SU1003738A3

SU1003738A3 - Способ получени вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса

Info

Publication number: SU1003738A3
Application number: SU792854825A
Authority: SU
Inventors: Хайнц Франц; Кунц Кристиан; Фаума Йоханн; Шварц Отто
Original assignee: Иммуно Аг Фюр Хемиш-Медицинише Продукте (Фирма)
Priority date: 1978-12-22
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1983-03-07
Also published as: ATA922078A; CS223975B2; FR2444466A1; IT1126676B; BE880732A; GB2038179B; SE447789B; DE2950004A1; CH644271A5; FR2444466B1; YU42204B; GB2038179A; YU311779A; AT358167B; SU1318149A3; IT7928341A0; DE2950004C2; SE7910054L

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ТАЕЖНОГО ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО ЭНЦЕФАЛИТНОГО ВИРУСА

1

Изобретение относи гс к произвоц- вакцин.

Известен способ получени вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса путем культивировани вируса в культуре ткани или в суспензии эмбриональных клеток птиц с последующим от далением вируссоцержащей жидкости центрифугированием , инактивацией вируса и получением целевого тфодукта

Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты целевого прюдукта.

Целью изобретени вл етс повышение чистоты целевого продукта.

Поставленна цель достигаетс тем, что при осуществлении способа получени вакцины таежного весенне-летнего энце- фалитного вируса путем культивировани вируса в культуре ткани или в суспензии (эмбриональных клеток птиц, с последуют i шим отделением вируссоцержашей жидкое- i ти центрифугированием, инактивацией вируса и получением целевого продукта

вируссодержащую жидкость HHaKTHEHv формалином или бета-пропиолактоном, затем обрабатывают протаминсульфатсхл, очистку осуществл ют при непрерывном

5 центрифугировании с градиентом, плотности сахарозы от О до 5О%, отбирают фракции, имекщие поылиенную экстинкцию при 26О нм и соцеркашие частицы с константой седиментации в области .

10 2OOS и полученные фракции развоа т буферным раствором, преимущественно (фосфатным буферным раствором рН 7,6.

Кроме того, с целью стабилизации целевого продукта фракции развоа г

15 буферным раствором, содержащим О,1% человеческого альбумина. Способ осуществл ют спецующим образом .

20 Эмбриональные клетки кур суспенаи (руют в среде культуры клеток ТСМ 199 (Tissue CuCiure eй1uw 199), инфицируют вирусом и держат в суспензии при аэробных услови х при температуре в пре делах 25-38 0 в течение 1-5 аией. Затем клегки и осгагки клеток отаеп ют путем центрифугировани . Полученную суспензию вируса инакгивируют с поМошью формалина или |) -пропиолактона и послёэтого концентрируют путем ультра фильтрации. Стации инактивации и концен трировани можно также проводить в обратной последовательности. Суспензи нар ду с ТВЛЭ-вирусом содержит различные примеси, которые седиментируют частично быстрее или медленнее чем ТВЛЭ-вирус. Предпочтительно огцел ют быстрее сецимёнтирующие части путем осаждени с помощью протаминсульфата, прежде чем осуществл ют собственный непрерывный сгособ ультрацентрифугирова ни с распределением градиентов плотное ти. Способ, в частности, осуществл ют таким образом, что в роторе ультрацентр фуги, наполненном раствором буфера, целесообразно раствором фосфатного буфера , при 3000 оборотов в минуту полови на буферного раствора вытесн етс 50 йым раствором сахарозы, и образуетс благодар этому градиент плотности О-5О% сахарозы. После этого суспензии, содержащей вирус, дают стечь через рогор при скорости вращени ротора 35ООО оборотов в минуту со скоростью истечени предпочтительно 3 л/ч. При выбранных услови х больша часть вирусных частиц вхоаит в градиенты плотности. Как только весь материал прощел аппарат цен трифуги тют еще один час, причем одновременно дают протекать раствору фосфатного буфера. Затем осторожно про вод т ротор в состо ние Поко и содержимое его раздел ют на отдельнью фракции . После этого в каждой фракции опре- дел юг экстинкпню при ам и одновременно )гста авлнвают содержание са- харозы во фракции. Локализаци вируса в ;грааиенгах плотности делаетс возмож ной благодар его экстннкпйн при 26Онм Вирус св зываетс в области при соцержании сахарозы примерво 4О% и ливает здесь отчетливое увеличение эко т вкцни при 260 нм. Йа чертеже прецставленв диаграмма этой зависимости,от1огда ввдиа экстинжпи отдёльньЬсфракпкй по отношению к грв-« . диентам плотности. Градиент плотности раствора сахарозы составл ет 0-50%. Штрихпункт раа рива показывает распределение ахстинкции при 2 6О нм в oiW дельных фракци х. В области около 4О% сахарозы фракции 10, 11 & 12 имеют 373а4 повышенную, а фракци 11 максимальную экстинкцию. В этой фракции наход тс почти исключительно частицы вируса с константой седиментации 20О S без редиментируюших заметно быстрее или медленнее чем вирус примесей. Пик соответствует концентрации сахарозы 39%. Другой пик у фракции номер 25, соот ветствуюший концентрации сахарозы менее чем 1О%, указывает на наличие примесей которые отсасываютс . На диаграмме нагл дно показано относительное протектнвное действие (определенное в пр мом опыте зашиты ) отдельных фракций с помощью различной высоты колонн . Фракци 11, следовательно, имеет . самое высокое относительное защитное действие.. Собраннью содержащие вирус фракции теперь предпочтительно разбавл ют буфером , содержащим человеческий альбумин дл того, чтобы улучщить стабильность вирус-антигена, и затем обычным спосо . бом перерабатьюают далее в вакцины. Полученные вакцины имеют более высокую чистоту и лучше перенос тс человеком , чем препараты, изготовленные обыч-. ным способом. в таблице приведены сравнительные результаты переносимости препаратов, полученных известным и предложенным способами, причем в первой графе приведены реакции с вакцинами, изготовленными известным способом, а во вторсА графе - реакции с вакцинами, полученными предложенным способом. В случав прививок с помощью полученных согласно изобретению вакцин не метл наблюдатьс никакие нежелательные реакции - ни локальные, ни системные, ные реакции ни локальные, ни системные . Полученные согласно преаложенному способу вакцины отличаютс незначнтель«ым содержанием протеина, не принима ВО внимание добавленный человеческий альбумин. Это содержание протеина при равном антиген ом действии во много раз (по меньшей мере в 10) меньше, чем в случае до сих пор примен емых препаратов. Пример.. Суспензию эмбри)наль« ных клеток кур в ТОМ 199 (TDSSUEкультура-среда ) инфиоируют ТВЛЭ-вирусом . После выдержки в течение 4 сут при содержащую вирус сустюнзию собирают и центрвф;ггирова анем при ЗОООт в теченне 1б мин при 4ГС отдел ют клетки. 10 к полученной суспензии вируса прибаЕШЯЮТ формалин в гаком количестве, чтобы конечное раз вление составл ло 1:200О, и затем суспензию выдерживаю в течение 30 мин при 37 С и 48 ч при комнатной температуре. . Затем инактивирдаанную суспензию вируса смешивают с0,5 мг/л протаминсульфата и смесь выдерживают в течение ночи при С, Образовавшийс осадок отдел ют посредством центрифугировани при ЮОООГ в течение 30 мин при 4 С. Преаварительно обработанна указанном способом суспензи представл ет собой /исходный материал дл непрерывного ультрацентрифугировани в градиенте плотности. Суспензию вируса со скоростью потока 3 л/ч пропускают с помошью насоса через центрифугу, в которой в качестве сахаррзного градиента плотности соце| житс 0-5О% сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе при рН 7,6. Объем составл ет 4,5 л, врем ценГрифугировани 1,5 ч. После остановки центрифуги содержимое ротора выкачивают и при этом раздел ют на 16 фракций по 100 мл. Дл каждой отдельной фракции определ ют экстинкаию при 26О нм па спектрофотометре н уце ьную плотность на рефрактометре. При этом наблюдает384 распределение, показанное на диаграмме . Пиковые фракции 10,11 и 12 с концентрацией сахара около 40% объедин ют и разбавл ют до 1:10 фосфатным буферным солевым раствором при значении рН 7,6, в котором содержитс 0,1% человеческого альбумина. Защитную ахти ность полученного предложенным способом препарата определ ют в пр мом защитном опыте на мышах. Подвергаемый исследованию преп&рпт разбавл ют (1:3;1:97 1:27,- 1:81; 1:243) и смешивают с 0,2% гидроокиси алюмини примененной в качестве средства, усил ваюшего препарата. При примевении в каждом случае 0,2 мл указанных разбавленных растворов 2 раза с промежутком в 1 неделю подкожно иммунизируют по 1О мышей (весом примерно по 10 г). Через две последующие нецали . мышей инфицируют 1ОО-1000 ТВЛЭ-БИрусом и рассчитывают защитную доауиГуо по методу Рида и Мюнха после наблюдени в течение 3 недель. При этом защитную дозу Ь1) определ ют при разбавлении 1:30. Предложенный способ позв6л51ет повысить чистоту и стабильность вакцины таежного весенне-летнего энцeфaлитнo o . вируса.

Локальна

До 72 боль, %

До 64

ПоБьшденна

температура

тепа {объем).%..

37,

38-39 С

Вьш1е

36

25

19 14 4

1

Claims

Форм ул а изобретения

1. Способ получения вакцины таёжного весенне-летнего энцефалитного вируса путем культивирования вируса в культуре ткани или в суспензии эмбриональных клеток птиц, с последующим отделением вируссоцержашей жидкости центрифугированием, инактивацией вируса и получением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, вируссодержащую жидкость инактивируют формалином йли бета-пропиолакганом, затем обрабатывают протаминсульфатом, очистку осуществляют при непрерывном ценгрифугировании с градиентом плотности сахарозы

1003736 8 от О до 50%, отбирают фракции,, имеющие повышенную экстинкцию при 260 нм и содержащие частицы с константой седиментации в области 200S < и полученные фракции разводят буферным раствором, преимущественно фосфатным буферным ^раствором pH 7,6.
2. Способ по. п. ^отличающий с я гем, что, с целью стабилизации целевого продукта, фракции разводят .буферным раствором, содержащим 0,1% человеческого альбумина.