DK160288B - Fremgangsmaade til fremstilling af liposomer, til hvilke der er bundet biologisk aktive substanser - Google Patents

Description

DK 160288 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav 1's indledning angivne art til fremstilling af liposomer, til hvilke der er bundet biologisk aktive substanser .

5 I nutidens teknik udføres in vitro prøver i alminde lighed med biologisk aktive substanser bundet til en latex-bærer (Am. J. Med. 21, 888-892 (1956)). Latexbæreren er en speciel polymeriseret polystyrensuspension indeholdende polystyrenpartikler med passende størrelse. Det er velkendt at 10 styren, der er udgangsmaterialet for denne latexsuspension, har høj tilbøjelighed til autopolymerisation. Derfor skilles styrenmonomeren fra det i handelen gående styren ved destillation, og den vundne monomer underkastes polymerisation. Trods denne forholdsregel "ældes" suspensionen ved lag-15 ring, og når partiklerne når en given størrelse bliver reaktanten uegnet til udførelse, af udfældningsreaktioner (J.A.M. A., 168 (2), 180-181 (1958)). Dette skyldes sandsynligvis den kendsgerning af også den ud fra styren fremstillede latexsuspension bevarer tendensen til autopolymerisation.

20 De reaktanter som indeholder en latexbærer fremstil les i mindst to trin. I første trin fremstilles bæreren, og i næste trin adsorberes de biologisk aktive substanser dertil. Denne fremgangsmåde er forholdsvis besværlig og de dannede reaktanter kan kun bruges til prøver in vitro, da styren er 25 overordentlig skadelig for levende organismer.

Til prøver in vivo anvender man udstrakt Freund adju-vanser (Molecular Biology,13, Biochemistry and Biophysics, 1973, New York). Deres anvendelse er imidlertid selv under forsøgsbetingelser stærkt begrænset af bivirkninger, der gør 30 deres anvendelse i den humane terapi umulig. Til human terapi bruges hyppigt metalholdige adjuvanser (Molecular Biology, 13, Biochemistry and Biophysics, New York 1973) og immunstimulan-ter af saponintype, der imidlertid har indflydelse på blodbilledet (Acta vet. scand. 19, 7-40 (1978)).

35 For nylig har man forsøgt at bruge "liposoma" (i det følgende betegnet liposom) til binding af biologisk virksomme substanser før parenteral indgift (Proc. Nat. Acad. Sci., 72,

DK 160288 B

2 88-92 (1975)). Liposomer er partikler dannet ud fra cholesterol og et ikke-heterogent overfladeaktivt middel. Partiklerne dannes ved blanding af en opløsning af de to komponenter i kloroform og tilsætning af et passende middel til dannelse 5 af bindingerne, fx fosfatidylcholin. Kloroformfasen afdestilleres derefter til tørhed. På denne måde dannes der lipidlag på beholderens væg. Derefter tilsættes der en vandig opløsning af den biologisk aktive substans til den dannede film ( USA-patentskrift nr. 4.053.585). · Det kan ses at frem- 10 stillingen beror på en trinvis fremgangsmåde, og i ét trin kan der kun opnås en meget ringe mængde af produktet. Kornstørrelsen af de på denne måde fremstillede partikler varierer inden for et meget bredt område.

Fra tysk offentliggørei£esskrift nr. 26 43 641 kendes 15 der et antigent præparat indeholdende et antal mikrovesikler (der ifølge beskrivelsen kan være liposomer eller unilamella-re legemer), som indeholder et lipid-dobbeltlag til hvis ydre overflade der er bundet et antigent protein stammende fra en patogen organisme. Skriftet beskriver en fremgangsmåde som be-20 står i at man bevæger et lipid i et vandigt medium til dannelse af mikrovesiklerne og derefter bevæger de dannede mikrovesikler i nærværelse af det antigene protein, hvorved dette binder den ydre overflade af mikrovesiklernes lipid-dobbeltlag.

Der er således tale om en totrinsproces, hvor man først danner 25 liposomerne (eller andre former for mikrovesikler) og derefter binder det biologisk aktive materiale, nemlig det antigene protein, til dem. Skriftet nævner parentetisk, og iøvrigt også i et krav, at produktet kan dannes i ét trin, hvorved proteinet er til stede i det vandige medium med lipidet. Der er ingen 30 nærmere redegørelse for hvorledes det kan gennemføres, og konkret er kun totrinsprocessen beskrevet.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en veldefineret ettrinsproces af den indledningsvis angivne, og opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del 35 angivne. Herved opnås der et liposom-bærersystem, som har ensartet partikelstørrelse uden tendens til autopolymerisation, og som er foreneligt med levende organismer og er derfor lige velegnede til anvendelse in vivo og in vitro. Den kan bruges inden for

DK 160288 B

3 forskellige grene af immunologien og biologien, herunder human og veterinær terapi.

Det er selvsagt afgørende at bærerpartiklerne er i stand til at adsorbere molekylerne af de biologisk aktive 5 substanser. Der er er en yderligere fordring at dannelse af partiklerne og binding af de biologisk aktive stoffer sker i et enkelt trin og at produktet kan vindes i store mængder på økonomisk måde.

På basis af den nævnte kendte teknik er det over-10 raskende, at fremstillingen af bærerpartiklerne og binding af de biologisk aktive substanser dertil kan udføres i et enkelt reaktionstrin når fx cholesterol og et ikke-hetero-gent overfaldeaktivt middel, fx æglecithin, opløses i alkohol (ætanol); og de biologisk virksomme substanser, fx 15 en bakterie, et virus, cellefraktioner af bakterier eller metaboliter eller derivater deraf, forskellige hormoner eller haptener, med ringe immunogen aktivitet i sig selv, eller antibiotika, opløses i et vandigt elektrolytisk sytem; hvorpå den alkoholiske og vandige fase forenes.

20 De ved reaktionen dannede partikler kan fx fraskil les ved centrifugering eller dekantering, hvorpå produktet frysetørres og om ønsket steriliseres ved bestråling.

De vigtigste fordele ved den foreliggende fremgangsmåde kan summarisk gengives på følgende måde: 25 1. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres frem stillingen af partiklerne og binding af de biologisk aktive stoffer dertil i et enkelt reaktionstrin.

2. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres kontinuerligt og muliggøre partikelfremstillingen også i stor 30 målestok.

3. Partiklerne dannes ud fra stoffer som er forenelige med den levende organisme.

4. Fremgangsmåden er økonomisk.

5. Ved den foreliggende fremgangsmåde opnås der hid- 35 til ukendte systemer som kan bruges til hurtige immunodiagnosti-ske undersøgelser in vitro, fx a) diagnostika til hurtig, kvantitativ bestemmelse af rheumatoid arthritis,

DK 160288 B

4 b) en lang række forskellige andre reagenser til hurtige immunodiagnostiske undersøgelser kan fremstilles.

6. En vigtig fordel ved de under punkt 5 nævnte immuno-diagnostiske reagenser består i at reaktionen kan udføres som 5 en dråbeprøve og resultatet bedømmes på nogle få minutter.

7. Da bærerens partikler ikke indeholder stoffer som er uforenelige med den levende organisme, egner disse sig til indførelse af de adsorberede biologiske aktive substanser i den levende organisme, og 10 a) i tilfælde af aktiv immunisering med et virus er de i stand til at forøge antigeniciteten af levende, in-aktiverede og desintegrerede vira; b) i tilfælde af aktiv immunisering med bakterie er de i stand til at stimulere immuniseringen med inaktiverede, 15 desintegrerede bakterier, bakteriefraktioner og stofskifteprodukter af bakterier; c) i tilfælde af immunisering med svampefraktioner udøver de en betydelig stimulerende aktivitet.

8. Ved anvendelse af den foreliggende fremgangsmåde 20 kan der opnås forøget immunrespons i den levende organisme på grund af bindingerne til liposompartiklerne. Således er det omhandlede partikelsystem egnet til at inducere en adju-vanseffekt (fx haptener, hormoner, enzymer og histamin). En betydningsfuld fordel ved parenteral injektion udført med 25 partikler fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i at injektionen ikke inducerer nogen uønskede forandringer, hverken på injektionsstedet eller i andre af organismens dele. Substansen adsorberes helt og holdent og har ingen bivirkninger.

30 9. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der også til liposomerne adsorberes biologisk aktive substanser som ellers elimineres forholdsvis hurtigt fra den levende organisme på grund af deres ringe molekylstrørrelse (fx antibiotika og forskellige kemoterapeutika), og på denne måde kan eliminatio- 35 nen deraf gøres væsentligt langsommere, hvilket medfører en forlænget virkning.

DK 160288 5

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses i det følgende ved et eksempel. Ved udførelse af fremgangsmåden blandes den alkoholiske fase med den vandige fase i et rumfangsforhold på 1:1000 til 9:1. På denne måde opnås der en optimal mængde par-5 tikler med optimal størrelse, og herved bliver partiklernes adsorptionskapacitet overfor biologisk aktive substanser ideelle.

Eksempel 10

Gamma-glubilinreagens bundet til partikler dannet af lipid-opløselige substanser a) Reaktionen udføres i et på tegningen vist apparat. To 15 beholdere 1 og 2 i apparatet fyldes op. I beholderen 1 indfyldes der en opløsning af lecithin og cholesterol i absolut ætanol. I beholeren 2 indfyldes der en vandig elektrolytopløsning indeholdende den biologisk aktive substans. Efter igangsætning af en omrører 3 udhældes, dryppes eller sprøjtes 20 indholdet fra beholderne 1 og 2 i en omrøringsbeholder 4. Efter omrøring ved 50 opm i 1 minut indføres den i blandebehol-deren 4 dannede suspension gennem et rør 5 i en opsamlingsbeholder 6. I opsamlingsbeholderen 6 fortsættes reaktionen under omrøring i sammenlagt mindst ét minut indtil der er vundet den 25 ønskede mængde partikelsuspension. Der inkuberes ved 37°C i 5 til 10 minutter. Derefter centrifugeres suspensionen med en hastighed på 6000 opm i 30 minutter, hvorefter bundfaldet dekanteres. Det dannede bundfald optages i destilleret vand, homogeniseres omhyggeligt og frysetørres efter opdeling i 30 passende portioner. Det frysetørrede produkt steriliseres ved bestråling.

b) Der fremstilles 2 1 af en 0,25% opløsning af gammaglobulin i en puffer med pH 6. Samtidig fremstilles der en opløsning af lipidopløselige substanser i absolut alkohol, 35 indeholdende 0,01 til 0,6% æglecithin og 0,1 til 2% cholesterol. Opløsningerne sammenblandes og viderebehandles som beskrevet ovenfor.

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af liposomer på basis af lipidopløselige stoffer, til hvilke liposomer 5 der er bundet biologisk aktive substanser, fortrinsvis udvalgt blandt levende inaktiverede eller desintegrerede viruspartikler, inaktiverede og desintegrerede bakterier, bakteriefraktioner, metabolitter og derivater deraf, cellefraktioner af svampe, cellefraktioner af protozoer, im-10 munoglobuliner, hormoner, histamin eller derivater deraf, antibiotika og/eller kemoterapeutika, kendetegnet ved at man blander en opløsning af det lipidopløselige stof og et egnet overfladeaktivt stof i et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis ætanol, med en opløs-15 ning eller suspension af den biologisk aktive substans i vand eller en vandig elektrolyt med pH 2-10, i et rumfangsforhold 1:1000 - 9:1, omrører reaktionsblandingen i mindst et minut, lader den henstå i højst 7 døgn og fraskiller de fra opløsningen udfældede partikler, hvorpå 20 man om ønsket på i og for sig kendt måde frysetørrer det dannede produkt og om ønsket steriliserer det ved bestråling.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som lipidopløselig substans bruges ægleci- 25 thin eller cholesterol.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at partiklerne fraskilles ved centrifugering. 30