TW202216736A

TW202216736A - 用於生產水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原的方法

Info

Publication number: TW202216736A
Application number: TW110125003A
Authority: TW
Inventors: 李光倍; 金美淑; 林正愛; 鄭裕敏; 韓升烈; 金智淵; 柳知成
Original assignee: 南韓商綠十字股份有限公司
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2022-05-01
Also published as: AR122915A1; WO2022010213A1; BR112022026727A2; CN115777018A; JP7487858B2; US20230257718A1; EP4180521A1; KR102270048B1; JP2023533160A

Abstract

本發明相關於一種生產水痘帶狀皰疹病毒表面之蛋白抗原的方法。本發明之水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原之生產方法為一種能夠以高產率和高純度獲得水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原之有效生產方法。因此，該方法可用於生產水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原，用於作為預防或治療水痘或帶狀皰疹之疫苗組成物。

Description

用於生產水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原的方法

發明領域

本發明相關於一種生產水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原的方法。

發明背景

水痘帶狀皰疹病毒 (VZV) 為一種主要在兒童和青少年中引起水痘之病毒。一旦發生感染，VZV會在感覺根和顱神經節細胞中休眠數年，並在成年後免疫力下降時重新激活並引起帶狀皰疹。水痘具有高度傳染性；一旦發生感染，就會導致全身出現水泡狀皮疹，伴有發燒和不適。在大多數正常兒童中，水痘很少會發展為嚴重疾病並最終發展為自限性疾病。然而，眾所周知，許多水痘進展為嚴重症狀之病例發生在接受器官移植或化療之患者身上(Adriana Weinberg等人, J Infectious Diseases, 200(7):1068, 2009；Judith Breuer等人，Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.1394843)。

帶狀皰疹之初期症狀為全身性的酸痛和疼痛，如身體痛，或劇烈瘙癢、刺痛和灼痛感，帶有劇烈疼痛如被刀刺傷感。帶狀皰疹為一種幾天後會出現水皰之疾病，隨著皮膚病變之增加疼痛會增加，老年患者往往會抱怨更嚴重之疼痛。即使在帶狀皰疹治癒之情況下，也可能有神經痛的後遺症。眾所周知，在 60歲或以上之人中，神經痛可能會導致他們失眠，導致他們抱怨慢性疲勞，即使輕微接觸或摩擦也會導致他們感到劇烈疼痛，甚至導致憂鬱，儘管這種神經痛為在40歲或以下之成年人中相對罕見。

ZOSTAVAX (Merck & Co, Inc.) 為一種使用Oka 株生產之減毒活疫苗，已開發作為帶狀皰疹之預防性疫苗。該疫苗已在美國和韓國獲得有條件的核准和銷售，由於疫苗中含有大量病毒，其條件為僅用於50歲或以上之成年人，兒童或青少年不適用。最近，GlaxoSmithKline Biologicals SA開發出一種由病毒表面蛋白(gE)和佐劑組成之疫苗，用於50歲或以上之成年人，並在臨床試驗中證明具有預防功效(美國專利號 7,939,084)。

技術問題

因此，在能夠提高水痘帶狀皰疹病毒(VZV)表面蛋白(gE)抗原之生產力而不影響其免疫原性之方法進行研究之同時，本發明人發現一種能夠提高 VZV gE抗原生產力之培養和純化方法，因而完成本發明。 發明概要

在本發明之一態樣中，一種用於生產水痘帶狀皰疹病毒(VZV)表面蛋白(GE)抗原之方法，包含以下步驟：(a) 培養生產該VZV gE抗原之重組細胞株，以獲得培養物溶液；以及(b) 純化該培養物溶液。

該培養物溶液獲得步驟(a)包含以下步驟：(a-1)對該重組細胞株進行種子培養(seed culture)；以及(a-2) 對已進行種子培養之細胞株進行生產培養。

該培養物溶液純化步驟(b)包含以下步驟：進行陰離子交換層析法；進行疏水性交互作用層析法；將該培養物溶液以病毒去活化劑處理，以使病毒去活化；進行混合模式層析法；以及進行濃縮和過濾。 本發明較佳影響

本發明之水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原之生產方法為一種能夠以高產率和高純度獲得水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原之有效生產方法。因此，該方法可用於生產水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原，用於作為預防或治療水痘或帶狀皰疹之疫苗組成物。

較佳實施例之詳細說明

以下將詳細描述本發明。

一種用於生產水痘帶狀皰疹病毒(VZV)之表面蛋白(GE)抗原的方法，包含以下步驟：(a)培養生產該VZV gE抗原之重組細胞株，以獲得培養物溶液；以及(b)純化該培養物溶液。

在本發明中，該水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原較佳可為國際公開號WO 2019/225962 A1中揭示之水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原之一者。具體地，該水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原(MGgE)可為由SEQ ID NO：1代表之胺基酸序列組成之多肽，以及該多肽可由SEQ ID NO：2代表之核苷酸序列組成之基因編碼。

由SEQ ID NO: 1胺基酸序列代表之水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原，為水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原之變異體，其衍生自由SEQ ID NO: 3胺基酸序列代表之水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原，其中該抗原變異體包括水痘帶狀皰疹病毒表面蛋白抗原第537個胺基酸殘基之羧基末端截短之變異。

該第537個胺基酸殘基之羧基末端截短之變異，係指從胺基末端(N-末端)往羧基末端(C-末端)之方向上，第 1 至第 537 個胺基酸殘基仍留存，而自第538個胺基酸殘基起至羧基末端之連續胺基酸殘基被截斷。

產生VZV gE抗原之細胞株可為以VZV gE抗原之編碼基因轉型之細胞株，該基因由SEQ ID NO：2代表之核苷酸序列組成。該細胞株可具有包含VZV gE抗原編碼基因之表現載體。在本發明之一實施例中，該表現載體可為包括在韓國專利第1591823號中揭示之pMSID2載體。然而，對於表現載體，可使用任何載體而沒有限制，只要其適合轉染VZV gE抗原至細胞株內即可。

如本文所用，術語“載體”指稱一核酸時係指其包括可被引入宿主細胞以重組並插入宿主細胞之基因組中，或可作為附加體自發性複製之核苷酸序列。合適之表現載體包含表現調控元件，例如啟動子、起始密碼子、終止密碼子、聚腺苷酸化信號和增強子，以及用於膜靶向或分泌之信號序列或前導序列，並且可根據其目的而相異地產生。起始密碼子和終止密碼子必須在將編碼標靶蛋白之基因構建體投予個體時在個體中起作用，並且必須與編碼序列在同讀框內。

以本發明實施例之載體轉染或轉型之宿主細胞或非人類宿主個體，可為經該載體基因修飾之宿主細胞或非人類宿主個體。如本文所用，術語“經基因修飾”係指宿主細胞、非人類宿主個體、前代或親代，除其自身基因組外還包含本發明實施例之多核苷酸或載體，其已進入該宿主細胞、非人類宿主個體、前代或親代。此外，本發明實施例之多核苷酸或載體可存在於經基因修飾之宿主細胞或非人類宿主個體中，以獨立分子形式，特別是可複製分子，存在於其基因組之外，或者可穩定插入宿主細胞或非人類宿主個體之基因組中。

本發明之一實施例之宿主細胞為真核細胞。該真核細胞包含真菌細胞、植物細胞、或動物細胞。真菌細胞之範例可包含酵母，具體而言，為酵母屬(Saccharomyces sp.)之酵母，更具體地，為啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外，動物細胞之範例包括昆蟲細胞或哺乳動物細胞，以及動物細胞之具體範例包含HEK293、293T、NSO、CHO、MDCK、U2-OSHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、IMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A，和類似細胞。此外，在本領域中公知之合適細胞株可由細胞株保藏機構如美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得。

本發明之VZV gE抗原可在各種類型之生物體，如細菌、酵母菌、哺乳動物細胞、植物和基因轉殖動物中表現。較佳地，可就蛋白質治療劑之規範和所產生之蛋白質需要為類似於其天然形式之事實，使用哺乳動物細胞。哺乳動物細胞之範例包括不朽雜合瘤細胞、NS/ O骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、HeLa細胞、CapT細胞(人類羊水衍生細胞)、COS細胞和類似細胞。根據本發明之一實施例，CHO DG44細胞可使用作為哺乳動物細胞。

將本發明之表現載體導入上述細胞株，可使用本領域已知之技術，例如電穿孔、原生質體融合、磷酸鈣(CaPO ₄)沉澱和氯化鈣(CaCl ₂)沉澱。

具體地，該獲得培養物溶液之步驟(a)包含以下步驟：(a-1) 對該重組細胞株進行種子培養(seed culture)；以及(a-2) 對已進行種子培養之細胞株進行生產培養。

如本文所用，術語“種子培養”為旨在以大量獲得細胞株之培養。種子培養可在允許細胞數量最活躍地增加之溫度條件下進行。換言之，可進行種子培養而獲得具有特定細胞數量之細胞株。

如本文所用，術語“生產培養”係指用於生產重組蛋白之細胞株之大規模培養。

種子培養進行步驟(a-1)為該VZV gE抗原生產細胞株係藉由選自於由繼代培養、懸浮培養及其組合組成的群組之任一方法培養。例如，VZV gE抗原生產細胞株之種子培養可經由繼代培養和懸浮培養進行，其生產培養可經由懸浮培養進行。

如本文所用，術語“繼代培養”係指培養細胞株，同時將細胞株轉移到相同或不同之新鮮培養基(取決於培養週期)之方法。

在本發明之一實施例中，繼代培養可經由轉移和接種細胞株至相同新鮮培養基中而進行，間隔為1至7天、2至5天，或3至4天。於此，接種之細胞數可為但不限於2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL、3 × 10 ⁵細胞/mL至4 × 10 ⁵細胞/mL，或4 × 10 ⁵細胞/mL。另外，繼代培養之CO ₂濃度可為，但不限於，4.0%至6.0%、4.5%至5.5%，或5.0%。

如本文所用，術語“懸浮培養”係指其中細胞懸浮於培養溶液中之培養方法。可對即使在體內仍以懸浮狀態增殖之細胞進行懸浮培養，例如腹水中之血細胞或癌細胞，無需搖動或旋轉；然而，在大多數情況下，可經由旋轉攪拌葉片(攪拌培養)、搖動每一培養瓶(搖動培養)或旋轉培養器(旋轉培養)來進行懸浮培養。

在本發明之一實施例中，懸浮培養可在86 rpm至96 rpm、88 rpm至94 rpm或90 rpm至92 rpm之攪拌速度條件下進行；然而，攪拌速度不限於此。懸浮培養中接種之細胞數目可為但不限於2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL、3 × 10 ⁵細胞/mL至4 × 10 ⁵細胞/mL、或4 × 10 ⁵細胞/mL。此外，pH值可為pH 6.7至pH 7.1，或pH 6.8至pH 7.0。此外，溶氧濃度可為但不限於10%至90%、20%至80%或30%至60%。

在經由細胞培養，特別是動物細胞培養而生產重組蛋白之情況下，通常在適合細胞生長之溫度下進行培養，使得生產力隨著培養時間之延長而提高，之後在低於適合細胞生長之溫度進行培養，因而休止細胞分裂週期，從而達成重組蛋白生產之轉換(請參閱Enhancement of productivity of recombinant α-amidating enzyme by low temperature culture, Furukawa K et al., Cytotechnol, 1999, Vol. 31, 85 to 94; and Enhancing Effect of Low Culture Temperature on Specific Antibody Productivity of Recombinant Chinese Hamster Ovary Cell: Clonal Variation, Yoon S K et al., Biotechnol Prog, 2004, Vol. 20, 1683 to 1688)。然而，本發明人已確認，在用於生產VZV gE抗原之細胞株培養之情況下，在低於適合細胞株生長之溫度而培養溫度無變化之條件下進行生產培養、在恆溫條件下進行種子培養及/或生產培養，或在恆定低溫條件下進行種子培養和生產培養，對於產率和純度方面較為有利。

具體地，種子培養進行步驟(a-1)可包括在34°C至38°C之溫度下培養細胞株。此外，生產培養進行步驟(a-2)可包含在34°C至35.5°C之溫度下培養細胞株。例如，可將細胞株在36°C至38°C、36.5°C至37.5°C或37°C之溫度下進行種子培養，之後可將經種子培養之細胞株在 34°C至35.5°C、34.5°C至35.5°C，或35°C之溫度下進行生產培養。此外，可將細胞株在34°C至35.5°C、34.5°C 至35.5°C，或35°C之溫度下進行種子培養，之後可將經種子培養之細胞株在34°C 至 35.5°C、34.5°C 至 35.5°C 或 35°C 之溫度下進行生產培養。此外，該細胞株可在34°C至35.5°C之溫度範圍內的恆溫下，進行種子培養和生產培養。

在本發明之一實施例中，該生產培養可藉由懸浮培養來進行。於此，懸浮液培養物可在62 rpm至72 rpm、64 rpm至70 rpm，或66 rpm至68 rpm之攪拌速度條件下進行；然而，攪拌速度並不限於此。細胞接種之數量在懸浮培養物中可為，但不限於，2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL、3 × 10 ⁵細胞/mL至4 × 10 ⁵細胞/mL，或4 × 10 ⁵細胞/mL。上述之細胞數量對應於最適合VZV gE抗原之生產培養之細胞密度。在細胞密度小於2 × 10 ⁵細胞/mL之情況下，所獲得之蛋白質量較少，由於細胞數量過少；而在細胞密度大於5 × 10 ⁵細胞/mL之情況下，亦會產生大量之宿主細胞蛋白質(HCPs)，如細胞碎片，這會形成問題，因為要在純化過程中將HCPs移除至符合藥物標準之濃度相當困難。此外，pH可為pH 6.7至pH 7.1，或pH 6.8至pH 7.0。此外，溶氧濃度可為，但不限於，10%至90%、20%至80%，或30%至60%。

在本發明之一實施例中，該培養可在燒瓶或生物反應器中進行。然而，本發明不限於此。燒瓶和生物反應器之種類和培養條件可在本領域技術人員通常可調整之範圍內改變。具體地，可使用能夠懸浮培養動物細胞之波動生物反應器、攪拌槽生物反應器及類似裝置；培養物溶液可使用CO ₂或鹼溶液如碳酸鈉和碳酸氫鈉，將pH值調節至pH 6.8至pH 7.2並使用。然而，本發明不限於此。

例如，該種子培養可藉由將細胞株接種到搖晃燒瓶中，進行繼代和懸浮培養，以獲得一定數量之細胞；而該生產培養可藉由將所獲得之一定數量細胞之細胞株，接種到生物反應器中進行懸浮培養，以獲得重組蛋白。

培養物溶液純化步驟(b)可包含以下步驟：進行陰離子交換層析；進行疏水性交互作用層析；將培養物溶液以病毒去活化劑處理，以使病毒去活化；進行混合模式層析法；並進行濃縮和過濾。該層析過程、病毒去活化過程以及濃縮和過濾過程，可以不同之順序進行，以達到最佳之產率。

在本發明之一實施例中，該培養物溶液純化步驟(b)可包含以下步驟：(b-1)進行陰離子交換層析；(b-2)進行疏水性交互作用層析；(b-3)將培養物溶液以病毒去活化劑處理，使病毒去活化，之後進行濃縮和滲濾(diafiltration)；(b-4)進行混合模式層析，以獲得沖提物；(b-5) 將該沖提物進行濃縮和滲濾，之後進行奈米過濾，這些步驟依照一系列順序進行。

此外，在培養物溶液純化步驟(b)之前，可對培養物溶液進行移除細胞碎片之處理過程。例如，藉由將該培養物溶液進行過濾而獲得之培養物濾液，係進行純化步驟。於此，用於過濾之過濾介質可為深度過濾器。此外，該過濾介質之孔徑可為1 μm或更小、0.5 μm或更小、0.45 μm或更小、0.3 μm或更小、0.25 μm或更小或0.2 μm或更小；並可使用各種直徑之過濾介質之混合物。

如本文所用，術語“層析法”係指在特定緩衝條件下將感興趣之溶質例如感興趣之蛋白質，與混合物中之其他溶質分離之過程，其中該分離係經由將該混合物通過吸附物進行滲濾而達成，該吸附物會吸附或保留溶質，這或多或少強烈歸因於該溶質之特性如pI值、疏水性、大小和結構。

在培養物溶液純化步驟(b)中，可使用陰離子交換層析法。該陰離子交換層析法可移除培養物溶液或培養物濾液中所含的培養基組成物和不純物。該陰離子交換層析可使用諸如DEAE纖維素、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50 (Applied Biosystems)、MonoQ、MiniQ、Source 15Q 和3OQ、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、QAE SEPHADEXTM 和Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)、WP PEI、WP DEAM、WP QUAT (J. T. Baker)、Hydrocell DEAE和Hydrocell QA (Biochrom Labs Inc.)、UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE和Macro-Prep High Q (Biorad，其中Q Sepharose Fast Flow樹脂為較佳。

此外，在將管柱平衡至 pH 值 7.0 ± 0.2 後，可以 150 ± 15 cm/hr 之流速載入待純化之培養物溶液。條件如樹脂之種類、pH值、流速等，不限於上述，可在本領域技術人員通常能夠調整之範圍內變化。

此外，對於陰離子交換層析法，可使用其氯化鈉濃度為150 mM或更低、0.1 mM至150 mM、10 mM至150 mM或100 mM至150 mM之洗滌緩衝液。此外，可使用其氯化鈉濃度為400 mM至600 mM、450 mM至550 mM或500 mM之沖提緩衝液。在使用其氯化鈉濃度在上述範圍內之洗滌緩衝液和沖提緩衝液進行純化之情況下，可使含有VZV gE抗原之培養物溶液中的不純物含量最小化。

在培養物溶液純化步驟(b)中，可使用疏水性交互作用層析法。疏水性交互作用層析可用於移除液體培養基組成物和不純物。疏水性交互作用層析法可使用樹脂例如丁基FF、丁基HP、辛基FF、苯基FF、苯基HP、苯基FF(high sub)、苯基FF(low sub)、Capto苯基ImpRes、Capto苯基(high sub)、Capto辛基、Capto丁基ImpRes、Capto 丁基(GE Healthcare)、TOYOPEARL® Super丁基-550C、TOYOPEARL® 己基-650C、丁基-650C、苯基-650C、丁基600 M、苯基-600M、PPG-600 M、丁基-650M、苯基-650M、醚-650M、丁基-650S、苯基-650S、醚-650S、TSKgel 苯基-5PW、TSKgel醚-5PW (Tosoh Bioscience)，其中TOYOPEARL®丁基-650M (Tosoh Bioscience)為較佳。

此外，在管柱平衡至pH值 7.0±0.2後，待純化之培養物溶液，例如來自陰離子交換層析之沖提物，可以100±10 cm/hr之流速載入。於此，在純化之前，可將1至10 M、2至8 M、3至7 M或5 M之氯化鈉加入待純化之溶液中。此外，可使用含有氯化鈉之洗滌緩衝液，也可使用不含氯化鈉之沖提緩衝液。條件如樹脂種類、pH值、流速等不限於上述，可在本領域技術人員通常能夠調整之範圍內變化。

培養物溶液純化步驟(b)可包含以病毒去活化劑處理培養物溶液，使病毒去活化之步驟。該病毒去活化過程可導致含有待純化之VZV gE 抗原之溶液中潛在的包膜病毒去活化。

具體地，該病毒去活化劑可為磷酸溶液。例如，該病毒去活化劑可添加到來自疏水性交互作用層析之沖提物中，因而將該沖提物之pH值調節至pH 2.8至pH 3.2、pH 2.9至pH 3.1，或pH 3.0。在病毒去活化步驟中，當pH值小於2.8時，VZV gE抗原之結構可能發生變性；在pH值大於3.2之情況下，病毒可能無法被去活化。

在培養物溶液純化步驟(b)中，可進行混合模式層析法。混合模式層析法可從含有VZV gE抗原之溶液中移除二聚體和不純物。混合模式層析法可使用樹脂進行，例如BAKERBOND ABX ^TM(J.T. Baker)、陶瓷羥基磷灰石第I型和第II型，以及氟化羥基磷灰石(BioRad)，以及MEP和MBI HyperCel (Pall Corporation)，其中較佳為陶瓷羥基磷灰石。

另外，在管柱平衡至pH 7.0±0.2後，該待純化之培養物溶液，例如將疏水性交互作用層析法之沖提物進行濃縮與過濾後得到的溶液，可以100 ± 10 cm/hr之流速載入。在混合模式層析法中，條件如樹脂、緩衝液和pH值不限於上述，可在本領域技術人員通常能夠調節之範圍內變化。

培養物溶液純化步驟(b)可包含進行濃縮和過濾之步驟。濃縮和過濾過程可在培養物溶液之純化過程中進行數次，且可在各個層析步驟之間進行、在層析步驟和病毒去活化步驟之間進行，或者在層析步驟或病毒去活化步驟之後進行。

例如，在進行混合模式層析法之前，可進行濃縮和過濾，以獲得具有適合混合模式層析法條件之溶液。例如，VZV gE分液之濃縮可藉由超濾及/或滲濾達成，且可包括一或多個切向流過濾(TFF)步驟。

此外，在進行混合模式層析法之後，可進行濃縮和過濾，以調整VZV gE抗原濃度。於此，可進行滲濾直到濾液之pH值和電導率達到期望值，之後可使用超濾來調整蛋白質濃度。

此外，該培養物溶液純化步驟(b)可包含對來自混合模式層析之已濃縮和過濾之沖提物進行奈米過濾之步驟。於此，具有奈米過濾器之過濾系統可用於奈米過濾。為了從含有VZV gE抗原之溶液中分離出病毒，可使用孔徑為例如75 nm、小於50 nm，或小於15 nm之奈米過濾器進行奈米過濾。

培養物溶液純化步驟(b)可進一步包含以配方緩衝液稀釋該經奈米過濾而獲得之濾液，之後進行過濾之步驟。於此，可使用孔徑為0.05至0.8 μm、0.07至0.6 μm或0.1至0.4 μm之微過濾器進行過濾。

若在培養物溶液純化步驟(b)中，經奈米過濾獲得之濾液被稀釋並使用微濾器過濾，可以97%或更高、98%或更高、99%或更高，或 99.5% 或更高之產率獲得蛋白質。此外，經純化之培養物溶液中的 HCP含量可為約180 ppm或更低、170 ppm或更低、160 ppm或更低、150 ppm或更低、100 ppm或更低、80 ppm或更低、70 ppm或更低、60 ppm或更低、50 ppm或更低、30 ppm或更低、或10 ppm或更低。 發明模式

在下文中，將以下列範例更詳細地描述本發明。然而，以下範例僅用於說明目的，本發明之範圍不限於此。 範例1 水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原的表現載體之構建及轉型

將國際專利公開號WO 2019/225962 A1中揭示之水痘帶狀皰疹病毒(VZV)之表面蛋白(gE)抗原的變異基因(MGgE; SEQ ID NO: 2)，選殖到韓國專利號1591823中揭示之pMSID2載體中，以構建 pMSID2-MGgE表現載體(圖2)。接下來，將該表現載體轉染到已適應化學成分確定培養基(CDM4CHO (+0/20 nM MTX；甲胺蝶呤))之 CHO DG44 (Thermo Fisher Scientific, USA)宿主細胞中，以產生細胞株(MGgE-CHO DG44)，其高度表現水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原(MGgE; SEQ ID NO: 1)。 範例 1.1 鑑定取決於抗原和細胞株之蛋白質生產力

為了鑑定取決於抗原和細胞株類型之蛋白質生產力，範例1中構建之pMSID2-MGgE表現載體，以及藉由將韓國專利第1357204號中揭示的編碼截短gE抗原之基因(GSKgE; SEQ ID NO: 4) 選殖至pMSID2載體上而建構之pMSID2-GSKgE表現載體，分別轉染至已適應化學成分確定之培養基(CD forti CHO (+50 nM MTX))之CHO-S宿主細胞中，以產生細胞株(MGgE-CHO-S和GSKgE-CHO-S)。

將MGgE-CHO DG44、MGgE-CHO-S和GSKgE-CHO-S分別在化學成分確定培養基中培養6天，之後藉由西方墨漬法和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)偵測VGV gE之表現位準。

結果，請參考圖3和4，MGgE在CHO-S細胞株中表現出比GSKgE更好之生產力，且MGgE在CHO DG44細胞株中表現出比在CHO-S細胞株中明顯較佳之生產力。特別地，MGgE在適應CDM4CHO (+20 nM MTX)培養基之CHO DG44(S)細胞株中表現出最高之生產力。 範例2. MGgE 生產培養方法之建立 範例2.1. 用於獲得一定細胞數量之細胞株的種子培養

將範例1中製備之MGgE-CHO DG44細胞以3×10 ⁵細胞/mL或更高接種至500 mL燒瓶中至總計100 mL，並在36°C至38°C和4%至6% CO ₂之條件下培養。之後，重複以2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL接種細胞株至總共200 mL 至800 mL 之步驟，間隔2至4天，同時增加燒瓶體積，以獲得一定數量之細胞。將燒瓶中獲得之細胞以2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL之濃度接種到生物反應器中，在36°C至38°C、pH 6.7至pH 7.1、10% 至 90% 之溶氧，以及86 rpm至96 rpm 之攪拌速度之條件下進行懸浮培養。以這種方式獲得一定數量之細胞。 範例2.2. MGgE 抗原之生產培養

將範例2.1中獲得一定數量細胞之MGgE-CHO DG44細胞以2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL之細胞濃度接種到生物反應器中，之後懸浮培養係於溫度34°C至35.5°C、pH 6.7至pH 7.1、10%至90%溶氧、攪拌速度62 rpm至72 rpm之條件下進行。 範例2.3. MGgE 抗原之定量

在以下實施例中，進行ELISA以測量MGgE抗原之含量。具體而言，將VZV gE抗體(Cat. #sc-17549, 200 μg/mL)以PBS稀釋至1 μg/mL 之濃度，之後將所得物以每孔100 μL添加到96 孔ELISA盤中。在4 °C 下進行過夜靜置(塗覆)。以洗滌液(0.05% Tween 20/磷酸鹽緩衝液生理食鹽水 (PBS))洗滌該盤3次，之後以含有2% BSA之PBS溶液靜置1小時。再次洗滌ELISA盤，之後加入稀釋樣本靜置2小時。之後，再次洗滌該盤。每一培養物溶液樣本離心後，將上清液保存在-20°C或更低溫。測定與使用前1小時在室溫下解凍樣本。將VZV gE抗體(Cat. #sc-56995, 100 μg/mL)稀釋至1 μg/mL 之濃度，每孔加入100 μL，並在室溫下靜置1 小時。洗滌該盤。之後，將山羊抗小鼠IgG-HRP稀釋至1/1000之濃度，之後每孔加入100 μL。將該盤在室溫下靜置1小時。洗滌該盤，並向其中加入3,3,5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)以誘導HRP反應。之後，每孔加入100 μL之1 N H ₂SO ₄以終止反應，並以微盤讀取儀在450 nm處測量吸光度。樣本之含量係藉由將測得之吸光度代入標準曲線方程並將所得值乘以稀釋倍數而計算。 實驗例 1. 培養溫度變化後生產力之鑑定

為了鑑定在生產培養步驟中確定細胞已充分生長時，培養溫度變化對MGgE抗原之生產力的影響，於範例2.1獲得之具一定細胞數量之MGgE-CHO DG44 細胞株，係以2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL之細胞濃度接種到生物反應器中，並進行懸浮培養。之後，當細胞株分別達到約60 × 10 ⁵細胞/mL、80 × 10 ⁵細胞/mL和150 × 10 ⁵細胞/mL之細胞濃度時，將培養溫度降至32 °C進行生產培養。此外，將範例2.1中獲得一定細胞數量之MGgE-CHO DG44細胞株，在37°C恆溫條件下進行生產培養，之後比較MGgE抗原的生產力(請見表 1、圖5A和5B)。 [表1]

加工參數	無溫度變化	溫度變化 (37 → 32°C)
(1)	(2)	(3)
溫度 (°C)	37.0 ± 0.5	37.0 ± 0.5 → 32.0 ± 0.5
溫度變化點 (×10 ⁵細胞/mL)	N/A	約60	約80	約150
加工參數	無溫度變化	溫度變化 (37 → 32°C)
(1)	(2)	(3)
培養期間 (日)	11.5	14	14	14
收穫生產力 (mg/L)	1576 ± 28	1096	1248	1183 ± 115
q _P(pg/細胞/日)	13.7 ± 0.7	11.9	11.5	7.7 ± 0.5

結果請參考表1和圖5A和5B，在發生溫度變化之情況下，細胞株存活之培養期間增加，而MGgE抗原生產力(q _P)比恆溫條件下之情況低得多。

這說明在MGgE抗原之生產培養期間，在MGgE-CHO DG44細胞株之培養溫度保持在一定範圍內而無溫度變化之情況下，生產力增進。 實驗例2. 取決於生產溫度之MGgE 抗原生產力之鑑定

在範例2.2之MGgE抗原之生產培養步驟中，MGgE-CHO DG44細胞株以2 × 10 ⁵細胞/mL至5 × 10 ⁵細胞/mL之細胞濃度接種到生物反應器中，在33°C至37°C範圍內選擇之恆溫條件下進行生產培養(表2，圖6A和6B)。 [表 2]

加工參數	33.0°C	33.5°C	34.0°C	34.5°C	35.0°C	35.5°C	37.0°C
溫度	33.0°C	33.5°C	34.0°C	34.5°C	35.0°C	35.5°C	37.0°C
加工表現度
VCD積分值 (×10 ⁵細胞/mL·日)	121.4	645.7	1681.4	1848.1	1705.7	1312.2	849.6
培養期間 (日)	11	16	14	14	14	12	10
收穫生產力 (mg/L)	205	880	2711	3268	3247	2196	1142
q _P(pg/細胞/日)	16.9	13.6	16.1	17.7	19.0	16.7	13.4

結果請參考表2和圖6A和6B，在低於37°C(一般CHO細胞生長之合適溫度)之低溫培養條件(34°C至35.5°C之恆溫條件)下，培養期間和生產力皆增加。此外，在33.5℃或更低溫度之條件下，細胞生長和生產力下降。另一方面，從q _P與培養細胞數相關之觀點來看，在33°C下q _P之計算值相當高之原因是因為儘管生產力低，但與其他批次相較，其細胞數非常少(請見VCD積分值)。意即，可看出，34°C至35.5°C之低溫條件導致MGgE-CHO DG44細胞株中MGgE抗原生產力之顯著增進。 範例3. MGgE 抗原之純化 範例3.1. 收穫和澄清

就在實驗例2中用於35°C生產培養條件之培養物溶液(MG1120)而言，為了移除培養物溶液中之細胞碎片，使用深度過濾器(COHC Millipore, USA)進行收穫和澄清。

過濾時之壓力條件保持在0.9bar或更低，將除去細胞碎片之濾液以0.45 + 0.2 μm之過濾器(Sartopore II, Sartorius, Germany)過濾，得到培養濾液。 範例3.2. 陰離子交換層析法 - 取決於洗滌緩衝液和沖提緩衝液中氯化鈉濃度之產率比較

進行陰離子交換層析，以移除範例3.1中獲得之培養物濾液中包含之液體培養基組成物和不純物。

具體而言，將管柱填充入Q Sepharose FF (GE Healthcare, USA)樹脂，之後使用平衡緩衝液平衡至 pH 值7.0 ± 0.2。之後，將範例3.1中獲得之培養濾液加載到管柱上，使流速為150 ± 15 cm/hr。隨後，依序以平衡緩衝液和含有氯化鈉之洗滌緩衝液洗滌管柱。之後，使用含有氯化鈉之沖提緩衝液沖提出MGgE抗原並收集。

在洗滌緩衝液和沖提緩衝液中所含氯化鈉之濃度改變之情況下，比較陰離子交換層析步驟之產率。

具體而言，陰離子交換層析使用含有150 mM、200 mM或250 mM 氯化鈉之洗滌緩衝液和含有 500 mM 氯化鈉之沖提緩衝液進行(表3)。 [表3]

洗滌緩衝液條件	gE總量 (ug)	產率 (%)	HCP總量(ug)	產率 (%)	沖提物
pH	NaCl濃度 (mM)	載入溶液	沖提物	載入溶液	沖提物	MGgE 總量 (ug)	HCP總量 (ug)	HCP/MGgE (%)
7	150	253601	163781	64.6	171929	5401	3.1	163781	5400.8	3.3
200	253601	87608	34.5	171929	3082	1.8	87608	3081.6	3.5
250	200780	29096	14.5	231663	1802	0.8	29096	1802.4	6.2

結果請參照表3，在洗滌緩衝液中氯化鈉之濃度為150 mM之情況下，每一MGgE之不純物含量最低。

因此，係使用含有150 mM氯化鈉之洗滌緩衝液和含有400 mM、500 mM或 600 mM氯化鈉之沖提緩衝液進行陰離子交換層析(表 4)。 [表4]

沖提緩衝液條件	gE總量(ug)	產率 (%)	HCP總量(ug)	產率 (%)	沖提物
pH	NaCl 濃度 (mM)	載入溶液	沖提物	載入溶液	沖提物	MGgE 總量 (ug)	HCP 總量 (ug)	HCP/MGgE (%)
7	400	253601	81152	32.0	171929	3093	1.8	81152	3093	3.8
500	253601	87608	34.5	171929	3082	1.8	87608	3082	3.5
600	200780	86710.4	43.2	231663	3669	1.6	86710	3669	4.2

結果請參照表4，在使用含有500 mM氯化鈉之沖提緩衝液之情況下，每一MGgE之不純物含量最低。

因此，在MGgE抗原純化步驟之陰離子交換層析法中，洗滌緩衝液和沖提緩衝液中之氯化鈉最佳濃度分別為150 mM和500 mM。 範例3.3. 疏水性交互作用層析法

將範例3.2中獲得之陰離子交換層析法之沖提物進行疏水性交互作用層析，以除去先前未除去之液體培養基組成物和不純物。

具體而言，該管柱填充有Toyopearl Butyl-650M (Tosoh)樹脂，之後使用平衡緩衝液平衡至pH 值7.0 ± 0.2。之後，在範例3.2中得到之陰離子交換層析法之沖提物中加入5 M氯化鈉，將所得物載入管柱中，使其流速為100 ± 10 cm/hr。之後，以平衡緩衝液和含有1 M氯化鈉之洗滌緩衝液依序洗滌管柱。之後，使用不含氯化鈉之沖提緩衝液沖提出MGgE抗原並收集。 範例3.4 病毒之去活化

為了使含有MGgE抗原之溶液中潛在的包膜病毒去活化，係進行添加溶劑以使病毒去活化之步驟。

具體地，在範例3.3之疏水性交互作用層析法中所得之沖提物中加入磷酸，調節沖提物之pH值至3.0±0.2，在室溫下以100±20 rpm攪拌30分鐘(對照組)以使病毒去活化。之後，使用磷酸二鈉將pH值調節至6.5 ± 0.5。

此外，將病毒去活化時間改為60分鐘、90分鐘和120分鐘，同時檢驗MGgE抗原之穩定性(表5)。 [表5]

pH	去活化時間 (分鐘)	含量(μg/mL)	純度(%)
UV含量	gE ELISA	SE-HPLC
3.0	30 (對照組)	598	776	93.61
60	593	827	93.13
90	585	760	92.80
120	571	795	93.48
反應120分鐘後，相對於初始值之%	95%	103%	100%

結果請參考表5，即使120分鐘之去活化也沒有引起MGgE抗原之含量和純度之顯著變化。因此，在對病毒去活化有效之pH 3.0條件下，即使病毒去活化時間為120分鐘，MGgE也很穩定。 範例3.5 第一次濃縮和滲濾

進行第一次濃縮和滲濾步驟，以便自範例3.4中獲得之加入溶劑的MGgE抗原溶液中移除低分子量離子，且該溶液具有適合混合模式層析法之條件。

具體地，使用超濾/滲濾系統(Sartocon Cassette (50K))對加入溶劑的MGgE抗原溶液進行超濾，且將該濾液以用於混合模式層析法(其為下一製程)之平衡緩衝液進行滲濾，直到濾液之pH值為7.2 ± 0.2，電導率為2.5 mS/cm或更低。 範例3.6 混合模式層析法

於範例3.5中得到之已經透析及/或濃縮之含MGgE抗原之溶液係進行混合模式層析法，以除去二聚體和不純物。

具體而言，該管柱填充有陶瓷羥基磷灰石(Bio-Rad) 樹脂，之後使用平衡緩衝液平衡至pH 值7.2 ± 0.2 。之後，將範例3.5中得到之已經透析及/或濃縮之含MGgE抗原之溶液載入管柱中，以使流速為100 ± 10 cm/hr，以收集未吸附之溶液。之後，管柱以平衡緩衝液洗滌以便收集。 範例3.7 第二次濃縮和滲濾

進行第二濃縮和滲濾步驟，使得範例3.6中的混合模式層析法得到之未吸附溶液中之蛋白質濃度可調整，且該溶液具有適於奈米過濾過程之條件。

將該混合模式層析之未吸附溶液置於超濾/滲濾系統中(Sartocon Cassette (50K))，濾液使用奈米過濾法(其為下一製程)之平衡緩衝液進行滲濾，直到濾液之pH值為7.4±0.2且導電率為15.5 mS/cm或更高。之後，將所得物經超濾濃縮至蛋白質濃度為7.0 ± 0.5 mg/mL。 範例 3.8 奈米過濾

奈米過濾為病毒移除步驟，其中使用奈米過濾器(Planova 20N, Asahi)，並使用配方緩衝液將pH 值平衡至 7.4 ± 0.2。

之後，將範例3.7中得到之經透析和濃縮之含MGgE抗原溶液，在1.0 ± 0.2巴之壓力條件下通過奈米過濾器以移除病毒，之後以平衡緩衝液洗滌該奈米過濾器。將奈米過濾所得之濾液與洗滌液混合，之後測定蛋白質濃度。 範例3.9 稀釋和過濾

將範例3.8中經奈米過濾所得之濾液，以製劑緩衝液稀釋，使得蛋白濃度為5.0 ± 0.5 mg/mL，之後以0.2 μm過濾器過濾。

之後，將所得之含MGgE抗原之溶液分裝並保存於-20℃或更低溫。 實驗例 3. 每一純化步驟之產率評估

純化步驟中每一步驟之產率，係藉由測量範例3中每一步驟之MGgE抗原含量而檢查 (表6)。就表6中的MGgE之蛋白質含量而言，每一帶有*標記之培養物溶液，其已進行收穫和澄清以及陰離子交換層析步驟，係以ELISA測試而測量；後續步驟之培養物溶液則以UV測量。 [表6]

製程	MGgE	HCP	SE-HPLC
蛋白質含量 (g)	產率(%)	ppm	LRV	%
收穫與澄清	334.0 *	-	-	-	-
254.5 *	76%	-	-	-
陰離子交換層析法	251.0 *	-	199488.8	-	-
199.8 *	80%	13854.9	1.16	85.48
疏水性交互作用層析法	231.3	-	10914.2	-	-
126.9	55%	4432.8	0.39	91.86
病毒去活化	125.5	-	4432.8	-	-
125.1	100%	3335.2	0.12	99.21
第1次濃縮與滲濾	124.6	-	3335.2	-	-
105.0	84%	3258.0	0.01	95.24
混合模式層析法	104.1	-	3258.0	-	-
107.3	103%	423.6	0.89	97.43
第2次濃縮與滲濾	106.8	-	423.6	-	-
108.0	101%	216.3	0.29	99.26
奈米過濾	101.0	-	216.3	-	-
91.5	91%	197.3	0.04	99.27
稀釋與過濾	89.4	-	-	-	-
100.5	-	-	-	99.32
藥物物質(抗原)	100.5	-	180.4	-	-
97.5	97%	172.6	0.02	99.32

(無)

圖1顯示在本發明之一實施例中，進行培養和純化以生產VZV gE抗原之製程的流程圖。圖2說明生產pMSID2-MGgE載體之方法的示意圖。圖3說明藉由西方墨漬法鑑定VZV gE生產力之結果，取決於VZV gE和細胞株之種類。圖4說明藉由ELISA鑑定VZV gE生產力之結果，取決於VZV gE和細胞株之種類。圖5A顯示由活細胞密度(VCD)鑑定獲得之結果，取決於MGgE導入細胞株之生產培養步驟中的培養溫度變化。圖5B顯示鑑定生產力所得之結果，取決於MGgE導入細胞株之生產培養步驟中的培養溫度變化。圖6A顯示鑑定活細胞密度(VCD)所得之結果，取決於MGgE導入細胞株之生產培養步驟中的培養溫度變化。圖6B顯示鑑定生產力所得之結果，取決於MGgE導入細胞株之生產培養步驟中的培養溫度變化。

                            序列表
          <![CDATA[<110>    南韓商綠十字股份有限公司 (GREEN CROSS CORPORATION)]]>
          <![CDATA[<120>    用於生產水痘帶狀皰疹病毒之表面蛋白抗原的方法]]>
          <![CDATA[<140>    TW 110125003]]>
          <![CDATA[<141>    2021-07-07]]>
          <![CDATA[<150>    KR 10-2020-0085685]]>
          <![CDATA[<151>    2020-07-10]]>
          <![CDATA[<160>    4]]>
          <![CDATA[<170>    KoPatentIn 3.0]]>
          <![CDATA[<210>    1]]>
          <![CDATA[<211>    537]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    MGgE抗原]]>
          <![CDATA[<400>    1]]>
          Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly
            1               5                  10                  15 
          Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val
                       20                  25                  30 
          Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn
                   35                  40                  45 
          Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp
               50                  55                  60 
          Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro
           65                  70                  75                  80 
          Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His
                           85                  90                  95 
          Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu
                      100                 105                 110 
          Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp
                  115                 120                 125 
          Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His
              130                 135                 140 
          Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val
                          165                 170                 175 
          Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr
                      180                 185                 190 
          Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys
                  195                 200                 205 
          Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr
              210                 215                 220 
          Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr
          225                 230                 235                 240 
          Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys
                          245                 250                 255 
          Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp
                      260                 265                 270 
          Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val
                  275                 280                 285 
          Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg
              290                 295                 300 
          Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro
                          325                 330                 335 
          Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser
                      340                 345                 350 
          Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His
                  355                 360                 365 
          Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp
              370                 375                 380 
          Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro
          385                 390                 395                 400 
          Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr
                          405                 410                 415 
          Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys
                      420                 425                 430 
          Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met
                  435                 440                 445 
          Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys
              450                 455                 460 
          Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr
                          485                 490                 495 
          Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr
                      500                 505                 510 
          Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val
                  515                 520                 525 
          Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg
              530                 535        
          <![CDATA[<210>    2]]>
          <![CDATA[<211>    1610]]>
          <![CDATA[<212>    DNA]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    MGgE抗原]]>
          <![CDATA[<400>    2]]>
          atgggaacag tcaacaaacc agtcgtcggc gtgctgatgg gcttcggtat tattacagga         60
          actctgagga ttactaaccc cgtgcgcgcc tctgtgctgc ggtacgacga tttccacaca        120
          gacgaggata agctggacac caattccgtg tatgagccct actatcactc tgatcacgcc        180
          gagagctcct gggtgaaccg gggcgagtct agcaggaagg cttacgacca caacagccct        240
          tatatctggc cacggaatga ctacgatggc tttctggaga acgcccacga gcaccacggc        300
          gtgtataatc agggcagagg catcgactct ggcgagcggc tgatgcagcc cacccagatg        360
          agcgcccagg aggatctggg cgacgataca ggcatccacg tgatccctac cctgaatggc        420
          gacgataggc acaagatcgt gaacgtggat cagagacagt acggcgacgt gttcaagggc        480
          gatctgaatc ccaagcctca gggccagagg ctgatcgagg tgtccgtgga ggagaaccac        540
          cccttcaccc tgagagcccc tatccagcgg atctacggcg tgaggtatac cgagacatgg        600
          agctttctgc catccctgac atgcaccggc gacgctgctc ctgctatcca gcacatctgc        660
          ctgaagcaca ccacatgttt tcaggacgtg gtggtggacg tggattgtgc cgagaataca        720
          aaggaggatc agctggctga gatctcctac cggttccagg gcaagaagga ggccgatcag        780
          ccttggatcg tggtgaacac ctctacactg tttgacgagc tggagctgga tccccctgag        840
          atcgagccag gcgtgctgaa ggtgctgaga accgagaagc agtacctggg cgtgtatatc        900
          tggaacatgc ggggctctga cggcaccagc acatacgcta ccttcctggt cacatggaag        960
          ggcgatgaga agacccggaa tccaacacct gctgtgaccc ctcagccaag gggagctgag       1020
          tttcacatgt ggaactatca ctcccacgtg ttctctgtgg gcgacacctt tagcctggcc       1080
          atgcacctgc aatataagat ccacgaggct cctttcgacc tgctgctgga gtggctgtat       1140
          gtgcccatcg atcctacatg ccagccaatg aggctgtact ccacctgtct gtatcaccca       1200
          aatgcccccc aatgcctgag ccacatgaac tccggctgta cctttacaag cccccacctg       1260
          gcccagagag tggcttccac agtgtaccag aactgcgagc acgccgacaa ttacaccgct       1320
          tattgtctgg gcatctctca catggagccc agcttcggcc tgatcctgca cgacggcggc       1380
          accacactga agtttgtgga tacacccgag tccctgtctg gcctctacgt gttcgtggtg       1440
          tacttcaacg gccacgtgga ggccgtggct tatacagtgg tgtctaccgt ggatcacttc       1500
          gtgaacgcca tcgaggagag aggatttcca cctaccgctg gacagcctcc agctaccaca       1560
          aagcctaagg aaatcacccc tgtcaatcct ggaacttcac ctctgctgcg                  1610
          <![CDATA[<210>    3]]>
          <![CDATA[<211>    623]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    VZV gE抗原]]>
          <![CDATA[<400>    3]]>
          Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly
            1               5                  10                  15 
          Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val
                       20                  25                  30 
          Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn
                   35                  40                  45 
          Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp
               50                  55                  60 
          Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro
           65                  70                  75                  80 
          Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His
                           85                  90                  95 
          Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu
                      100                 105                 110 
          Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp
                  115                 120                 125 
          Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His
              130                 135                 140 
          Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val
                          165                 170                 175 
          Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr
                      180                 185                 190 
          Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys
                  195                 200                 205 
          Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr
              210                 215                 220 
          Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr
          225                 230                 235                 240 
          Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys
                          245                 250                 255 
          Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp
                      260                 265                 270 
          Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val
                  275                 280                 285 
          Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg
              290                 295                 300 
          Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro
                          325                 330                 335 
          Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser
                      340                 345                 350 
          Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His
                  355                 360                 365 
          Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp
              370                 375                 380 
          Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro
          385                 390                 395                 400 
          Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr
                          405                 410                 415 
          Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys
                      420                 425                 430 
          Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met
                  435                 440                 445 
          Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys
              450                 455                 460 
          Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr
                          485                 490                 495 
          Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr
                      500                 505                 510 
          Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val
                  515                 520                 525 
          Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly
              530                 535                 540 
          Leu Ala Ala Val Val Leu Leu Cys Leu Val Ile Phe Leu Ile Cys Thr
          545                 550                 555                 560 
          Ala Lys Arg Met Arg Val Lys Ala Tyr Arg Val Asp Lys Ser Pro Tyr
                          565                 570                 575 
          Asn Gln Ser Met Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Val Asp Asp Phe Glu Asp
                      580                 585                 590 
          Ser Glu Ser Thr Asp Thr Glu Glu Glu Phe Gly Asn Ala Ile Gly Gly
                  595                 600                 605 
          Ser His Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Val Tyr Ile Asp Lys Thr Arg
              610                 615                 620 
          <![CDATA[<210>    4]]>
          <![CDATA[<211>    546]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    GSKgE]]>
          <![CDATA[<400>    4]]>
          Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly
            1               5                  10                  15 
          Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val
                       20                  25                  30 
          Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn
                   35                  40                  45 
          Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp
               50                  55                  60 
          Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro
           65                  70                  75                  80 
          Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His
                           85                  90                  95 
          Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu
                      100                 105                 110 
          Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp
                  115                 120                 125 
          Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His
              130                 135                 140 
          Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val
                          165                 170                 175 
          Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr
                      180                 185                 190 
          Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys
                  195                 200                 205 
          Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr
              210                 215                 220 
          Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr
          225                 230                 235                 240 
          Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys
                          245                 250                 255 
          Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp
                      260                 265                 270 
          Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val
                  275                 280                 285 
          Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg
              290                 295                 300 
          Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro
                          325                 330                 335 
          Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser
                      340                 345                 350 
          Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His
                  355                 360                 365 
          Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp
              370                 375                 380 
          Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro
          385                 390                 395                 400 
          Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr
                          405                 410                 415 
          Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys
                      420                 425                 430 
          Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met
                  435                 440                 445 
          Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys
              450                 455                 460 
          Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr
                          485                 490                 495 
          Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr
                      500                 505                 510 
          Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val
                  515                 520                 525 
          Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly
              530                 535                 540 
          Leu Ala
          545

Claims

一種用於生產水痘帶狀皰疹病毒(VZV)之表面蛋白(GE)抗原的方法，包含以下步驟： (a)培養生產該VZV gE抗原之重組細胞株，以獲得培養物溶液；以及 (b)純化該培養物溶液。
如請求項1之方法，其中該培養物溶液獲得步驟(a)包含以下步驟： (a-1)對該重組細胞株進行種子培養(seed culture)；以及 (a-2)對已進行該種子培養之細胞株進行生產培養。
如請求項1之方法，其中該培養物溶液純化步驟(b)包含以下步驟：進行陰離子交換層析法；進行疏水性交互作用層析法；將該培養物溶液以病毒去活化劑處理，以使病毒去活化；進行混合模式層析法；以及進行濃縮和過濾。
如請求項3之方法，其中該培養物溶液純化步驟(b)包含以下步驟： (b-1)進行陰離子交換層析法； (b-2)進行疏水性交互作用層析法； (b-3)將該培養物溶液以病毒去活化劑處理，使病毒去活化，之後進行濃縮和滲濾(diafiltration)； (b-4)進行混合模式層析法，得到沖提物；以及 (b-5)將該沖提物進行濃縮和滲濾，之後進行奈米過濾，這些步驟依照一系列順序進行。
如請求項1之方法，其中該VZV gE抗原為由SEQ ID NO：1代表之胺基酸序列組成之多肽。
如請求項1之方法，其中該細胞株係以由SEQ ID NO：2代表之核苷酸序列組成之基因進行轉型。
如請求項2之方法，其中該種子培養進行步驟(a-1)為該VZV gE抗原生產細胞株係藉由選自於由繼代培養、懸浮培養及其組合組成的群組之任一方法培養。
如請求項2之方法，其中該種子培養進行步驟(a-1)包括在34°C至38°C之溫度下培養該細胞株。
如請求項2之方法，其中該生產培養進行步驟(a-2)包括在34°C至35.5°C之溫度下培養該細胞株。
請求項3或4之方法，其中該陰離子交換層析法係使用其氯化鈉濃度為0.1 mM至150 mM之洗滌緩衝液。
如請求項3或4之方法，其中該陰離子交換層析法係使用其中氯化鈉濃度為400 mM至600 mM之沖提緩衝液。
如請求項3或4之方法，其中該病毒去活化劑為磷酸溶液。
如請求項3或4之方法，其中該病毒去活化步驟在pH值 2.8至3.2之條件下進行。
如請求項4之方法，其中該奈米過濾步驟(b-5)係使用具有奈米過濾器之過濾系統。
如請求項4之方法，更包含：在步驟(b-5)之後，將奈米過濾所得到之濾液以配方緩衝液稀釋，之後進行過濾之步驟。