CN103134860A - 一种目标多肽和蛋白质定量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种目标多肽和蛋白质定量测定方法，尤其涉及质谱多反应检测法定量目标多肽或蛋白质的方法。本方法通过对标准肽和标准蛋白质进行质谱MRM定量方法的摸索，确立乙腈沉淀法是最佳多肽提取方法，以及适合多肽定量的质谱液相色谱条件，本方法液质联用MRM法检测，可以很好的实现多肽定量，标曲的线性可达到0.999，MRM蛋白质定量的线性关系为0.995。且由于MRM方法选择性和特异性高，该定量方法可以推广应用于复杂样品中的多肽和蛋白质的定量分析。

Description

一种目标多肽和蛋白质定量测定方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种目标多肽和蛋白质定量测定方法，尤其涉及质谱多反应检测法定量目标多肽或蛋白质的方法。

背景技术

研究认为：多肽组作为一个尚未被开发的资源库，它蕴含了疾病特异诊断标志的信息。组织蛋白质因其通常分子量太大，而不能穿过内皮层而进入体液循环，但这些蛋白的信息可能从它们的蛋白片段即多肽而获得。研究显示，多肽组包含了若干类型的诊断信息：1)母蛋白的鉴定；2)肽段片段的信息，如片段的大小，断裂位点，翻译后糖基化修饰和/或磷酸化修饰位点；3)肽段的含量；4)肽段绑定的转运蛋白质的信息等等。

血清中的低分子量蛋白质组被称为多肽组，一般为小分子蛋白质和蛋白质片段。研究显示，血液多肽组非常复杂，它既能反应微小的组织病变所引起的多肽表达变化，也受到机体每天的生理学变化的影响，因此多肽的分析要求样品必须按照快速且标准化的处理方法进行收集。随着蛋白质组学和多肽组学研究的不断发展，差异蛋白质和多肽的质谱鉴定已被本领域技术人员知晓，但是如何进一步探讨这些蛋白质和多肽的丰度，越来越受到研究者的关注。质谱多反应监测(Multiple reaction monitoring，MRM)技术具有灵敏、准确和特异等特点，作为小分子化合物的定量方法业已广泛的应用于药学领域，近年来逐渐被应用于蛋白质组学目标差异蛋白质的定量，但在多肽组学研究中的应用较少，目前国内还鲜有用该方法进行目标蛋白质或多肽定量的报道。

与本发明县官的现有技术有：

[1]Petricoin EF，Belluco C，Araujo RP，et al.The blood peptidome：a higher dimension ofinformation content for cancer biomarker discovery[J].Nat Rev Cancer，2006，6(12)：961-967.

[2]Liu Y，Uboh CE，Soma LR，et al.Efficient Use of Retention Time for the Analysis of 302Drugs in Equine Plasma by Liquid Chromatography-MS/MS with Scheduled MultipleReaction Monitoring and Instant Library Searching for Doping Control[J].Anal Chem，2011.

[3]Lee JH，Lim H，Kim DG，et al.Quantification of oltipraz using liquid chromatography-tandemmass spectrometry and its application to a pharmacokinetic study in rat plasma[J].J PharmBiomed Anal，2011，56(3)：623-626.

[4]Ang CS，Nice EC.Targeted in-gel MRM：a hypothesis driven approach for colorectal cancerbiomarker discovery in human feces[J].J Proteome Res，2010，9(9)：4346-4355.

[5]Kuzyk MA，Smith D，Yang J，et al.Multiple reaction monitoring-based，multiplexed，absolutequantitation of 45 proteins in human plasma[J].Mol Cell Proteomics，2009，8(8)：1860-1877.

[6]赵焱，应万涛，钱小红.质谱MRM技术在蛋白质组学研究中的应用[J].生命的化学，(Zhao Yan，Ying Wan-Tao，Qian Xiao-Hong.Application of mass spectrometry MRMtechnology in proteome research.[J].Chemistry of Life).2008，28(2)：210-213.

[7]Ueda K，Saichi N，Takami S，et al.A comprehensive peptidome profiling technology for theidentification of early detection biomarkers for lung adenocarcinoma[J].PLoS ONE，2011，6(4)：e18567.

[8]

H.Tricine-SDS-PAGE[J].Nature Protocols，2006，1(1)：16-22.

发明内容

本发明的目的是提供一种目标多肽和蛋白质定量测定方法，尤其涉及质谱多反应检测法定量目标多肽或蛋白质的方法。

本研究通过对标准肽和标准蛋白质进行质谱MRM定量方法的摸索，确立适合多肽定量的质谱液相色谱条件，多肽和蛋白质的定量呈比较好的线性关系，且由于MRM方法选择性和特异性高，该定量方法可以推广应用到复杂样品中的多肽和蛋白质的定量中去。

具体而言，本发明的一种目标多肽和蛋白质定量测定方法，其特征在于，其包括：

1、建立标准化的血浆多肽提取方法，尤其是对血浆内源性多肽的提取方法；

2、通过质谱多反应监测(MRM)技术，构建目标多肽和蛋白质的定量方法。

本发明中，采用超滤法、有机溶剂沉淀法和固相萃取法检测对血浆内源性多肽的提取效果，并通过Tricine-SDS-PAGE法对提取效果进行比较；

本发明对三种血浆内多肽提取方法进行比较，其中，1∶2乙腈(含0.1％甲酸)沉淀法能在去除血浆蛋白质的同时收获很多的15kDa以下的小分子量多肽，且该方法操作简便，样品处理时间短，价格低廉；固相萃取法虽能有效地富集血浆中小分子量的多肽，但其去高分子量蛋白质的能力有待提高和优化，且该方法操作复杂，耗时耗力，且实验耗材昂贵；超滤法虽然操作简便，对高分子蛋白质去除效果明显，但是多肽富集效果欠佳，且实验耗材较为昂贵，故其仅适用于处理微量样本，当处理大量样品时其效率较低，且较为浪费。

本发明的一个实施例中，优选乙腈沉淀法为最佳多肽提取方法，其中，低分子量的多肽可以得到很好的富集，且高分子量的蛋白质污染得到了很好的去除。

本发明中，通过导津LC-20AD液相色谱串联Applied Biosystems三重四极杆质谱API3200建立多肽标准品定量方法，检测对标肽定量的准确度、精密度和标曲；以及，

本发明中，还可将标肽定量建立的液相色谱和质谱条件应用于蛋白质的定量，对蛋白质定量方法的标曲测定。

本发明采用简单有效的血浆多肽提取方法，通过液质联用MRM法能成功地实现目标多肽和蛋白质定量测定，所得标曲的线性可达到0.999，MRM蛋白质定量的线性关系为0.995。该定量方法可用于复杂样品中的多肽和蛋白质的定量分析。

为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的目标多肽和蛋白质定量测定方法进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本专利范围之内。

附图说明

图1是本发明方法主要实验流程图。

图2是两倍体积乙腈(含1％甲酸)溶液的提取效果。

图3是标肽ESAT-6的四个离子对检测的MRM图谱以及离子对735.5/215.3标准曲线。

图4是0.375-6ug BSA SDS-PAGE考染电泳图谱。

具体实施方式

实施例1

1)主要仪器与试剂：

德国Sartorius公司BP211D分析天平，美国LABCONCO公司旋转浓缩仪，美国戴安公司纳升级液相色谱Ultimate 3000及C18预柱和C18反相色谱柱，上海精宏实验设备有限公司恒温水浴锅。Eppendorf微量移液器，BACKMANCOULTER台式高速冷冻离心机，BIO-RAD电泳仪，SDS-PAGE蛋白垂直凝胶电泳装置，GE Imagescanner凝胶成像系统，JA2003A型电子天平，WATERS公司C18固相萃取柱(SPE)，Millipore公司的ultracel YM-10(分子量截流值10KD)。N，N-甲叉双丙烯酞胺、丙烯酞胺购自美国USB公司；过硫酸铵(APs)，N，N，N，N-四甲基己二胺(TEMED)，碘乙酰胺(IAA)均为美国AMRESCO公司产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘油购自美国GE公司；色谱纯乙腈(ACN)，甲醇(CH3OH)购自美国Merck公司；甲酸(FA)购自美国Fluka公司；十二烷基硫酸钠(SDS)购自美国SIGMA公司；分析纯冰乙酸(CH3COOH)、100％乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。

.2)选择血浆多肽提取方法

采用无病原体级SD大鼠血浆做为选择多肽提取条件的血浆标本。分别用有机溶剂沉淀法、超滤法和固相萃取法进行血浆中游离多肽的提取，采用Tricine-SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色法对提取的多肽标本进行检测。(1)有机溶剂沉淀：采用含0.1％甲酸的乙腈为沉淀剂，测定有机溶剂沉淀法提取血浆内多肽的效果：向50ul血浆加入100ul(血浆∶沉淀剂＝1∶2)或500ul(血浆∶沉淀剂＝1∶10)乙腈(含0.1％TFA)，充分震荡混匀后，4℃下孵育30min，4℃，12000rpm离心20min，取上清，再次离心20min，收集上清，用旋转浓缩仪进行冻干。

(2)固相萃取法：比较两种固相萃取洗脱液(15％乙腈和60％乙腈)的多肽提取效果：①取两支Waters C18固相萃取小柱(SPE)，加入500ul甲醇进行SPE活化，甲醇缓慢流过色谱柱的填料，重复一次，弃洗脱液；②加入500ul含75％ACN和0.1％FA的水溶液，平衡SPE柱，重复一次，弃洗脱液；③加入500ul含2％ACN和0.1％FA的水溶液，平衡SPE柱，弃洗脱液；④将两份50ul大鼠血浆样品分别用450ul的10％ACN溶液稀释混匀后，分别加入两支SPE柱中，样品缓慢的流经SPE柱，弃流出液，多肽标本挂在SPE柱上；⑤加入500ul含2％ACN和0.1％FA的水溶液，洗掉水溶性的未挂在色谱柱上的杂质，弃洗脱液；⑥分别向两支SPE柱中加入500ul 15％或60％的ACN溶液，重复此步骤一次，合并两次收集的洗脱液，用旋转蒸发仪进行冻干。

(3)超滤法：50ul大鼠血浆样品加入450ul10％ACN溶液混匀稀释后，4℃孵育30min，将样品加入超滤管上层，4℃3000g离心30min，收集滤过超滤膜的多肽溶液，用旋转蒸发仪进行冻干。

(4)Tricine-SDS-PAGE经过有机溶剂沉淀法、固相萃取法和超滤法提取的血浆多肽标本，经过旋转蒸发仪冻干后，采用20ul上样缓冲液(12％SDS，6％β-巯基乙醇，30％甘油，150mMTris-HCl，pH＝7.0)进行复溶，通过Tricine-SDS-PAGE电泳(4％浓缩胶、10％间层胶和16％分离胶)分离检测。

结果显示：

(1)在有机溶剂沉淀方法中，两倍体积乙腈(含1％甲酸)溶液的提取效果较好，其可以较好的富集低分子量蛋白质(小于15kDa)，同时可以较为有效的去除高丰度蛋白质。十倍体积乙腈沉淀样本在电泳中几乎看不见条带，可能是其富集的量太少，在Tricine-SDS-PAGE胶上无法展现；(2)在固相萃取方法中，实验60％乙腈溶液洗脱效果较好，可以较好的富集低分子量蛋白质(小于15kDa)，且与两倍乙腈沉淀相比，其富集低分子量多肽的含量更高。但是，其对高丰度蛋白质的去除作用不是很明显；(3)超滤法提取的多肽样品样本，电泳后几乎看不见条带，可能由于tricine-SDS-PAGE胶的分辨率还达不到检测所需。综合考虑，两倍体积乙腈(含1％甲酸)沉淀法既能有效富集多肽，同时也能够有效地取出高分子量的蛋白质，是最有效的提取方法(如图2所示)。

3)多肽或蛋白质质谱MRM定量方法

(1)液相色谱串联质谱MRM分析：采用导津LC-20AD高效液相色谱串联美国应用生物系统公司的三重四级杆质谱API3200进行多肽定量分析。液相色谱流动相为：A：0.1％甲酸；B：80％乙腈，0.1％甲酸。使用戴安1.0*150mm

C18色谱柱，流速是0.06ml/min。液相色谱梯度为：0-12min，5％-62.5％流动相B；12.1-20min，62.5％流动相B；20.1-25min，100％流动相B；25.1-50min，5％流动相B。API3200质谱仪基本参数为：CUR：10；IS：5500；TEM：300；GS1：50；GS2：50；ihe：ON；CAD：6；DP：50；EP：80；CE：35；CXP：8.同时对需要定量的蛋白质或多肽的多个离子对进行扫描。

(2)准肽段MRM分析标准曲线：合成一条标准肽段ELNNALQNLARTI(ESAT-6)进行多肽定量的方法摸索，进一步验证API3200质谱仪应用于多肽或蛋白质定量的可行性。所述肽段来源于6kDa结核早期分泌抗原靶标的64-76号氨基酸序列(人和哺乳动物的蛋白质中无其重复序列)，该蛋白质作为多肽或蛋白质样品定量的内参多肽。将5ul 6.25、12.5、25、50、100和200ng/ul标准肽段ESAT-6分别加入50μl健康人血浆中，获得含有0.625，、1.25、2.5、5、10和20ng/ul的ESAT-6溶液，采用1∶2乙腈(含0.1％甲酸)沉淀法进行多肽提取，冻干后的多肽采用100ul 2％乙腈，0.1％甲酸进行复溶，取10ul上样API3200进行质谱MRM分析，同时检测四个离子对735.5/215.5、735.5/389.3、735.5/460.3、735.5/524.4。结果显示：

以标准曲线制备向下测得的血浆样品中的标肽ESAT-6的MRM测定峰面积为纵坐标，标肽的浓度为横坐标，采用外标法，进行直线回归。结果表明：血浆中标肽ESAT-6浓度在0.625-20ng/ul的范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系，标准曲线的r＝0.9993.图3列出了标肽ESAT-6的四个离子对(735.5/215.5、735.5/389.3、735.5/460.3、735.5/524.4)检测的MRM图谱以及离子对735.5/215.3标准曲线。

4)蛋白质定量

0.375、0.75、1.5、2.25、3、4.5和6ug牛血清白蛋白BSA，经过11.5％分离胶的SDS-PAGE电泳分离，采用G-205考染染色。切取BSA的条带，进行脱色，还原烷基化和Trypsin酶切，萃取，冻干。采用导津LC-20AD高效液相串联AppliedBiosystems API3200质谱进行定量。绘制标准曲线。

结果显示：

0.375-6ug BSA SDS-PAGE考染电泳图谱(如图4所示)，BSA条带经过胰酶酶切后，经过API3200质谱进行MRM定量。以标准曲线制备向下测得的BSA酶切肽段离子对的MRM测定峰面积和为纵坐标，BSA上样量为横坐标，采用外标法，进行直线回归。结果表明：BSA上样量在0.375-6ug的范围内，浓度与峰面积之和有良好的线性关系，标准曲线的r＝0.9949，标准曲线见Fig.4B。

表1是BSA定量的肽段及相应的离子对。

表1

Claims (7)

1.一种目标多肽和蛋白质定量测定方法，其特征在于，其包括：

1)建立标准化的血浆多肽提取方法；

2)通过质谱多反应监测技术，构建目标多肽和蛋白质的定量方法。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中采用超滤法、有机溶剂沉淀法和固相萃取法检测对血浆内源性多肽的提取效果，并通过Tricine-SDS-PAGE法对提取效果进行比较。

3.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述有机溶剂沉淀法为乙腈沉淀法，其中：1∶2乙腈(含0.1％甲酸)。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，通过导津LC-20AD液相色谱串联Applied Biosystems三重四极杆质谱API3200建立多肽标准品定量方法，其中，液相色谱流动相为：A：0.1％甲酸；B：80％乙腈，0.1％甲酸。使用戴安1.0*150mm

C18色谱柱，流速是0.06ml/min。液相色谱梯度为：0-12min，5％-62.5％流动相B；12.1-20min，62.5％流动相B；20.1-25min，100％流动相B；25.1-50min，5％流动相B。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法所得标曲的线性达到0.999，MRM蛋白质定量的线性关系为0.995。

6.权利要求1所述的方法在定量测定目标多肽中的用途。

7.权利要求1所述的方法在定量测定目标蛋白质中的用途。

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