全分离并准确定量的方法。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种能够高效地将牛乳和乳制品中的未变性的α-乳白蛋白(牛α-La)和牛βa-乳球蛋白(βa-Lg)、牛βb-乳球蛋白(βb-Lg)完全分离的方法和将分离出来的这些蛋白进行准确定量的方法。

本发明的乳清蛋白的分离方法包括：

对乳清蛋白进行预处理，

用以1.7μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒为填料的超高效液相色谱柱将试样中的牛α-乳白蛋白和牛βa-乳球蛋白、牛βb-乳球蛋白完全分离。

在上述分离方法中，作为所述以1.7μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒为填料的超高效液相色谱柱，优选采用ACQUITY UPLC BEH300 C18柱，并且以含三氟乙酸的水和含三氟乙酸的乙腈溶液为流动相进行梯度分离。

在上述分离方法中，所述预处理包括用含Triton X-100的NaCl溶液将样品溶解后，用稀三氟乙酸(TFA)溶液调节pH至4.6，定容、均质后离心分离，取上清液用滤膜过滤。

在本发明中，前述乳清蛋白的“完全分离”是指二个或多个不同性质的乳清蛋白在所应用的液相色谱条件下其溶出峰各自完全分离，没有重叠和干扰。

在本发明中，前述“稀TFA溶液”是指TFA溶液中的TFA浓度在1％以下，优选0.5％以下，更优选为0.2％。

在本发明中，前述预处理中的NaCl溶液中的Triton X-100的浓度在1％以下，优选0.5％以下，更优选为0.2％。

本发明还包括一种通过液相色谱质谱联用测定乳清蛋白的方法，它包括：在上述乳清蛋白的分离方法中，进一步地用质谱仪进行区间扫描，对未变性的上述牛乳白蛋白和牛乳球蛋白进行定量。

在本发明中，通过在ESI条件下进行质谱分析，可以比较容易地获得蛋白质的高丰度多电荷离子。为了尽可能达到准确定量，针对高丰度的多电荷离子的质量数，采用选择区间的扫描方式。

在本发明的区间扫描方式中，选用下述质量数范围作为对牛乳清蛋白进行定量的扫描区间：牛α-La：2357-2368m/z；牛βb-Lg：1656-1666m/z；牛βa-Lg：1665-1675m/z。

在上述分离和测定方法中，优选添加人α-乳白蛋白作为内标。如本发明的后述的一个实施例所示，在电喷雾质谱离子化过程中，样品基质会对牛β-Lg离子化产生干扰，引起定量误差。而目前尚无理想的与乳清蛋白极为相似的蛋白质或同位素蛋白质作为内标，对三个乳清蛋白进行准确定量。人类母乳中的人α-乳白蛋白(人α-La)和牛乳中的牛α-乳白蛋白(牛α-La)的相似度达到72％(参见J.G.Jackson，et al.，A multinational study of a-lactalbumin concentrations in human milk，J.Nutr.Biochem.，15(2004)517-52)。而且，人乳中的人α-La含量丰富。本发明者第一次使用人α-La作为定量的内标物，取得了令人满意的效果。

此外，在本发明中，在使用人乳α-La作为内标的同时，采用基质加标法，以消除牛β-Lg的定量中由水与试样消解液基质不同引起的误差。

在本发明中，用于作为内标的人α-乳白蛋白的区间扫描质量数范围为2340-2350m/z。

较好的是，在本发明中，上述加标的基质经过微波处理。

在本发明的牛乳清蛋白的分离和测定方法中，使用含约0.06-0.1％左右的酸的乙腈溶液作为溶剂和流动相。从试样蛋白的分离性和检测的灵敏度考虑，优选使用TFA。若TFA浓度低于上述范围，例如小于0.05％，试样蛋白的离子化干扰明显减弱，但试样蛋白的出峰时间过短，牛βb-Lg和牛βa-Lg之间难以分离；而若TFA浓度大于0.1％，将产生离子化抑制作用，试样蛋白出峰时间推迟、峰形变差。在本发明中，从试样蛋白的分离效果和离子化效率考虑，特别是以牛βb-Lg和牛βa-Lg之间的完全分离为优先考虑因素，优选使用含0.08％TFA的水/乙腈溶液。

在所述质谱分析中，可以用将试样溶解在TFA溶液中进行测定，也可以溶解在甲酸溶液中，但从使试样蛋白更好地离子化、从而获得试样蛋白的高丰度和高信噪比的角度考虑，在本发明中，优选TFA溶液。

附图说明

图1是牛α-La、βa-Lg和βb-Lg的标准溶液的全扫描图。

图2是牛α-La与人α-La全扫描图谱和人α-La分子量计算图谱。

图3是人乳和母乳化奶粉试样四个检测通道的色谱质谱图。

图4是在本发明的一个实施例中的三种牛乳清蛋白的信噪比图。

图5是在本发明的一个实施例中的三种牛乳清蛋白的标准曲线。

图6是标准品的完全扫描方式和区间扫描方式的质谱色谱图比较。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的具体实施方式作详细说明，但本发明不限于这些具体实施例。

<试样的预处理>

在牛乳和婴幼儿配方奶粉中，除了含有乳清蛋白外，还含有大量的酪蛋白或其他蛋白(如奶粉中添加的大豆蛋白等)，这些成分可能会对牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的检测产生干扰。因此，需要选择适当的预处理方法沉淀去除酪蛋白，以便更充分有效地提取所要检测的乳清蛋白。

在本发明中，除非另有说明，用以下方法对乳清蛋白试样或含乳清蛋白试样进行预处理：

准确称取0.20g试样，加入500μL内标溶液(1mg/mL)，用0.3mol/L NaCl(含0.2％Triton X-100)溶液9mL溶解，用0.2％TFA溶液调节pH至4.6(酪蛋白的等电点)，定容至10mL，以约13500r/min均质10min，静置30min。然后置于离心管中，15000r/min离心15分钟，取上清液用0.22μm滤膜过滤，作为分析用试样。

<基质阴性的试样(消解液)的制备>

在分析测定中，样品基质的组分会对质谱检测的灵敏度和稳定性产生重要影响。已知牛α-La具有较好的热稳定性，牛βb-Lg和牛βa-Lg的热稳定性相对较差。为此，在本发明中，除了标准样品溶液和另有说明之外，用微波处理的方式破坏试样中的乳清蛋白，获得基质阴性的试样。

制备待测试样空白基质溶液(不含牛乳α-乳白蛋白和牛乳β-乳球蛋白)的方法如下：

称取1.00g待测试样于100mL烧杯中，用0.3mol/L氯化钠溶液(含0.2％Triton X-100)约70mL溶解、2％三氟乙酸溶液调整pH至4.6，移入100mL容量瓶中，用上述氯化钠溶液(4.3.4)定容至刻度。移至烧杯中，用均质机以约13500r/min均质10min，静置30min，移入微波消解管中，在功率250w、温度150℃的条件下处理10.5min。冷却至室温移入50mL离心管中，在4℃下以15000r/min离心15min。取离心管中的上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

<检测仪器和条件>

1)检测仪器

在本发明中，使用下述液相色谱-质谱联用仪：

ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪和Micromass Quattro Ultima TMPt质谱仪(购自美国Waters公司)。

2)UPLC条件：

分析柱：ACQUITY UPLC BEH300 C18柱(150mm×2.1mm I.D.，粒径1.7μm)(美国Waters公司)

柱温度：40℃；

流动相：含0.08％TFA的水溶液(A)和含0.08％TFA的乙腈溶液(B)

流速：0.25mL/min；

进样体积：1μL；

检测波长：280nm；

梯度条件：如下表1所示。

表1梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)	梯度变化曲线
				0	62	38	0
2.0	60	40	6
				5.4	57	43	6
5.5	0	100	6
				5.9	0	100	1
6.0	62	38	6

3)质谱参数

电离方式	电喷雾电离，正离子
		毛细管电压(kV)	3.5
锥孔电压(V)	90
		射频透镜1电压(V)	40
射频透镜2电压(V)	0.5
		离子源温度(℃)	120
锥孔反吹气流量(L/h)	50
		脱溶剂气温度(℃)	350
脱溶剂气流量(L/h)	600
		电子倍增电压(V)	650

在本发明中，通过电离方法来进行质量分析(ESI，正离子)，用区间扫描方式进行检测，以获得蛋白质的高丰度多电荷离子。为了尽可能达到准确定量，针对高丰度的多电荷离子的质量数，采用选择区间的扫描方式。为此，从扫描区间的电荷化离子是否丰度大、基线波动小和质量数相对较大的角度考虑，选用下述质量数范围作为对牛乳清蛋白进行定量的扫描区间：牛α-La：2357-2368m/z；牛βb-Lg：1656-1666m/z；牛βa-Lg：1665-1675m/z。

4)标准样品和试剂

牛α-乳白蛋白：纯度不低于85％(购自SIGMA公司，PN.035K70)。

牛β-乳球蛋白：纯度不低于90％，其中，βa-乳球蛋白和βb-乳球蛋白之含量比约为1∶1(购自SIGMA公司，PN.094K7047)。

人α-内标样品溶液：从一产后2周的28岁健康产妇采取新鲜乳汁约100mL，参照Christoph C.et al，Analytical Chemistry，2007，79(14)，5165-5172中所示方法进行分离、纯化、冻干，得到人α-乳白蛋白约200mg，纯度不低于85％。使用时，称取10.0mg于10mL容量瓶中，用下述待测试样空白基质溶液稀释至1mg/mL。

在本发明中，除非另有说明，所用试剂均为分析纯。

实施例1

用贝因美“冠军宝贝”初生婴儿配方奶粉按前述<基质阴性的试样(消解液)的制备>中所示的方法配制空白基质溶液，再用该空白基质溶液和水分别配制内标与牛α-La、牛βa-Lg和牛βb-Lg三种乳清蛋白的浓度为60μg/mL的标准溶液，经进样测定，UV检测所得峰的峰面积，计算结果见表2。

表2不同溶液基质对离子化效应的影响(n＝3)

	牛α-La峰面积	人α-La峰面积	牛βa-Lg峰面积	牛βb-Lg峰面积
					水(A1)	211175	151136	5484	30855
阴性基质(A2)	217384	153957	13457	81467
					A2/A1之面积比	1.03	1.02	2.45	2.64

上表结果表明，试样消解液的基质对牛β-Lg比牛α-La更具有明显的增益效应，牛β-Lg和牛α-La两类蛋白的增益效应有较大区别。上表结果还表明，虽然使用人α-La作为内标对牛α-La的定量不产生较大误差，但对于牛β-Lg而言，由于配制标准溶液中基质的差异，引起明显的增益效应(两倍以上)，说明用水配制标准系列溶液会引起牛β-Lg定量的误差。

因此，为了达到对牛β-Lg准确定量的目的，在本发明中，在使用人乳α-La作为内标的同时，采用基质加标法，以消除牛β-Lg的定量中由水与试样消解液基质不同引起的误差。

实施例2

用水配制牛α-La、βa-Lg和βb-Lg的标准溶液(浓度：100μg/mL)，在前述色谱和质谱的条件下进行分离、测定，并通过MaxEnt.xyz软件计算，算出α-La的分子量为14178Da，βb-Lg为18276Da，βa-Lg为18363Da(参见图1。图中，a是牛α-La的扫描图，b是牛βb-Lg的扫描图，c是牛βa-Lg的扫描图；各蛋白的分子量用MaxEnt.xyz软件算出)，与理论平均分子量完全吻合。由此可以确定，选择2357-2368m/z、1656-1666m/z和1665-1675m/z分别作为牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的区间扫描质量数范围是完全可行的。

实施例3和比较例1、2：

在与实施例2相同的条件下，改变区间扫描的质量数范围(扫描通道)，结果见下表。

表3三个通道的区间质量数扫描

通道	牛α-La扫描质量数范围(m/z)	信噪比(S/N)	牛βb-Lg扫描质量数范围(m/z)	信噪比(S/N)	牛βa-Lg扫描质量数范围(m/z)	信噪比(S/N)
							实施例3	2357-2368	178	1656-1666	171	1665-1675	167
比较例1	2020-2030	24	1518-1528	68	1525-1535	32
							比较例2	2830-2840	125	1822-1832	46	1831-1841	55

从上表可知，实施例3中选用的区间扫描质量数范围与其低质量数一侧的区间扫描(比较例1)和高质量数一侧的区间扫描(比较例2)相比，信噪比(灵敏度)明显优于后二者。说明本发明中选用2357-2368m/z、1656-1666m/z和1665-1675m/z分别作为牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的区间扫描质量数范围是正确和适宜的。

实施例4

从一产后2周的28岁健康产妇处采取新鲜乳汁1mL，用纯水稀释20倍后过0.22μm微孔滤膜，进样，用前述方法进行色谱分离、质谱全扫描，结果见图2(图中，a是牛α-La与人α-La的多电荷离子比较；b是计算出的人α-La的分子量)。由图2可见，所得人α-La质谱图(图2-a下)与牛α-La(图2-a上)极其相似，经计算，人α-La的分子量为14070(图2-b)，与牛α-La只相差大约108。最高丰度多电荷的扫描质量数范围为2340-2350m/z。

取前述过膜后的人乳稀释液，再用水稀释20倍后进样，结果见图3(图中，a表示人乳四个通道检测，b表示贝因美宝宝成长配方奶粉)的四个通道检测，a和b中，1为牛α-La的检测，2为人α-La的检测，3为牛βb-Lg的检测，4为牛βa-Lg的检测)。由图3-a可见：在牛βb-Lg和牛βa-Lg的检测通道中均未见人α-La的干扰，但在牛α-La的检测通道(2357-2368m/z)中可检出人α-La(2340-2350m/z)(保留时间为4.69min，见图3-a之1)，这是由于人α-La和牛α-La具有极高的相似性。但是，在所应用的LC色谱条件下，牛α-La的保留时间为2.42min(图3b之1)，远小于上述人α-La的保留时间，因此，两者被完全分离，只要在两者各自的保留时间进行质谱分析，就可以实现两者的准确分析和定量，相互间不形成干扰。

虽然牛βb-Lg和牛βa-Lg的氨基酸相似度在99％以上，但从图3-b可知，在本发明，通过选用waters公司的以1.7μm亚乙基桥杂化颗粒为填料的超高效液相色谱柱，更优选的是反相色谱柱ACQUITYUPLC BEH300(C18 300

1.7μm 2.1×100mm)，在优化的分离条件下使得该二个分子量相近的牛乳球蛋白遗传变异体实现了完全分离。在牛βb-Lg和牛βa-Lg检测通道中，由于选择的扫描质量数范围和色谱分离保留时间均不同，更不会产生相互干扰。

以贝因美初生婴儿配方奶粉为试样进行检测的结果表明，标准样品中人α-La(内标)通道中的出峰位置均未见有杂质峰出现，在被检样品的人α-La通道中未出现干扰峰。

由于人乳α-La具有本身化学性质稳定、对被分析物不产生干扰并与其具有高度相似性、但在试样中不存在的优点，因此，非常适宜作为内标添加在牛乳清蛋白试样中。

实施例5

分别称取0.2g贝因美初生婴儿配方奶粉12份于25mL容量瓶中，以3份为一组，分别加入用空白基质溶液配制的牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的1mg/mL的标准溶液125、500和1250μL(浓度分别为5，20，50μg/mL)，以另3份为空白对照，加入2.5mL的内标溶液，按前述方法进行预处理后进样。结果见表4。

表4使用本发明的分离和测定方法的回收率试验(n＝3)

表4结果显示，三种乳清蛋白的高、中、低各浓度的平均回收率在90％～100％之间，说明本发明的分离和测定方法具有良好的准确性。

实施例6

分别用分离乳清蛋白(WPI，美国Davisco公司，N.20081225)微波、过膜处理过的空白基质溶液配制浓度为5μg/mL和10μg/mL的牛α-La、牛β-Lg混合试样，所得各峰的信噪比如图4所示。

由图4得知，牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的信噪比(S/N)分别为79.53、124.03和114.56。若以信噪比为10倍时的溶液浓度为定量限(LOQ)，并考虑样品处理过程中的稀释倍数，则可以计算出在本实施例中，牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的方法定量限(LOQ)分别为3.2、2.0和2.2mg/100g。

为了确保试验的严密性和准确性，在本发明中，可将牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的方法定量限(LOQ)分别放宽至5mg/100g。

实施例7

按与实施例1相同的方法配制浓度分别为100μg/mL和200μg/mL的牛α-La和牛β-Lg混合标准溶液，从中吸取10、50、100、200、300、400、500μL与50μL的内标溶液混合，定容至1mL。取1μL进样，以样品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，样品浓度为横坐标，得到的标准曲线数据见表10，标准曲线见图5(图中，a示出牛α-La的标准曲线，b示出牛βb-Lg的标准曲线，c示出牛βa-Lg的标准曲线)。

表5三种乳清蛋白的标准曲线数据

浓度(μg/mL)	牛α-La峰面积	牛βb-Lg峰面积	牛βa-Lg峰面积
				5	3845367	1278028	1455866
10	7251673	2523727	3007049
				20	15029115	5236174	6410948
30	22815400	7819867	9412207
				40	30123176	10541956	12967169
标准曲线(y)及相关系数(r)	y＝5.99437x+0.280909r＝0.999791	y＝2.06317x+0.041444r＝0.999599	y＝2.51317x+0.322083r＝0.999049

上表数据显示，三种乳清蛋白的相关系数r＞0.99，完全符合蛋白定量分析要求。

实施例8

选择50μg/mL标准溶液，在前述<检测仪器和条件>中所述的色谱质谱条件下进样检测。将所选择的区间扫描方式(即，区间扫描质量数范围：牛α-乳清蛋白为2357-2368质荷比，牛βb-乳球蛋白为1656-1666质荷比，牛βa-乳球蛋白为1665-1675质荷比，人α-乳白蛋白为2340-2350质荷比)与全扫描提取离子方式(continue方式)加以比较，结果见表6和图6(图中，a表示全扫描图谱，b表示区间扫描图谱，1为牛α-La的情形，2为人α-La的情形，3为牛βb-Lg的情形，4为牛βa-Lg的情形)。由实验结果可知，区间扫描方式的信噪比与提取离子方式相比，有2～4倍的提高。因此，采用选择区间扫描方式可较好地排除基线噪音干扰，从而提高检测灵敏度，这有利于提高方法的定量限和稳定性。

表6不同扫描方式的信噪比对比

扫描方式	牛α-La	人α-La	牛βb-Lg	牛βa-Lg
					全扫描(提取离子)(S/N)	395	286	182	205
区间扫描(S/N)	910	1035	732	855

经方法学验证，在上述标准色谱分离和质谱分析的条件下，本发明的乳清蛋白分离和测定方法的线性范围为：5～50μg/mL，α-La、βb-Lg和βa-Lg三种乳清蛋白的相关系数r＞0.99，经过11次重复试验，日内重现性RSD＜6％。

如上所述，根据本发明的牛乳清蛋白的分离和测定方法，通过使用超高效反相液相色谱，使牛乳或牛乳制品中的未变性的牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg能够完全分离；通过采用选择区间质量数扫描方式，实现较强选择性和较高灵敏度的检测，使得牛α-La、牛βb-Lg和牛βa-Lg的方法检出定量限在5、5、5mg/100g，能够满足低含量乳清蛋白样品的定量检测。

另外，以人α-La为内标，通过基质加标的方法，可排除质谱检测中的基质干扰，在准确定量牛α-La的同时，对牛βb-Lg和牛βa-Lg也可准确定量。

此外，本发明的乳清蛋白分离和测定方法还具有预处理简单、检测速度快、选择性和再现性俱佳的优点。

Claims (1)

1.一种通过液相色谱质谱联用测定牛乳清蛋白的方法，它包括以下分离步骤和测定步骤：

在分离步骤中，对乳清蛋白进行预处理后，用以1.7μm亚乙基桥杂化颗粒为填料的超高效液相色谱柱对试样中的牛乳α－乳白蛋白和牛乳βa－乳球蛋白、牛乳βb－乳球蛋白进行分离；

在测定步骤中，添加人α－乳白蛋白作为内标，用质谱仪进行区间扫描，对未变性的上述牛乳白蛋白和牛乳球蛋白进行定量；

所述超高效液相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH300C18柱；

所述预处理包括用含Triton X-100的NaCl溶液将样品溶解后，用含TFA溶液调节pH至4.6，定容、均质后离心分离，取上清液用滤膜过滤；

所述超高效液相色谱使用含0.06－0.10％三氟乙酸的水/乙腈溶液作为溶剂和流动相，进行梯度洗脱；

选用下述质量数范围作为牛乳清蛋白定量的扫描区间：牛α－乳清蛋白为2357－2368质荷比，牛βb－乳球蛋白为1656－1666质荷比，牛βa－乳球蛋白为1665－1675质荷比；

采用基质加标法；

对加标基质进行微波处理；

用于人α－乳白蛋白区间扫描的质量数范围为2340－2350质荷比。

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