SU1750689A1 - Способ получени полисахаридно-белковой вакцины против NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В - Google Patents

Abstract

Использование профилактика менинго кокковой инфекции, медицинска  биотехнологи . Сущность изобретени  вакцинный штамм культивируют в жидкой синтетиче ской питательной среде экспоненциальным отливно-доливчым методом К выросшей культуре добавл ют цетавлон до конечной концентрации 0,05-0 15% Выдерживают до образовани  осадка Преципитат отдел   ют центрифугированием и провод т экстра кцию цетавлонового комплекса хлористым кальцием Экстракты многократно обрабатывают этанолом На заключительном этапе экстрагированный комплекс обрабатывают ацетоном, стерилизуют и лиофильно высу шивают. Полученна  вакцина может быть использована дл  вакцинации людей без применени  адъюванта 7 табл сл

Description

Изобретение относитс  к медицине, в частности к способам получени  вакцин дл  профилактики менингококковой инфекции

Известен способ получени  вакцин против N. menlngltidis серогруппы В, включающий культивирование штамма в жидкой питательной среде, содержащей природное сырье (гидролизат казеина), в услови х аэрации , отделени  культуральной жидкости от бактериальной массы, добавление цетавлона к супернатанту, экстракцию полисахаридно- белкового комплекса хлористым кальцием, обработку этиловым спиртом с последующим отделением полученного комплекса центрифугированием , лиофилизацией, гельфильтра- цией в присутствии в препарате тиомерсала с последующим добавлением к фракции выход щей в свободном объеме дезоксихолата натри , стерилизацией через мембраны,

осаждением фильтрата этиловым спиртом, приготовлением целевого продукта - растворени  полисахаридно-белкоеого комп лекса в натрий-фосфатном буфере в 5%-ном растворе лактозы и А12(504)з

Состав питательной среды г/л

Фосфорнокислый

двузамещенный калий0230

L-глутаминова 

кислота00013

Цистеин

гидрохлорид0 130

Углекислый-кислый

натрий 0 842

Гидроксиметил-метил

глицин0716

Сернокислое железо

7-водное0 0028

Хлористый аммоний0 500

VJ

СЛ

о о

00

о

Сернокислый

калий0,048

Раствор хлористого кальци  0,0074%1мл

Гидролизат казеина0,020

1 Хлористый магний

6-водный0,107

Глюкоза7,500

Культивирование менингококка простое - неуправл емое. Цетавлон добавл етс  до концентрации 1%. Полиеахаридно- белковый комплекс обрабатывают дважды 3-м  объемами этанола. Полисахаридно- белковый комплекс подвергают гельфильт- рации на колонке с сефадексом CL-2B и собирают фракцию, вход щую в свободном объеме.

Недостатки известного способа: неуправл емое культивирование не позвол ет получать стандартный целевой продукт; необходимость включени  в питательную среду природного сырь  - гидролизата казеина, загр зн ющего препарат неме- нингококковыми макромолекул рными соединени ми; использование двух разных детергентов (цетавлон и дезоксихолат натри ), а также консерванта тиомерсала, от остатков которого нужно избавл тьс , как от вредной примеси; использование сложного и плохо воспроизводимого процесса гельфильтрации; низка  активность получаемого препарата и как следствие этого необходимость его введени  совместно с адъювантом (гидроокисью алюмини ) дл  индукции синтеза антикапсульных антител.

Таким образом, недостатками известного способа  вл етс  сложность и низка  активность вакцины.

Цель изобретени  - упрощение способа и повышение активности вакцины.

Цель достигаетс  тем, что культивирование провод т экспоненциальным отлив- но-доливным методом в жидкой синтетической питательной среде, содержащей L-глутамат натри , хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний 7- водный, фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный, цитрат натри  трехзаме- щенный, глюкозу - при следующем содержании компонентов, г/л:

L-глутамат

натри 1,300±0,100

L-цистеин

гидрохлорид0,030±0,010Хлористый

калий0,090±0,010

Хлористый

натрий6,000±1,000

0

0,060±0,010 1,250±0,010

2,500±0.200

0,500±0.100 1,600±0,200

Сернокислый магний 7-водный Хлористый аммоний Фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный Цитрат натри  трехзамещенный Глюкоза Дистиллированна  вода До 1,00 л Цетавлон добавл ют к выросшей культуре до конечной концентрации 0,05-0,15%, 5 выдерживают до образовани  осадка, аналогично приведенному выше способу провод т экстракцию хлористым кальцием, обработку спиртом осуществл ют, добавл   его в объеме 0,20-0.30 мл в течение 2-4 ч, 0 далее полученный надосадок повторно обрабатывают 0,75-0,85 объема спирта в течение 16-20 ч.

Пример 1. Приготовление синтетической питательной среды. 5 Суха  синтетическа  питательна  среда представл ет мелкодисперсный порошок белого цвета. Дл  приготовлени  1 л питательной среды взвешивают (11,75±0,10) г сухой питательной среды следующего со- 0 става, г/л;

L-глутамат

натри 1,30±0,100

L-цистеин гидрохлорид0 ,03 ±0,010 5 Хлорид кали  |0,09±0,010 Хлорид натри 6,00±1,000 Сернокислый магний 7-водный0,06±0,010 Хлорид аммони 1,25±0,010 0 Фосфорнокислый

двузамещенный натрий 12-водный2,50±0,200 Цитрат натри  трехзамещенный0 ,50±0,100 5 и раствор ют в 1,0 л дистиллированной воды, подогревают до полного растворени  всех компонентов, устанавливают рН 7,2-7,3 с помощью 30,0±1,0% HCf, фильтруют через батистовый фильтр и разливают мерно в емкости. 0 Питательную среду стерилизуют при 112±1 °С в течение 30±5 мин. После стерилизации добавл ют стерильный раствор 40±1% глюкозы из расчета 4,0±0.1 мл на 1,0 л питательной среды. В бутыли в стерильных услови х вставл ют сифоны, позвол ющие стерильно перекачивать питательную среду в ферментер. Приготовление посевной культуры. В стерильных услови х вскрывают ампулу с лиофильно высушенной культурой

5

менингококка штаммов № 125 или № 150. Пастеровской пипеткой внос т в ампулу (0,5±0,1) мл стерильного (0,85±0,01)% раствора хлорида натри  и полученную взвесь последовательно рассеивают на 3 чашки с 5 20% сывороточным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют при 37±0,5°С в течение 18-20 ч в эксикаторе со свечой. Выросшие колонии должны быть в S-форме, прозрачные с голубоватым оттенком, с ровными 10 кра ми и гладкой блест щей поверхностью, не более 2 мм в диаметре. В мазке, окрашенном по Граму в модификации Калины культура должна представл ть собой мелкие грамотрицательные диплококки. Вы- 15 росша  микробна  взвесь должна давать положительную реакцию агглютинации на стекле с коммерческой сывороткой N.meningltldls серогруппы В. Культуру, типичную по всем показател м, рассеивают 20 на 15 чашек или 3 матраца с 20%-ным сывороточным агаром Хоттингера, инкубируют при 37±0,5°С в течение 18-20 ч, смывают стерильным 0,85±0,01 %-ным раствором хлорида натри  и помещают в стерильную 25 колбу с сифоном и используют в качестве посевной культуры.

Культивирование в ферментере.

Посевную культуру, наход щуюс  в колбе с сифоном, присоедин ют к шлангу засе- 30 ва и с помощью резиновой груши через шланг со стерильным фильтром в ней создают избыточное давление, позвол ющее перелить содержимое колбы в ферментер. Выращивание культуры в синтетической пи- 35 тательной среде провод т при постепенном увеличении частоты вращени  мешалки от 70±10 об/мин в начале процесса до (200±10) об/мин в конце экспоненциальной фазы роста (к 7-8 ч роста). К 7-8 ч роста, т.е. 40 к концу экспоненциальной фазы, оптическа  плотность (ОД) достигает значений 1,5±0,2 ед. по показател м ФЭК-56М или 46±2 единиц мутности по стандарту оптической плотности ГИСК. В этот момент из фер- 45 ментера сливают половину объема культуры и доливают свежей питательной среды до прежнего объема. После долива питательной средой ОД становитс  равной 0,72 ±0,1 ед. или 23±2 единицы мутности по стандар- 50 ту оптической плотности ГИСК. Через 2±0,5 ч оптическа  плотность культуры достигает уровн , существовавшего до первого слива культуры. Вновь осуществл ют слив половины объема -культуры и долив свежей пита- 55 тельной средой до прежнего объема. Такие сливы-доливы производ т через каждые- 2,0±0,5 ч. Уровень растворенного в среде кислорода поддерживают на значени х

25±5% от полного насыщени . Слитую из ферментера культуру собирают в стекл нные сосуды.

Получение цетавлонового осадка.

К микробной культуре добавл ют свежеприготовленный 10±1%-ный раствор це- тавлона до конечной концентрации 0,10±0,05%. Культуру перемешивают вращением бутыли и оставл ют при 20-25°С на 2 ±0,1 ч. За это врем  полисэхаридно-белко- вый комплекс с цетавлоном выпадает в осадок , и одновременно происходит стерилизаци  культуры под воздействием цетавлона.

Получение полуфабриката вакцины.

Цетавлоновый осадок отдел ют центрифугированием при 4±2°С при 3000 ± 500 об/мин в течение 30±5 мин, промывают дистиллированной водой, при повторном центрифугировании . Осадок взвешивают и сохран ют при -20±2°С.

В дальнейшем осадок хорошо растирают , перенос т в химиче ский стакан и прибавл ют 1 моль/л раствор CaCl2 в соотношении 1:10. Экстракцию провод т в течение 30±5 мин при посто нном перемешивании на магнитной мешалке. Экстракт отдел ют центрифугированием при 6200±100 в течение 30±5 мин и сливают о чистый химический стакан. Повтор ют процесс экстракции, добавл   новую порцию раствора СаСЬ. Полученные экстракты объедин ют и добавл ют 96±1 % этанол до конечной концентрации 25 ±5%, перемешивают и оставл ют на 18-20 ч при 6±2°С. Выпавший осадок отдел ют на Центрифуге при 6200±100 в течение 30±5 мин и отбрасывают . К надосадочной жидкости добавл ют 96±1 % этанол до конечной концентрации 80±15%. Смесь перемешивают и оставл ют на 3±0,1 ч. Выпавший осадок отдел ют центрифугированием при 2600±100 в течение 30±5 мин. Этот осадок, представл ющий собой полуфабрикат вакцины , отмывают три раза 96±1% этанолом, 2 раза ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе над прокаленным CaCte.

Получение вакцины.

Готов т 0,2±0,05%-ный раствор полуфабриката в 1±0,1% апирогенном растворе лактозы. Дл  удалени  нерастворившихс  частиц раствор центрифугируют при 12000±1000 об/мин в течение 30±5 мин. Надосадочную жидкость собирают и подвергают стерилизующей фильтрации на фильтрах Milllpore с размером пор 0,45±0,01 мкм. Полученный стерильный раствор вакцины разливают по 1,0±0,1 мл в стерильные ампулы и лиофильно высушивают . Все эти работы провод т с соблюдением правил асептики

Характеристика вакцины. Вакцина представл ет собой природный комплекс группоспецифического полисахарида (В-полисахарида) и белков наружной мембраны менингококков серо- группы В. Препарат имеет вид рыхлого порошка белого цвета. Выпускаетс  в сухом виде в ампулах по 3-6 иммунизирующих доз в пересчете на группоспецифический В- полисахарид. Вакцина должна полностью раствор тьс  при добавлении (0,85 ±0,01)%- ного стерильного раствора хлорида натри  в течение 1 ±0,5 мин. Раствор должен представл ть бесцветную жидкость, опалесци- рующую, но без видимых включений и осадка. Остаточна  влажность готового продукта не более 2,5%. Одна иммунизирующа  доза содержит 85-105 мкг белка и 50-55 мкг сиаловых кислот. Отношение в готовой вакцине белок/полисахарид (1:0,6)- (1:0,7). Вакцина должна быть стерильной, не токсичной при испытании ее в тестах на мышах и морских свинках, апирогенной при внутривенном введении кроликам. Вакцина должна быть иммуногенной дл  мышей и вызывать нарастание в сыворотках иммунизированных мышей титров специфических В-антител, вы вл емых в РПГА.

В табл. 1 приведены основные характеристики менингококковой В-вакцины.

Как видно из табл. 1, полученна  по предлагаемому способу вакцина индуцирует образование антикапсульных антител в сыворотках мышей при однократной иммунизации в отсутствии адыовантэ, что не достигалось при использовании способа- прототипа.

Полученна  по предлагаемому способу вакцина проверена на люд х. Под наблюдением находилось 82 человека в возрасте 19-22 г., из которых 56 были вакцинированы подкожно однократно и 43 двукратно. Лица, входившие в контрольную группу, получали инъекции физиологического раствора. Кровь из локтевой вены брали до иммунизации , через 10-24 и 54 дн  после первой инъекции и спуст  30 дней после 2-ой инъекции препаратов, т.е. на 85-ый день после первой инъекции. Сыворотки отсасывали и исследовали в реакции пассивной гемагг- лютинации (РПГА), использу  в качестве ди- агностикума эритроциты человека с группой крови -(О), сенсибилизированные высокоочищенным капсульным полисахаридом менингококков группы В,

Как видно из табл. 2, двукратна  инъекци  разработанной вакцины с интервалом в

54 дн  обеспечивала интенсивную индукцию антикапсульных антител. При этом 4- кратное нарастание титра антител отмечено у 62,8±7,5% лиц, получивших 2 инъекции

вакцины. Естественное противоэпидимичи- вание обеспечивало аналогичный эффект лишь у существенно меньшего количества 20,8±8,5% лиц в контрольной группе (р 0,05).

Пример 2. Обоснование выбора фазы роста культуры менингококка.

Получение культуры в экспоненциальной фазе роста позвол ет сохран ть антигены в высокомолекул рном состо нии. Это

показано в следующих опытах, представленных в табл. 3.

Опыт 1. Культивирование менингококка штамма № 125 серогруппы В осуществл ли в ферментере экспоненциальным отливнодоливным способом, указанным выше в примере 1, различие состоит в том, что использовали модифицированную полусинтетическую питательную среду Коэн-Виллер. Из выращенных культур выдел ли группоспецифический полисахарид по методу Gotschllch C.E. (5) в модификации Кувакиной В.И.. Молекул рную массу полисахаридов определ ли методом гельфильтрации на Се- фарозе 4В. При анализе профил  элюции

этого препарата оказалось, что выход полисахарида до ,25 составил 61%.

Опыт 2. Штамм, питательна  среда, метод выделени  антигена и др. полностью соответствуют опыту 1. Отличие состоит в

том, что процесс культивировани  менингококка вели до начала стационарной роста. Все это повли ло на выход высокомолекул рного полисахарида (до Kd 0-25). Он со ста вил-46%.

Опыт 3. Он аналогичен опыту 1, отличие в том, что выращивание менингококка осуществл ли до поздней стационарной фазы роста. Выход В-полисахарида до ,25 составил -25%.

Таким образом видно, что по мере роста культуры количество высокомолекул рного компонента в препаратах В-полисахарида снижалось, что обосновывает целесообразность получени  культуры в экспоненциальной фазе роста, поскольку высокомолекул рный полисахарид более иммуногенен.

Пример 3. Обоснование использовани  синтетической питательной среды. Выращивание менингококка осуществл ли в двух средах: синтетической и полусинтетической - Коэн-Виллер способом, указанным в примере 1. Способ выделени  полисахаридно-белкового комплекса также аналогичен способу, указанному в примере

1. Сравнительный анализ выхода комплекса показал преимущества использовани  синтетической питательной среды.

В табл. 4 приведены данные, свидетельствующие о преимуществах использовани  синтетической среды при получении полуфабриката вакцины.

Пример 4. Определение оптимальной концентрации цетавлона.

Штамм, питательна  среда, выращива- ние менингококка, сбор культуры аналогичны примеру 1. Дл  определени  оптимальной концентрации цетавлона, добавл емого в культуру, использовали следующие растворы цетавлона - 0,01%-ный, 0,05%-ный, 0,10%-ный, 0,15%-ный, 0,50%- ный.

Втабл.5 приведены данные по обработке культуры разным количеством цетавлона, свидетельствующие о том, что 0,10±0,05%  вл етс  минимальной концентрацией цетавлона , обеспечивающей гибель менингококков и формирование осадка в течение 2 ч.

Пример 5. Определение оптимальных условий обработки этанолом дл  выделени  полисахаридно-белкового комплекса.

Штамм, питательна  среда, способ культивировани  менингококка, получение цетавлонового осадка, выделение из него экстракта аналогичны примеру 1. Дл  определени  оптимальных условий обработки этанолом полученных экстрактов использовали различные концентрации при однократной и двукратной обработке.

В табл. 6 приведены результаты определени  условий обработки этанолом, из которых следует (опыт 4), что предварительна  обработка экстракта (20±5)% этанолом с последующим удалением осадка значительно повышает растворимость препарата, и при этом не происходит потер  сиаловой кислоты (капсульного полисахарида).

Таким образом, предлагаемый способ обладает новизной, заключающейс  в ис- пользовании дл  получени  биомассы управл емого отливно-доливного экспоненциального способа культивировани  менингококка в синтетической питательной среде. Существенные отличи  заключаютс  в ис- пользовании дл  обработки цетавлоном цельной культуры, минимальных концентраций цетавлона (0,10±0,05%) и предварительном удалении из солевых полисахаридно-белковых экстрактов фрак- ций, осаждаемых 25% этанолом.

Положительный эффект состоит в значительном упрощении способа получени  противоменингококковой вакцины (табл. 7),

котора  в отличие от прототипа индуцирует синтез антикапсульных антител у животных в отсутствии адъюванта. Предложенный способ позволил получить препарат, у которого , в отличие от ранее предлагавшихс  препаратов, достоверно зарегистрирована способность к индукции антикапсульных антител у человека без применени  ионов металла.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  полисахаридно-бел- ковой вакцины против Nelsserla meningitldls серогруппы В, включающий культивирование штамма в услови х аэрации в жидкой синтетической питательной среде, содержащей L-цистеин гидрохлорид, глюкозу, хлористый аммоний и дистиллированную воду, сбор культуры, добавление цетавлона , отделение осадка, экстракцию полисахаридно-белкового комплекса хлористым кальцием, многократную обработку экстракта 96%-ным этиловым спиртом с последующим отделением полученного комплекса центрифугированием, стерилизацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа и повышени  активности вакцины, культивирование провод т экспоненциальным отливно-доливным методом в жидкой питательной среде, дополнительно содержащей L-глутамат натри , хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый магний се- миводный, фосфорнокислый двузамещен- ный натрий двенадцат йв одный и цитрат натри  трехзамещенный при следующем содержании компонентов, г/л:

   L-глутамат натри 1,2-1,4

   L-цистеин гидрОхлорид0 ,02-0,04

   Хлористый калий0,09-0,1

   Хлористый натрий5-7

   Сернокислый магний

   семиводный0,05-0,07

   Хлористый аммоний 1,24-1,26

   Фосфорнокислый

   двузамещенный

   натрий двенадцативодный2 ,3-2,7

   Цитрат натри  трехзамещенный0 ,4-0,6

   Глюкоза. 1,4-1,8

   Дистиллированна 

   водаДо 1л

   цетавлон добавл ют до конечной концентрации 0,05-0,15 об.%, обработку экстракта спиртом осуществл ют последовательно при объемном соотношении экстракта и спирта 1:0,2 - V0,3 соответственно, а затем - при объемном соотношении 1:0,75 - 1:0,85 соответственно в течение 16-20 ч

   Таблица 1

   аРа«терШйка п)рёпарата белково-полисахарйдной менингококковой В-вакцины

   ой W Достаточнй  дл  сенсибилизации эритроцитов в реакции рассивной гемагглютинации. .

   С-г тиет ич«еки значимо у«елиивмие по Ера (нени  с контрол«  при р «10.001

   Вли ние фазы роста культуры N meningitldls серо- группы В на выход высокомолекул рного полисахарида

   Сравнительный выход природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны N. menlngitidis серогруппы В штамма №125 при выращивании в ферментере до конца экспоненциальной фазы роста в различных жидких питательных средах.

   Определение оптимальной концентрации цетавлона

   Т а 6 л и ц л 3

   Таблица 4

   Таблица 5

   Определение оптимальных условий обработки этанолом

   Сравнение способа получени  полисахаридно-бе кового комплекса менингококка серогруппы В

   Приготовление препарата в стерильных услови х

   Синтез знтикапсульных антител в отсутствии адтиованта.

   до рН 8-9

   К раствору содержащему Нет 10 мкг комплекса добавл ют 0,01 М фосфат натри  до рН - 7,1 и 0,0001 М

   НетЕсть

   Таблица 6

   Т л блица 7