CN111087442A - 一种多肽提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种多肽提取方法。本发明所述多肽提取物包含以下步骤：将待测血清加入磷酸溶液和乙腈溶液，混匀后离心取上清；在上清中加入乙腈溶液混匀，离心取上清浓缩至1‑50μl加水稀释；经疏水性固相萃取柱过滤，用甲醇清洗所述固相萃取柱，三氟乙酸与乙腈混合溶液进行洗脱并收集洗脱液。本发明所述方法可特异性获得分子量在800‑1500Da的多肽，回收率在90％以上，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种多肽提取方法。
背景技术
肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病，伴随着人类对自然的改造进程而产生的环境污染，更使得全球恶性肿瘤患者人数大大增加。而传统的治疗手段如手术、化疗、放疗这三大疗法由于缺乏靶向性，在治疗肿瘤的同时也大大的损害了机体的正常组织细胞，不能达到良好的抗肿瘤效果。
精准医疗由个性化医疗(personalized medicine)的概念进化而来。精准药物直接针对疾病主因的精确缺陷(precise defect)来抑制功能紊乱，甚至是恢复正常功能。精准医疗的目的就是为患者提供最有利的治疗。
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的精准医疗模式，是一种基于自身免疫的新型治疗方法，其运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发/增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。细胞治疗以自体体细胞治疗为主，分为主动特异性免疫治疗和被动免疫治疗两类。
细胞疗法的具体方法是通过科技手段将病人体内的单个核细胞提取出来，用特殊方法在患者体外将其培养成为树突状细胞(DC)，赋予其专杀肿瘤细胞的抗原信息，再使其数量成千万倍增多，成为专门攻击杀伤肿瘤细胞的“细胞导弹”。然后将这种负载抗原信息的DC细胞回输到患者体内，在患者体内形成大量针对肿瘤细胞的免疫杀伤细胞(CTL)，从而针对肿瘤细胞产生主动性和靶向性攻击，迅速准确地杀灭肿瘤细胞。
在进行细胞治疗的过程中，需要对T细胞或DC细胞活化，赋予其特异性消灭肿瘤细胞的抗原信息。抗原的提取及纯化是细胞治疗过程中不可缺少的步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性获得分子量在800-1500Da多肽的提取方法。
本发明所述组合物获得目的多肽收率可达90％以上。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种多肽提取方法，包含以下步骤：
步骤1：将待测血清加入磷酸溶液和乙腈溶液，混匀后离心取上清；
步骤2：在所述上清中加入乙腈溶液混匀，离心取上清浓缩至1-50μl后加水稀释；
步骤3：经疏水性固相萃取柱过滤，用甲醇清洗固相萃取柱，三氟乙酸与乙腈混合溶液进行洗脱并收集洗脱液。
待测血清经磷酸、乙腈溶液处理去除磷脂、脂肪和高峰度蛋白，后经固相萃取柱去除小分子干扰杂质，经溶液三氟乙酸与乙腈洗脱最终得到目标多肽。
作为优选，步骤1中血清、磷酸与乙腈的体积比为1:1-2:4-6。
作为优选，步骤2中乙腈:血清体积比为0.3-1:2，优选1:4；
作为优选，步骤2加水稀释200-1000倍；
作为优选，步骤3中甲醇为5％-10％的甲醇。
作为优选，步骤3所述疏水性固相萃取柱为Oasis Prime HLB固相萃取柱。
作为优选，步骤3所述三氟乙酸与乙腈混合溶液中三氟乙酸与乙腈体积比为0.1:40-0.1：70。
本发明所述提取方法获得的洗脱液经回收率测定结果显示，获得目的多肽收率为91.6％。洗脱液用于多肽的提取、富集、纯化等步骤，其处理后的产物用于临床体外检测，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1为样品A的液相色谱图；
图2为样品B的液相色谱图；
图3为阳性标准品的二级质谱图。
具体实施方式：
本发明公开了一种多肽提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1：
以1ml血清样本为例：(其中，溶液PR为磷酸溶液；溶液PP为乙腈溶液；溶液C为甲醇溶液；溶液E为三氟乙酸与乙腈混合溶液。)
1、1ml血清样本平均分成两份，每份500μl，盛放到2个2ml的EP管中，每个2ml的EP管依次加入500μl溶液PR，1ml溶液PP，混匀之后低温高速离心10min-20min。12000rpm，4℃ 离心15min
2、每管取上清，每个管当中的溶液(此时应为浑浊溶液)平均分成两份(每份大概910μl)，盛放到2ml的EP管中，此时应该为4管，每管加入500μl溶液PP，混匀后超声波震荡3min，之后12000rpm，4℃离心15min。
3、每管取上清，用真空离心浓缩仪旋蒸至每管剩余1-50μl，停止旋蒸，用12ml的三级水稀释，转移到15ml离心管中。
4、将15ml离心管中的样品经过疏水性固相萃取柱过滤，1ml 5％的甲醇溶液C清洗固相萃取柱，200μl溶液E进行洗脱并收集洗脱液，收集的洗脱液为最终所需。
实施例2：
以1ml血清样本为例：(其中，溶液PR为磷酸溶液；溶液PP为乙腈溶液；甲醇溶液；溶液E为三氟乙酸与乙腈混合溶液。)
1、1ml血清样本平均分成两份，每份500μl，盛放到2个EP管中，每个EP管依次加入500μl溶液PR，2ml溶液PP，混匀之后12000rpm，4℃离心15min。
2、每管取上清，平均分成两份，盛放到EP管中，每管加入500μl溶液PP，混匀后超声波震荡3min，之后低温高速离心10-20分钟。
3、每管取上清，用真空离心浓缩仪旋蒸大约3h，最后每管剩余1-50μl样品，停止旋蒸，用10ml水稀释，转移到15ml离心管中。
4、将15ml离心管中的样品经过Oasis Prime HLB固相萃取柱过滤，1ml 8％的甲醇溶液清洗固相萃取柱，170μl溶液E进行洗脱并收集洗脱液，收集的洗脱液为最终所需。
实施例3：回收率测定实验方法
1、样品A的制备：将500μL血清参照实施例1或实施例2的方法得到洗脱液，在其中加入阳性标准品A0532(多肽序列：AARANFLAL，分子量为931.58Da)溶液400μL(1mg/mL)，用纯水定容到1mL，得到样品A。
2、样品B的制备：将阳性标准品A0532(AARANFLAL，分子量为931.58Da)溶液400μL(1mg/mL)加入到同一来源的500μL血清中，混匀后参照实施例1或实施例2的方法得到洗脱液，用纯水定容到1mL得到样品B。
3、将样品A和B分别在液相色谱仪上检测分别得到峰面积Ma和Mb，回收率＝Mb/Ma*100％。检测方法如下:
色谱仪：Waters ACQUITY UPLC I-Class；
色谱柱：CORTECS UPLC C18，
1.6μm；2.1x 100mm(部件号186007095)；
柱温：50℃；
进样体积：2μL；
流速：0.4mL/min；
检测波长：214nm
流动相A：0.1％甲酸溶液；
流动相B：0.1％甲酸的乙腈溶液；
梯度：初始条件为10％的流动相B，流动相B在3.5min内增加至40％，再在4.0min内增加至90％，然后在0.5min内返回至10％。重新平衡系统0.5min。整个循环时间为5min。
4、液相检测结果：样品A的液相色谱图见图1，色谱峰面积Ma＝406328；样品B的液相色谱图见图2。阳性标准品A0532的二级质谱图见图3。质谱参数：Capillary(kV):2.5；Cone(V):30；DesolvationTemp(℃):550；Desolvation(L/hr):800；Cone(L/Hr):50；
色谱峰面积Mb＝372196。
回收率＝Mb/Ma*100％＝372196/406328*100％＝91.6％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种多肽提取方法，包含以下步骤：
步骤1：将待测血清加入磷酸溶液和乙腈溶液，混匀后离心取上清；
步骤2：在所述上清中加入乙腈溶液混匀，离心取上清浓缩至1-50μl后加水稀释；
步骤3：经疏水性固相萃取柱过滤，用甲醇清洗固相萃取柱，三氟乙酸与乙腈混合溶液进行洗脱并收集洗脱液。
2.根据权利要求1所述的多肽提取方法，其特征在于，步骤1中血清、磷酸与乙腈的体积比为1:1-2:4-6。
3.根据权利要求1所述的多肽提取方法，其特征在于，步骤2中乙腈:血清体积比为0.3-1:2，优选1:4。
4.根据权利要求1所述的多肽提取方法，其特征在于，步骤2加水稀释200-1000倍。
5.根据权利要求1所述的多肽提取方法，其特征在于，步骤3中甲醇浓度为5％-10％。
6.根据权利要求1所述的多肽提取方法，其特征在于，步骤3所述疏水性固相萃取柱为Oasis Prime HLB固相萃取柱。
7.根据权利要求1所述的多肽提取方法，其特征在于，步骤3所述三氟乙酸与乙腈混合溶液中三氟乙酸与乙腈体积比为0.1:40-0.1：70。
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| GR01 | Patent grant | ||
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