CN102435680B - 一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，步骤如下：(1)蛋白的酶解；(2)液相色谱检测：对蛋白的酶解产物进行液相色谱检测；(3)定性检测：定性检测的肽段为：HLVDEPQNLIK，检测蛋白的酶解产物中是否含有该肽段，若有，则证明待检测的蛋白样品为牛血清白蛋白，若没有，则证明待检测的蛋白样品不是牛血清白蛋白；(4)定量检测：定量检测的肽段为：ATEEQLK，检测蛋白的酶解产物中该肽段的浓度，通过以下公式计算得出牛血清白蛋白的浓度：y＝51925x-491814，R2＝0.9991。本方法的方法操作简单，检测快速，成本较低，且专一性强，可用于已知蛋白的定性、定量检测。
Description
技术领域
本发明提供了一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法。
背景技术
质谱法是目前用于蛋白质高效准确检测的一种新技术新方法，其检测灵敏度和准确度高，可同时获得定性定量的结果，还可用于多种蛋白的同时测定。近年来质谱技术发展很快。随着质谱技术的发展，质谱技术的应用领域也越来越广。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛的应用于化学，化工，环境，能源，医药，运动医学，刑侦科学，生命科学，材料科学等各个领域。
目前，蛋白质组研究的实验技术流程一般为样品(蛋白混合物)经二维凝胶电泳，染色，胶上蛋白酶切，进入质谱鉴定；或样品(蛋白混合物)直接经酶切，色谱分离，进入质谱进行鉴定。在二维凝胶电泳的实验中，可以通过比较染色后的2张2DE-gel图像中蛋白点的光密度值进行差异定量，或比较同种蛋白经同位素标记和未经标记的串联质谱峰面积进行差异定量。但这两种常用技术由于在样品处理上费时费力，不利于大规模的蛋白质组定量。因此，兴起了无标记的质谱定量方法，这种方法只需分析大规模鉴定蛋白时所产生的质谱数据，用蛋白相应肽段的质谱数据进行定量，因此，非标记定量技术在定量蛋白质组学研究中受到了众多科学工作者的推崇。
非标记蛋白定量检测技术的优势：
1、无需昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低。
2、对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，步骤如下：
(1)蛋白的酶解：将50μg待检测的蛋白样品溶于8.34μL含有尿素、DTT和NH4HC03的水溶液中，置于37℃水浴中还原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺溶液，放置暗处1h，进行烷基化，再加58.34μL NH4HCO3溶液稀释尿素，最后加入1μg胰蛋白酶，37℃保温反应16h，反应结束后，冷冻干燥成粉末备用；
所述含有尿素、DTT和NH4HCO3的水溶液中，含有尿素、DTT和NH4HCO3的水溶液中，尿素的浓度为8M，DTT的浓度为10mM，NH4HCO3的浓度为50mM；
所述碘乙酰胺溶液中碘乙酰胺的浓度为0.5M；
所述NH4HCO3溶液的浓度为50mM；
(2)液相色谱检测：对上述蛋白的酶解产物进行液相色谱检测，蛋白酶解产物的进样量不低于100ng(进样时，进样浓度范围为0.1mg/mL～5mg/mL)，液相的梯度条件为：0-5min，B相保持5％；5-45min，B相从5％升至45％；45-50min，B相从45％升至95％；50-55min，B相从95％降至5％，柱后平衡10min；流速为0.2-0.6mL/min；
(3)定性检测：定性检测的肽段为：HLVDEPQNLIK，检测蛋白的酶解产物中是否含有该肽段，若有，则证明待检测的蛋白样品为牛血清白蛋白，若没有，则证明待检测的蛋白样品不是牛血清白蛋白；
(4)定量检测：定量检测的肽段为：ATEEQLK，检测蛋白的酶解产物中该肽段的浓度，通过以下公式计算得出牛血清白蛋白的浓度：在蛋白浓度为10μg/mL-500μg/mL的线性范围内，该肽段的浓度与丰度线性方程为：y＝51925x-491814，R2＝0.9991，其中，x：牛血清白蛋白的浓度，y：肽段ATEEQLK的丰度。
所述步骤(2)中，选用Agilent-1200色谱系统，流动相A为含0.1％(体积百分数)甲酸的水溶液，B为含0.1％(体积百分数)甲酸的乙腈溶液；分析柱为Agilent Poroshell 120SB-C18色谱柱，规格为3.0mm×150mm，粒径2.7μm。
所述步骤(3)、(4)中，检测肽段所用的质谱条件为：离子源：ESI源，采用正离子模式检测，四极杆温度：100℃，毛细管电压：4000V，雾化压力：40 psig，Fragmentor：175V，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，扫描模式：Scan，质量扫描范围200-2000m/z。
本方法的方法操作简单，检测快速，成本较低，且专一性强，可用于已知蛋白的定性、定量检测。
附图说明
图1为液相条件与肽段匹配率、肽段匹配数的关系示意图，其中，A：液相条件与肽段匹配率的关系示意图；B：液相条件与肽段匹配数的关系示意图。
图2为液相的流速与混合蛋白肽段匹配率的关系示意图。
图3为液相的流速与肽段丰度的关系示意图，其中，A：BSA酶解的肽段质量数；B：Mb酶解的肽段质量数；C：Cyt.C酶解的肽段质量数。
图4为蛋白浓度与肽段匹配率关系示意图。
图5为ATEEQLK的浓度与丰度线性关系示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1.1实验方法
1.1.1色谱条件
Agilent-1200色谱系统，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，B为含0.1％甲酸的乙腈溶液。分析柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱，规格为3.0mm×150mm，粒径2.7μm。
1.1.2质谱条件
离子源：ESI源，采用正离子模式检测，四极杆温度：100℃，毛细管电压：4000 V,雾化压力：40 psig，Fragmentor：175V，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，扫描模式：Scan，质量扫描范围200-2000m/z。
1.1.3样品蛋白的酶解方法
每50μg蛋白样品溶于8.34μL含有尿素(8M)，DTT(10mM)，NH4HCO3(50mM)溶液中，置37℃水浴中还原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺(0.5M)放置暗处1h进行烷基化，加58.34μL NH4HCO3(50mM)溶液稀释尿素，最后加入1μg(1∶50)的胰蛋白酶37℃保温反应16h，反应结束后，冷冻干燥成粉末备用。
11.4液相条件的摸索
酶解蛋白的液相分离程度直接影响蛋白的检测结果，因此首先对液相条件如梯度洗脱条件，液相流速条件进行优化。进样20μL含100μg/mL的BSA，Mb和Cyt.C的混合蛋白酶解物，根据质谱检测得到的肽段匹配率及肽段响应值，筛选合适的液相梯度及流速条件。
11.5数据处理方法的优化
酶解蛋白样品的数据处理使用的是Masshunter数据定量分析软件(安捷伦公司)，在进行分子特征峰提取之前，利用空白样品的检测数据对主要的提取参数-“提取基峰高度”进行优化，这样可以提高数据检测的准确性，避免假阳性的结果。
11.6方法重现性及检测限的摸索
为了验证非标记蛋白定量检测方法的重现性，连续进样四次10μg胰蛋白酶解的牛血清白蛋白，并选择肽段中响应相对较高的肽段，对其检测的肽段响应值的重现性进行考察。除此之外，分别进样检测1ng，10ng，20ng，100ng，200ng，500ng的BSA蛋白酶解样品，考察方法的检测限。
1.1.7特异性肽段的筛选
分析数据寻找可用于蛋白定性定量检测的特异性肽段。
1.1.8方法回收率的考察
将200μg/mL的牛血清白蛋白与200μg/mL肌红蛋白和200μg/mL细胞色素C蛋白等体积混合酶解，进样20μL蛋白混合样品，经四级杆串联飞行时间质谱检测后，考察检测方法的回收率。
2.结果与讨论
2.1液相梯度条件及流速的优化
实验中选择了四种不同的液相梯度条件对20μL含100μg/mL的BSA，Mb和Cyt.C酶解物进行分析，通过结果分析可以看出(如表1和图1所示)，四种液相分离条件对混合蛋白酶解后肽段的匹配数影响不是很大，但是对肽段匹配率略有影响，最终确定液相的梯度条件为：0-5min，B相保持5％；5-45min，B相从5％升至45％；45-50min，B相从45％升至95％；50-55min，B相从95％将至5％，柱后平衡10min。
表1.四种液相梯度洗脱条件
利用混合蛋白检测到的肽段匹配率及匹配数为参考，优化液相梯度洗脱条件，检测结果如图1所示：从结果可以看出，四种液相分离条件对混合蛋白酶解后肽段的匹配数影响不是很大，但是对肽段匹配率略有影响，采用方法M-2时，肽段匹配率均达到最高值，因此，后期的实验采取M-2作为酶解后肽段液相梯度洗脱条件。
随后，分别考察在0.2mL/min，0.3mL/min，0.4mL/min，0.5mL/min，0.6mL/min的流速下，混合肽段的分析效果，如图2、图3所示。
从图2中可以看出，随着液相流速的增加，肽段匹配数逐渐减少，肽段的丰度也逐渐降低(如图3)，如果液相流速低于0.2mL/min，会增加梯度洗脱的时间，因此后续的实验中，选择流速为0.2mL/min。
2.2数据处理方法的优化
利用空白样品，对数据提取参数进行优化。采用安捷伦Masshunter定性分析数据处理软件提取峰高的方法提取分子特征，肽段质量数匹配精确度+/-10.00ppm，结果如表2所示。
表2空白样品设置不同参数进行数据提取得到的检测结果
从结果可以看出，针对空白样品，提取峰面积的高度＞3000时，提取出的杂质化合物为零，检测结果可信度较高。因此在数据处理时，应将提取峰高设置为＞3000，可避免一些假阳性的结果。
2.3方法重现性的考查
为了验证实验方法的重现性，重复进样10μg酶解的BSA样品四次，考查其中8个肽段峰面积的稳定性，实验结果如表4所示。从结果中可以看出，肽段峰面积的变异系数(C.V.)均在0.04以下，方法重现性好。
表3.所选肽段的信息
表4.重现性实验的结果.
2.4方法检测限的摸索
分别进样检测1ng，10ng，20ng，100ng，200ng，500ng的BSA蛋白酶解样品，考查方法的检测限，结果如表5所示。
表5
从结果可以看出，BSA蛋白的最低检测限为100ng。
2.5酶解蛋白的浓度与肽段匹配率的关系
分别将5μg，10μg，25μg，50μg，100μg，200μg，400μg，500μg的BSA蛋白酶解成肽段，经色谱质谱联用分析后，进行BSA肽段匹配率的数据分析，蛋白浓度与肽段匹配率成如
图4所示关系，线性方程为：y＝14.569Ln(x)-9.5883。
据图4可以看出，酶解蛋白的含量与肽段匹配率呈对数关系，可以根据蛋白的肽段匹配率，确定样品中蛋白的大体含量。
2.6可定量检测蛋白含量的肽段筛选
随后，从检测到的所有BSA的酶解肽段中筛选出八个丰度较高的肽段作为候选肽段，肽段信息如表3所示。通过分析10μg～500μg的蛋白样品的肽段的丰度信息，从中寻找可用于BSA蛋白定性、定量检测的特异性肽段。通过数据分析发现，肽段4：HLVDEPQNLIK在最低检测限时可以仍可以被检测到，且丰度较高，随后对其进行Swissprot数据库的检索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结果显示，此肽段为BSA专属性肽段，可用作BSA蛋白定性分析的特异性肽段。除此之外，蛋白浓度与肽段丰度的线性关系显示，在蛋白浓度为10μg/mL-500μg/mL的线性范围内，肽段1：ATEEQLK的浓度与丰度线性关系较好，线性方程为：y＝51925x-491814(R2＝0.9991)，如图5所示。此肽段被选作BSA蛋白定量检测的特异性肽段。
2.7方法回收率的考察
为了验证定量方法的准确性，将200μg BSA与200μg Cyt.C和200μg Mb蛋白混合，酶解后冷冻干燥，复溶成1mL进样检测。根据利用肽段1的丰度计算BSA的浓度，考查方法的回收率，所得的结果如表6所示。
表6.BSA的回收率.
三.技术效果
蛋白定量检测是目前生物定量检测的难点，近年来，基于质谱信息的非标记定量检测技术发展起来，并用于糖蛋白和磷酸化蛋白的检测中。在此，本发明以四级杆飞行时间质谱检测的蛋白肽段的一级质谱信息为基础，开发了一种简单、准确的的蛋白定性、定量检测方法，并用于牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的定性、定量检测中。实验首先对酶解肽段的液相分离条件，如梯度洗脱条件和流速，进行优化；然后进行蛋白标样的酶解检测，利用MassHunter定量软件对数据处理，优化数据处理过程中的设置参数；最终，从检测到的丰度较高的八个肽段中确定可用于BSA蛋白定性检测的肽段为：HLVDEPQNLIK，定量检测的肽段为：ATEEQLK，计算方法回收率为105.88％。本方法操作简单，检测快速，成本较低，且专一性强，可用于已知蛋白的定性、定量检测。
Claims (2)
1.一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）蛋白的酶解：将50μg待检测的蛋白样品溶于8.34μL含有尿素、DTT和NH4HCO3的水溶液中，置于37℃水浴中还原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺溶液，放置暗处1h，再加58.34μLNH4HCO3溶液，最后加入1μg胰蛋白酶，37℃保温反应16h，反应结束后，冷冻干燥成粉末备用；
所述含有尿素、DTT和NH4HCO3的水溶液中，尿素的浓度为8mol/L，DTT的浓度为10mmol/L，NH4HCO3的浓度为50m mol/L；
所述碘乙酰胺溶液中碘乙酰胺的浓度为0.5mol/L；
所述NH4HCO3溶液的浓度为50m mol/L；
（2）液相色谱检测：对上述蛋白的酶解产物进行液相色谱检测，蛋白酶解产物的进样量不低于100ng，选用Agilent-1200色谱系统，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，B为含0.1%甲酸的乙腈溶液；分析柱为Agilent Poroshell120SB-C18色谱柱，规格为3.0mm×150mm，粒径2.7μm；液相的梯度条件为：0-5min，B相保持5%；5-45min，B相从5%升至45%；45-50min，B相从45%升至95%；50-55min，B相从95%降至5%，柱后平衡10min；流速为0.2-0.6mL/min；
（3）定性检测：定性检测的肽段为：HLVDEPQNLIK，检测蛋白的酶解产物中是否含有该肽段，若有，则证明待检测的蛋白样品为牛血清白蛋白，若没有，则证明待检测的蛋白样品不是牛血清白蛋白；
（4）定量检测：定量检测的肽段为：ATEEQLK，检测蛋白的酶解产物中该肽段的浓度，通过以下公式计算得出牛血清白蛋白的浓度：在蛋白浓度为10μg/mL-500μg/mL的线性范围内，该肽段的浓度与丰度线性方程为：y=51925x-491814，R2=0.9991，其中，x：牛血清白蛋白的浓度，y：肽段ATEEQLK的丰度；
所述步骤（3）、（4）中，检测肽段所用的质谱条件为：离子源：ESI源，采用正离子模式检测，四极杆温度：100℃，毛细管电压：4000V，雾化压力：40psig,碎裂电压：175V，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，扫描模式：扫描，质量扫描范围200-2000m/z。
2.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中，流速为0.2mL/min。
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