SE453537B - Sett att framstella blandningar innehallande partiklar av lipoidlosliga substanser och vid dessa bundna biologiskt aktiva substanser - Google Patents

Description

453 537 and Biophysics, 1973, New York) och immnnstimulantia av saponintyp, som har inverkan på blodbilden (Acta vet, scand. lg, 7-40 (1978)).

Nyligen har man försökt använda liposomer för bindning av biologiskt aktiva substanser för parenteral administration (Prcc. Nat. Acat. Sci. lg, 88-92 (1975)). Liposomer är partiklar som bildats av kolesterol och ett icke-heterogent ytaktivt medel. Partiklarna framställes genom sammanbland- ning av en lösning av de båda komponenterna i kloroíorm och tillsats av ett lämpligt bindemedel, exempelvis fosfat- idylkolin. Klcroformfasen avdestilleras därefter och man erhåller som indunstningsåterstod på behâllarens inre yta ett lipidskikt, till vilket man sätter en vattenlösning av den biologiskt aktiva substansen (GB-PA 28 131/74).

Metoden är som synes stegvis och man kan i ett steg endast erhålla en mycket ringa mängd av produkten. Storleken hos de så erhållna partiklarna varierar inom vida gränser.

Enligt förevarande uppfinning tillhandahâlles ett nytt sätt fritt från nackdelarna som vidlâder framställningen av ovan nämnda adjnvantia och användbart såväl in vivo som in vitro.

Den vid sättet enligt uppfinningen använda bäraren har icke benägenhet att undergå självpolymerisation, är för-. enlig med den levande organismen och följaktligen lika lämplig för användning in vivo som in vitro. Den kan an- vändas inom olika immunologi- och biologigrenar, bl.a. inom human- och veterinärterapin.

Det är givetvis väsentligt att den enligt uppfinningen an- vända bârarens partiklar skall kunna adsorbera de biolo- giskt aktiva snbstansernas molekyler. Ett annat krav är att framställningen av partiklarna oëh bindningen av de biologiskt aktiva snbstanserna kan genomföras i ett enda 453 557 steg och att produkten kan framställas på ekonomiskt sätt i stora mängder.

Det har vid de arbeten som ligger till grund för förevarande uppfinning helt överraskande visat sig, att framställning av bärarpartiklar och bindning av biologiskt aktiva sub- stanser kan åstadkommas i ett enda reaktionssteg, exempel- vis när kolesterol och ett icke-heterogent ytaktivt medel, exempelvis lecitin, löses i alkohol. De biologiskt aktiva substanserna, exempelvis en bakterie, ett virus, cellfrag- ment av bakterier eller metaboliter eller derivat därav, olika hormoner, heptener som i och för sig har dålig immu- nogen aktivitet eller antibiotika, löses i ett vattenhaltigt elektrolytsystem. Alkoholfasen kombineras med vattenfasen.

Alternativt kan framställningen genomföras í två steg. Eär- vid löses de partikeïbildande substanserna i alkoholfasen och elektrolytfasen tillsättes för åstadkommande av s.k. tomma partiklar. Dessa partiklar kan binda biologiskt akti- va substanser.

Den på något av dessa båda sätt erhållna'suspensionen centrifugeras, dekanteras och fällningen suspenderas i vatten eller i en vattenhaltig elektrolytlösníng, vilken därefter utsättes för behandling med ultraljud. Produkten förvaras i lyofiliserad eller nedkyld form. Lyofilisatet steriliseras genom bestrålning.

Uppfinningen avser närmare bestämt ett sätt att framställa blandningar innehållande partiklar av lípoidlösliga sub- stanser och vid dessa bundna biologiskt aktiva substanser, varvid sättet utmärkas av att en i alkohol eller annat lämp- ligt organiskt lösningsmedel löst lipoidpartikel-bildande substans innehållande ett ytaktivt medel blandas med (a) en biologiskt aktiv substans upptagen i vatten eller 453 537 i en vattenhaltig elektrolyt med pH 2-10, i ett volymför- hållande av l:lO00-9:1, reaktionsblandningen omröres i minst 1 minut och därefter får stå i högst 7 dagar, var- på de utfällda partiklarna avskiljes från lösningen; eller (b) vatten eller en vattenhaltig elektrolytlösning i ett volymförhållande av l:l000-9:1, de utfällda partiklarna isoleras och sättes till en biologiskt aktiv substans upp- tagen i vatten eller i en vattenhaltig elektrolytlösning med pH 2-l0, varpå den så erhållna lösningen omröres i minst två minuter och får stå i högst 7 dagar, och de bildade partiklarna isoleras, och den på så sätt som an~ gives under (a) eller (b) här ovan erhållna produkten eventuellt lyofiliseras och steriliseras genom bestrâlning.

De viktigaste fördelarna med uppfinningen kan sammanfattas på följande sätt: 1. Genom förfarandet enligt förevarande uppfinning kan framställningen av partiklarna och bindningen av de bio- logiskt aktiva substanserna om så önskas genomföras i ett enda reaktionssteg. 2. Förfarandet enligt uppfinningen kan genomföras kontinu- erligt och möjliggör framställning av partiklar också i stor skala. 3. Partiklarna framställes av substanser som är förenliga med den levande organismen. 4. Förfarandet är ekonomiskt (se även l. onn 2. när ovan). 5. Genom förfarandet enligt uppfinningen kan nya sjscer framställas i start urval: Dessa kan användas fo immnnodiagnsstiska undersökningar in vitrs, exempelvis sy diagnostik för snabb kvantitativ bsstanning av 453 537 reumatoid artrit, och b) för-framställning av andra reaktionskomponenter för snabba immunodiagnostiska undersökningar. 6. En viktig fördel med de immunodiagnostiska reaktions- komponenterna, som antydes under 5. här ovan, består i att reaktionen kan genomföras som ett dropprov och resul- tatet kan utvärderas på några få minuter. 7. Enär bärarpartiklarna icke innehåller substanser som är oförenliga med den levande organismen, är de lämpliga för införing av de adsorberade, biologiskt aktiva substan- serna i den levande organismen; a) vid aktiv immunisering med virus kan de också öka antigenförmågan hos levande, inaktiverade och sönderdelade virus; b) vid aktiv immunisering med en bakterie kan de stimulera immuniseringen med inaktiverade, sönder- delade bakterier, bakteriefragment och metaboliter av bakterier; c) vid imunisering med fungusfragment utövar de en avsevärd stimulerande aktivitet. 8. Partiklarna framställda enligt förevarande uppfinning kan också adsorbera biologiskt aktiva substanser, som in- ducerar en mycket ringa immunrespons i den levande orga- nismen och på detta sätt kan den av dem inducerade immun- responsen väsentligt ökas. Partikelsystemet enligt uppfin- ningen är sålunda lämpligt för inducering av en adjuvant- effekt (exempelvis heptener, hormoner, enzymer, histamin).

En viktig fördel med parenteral injicering av partiklarna enligt uppfinningen består i att injektionen icke indu- cerar någon oönskad förändring vare sig vid injektions- stâllet eller i någon annan del av organismen. Substansen adsorberas fullständigt och har inga biverkningar. 455 537 9. Genom förfarandet enligt förevarande uppfinning kan man också adsorbera biologiskt aktiva substanser, som relativt snabbt elimineras ur den levande organismen tack vare det faktum, att deras molekyler är små (exempelvis antibiotika, olika kemoterapeutika etc.) och på detta sätt kan deras eliminering väsentligt bromsas, så att man erhåller en prolongerad effekt.

Ytterligare detaljer beträffande uppfinningen återfinnes i följande exempel, men uppfinningen är givetvis icke begränsad till de i exemplen angivna speciella åtgärderna och detaljerna. Vid genomförandet av förfarandet blandas den alkoholiska eller organiska fasen med den vattenhal- tiga fasen i volymförhållandet l:l000-9:1. På detta sätt erhålles optimal mängd partiklar med optimal storlek och därmed idealisk kapacitet för partiklarna beträffande * adsorbtion av biologiskt aktiva substanser.

Förfarínqsvaríant a.

Båda de i fig. 1 åskådliggjorda behållarna fylles. I be- hållaren l hälles en lösning av lecitín och kolesterol i absolut etanol. I behållaren 2 hälles en vattenhaltig elektrolytlösning innehållande den biologiskt aktiva sub- stansen- Sedan omröraren 3 igångsatts tappas, droppas eller sprutas innehållet i behållarna 1 och 2 i behållaren 4, i vilken omrörning sker. Efter omrörning med 50 varv per minut i 1 minut överföres suspensionen från omrörningsbe- hållaren 4 genom röret 5 till uppsamlingsbehållaren 6. I denna sistnämnda fortsättes omrörningen till dess att en önskad mängd partikelsuspension erhållits. Substansen in- kuberas vid 37°C i 5-10 minuter, varpå suspensionen centri- fugeras med 6000 varv per minut i 30 minuter. Därefter av- dekanteras fällningen och om direkt användning avses upp- tages den i en fysiologisk koksaltlösning, homogeniseras omsorgsfullt och underkastas ultrasonor behandling. Om 453 537 produkten skall förvaras upptages den erhållna fällningen i destillerat vatten, homogeniseras omsorgsfullt och lyo- filiseras efter portionering. Den lyofiliserade produkten steriliseras genom bestrålning.

Förfaringsvariant b.

Båda de i fig. 1 åskädliggjorda behållarna fylles. I be- hållaren l fylles en lösning av lecitin och kolesterol i absolut etanol. I behållaren 2 fylles en vattenhaltig elektrolytlösning. Sedan omröraren 3 igàngsatts hälles, droppas eller sprutas innehållet i behållaren 1 och 2 i den med omröraren försedda behållaren 4. Efter omrörning överföres suspensionen från omrörningsbehållaren 4 genom röret 5 till uppsamlingsbehållaren 6. I denna sistnämnda fortsättes omrörningen, till dess att en önskad¿mängd partikelsuspension erhållits.

Suspensionen centrifugeras med cirka 6000 varv per minut i 30 minuter, varpå den dekanteras. Om direkt användning är avsedd upptages den önskade biologiskt aktiva före- ningen i fysiologisk koksaltlösning och den erhållna fäll- ningen suspenderas i denna lösning, varpå den homogenise- ras och underkastas ultrasonor behandling. Om fällningen skall förvaras sättes till den erhållna fâllningen den biologiska föreningen, som dessförinnan upptagits i vatten eller i en vattenhaltig elektrolytlösning med pH 2-10, var- på blandningen omsorgsfullt homogeniseras, underkastas ultrasonor behandling, inkuberas vid 37°C i 5-10 minuter portioneras och lyofiliseras.

Exemnel 1 Framställnínq av heoatitantikroppar.

Levande och inaktiverat hepatitvirns adsorberades på ñartíklar genom tillsats av 109 virnspartiklar till en <,~ i , ff; \ ,, .w så Ä-v ¿< L 453 537 lvofiliserad partikelenhet framställd enligt förfarings- varianten b. Med den så erhållna immunsubstansen kan man uppnå högre antikroppsnivå än vad som hittills kunnat_upp- nås.

Exempel 2 Inaktiverat mvxomatosvirusvaccins skvddsverkan.

Hittills har endast vacciner framställda av levande virus visat sig skydda gentemot detta virus. Pâ kaniner injicie- rades inaktiverat myxomatosvirus innehållande 108 virus- partiklar/ml. På kaniner injicierades subkutant 1 ml vaccin adsorberat på 1 partikelenhet framställd enligt förfarings- variant b. 30 dagar efter injicieringen visade de utvärde- rade resultaten att vaccinet framställt och använt på detta sätt gav fullt skydd till och med gentemot levande virus representerande 100 infektiva doser under kontroll- försöken. När partikelenheten framställts enligt förfarings- varianten a) gav antikroppsnivån fullt skydd gentemot 10 infektiva doser.

Exempel 3 Immunitet gentemot treponematos.

Av sönderdelade celler av stammen treponema pallidum Buda- pest (10 /ml) framställdes antigen genom behandling med ultraljud och det sä erhållna antigenet adsorberades på två enheter lyofiliserade partiklar per milliliter, vilka framställts enligt förfaringsvarianten b. På försöksdjur injicierades en gång i veckan och sammanlagt sex gånger med användning av 1 ml antigeninneháll intramuskulärt, intravenöst och subkutant. Hos på detta sätt behandlade försöksdjuren fastställdes en hög halt specifika anti- kroppar och immunitet gentemot schanker. 453 537 Exempel 4 V Lmmunitet gentemgt stelkramn.

I 1 s l a) En enhetsmängd av partiklar framställda enligt förfaringsvariant b) försattes med en enhetsmängd teta- nustoxoid. Substansen lyofiliserades. Före användningen suspenderades substansen i en fysiologisk koksaltlösning svarande mot dess ursprungliga volym. Aktiviteten provades enligt den metod som beskrives i British Pharmacopeae, U.S. Pharmacopeae och Pharmacopeae flungaricae VI på mar- svin. Det kunde klart fastställas, att de immunologiska egenskaperna hos substansen gentemot tetanus är väsent- ligt bättre än den immunologiska effekt som erfordras enligt föreskrifterna.

Prov genomfördes också med ett vaccin framställt enligt förfaringsvariant a). Samma resultat som ovan angives erhölls. b) Vid en enhetsmängd partiklar framställda enligt förfaringsvariant b) adsorberades olika mängder tetanus- toxoid. Substansen lyofiliserades, varpå den upptogs i en fysiologisk koksaltlösning svarande mot volymen före lyofi~ liseringen. Aktiviteten provades på marsvin på ovan angi- vet sätt. Den specifika antigeneffekten visade sig vara bättre än den föreskrivna och stod i överensstämmelse med dosresponslagen. c) Till olika mängder partiklar framställda enligt förfaringsvarianten b) sattes inbördes lika stora mängder tetanustoxoid. Efter lyofilisering upptogs den erhållna substansen i en fysiologisk koksaltlösning svarande mot volymen före lyofiliseringen. Prov genomfördes på marsvin på ovan angivet sätt och visade klart bättre antigeneffekt än den som föreskrives i vart enskilt fall. wmwfli. 453 537 10 Exempel 5 Immuníserina med kombinerade bakterieantiqen.

Vid en enhetsmängd partiklar framställda enligt förfarings- varianten b) adsorberades en kombination av tetanus-, difteria- och bakterieantigen. Efter lyofilisering suspen- derades substansen i sin ursprungliga volym och aktiviteten hos antigenkomponenterna provades på marsvin respektive vita möss enligt de Pharmacopeae metoder, vartill hänvisas i exempel 4. Antigenaktiviteten visade sig vara densamma eller högre än den föreskrivna.

Exempel 6 Framställning av anti-chloriogonadotropin - immnnserum (HCG) För framställning av antihormonmodell genomfördes prov med humant chloriogonadotropin (HCG). Denna traditionellt svaga immunogena substans adjuveras konventionellt med en oljeadjuvans enligt Freund. 3000 E/mg HCG adsorberades på en partikelenhet som framställts enligt förfaringsvariant b). Det så framställda vaccinet injicierades subkutant på kaniner (NZW) som vardera hade kroppsvikt 2,5 kg. Injicie- ringen genomfördes varannan vecka. Efter den sjunde injek- tionen hade anti-HCG-antikroppnivån överträffat antikropp- nivån som uppmättes i kontrollgruppen. Därefter injiciera- des på försöksdjuren i kontrollgruppen samma mängd HCG stimulerad med en adjuvans enligt Freund. Oönskade biverk- ningar observerades. Detta i motsats till vad fallet var med de försöksdjur som behandlats med partiklarna enligt uppfinningen, hos vilka inga biverkningar uppträdde.

Efter denna långa immuniseringsperiod avtappades försöks- djurens blod och autopsi genomfördes. Vid mikroskopisk och histologisk undersökning av lever, njurar och lungor fast- ställdes ínga patologiska förändringar. 453 537 ll Exemgel 7 Framställning av antihistaminserum. 2,7 mg detoxikerat histamin (p-amino-bensenazohistamin) adsorberades på 2 partikelenheter av en lyofiliserad bärare framställd enligt förfaringsvariant b). Med den så erhållna substansen immuniserades kaniner varannan dag.

Efter den tjugonde injektionen registrerades en hög halt av antihistaminantikroppar.

Exemgel 8 Framställning av gammaglobulinreagens bunden vid partikar framställda ur lipoidlösliga substanser.

Förfarinosvariant a) Man framställde 2 liter av en 0,25 % lösning av gammaglo- bulin i en buffert med pH 6. Samtidigt framställdes en lösning av lipoidlösliga substanser i absolut alkohol.

Denna innehöll 0,01-0,6 % ägglecitin och 0,1-2 % koleste- rol. Lösningarna blandades på sätt som angives i förfa- ringsvarianten a.

Den erhållna fällningen upptog i en fysiologisk elektrolyt- lösning (5 liter) som konventionellt används för utspäd- ning av blodserum, blandades och underkastades behandling med ultraljud för erhållande av ett för användning klart Iêagêllå _ __ Exemgel 9 Användning av gammaglobulinreagens bundet vid partiklar framställda av lipoidlösliga substanser för kvantitativ bestämning av reumatoidfaktor.

Reumatoidartrit belegsagas av immunkomplex, som reagerar med normala humanimmunoglobuliner. Deras detektion och / 453 557 12 diagnos av reumatoidartrit är för närvarande baserad på denna reaktion, som göres synlig exempelvis med använd- ning av latexpartiklar eller den mycket känsliga WAALER- ROSE-reaktionen.

Latexadjuvantssystemets egenskaper har ovan beskrivits i ingressen till förevarande beskrivning.

WAALER-ROSE-reaktionen är en passiv hemaglutinatíonsmetod, som är ganska omständlig och tar lång tid.

Blodserum uppsamlat från de för undersökning avsedda pati- enterna upphettas till 56°C i 30 minuter och förvaras vid +4°C till användningstillfället. Om möjligt användes nytt serum, men serum icke äldre än en vecka kan fortfarande användas.

Det serum som skall undersökas utspädes med fysiologisk koksaltlösning. En droppe (0,05 ml) appliceras på en glas- platta och till dropparna sättes svarande mot olika ut- spädningar portioner om vardera 0,01 ml av reaktionskompo- nenten innehållande gammaglobulin (exempel 8).

Reaktionens fortskridande övervakas sedan reaktionskompo- nenten satts till serum. Reaktionskomponenten skall givet- vis sättas till de utspädda serumdropparna så snart som möjligt, dropparna omröres omsorgsfullt med en glasstav och homogen samanblandning av de båda komponenterna gynnas genom oavbruten omrörning. Reaktionens fortskridande utvär- derades visuellt. Resultatet är "O" om efter en given tid, exempelvis 5 minuter, ingen agglutination skett. Aggluti- nationsgraden åskådliggöres med förkryssningar. Sålunda betecknas reaktionsgraden “++++“ om kraftig agglutination sker under provningstiden och vätskan mellan klumparna av agglutinerad fällning är klar. Bedömningen underlättas om man betraktar provet genom ett förstoringsglas. Ett kon- 453 537 13 *rollprov om 1 droppefysíologisk koksaltlösning användes för utspädning av serum och 0,01 ml avrreaktionskomponen- ten användes. I kontrollprovet sker ingen agglutineríng under provningstiden (S minuter).

Bíldníngen av míkroaggregat kan också övervakas míkrosko- E pískt. I så fall genomföres reaktionen på ett objektgïas och man använder objektiv 40 X och okular 7 X.

Proven kan också genomföras med koncentrerat, outspätt serum. Provet är positivt om agglutínation kan observeras inom loppet av en minut och negativt om ingen agglutína- tion sker under samma tid.

Provningsresultaten är sammanställda i följande tabell.

Tabell 1 Titer för lipoidpartiklar bundna vid gammaglobulin. titer för WAALER-ROSE-reaktion (ERT) Serumutspädning O, 52, 64, 128, 256, 512, IOEÅ, kgnçentrerat + ++++ ++++ ++++ +f++ ++++ ++f- 2 _ +++ ++++ +f+f ++++ ++++ ++f- # _ + ++ +++ ++++ ++f+ +ff- 8 - '+ + ++ +++ ++++ +ff- 15 _ _ + + +++ +++ -+-- _ 32 _ - - + *f vrf ~f- el; 1 a: t 1 1' f' TT* 128 - - - - - i- 3

Claims (3)

10 15 20 25 39 IW 453 557 PATENTKRAV

1. Sätt att framställa blandningar innehållande partik- lar av lípoídlösliga substanser och vid dessa bundna bio- logiskt aktiva substanser, k ä n n e t e c k n a t av att en i alkohol eller annat lämpligt organisk* lös- ningsmedel löst lipoidpartikel-bildande substans inne- hållande ett ytaktivt medel blandas med (a) en biologiskt aktiv substans upptagen l vatten eller i en vattenhaltig elektrolyt med pH 2-19, l ett volymför- hållande av ï:1000-9:1, reaktionsblandníngen omröres i minst 1 minut och därefter får stå i högst 7 åagal, var- på de utfällda partiklarna avskiljes från lösningen; el- ler (b) vatten eller en vattenhaltíg elektrolytlösning i ett volymförhållande av l:1üG0-9:1, de utfëllda partiklarna isoleras och sättes till en biologiskt aktiv substans upp- tagen i vatten eller i en vattennaltig elektrolytlösning med pH 2-10, varpå den så erhållna lösningen onröres l minst två minuter och får stå i högst 7 dagar, och de bildade partiklarna isoleras, och den på så sätt som an- gives under (a) eller (b) här ovan erhållna produkten eventuellt lyofiliseras och steriliseras genom bestrâl- ning.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att man som lipoidlöslig substans använder ägglecitin eller kolesterol.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att partiklarna avskiljes genom centrifugering.