WO2022010213A1 - 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원의 생산 방법 - Google Patents

바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원의 생산 방법 Download PDF

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WO2022010213A1
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김미숙
임정애
정유민
한승열
김지연
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    • C12N2710/16763—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a surface protein antigen of varicella zoster virus.
  • VZV Varicella Zoster Virus
  • herpes zoster The initial symptoms of herpes zoster are aching all over the body like body aches or are accompanied by severe itching, stinging, burning, and severe pain like stabbing with a knife. After a few days, blisters occur. It is a disease in which patients tend to complain of more severe pain. Even when fully cured, herpes zoster leaves sequelae of neuropathic pain, which is relatively rare in adults under 40 years of age. It is also known to cause depression.
  • ZOSTAVAX Merck Corporation
  • a live attenuated vaccine in Oka state has been developed. It is licensed and sold in Korea and Korea.
  • GlaxoSmithKline has developed a vaccine composed of gE, a viral surface protein, and an immune enhancer, targeting adults 50 years of age or older, and has proven its preventive effect in clinical trials (US Patent No. 7,939,084).
  • the present inventors improved the productivity of VZV gE antigen while conducting research on a method to increase productivity without affecting the immunogenicity of the surface protein (gE) antigen of varicella zoster virus (VZV)
  • the present invention was completed by discovering a culture and purification method that can be performed.
  • obtaining a culture medium by culturing a recombinant cell line that produces a surface protein (gE) antigen of Varicella-Zoster Virus (VZV); And (b) provides a method for producing the VZV gE antigen comprising the step of purifying the culture medium.
  • gE surface protein
  • VZV Varicella-Zoster Virus
  • the method for producing a varicella zoster virus surface protein antigen according to the present invention is an effective production method capable of obtaining the varicella zoster virus surface protein antigen in high yield and high purity. Therefore, the method is useful for producing a surface protein antigen of varicella zoster virus for use as a vaccine composition for preventing or treating chickenpox or herpes zoster.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a process of culturing and purifying to produce a VZV gE antigen according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the pMSID2-MGgE vector production process.
  • VZV gE productivity is a result of confirming the VZV gE productivity according to the type of VZV gE and cell lines by Western blot.
  • VCD viable cell density
  • Figure 5b is a result of confirming the productivity (productivity) according to the change of the culture temperature in the production culture stage of the cell line introduced with MGgE.
  • 6a is a result of confirming the viable cell density according to the culture temperature in the production culture stage of the MGgE-introduced cell line.
  • 6b is a result of confirming the productivity according to the culture temperature in the production culture stage of the cell line introduced with MGgE.
  • obtaining a culture medium by culturing a recombinant cell line that produces a surface protein (gE) antigen of Varicella-Zoster Virus (VZV); And (b) provides a method for producing the VZV gE antigen comprising the step of purifying the culture medium.
  • gE surface protein
  • VZV Varicella-Zoster Virus
  • the surface protein antigen of the varicella zoster virus may preferably be one of the surface protein antigens of the varicella zoster virus disclosed in International Publication No. WO 2019/225962 A1.
  • the surface protein antigen (MGgE) of the varicella zoster virus may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the polypeptide is formed by a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 It may be coded.
  • the surface protein antigen of varicella zoster virus represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the 537th amino acid residue carboxy terminus of the surface protein antigen of varicella zoster virus represented by the amino acid sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Varicella zoster virus surface protein antigen variant containing this truncated mutation.
  • the truncated mutation of the carboxy terminus of the 537th amino acid residue is amino acid residues 1 to 537 in the direction from the amino terminus (N-terminus) to the carboxy (C-terminus), and consecutive amino acids from the 538th amino acid residue to the carboxy terminus It refers to a mutation in which residues are truncated.
  • the cell line producing the VZV gE antigen may be one transformed with a gene encoding the VZV gE antigen consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a cell having an expression vector containing the gene encoding the VZV gE antigen can be a week
  • the expression vector may be an expression vector of the pMSID2 vector disclosed in Korean Patent Registration No. 10-1591823, but any vector suitable for transfecting the VZV gE antigen into a cell line may be used without limitation.
  • vector refers to a nucleic acid means comprising a nucleotide sequence that can be introduced into a host cell, can be recombinated and inserted into the host cell genome, or can be spontaneously replicated into an episome.
  • Suitable expression vectors include a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, initiation codon, stop codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. . When the gene construct encoding the target protein is administered with the start codon and stop codon, it must function in the subject and must be in frame with the coding sequence.
  • Host cells or non-human host cells transfected or transformed with the vector according to an embodiment of the present invention may be host cells or non-human host cells genetically modified by the vector.
  • the term "genetically modified" refers to a polynucleotide or vector according to an embodiment of the present invention introduced into a host cell, a non-human host organism, predecessors or parents. It means that the host cell, non-human host organism, antecedent species or seedling includes in addition to its genome.
  • polynucleotide or vector according to one embodiment of the present invention may exist in a genetically modified host cell or a non-human host organism as an independent molecule outside the genome, specifically a replicable molecule, or a host cell Alternatively, it may be stably inserted into the genome of a non-human host organism.
  • the host cell according to one embodiment of the present invention is a eukaryotic cell.
  • the eukaryotic cells include fungal cells, plant cells, or animal cells.
  • the fungal cell may be yeast, specifically, yeast of the genus Saccharomyces sp., more specifically, S. cerevisiae.
  • animal cells include insect cells or mammalian cells, and specific examples of animal cells include HEK293, 293T, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC- 3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A, etc.
  • suitable cell lines well known in the art can be obtained from a cell line depository such as the American Type Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the VZV gE antigen according to the present invention can be expressed in various types of organisms such as bacteria, yeast, mammalian cells, plants, and transgenic animals.
  • mammalian cells can be used in terms of regulation for protein therapeutics and that the manufactured protein must be similar to the native type.
  • Examples of the mammalian cells include immortal hybridoma cells, NS/O myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CapT cells (human amniotic fluid-derived cells), COS cells, and the like, and according to an embodiment of the present invention, CHO DG44 cells can be used.
  • a technique known in the art may be used, for example, electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, and chloride. and calcium (CaCl2) precipitation.
  • seed culture refers to a culture for the purpose of obtaining a large amount of cell lines.
  • the seed culture may be cultured at a temperature condition in which the number of cells can be most actively increased. In other words, in order to secure a certain number of cells in the cell line, it can be cultured.
  • production culture refers to mass culturing of a cell line to produce a recombinant protein.
  • the (a-1) seed culture step may include culturing the cell line producing the VZV gE antigen by any one method selected from the group consisting of subculture, suspension culture, and combinations thereof.
  • a cell line producing the VZV gE antigen may be cultured by subculture and suspension culture method, and may be cultured for production by suspension culture method.
  • culture refers to a method of culturing while transferring a cell line to the same or different fresh medium according to the culture cycle.
  • the subculture can be cultured by transferring the cell line to the same fresh medium at intervals of 1 to 7 days, 2 to 5 days, or 3 to 4 days.
  • the number of inoculated cells may be 2x10 5 cells/mL to 5x10 5 cells/mL, 3x10 5 cells/mL to 4x10 5 cells/mL, or 4x10 5 cells/mL, but is not limited thereto.
  • the CO 2 concentration in the subculture may be 4.0% to 6.0%, 4.5% to 5.5%, or 5.0%, but is not limited thereto.
  • the term "suspension culture” refers to a culture method in which cells are suspended in a culture medium, and cells that proliferate in a suspended state even in vivo, such as blood cells or a plurality of cancer cells, are shaken or rotated. Floating culture can be carried out even if it is not performed, but in most cases, it can be cultured by rotating the gaiters (gaiter culture), shaking each culture bottle (shaking culture), or rotating the incubator (rotating culture).
  • suspension culture may be performed under conditions of agitation speed of 86 rpm to 96 rpm, 88 rpm to 94 rpm, or 90 rpm to 92 rpm, but is not limited thereto.
  • the number of cells inoculated in the suspension culture may be 2x10 5 cells/mL to 5x10 5 cells/mL, 3x10 5 cells/mL to 4x10 5 cells/mL, or 4x10 5 cells/mL, but is not limited thereto.
  • the pH may be between pH 6.7 and pH 7.1, or between pH 6.8 and pH 7.0.
  • the dissolved oxygen concentration may be 10% to 90%, 20% to 80%, or 30% to 60%, but is not limited thereto.
  • the (a-1) seed culturing step may include culturing the cell line at a temperature of 34°C to 38°C.
  • the (a-2) production and culturing may include culturing the cell line at a temperature of 34 to 35.5°C.
  • the cell line may be seed cultured at a temperature of 36 to 38 °C, 36.5 to 37.5 °C or 37 °C, and then the cultured cell line is produced at a temperature of 34 to 35.5 °C, 34.5 to 35.5 °C or 35 °C. can be cultured.
  • the cell line may be seed cultured at a temperature of 34 to 35.5 ° C, 34.5 to 35.5 ° C or 35 ° C, and then the cultured cell line is produced and cultured at a temperature of 34 to 35.5 ° C, 34.5 to 35.5 ° C or 35 ° C.
  • the cell line may be cultured for seed culture and production at a constant temperature within a temperature range of 34 to 35.5°C.
  • the production culture may be by a suspension culture method.
  • the suspension culture may be performed under conditions of agitation speed of 62 rpm to 72 rpm, 64 rpm to 70 rpm, or 66 rpm to 68 rpm, but is not limited thereto.
  • the number of cells inoculated in the suspension culture may be 2x10 5 cells/mL to 5x10 5 cells/mL, 3x10 5 cells/mL to 4x10 5 cells/mL, or 4x10 5 cells/mL, but is not limited thereto.
  • the cell number corresponds to the optimal cell density in the production culture of VZV gE antigen.
  • the cell density is less than 2x10 5 cells/mL
  • the amount of protein obtained is small because the number of cells is too small, and when it exceeds 5x10 5 cells/mL, HCP (Host Cell Protein) such as cell debris is also produced a lot
  • HCP Host Cell Protein
  • the pH may be between pH 6.7 and pH 7.1, or between pH 6.8 and pH 7.0.
  • the dissolved oxygen concentration may be 10% to 90%, 20% to 80%, or 30% to 60%, but is not limited thereto.
  • the culture may be performed in a flask or bioreactor, but is not limited thereto.
  • the type and culture conditions of the flask and bioreactor can be changed within a range that can be generally controlled by those skilled in the art.
  • wave bioreactor and stirred tank bioreactor capable of suspension culture of animal cells can be used, and the pH of the culture medium is adjusted to pH 6.8 to pH 7.2 using a base solution such as CO 2 or sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate. can, but is not limited thereto.
  • the number of cells can be obtained by inoculating a cell line into a shake flask, subculture and suspension culture, and the production culture is recombinant by inoculating the cell line with the cell number secured in a bioreactor and culturing in suspension. protein can be obtained.
  • the chromatography, virus inactivation process, concentration and filtration process may be performed in various sequences to achieve optimal production yield.
  • the step of purifying the culture solution (b) comprises: (b-1) performing anion exchange chromatography; (b-2) performing hydrophobic interaction chromatography; (b-3) treatment with a virus-inactivating agent to inactivate the virus, followed by concentration and diafiltration; (b-4) performing mixed mode chromatography to obtain an eluate; And (b-5) after concentrating and diafiltration of the eluate, the steps of performing nanofiltration may be performed in a series sequence.
  • a treatment process for removing cell debris from the culture solution may be performed before the step of purifying the culture solution (b).
  • a purification step may be performed on the culture filtrate obtained by filtering the culture solution.
  • the filter medium used for filtration may be a depth filter.
  • the pore diameter of the filter medium may be 1 ⁇ m or less, 0.5 ⁇ m or less, 0.45 ⁇ m or less, 0.3 ⁇ m or less, 0.25 ⁇ m or less, 0.2 ⁇ m or less, and filter media of various diameters may be mixed and used.
  • chromatography refers to the percolation of a mixture through an adsorbent that adsorbs or retains more or less strongly the solutes due to the properties of the solutes, such as pI, hydrophobicity, size and structure, under the specific buffer conditions of the process.
  • percolation it refers to a process of separating a solute of interest in a mixture, eg, a protein of interest, from other solutes in the mixture.
  • anion exchange chromatography may be used.
  • the anion exchange chromatography can remove the medium composition and impurities contained in the culture solution or the culture filtrate.
  • the anion exchange chromatography was performed using DEAE Cellulose, Poros PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 (Applied Biosystems), MonoQ, MiniQ, Source 15Q and 3OQ, Q, DEAE and ANX Sepharose.
  • the culture medium to be purified may be loaded at a flow rate of 150 ⁇ 15 cm/hr.
  • Conditions such as the type of the resin, pH, and flow rate can be changed within a range that can be normally adjusted by those skilled in the art, but is not limited thereto.
  • the anion exchange chromatography may use a wash buffer having a sodium chloride concentration of 150 mM or less, 0.1 mM to 150 mM, 10 mM to 150 mM, or 100 mM to 150 mM.
  • an elution buffer having a sodium chloride concentration of 400 mM to 600 mM, 450 mM to 550 mM, or 500 mM may be used.
  • the content of impurities in the culture medium containing the VZV gE antigen can be minimized.
  • hydrophobic interaction chromatography may be used.
  • the medium composition solution and impurities may be removed by using the hydrophobic interaction chromatography.
  • the hydrophobic interaction chromatography is butyl FF, butyl HP, octyl FF, phenyl FF, phenyl HP, phenyl FF (high sub), phenyl FF (low sub), capto phenyl impres (Capto Phenyl ImpRes), capto phenyl (high sub) ), Capto Octyl, Capto Butyl Impress, Capto Butyl (GE healthcare), Toyo Pearl® Super Butyl-550C, Toyo Pearl® Hexyl-650C, Butyl-650C, Phenyl-650C, Butyl 600 M, Phenyl-600M, PPG-600M , butyl-650M, phenyl-650M, ether-650M, butyl-650S, phenyl
  • a culture solution to be purified for example, an eluate of anion exchange chromatography may be loaded at a flow rate of 100 ⁇ 10 cm/hr.
  • 1 to 10 M, 2 to 8 M, 3 to 7 M, or 5 M of sodium chloride may be added to the target solution before purification.
  • a washing buffer containing sodium chloride may be used, and an elution buffer containing no sodium chloride may be used.
  • Conditions such as the type of the resin, pH, and flow rate can be changed within a range that can be normally adjusted by those skilled in the art, but is not limited thereto.
  • the step (b) of purifying the culture medium may include the step of inactivating the virus by treating the virus-inactivating agent.
  • the virus inactivation process can inactivate a potential enveloped virus in a solution containing the VZV gE antigen to be purified.
  • the virus-inactivating agent may be a phosphoric acid solution.
  • it can be adjusted to pH 2.8 to pH 3.2, pH 2.9 to pH 3.1, or pH 3.0 by adding the virus-inactivating agent to the eluate of the hydrophobic interaction chromatography. If the pH is less than 2.8 in the virus inactivation step, the structure of the VZV gE antigen may be denatured, and if the pH exceeds 3.2, there is a fear that the virus may not be inactivated.
  • mixed mode chromatography may be performed.
  • the mixed mode chromatography can remove dimers and impurities from a solution containing the VZV gE antigen.
  • Mixed mode chromatography can be performed with resins such as Bakerbond® ABX (JT Baker), ceramic hydroxyapatite types I and II and fluoride hydroxyapatite (Bio-Rad) and MEP and MBI Hypercell (Pall Corporation). , preferably ceramic hydroxyapatite.
  • a culture solution to be purified for example, a solution obtained by concentrating and filtering an eluate of hydrophobic interaction chromatography may be loaded at a flow rate of 100 ⁇ 10 cm/hr.
  • conditions such as resin, buffer, and pH can be changed within a range that can be generally controlled by those skilled in the art, but is not limited thereto.
  • the step (b) of purifying the culture solution may include the step of performing concentration and filtration.
  • the concentration and filtration process may be performed several times during the purification process of the culture medium, and may be performed between or after each chromatography or virus inactivation step.
  • concentration and filtration may be performed to obtain a solution having conditions suitable for mixed mode chromatography.
  • the VZV gE fraction may be concentrated by ultrafiltration and/or diafiltration, and may include one or more tangential flow filtration (TFF) steps.
  • concentration and filtration may be performed to control the concentration of the VZV gE antigen.
  • diafiltration may be performed until the pH and conductivity of the filtrate reach desired values, and then ultrafiltration may be used to control the protein concentration.
  • the step (b) of purifying the culture solution may include nanofiltration of the concentrated and filtered mixed mode chromatography eluate.
  • the nanofiltration may use a filtration system through a nanofilter. Nanofiltration can be used to separate the virus from a solution comprising VZV gE antigen, for example, a nanofilter with a pore size of less than 75 nm, less than 50 nm or less than 15 nm.
  • the step (b) of purifying the culture solution may further include filtration after diluting the nano-filtered filtrate with a formulation buffer.
  • the filtration may be performed using a micro filter having a pore size of 0.05 to 0.8 ⁇ m, 0.07 to 0.6 ⁇ m, or 0.1 to 0.4 ⁇ m.
  • the protein When the nano-filtered filtrate is diluted through the step of purifying the culture solution (b) and filtered using a micro filter, the protein can be obtained in a yield of 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more.
  • the HCP content of the purified culture medium is about 180 ppm or less, 170 ppm or less, 160 ppm or less, 150 ppm or less, 100 ppm or less, 80 ppm or less, 70 ppm or less, 60 ppm or less, 50 ppm or less, 30 ppm or less, or It may be 10 ppm or less.
  • the expression vector was transfected into CHO DG44 (Thermo Fisher Scientific, USA) host cells adapted to a chemically defined medium (CDM4CHO (+0/20 nM MTX; Methotrexate)), and the surface protein antigen of Varicella zoster virus A cell line (MGgE-CHO DG44) that highly expresses ((MGgE, SEQ ID NO: 1) was prepared.
  • the pMSID2-MGgE expression vector prepared in Example 1 and the truncated gE antigen (GSKgE; SEQ ID NO: 4) disclosed in Korean Patent Registration No. 10-1357204 were used.
  • the pMSID2-GSKgE expression vector prepared by cloning the coding gene into the pMSID2 vector was transformed into a cell line (MGgE-CHO-S) using CHO-S host cells adapted to a chemically defined medium (CD forti CHO (+50 nM MTX)). and GSKgE-CHO-S) were prepared.
  • VGV gE After culturing the MGgE-CHO DG44, MGgE-CHO-S and GSKgE-CHO-S in a chemically defined medium for 6 days, the expression level of VGV gE was confirmed by western blot and ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
  • the productivity of MGgE was superior to that of GSKgE in the CHO-S cell line, and the productivity of MGgE was superior to that of CHO-DG44 in the CHO-S cell line.
  • MGgE had the highest productivity in the cell line of CHO DG44(S) adapted to CDM4CHO (+20 nM MTX) medium.
  • Example 2 Establishment of a culture method for MGgE production
  • Example 2.1 Seed culture to secure cell number of cell line
  • the MGgE-CHO DG44 cell line prepared in Example 1 was inoculated in a 500 mL flask to a total of 100 mL at 3x10 5 cells/mL or more, and cultured at 36°C to 38°C, 4% to 6% CO 2 conditions, The number of cells was secured by repeating the step of inoculating a cell line of 2x10 5 cells/mL to 5x10 5 cells/mL to a total of 200 mL to 800 mL while increasing the volume of the flask at intervals of 2 to 4 days.
  • the MGgE-CHO DG44 cell line obtained in Example 2.1 was inoculated into a bioreactor at a cell concentration of 2x10 5 cells/mL to 5x10 5 cells/mL, and then at a constant temperature of 34°C to 35.5°C, pH 6.7 to pH 7.1, 10% to 90% dissolved oxygen, and suspension cultured under conditions of a stirring speed of 62 rpm to 72 rpm.
  • ELISA was performed to measure the content of MGgE antigen. Specifically, after diluting VZV gE antibody (Cat. #sc-17549, 200 ⁇ g/mL) in PBS to a concentration of 1 ⁇ g/mL, put 100 ⁇ L per well in a 96-well ELISA plate, and overnight incubation at 4°C (coating) did After washing the plate 3 times with a washing solution (0.05% tween 20 / PBS (phosphate-buffered saline)), it was incubated for 1 hour with a PBS solution containing 2% BSA. After washing the ELISA plate again, diluted samples were added, incubated for 2 hours, and washed again.
  • VZV gE antibody Cat. #sc-17549, 200 ⁇ g/mL
  • PBS phosphate-buffered saline
  • VZV gE antibody (Cat. #sc-56995, 100 ⁇ g/mL) was diluted to a concentration of 1 ⁇ g/mL, put in 100 ⁇ L per well, and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the plate, diluted Goat anti-mouse IgG-HRP to 1/1000 concentration, put 100 ⁇ L per well, and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the MGgE-CHO DG44 cell line obtained in Example 2.1 above was treated with 2x10 5 cells/mL After inoculation and suspension culture in a bioreactor at a cell concentration of 5x10 5 cells/mL to about 60x10 5 cells/mL, 80x10 5 cells/mL and 150x10 5 cells/mL, the incubation temperature was increased when the cell concentration reached about 60x10 5 cells/mL, respectively. It was lowered to 32 °C and cultured for production.
  • the MGgE-CHO DG44 cell line obtained in Example 2.1 was cultured under constant temperature conditions at 37°C, and then the productivity of MGgE antigens was compared (see Table 1, FIGS. 5A and 5B ).
  • Example 2.2 the MGgE-CHO DG44 cell line inoculated into a bioreactor with a cell concentration of 2x10 5 cells/mL to 5x10 5 cells/mL was produced under constant temperature conditions selected within the range of 33 to 37 ° C. cultured (Table 2, Figures 6a and 6b).
  • FIGS. 6a and 6b low-temperature culture conditions lower than 37°C, which is a suitable temperature for general CHO cells to grow (incubation period at a constant temperature of 34°C to 35.5°C, the culture period was increased, and productivity was increased. In addition, cell growth was slowed and productivity was lowered under conditions below 33.5 ° C.
  • qP is related to the number of cells in culture. This is because the number is much smaller than that of other batches (see Integral VCD values), that is, it can be seen that the low temperature conditions of 34°C to 35.5°C significantly improved the productivity of MGgE antigen in the MGgE-CHO DG44 cell line.
  • the pressure condition during filtration was maintained below 0.9 bar, and the filtrate from which cell debris was removed was filtered with a 0.45 + 0.2 ⁇ m filter (Sartopore II, Sartorius, Germany) to obtain a culture filtrate.
  • Example 3.2 Anion exchange chromatography - Comparison of yields according to sodium chloride concentration of wash buffer and elution buffer
  • the column was equilibrated to a pH of 7.0 ⁇ 0.2 using an equilibration buffer. Then, the culture filtrate obtained in Example 3.1. was loaded onto the column so that the flow rate was 150 ⁇ 15 cm/hr. Thereafter, the MGgE antigen was eluted and recovered using an elution buffer containing sodium chloride after washing sequentially with an equilibration buffer and a wash buffer containing sodium chloride.
  • Q sepharose FF GE Healthcare, USA
  • anion exchange chromatography was performed using a wash buffer containing 150 mM, 200 mM and 250 mM sodium chloride and an elution buffer containing 500 mM sodium chloride (Table 3).
  • anion exchange chromatography was performed using a wash buffer containing 150 mM sodium chloride and an elution buffer containing 400 mM, 500 mM and 600 mM sodium chloride (Table 4).
  • the optimal concentrations of sodium chloride contained in the wash buffer and the elution buffer in the anion exchange chromatography during the purification step of the MGgE antigen are 150 mM and 500 mM, respectively.
  • Hydrophobic interaction chromatography was performed to remove the medium composition and impurities that could not be removed from the anion exchange chromatography eluate obtained in Example 3.2.
  • the column was equilibrated to a pH of 7.0 ⁇ 0.2 using an equilibration buffer. Then, 5 M sodium chloride was added to the anion exchange chromatography eluate obtained in Example 3.2, and the column was loaded at a flow rate of 100 ⁇ 10 cm/hr. Thereafter, the MGgE antigen was eluted and recovered using an equilibration buffer and a wash buffer containing 1 M sodium chloride, and then an elution buffer containing no sodium chloride.
  • Tosoh Tosoh
  • the virus inactivation step was performed by adding a solvent to inactivate the enveloped virus in the solution containing the MGgE antigen.
  • the pH was adjusted to 3.0 ⁇ 0.2 by adding phosphoric acid to the hydrophobic interaction chromatography eluate obtained in Example 3.3, and stirred at 100 ⁇ 20 rpm for 30 minutes at room temperature (control) to remove the virus. inactivated. Thereafter, the pH was adjusted to 6.5 ⁇ 0.5 using disodium phosphate.
  • Example 3.5 First concentration and diafiltration
  • the first concentration and diafiltration steps were performed to remove low molecular weight ions from the solvent-added MGgE-containing solution obtained in Example 3.4 and to have conditions suitable for the mixed mode chromatography process.
  • the solution containing the MGgE antigen to which the solvent was added was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration/diafiltration (Sartocon cassette (50K)) system, and the equilibration buffer of the next process, the Mixed mode chromatography process, was diafiltration was performed until the pH of the filtrate was 7.2 ⁇ 0.2 and the conductivity was 2.5 mS/cm or less.
  • hydroxyapatite (Ceramic Hydroxyapatite, Bio-Rad) resin, which is a ceramic material, using an equilibration buffer
  • the pH was equilibrated to 7.2 ⁇ 0.2.
  • the non-adsorbed solution was recovered while the solution containing the dialysis and/or concentrated MGgE antigen of Example 3.5 was loaded onto the column at a flow rate of 100 ⁇ 10 cm/hr, and then the column was washed with an equilibration buffer to recover together.
  • the mixed mode chromatography non-adsorbent solution used an ultrafiltration/diafiltration (Sartocon cassette (50K)) system, and the pH of the filtrate was 7.4 ⁇ 0.2, using the equilibration buffer of the next step, the nanofiltration process, Diafiltration was performed until the conductivity became 15.5 mS/cm or more. Thereafter, it was concentrated by ultrafiltration to a protein concentration of 7.0 ⁇ 0.5 mg/mL.
  • Nanofiltration is a virus removal step, and pH was equilibrated to 7.4 ⁇ 0.2 using a formulation buffer in a nanofilter (Planova 20N, Asahi).
  • the virus was removed from the solution containing the dialysis-concentrated MGgE antigen in Example 3.7 through a nanofilter under a pressure condition of 1.0 ⁇ 0.2 bar, and then the nanofilter was washed with an equilibration buffer. After mixing the nano-filtered filtrate and the washing solution together, the protein concentration was measured.
  • the nano-filtered filtrate obtained in Example 3.8 was diluted with a formulation buffer so that the protein concentration was 5.0 ⁇ 0.5 mg/mL, and then filtered using a 0.2 ⁇ m filter.
  • Example 3 the yield of each purification step was confirmed by measuring the content of MGgE antigen at each step (Table 6). With respect to the protein content of MGgE in Table 6, each culture medium that has undergone the Harvest and clarification and Anion exchange chromatography steps marked with * was confirmed by an ELISA test, and the culture medium in subsequent steps was measured using UV.

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Abstract

본 발명은 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원의 생산 방법은 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원을 높은 수율 및 높은 순도로 수득할 수 있는 효과적인 생산방법이다. 따라서, 상기 방법은 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물로 이용하기 위한 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원을 생산하기에 유용하다.

Description

바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원의 생산 방법
본 발명은 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원의 생산 방법에 관한 것이다.
바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus, VZV)는 주로 아동 및 청소년에서 수두를 일으키는 바이러스로, 한번 감염 후 수년 동안 감각신경근 및 뇌신경의 신경절 세포에 잠복해 있다가, 성인이 되어 면역력이 떨어지면, 재활성화 되어 대상포진을 유발하는 바이러스이다. 수두는 전염성이 강한데 일단 감염되면 열감 및 권태감을 동반한 전신에 수포성 홍반을 나타내게 된다. 정상 소아에서는 대부분의 경우 심각하게 진행되는 경우가 드물고 최종적으로 자기 한정 질환(self-limiting disease)으로 진행되지만, 장기이식, 항암치료를 받은 환자에서 심각한 증상으로 진행되는 경우가 많이 발생하는 것으로 알려져 있다(Adriana Weinberg et al., J Infectious Diseases, 200(7):1068, 2009; Judith Breuer et al., Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.1394843).
대상포진의 초기 증상은 몸살처럼 온몸이 쑤시고 아프거나 심한 가려움증과 따끔거림, 화끈거림, 칼로 찌르는 듯한 심한 통증이 수반되며, 수일이 지나면 수포가 발생하게 되는데, 피부 병변이 많을수록 통증이 커지며, 고령의 환자일수록 더 심각한 통증을 호소하는 경향이 있는 질병이다. 대상포진은 완치가 돼도 신경통증의 후유증을 남기는데, 40세 이하의 성인에게는 비교적 드물지만, 60세 이상에서는 잠을 설치거나, 만성피로를 호소하기도 하고, 작은 접촉이나 마찰에도 심한 통증을 느끼거나, 우울증까지 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
대상포진 예방 백신으로는 Oka 주의 약독화 생백신인 ZOSTAVAX(머크사)가 개발되었으며, 백신에 포함된 바이러스의 양이 많기 때문에, 어린이나 청소년이 아닌 50세 이상 성인을 대상으로 사용하는 것을 조건으로 미국과 한국에서 허가되어 판매되고 있다. 최근에는 글락소스미스클라인사에 의하여 50세 이상의 성인을 대상으로 하는 바이러스 표면 단백질인 gE 및 면역증강제로 구성된 백신이 개발되어, 임상시험에서 예방효과가 입증되었다(미국 등록특허공보 제7,939,084호).
이에, 본 발명자들은 바리셀라 조스터 바이러스(VZV)의 표면 단백질(gE) 항원의 면역원성에는 영향을 주지 않으면서도 생산성을 높일 수 있는 방법에 대한 연구를 진행하던 중, VZV gE 항원의 생산성을 향상시킬 수 있는 배양 및 정제 방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, (a) 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus, VZV)의 표면 단백질(gE) 항원을 생산하는 재조합 세포주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양액을 정제하는 단계를 포함하는, VZV gE 항원의 생산 방법을 제공한다.
상기 (a) 배양액을 수득하는 단계는, (a-1) 상기 재조합 세포주를 종배양하는 단계; 및 (a-2) 상기 종배양한 세포주를 생산배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; 바이러스-비활성제를 처리하여 바이러스를 불활화시키는 단계; 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 농축 및 여과를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원의 생산 방법은 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원을 높은 수율 및 높은 순도로 수득할 수 있는 효과적인 생산방법이다. 따라서, 상기 방법은 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물로 이용하기 위한 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원을 생산하기에 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 VZV gE 항원을 생산하기 위해 배양 및 정제하는 과정을 흐름도로 나타낸 것이다.
도 2는 pMSID2-MGgE 벡터 제작 공정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 VZV gE 및 세포주의 종류에 따른 VZV gE 생산성을 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 4는 VZV gE 및 세포주의 종류에 따른 VZV gE 생산성을 ELISA로 확인한 결과이다.
도 5a는 MGgE가 도입된 세포주의 생산배양 단계에서 배양 온도의 전환에 따른 생존 세포 밀도(viable cell density, VCD)를 확인한 결과이다.
도 5b는 MGgE가 도입된 세포주의 생산배양 단계에서 배양 온도의 전환에 따른 생산성(productivity)을 확인한 결과이다.
도 6a는 MGgE가 도입된 세포주의 생산배양 단계에서 배양 온도에 따른 생존 세포 밀도를 확인한 결과이다.
도 6b는 MGgE가 도입된 세포주의 생산배양 단계에서 배양 온도에 따른 생산성을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, (a) 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus, VZV)의 표면 단백질(gE) 항원을 생산하는 재조합 세포주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양액을 정제하는 단계를 포함하는 VZV gE 항원의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원은 바람직하게는 국제공개번호 WO 2019/225962 A1에 개시된 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 중 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원(MGgE)은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원에서 537번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체이다.
상기 537번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단된 변이는 아미노 말단(N-말단)으로부터 카르복시(C-말단) 방향으로 1 내지 537번째 아미노산 잔기가 존속하고, 538번째 아미노산 잔기부터 카르복시 말단까지의 연속된 아미노산 잔기가 절단된 변이를 의미한다.
상기 VZV gE 항원을 생산하는 세포주는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 VZV gE 항원을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 상기 VZV gE 항원을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포주일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 한국 등록 특허 제10-1591823호에 개시된 pMSID2 벡터를 발현 벡터일 수 있으나, 세포주에 VZV gE 항원을 형질감염하기에 적합한 벡터라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀(episome)으로 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단을 말한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 같은 발현 조절 요소(element) 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈을 표적 단백질을 암호화하는 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체는 상기 벡터에 의해 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "유전적으로 변형된"이라는 용어는 숙주세포, 비-인간 숙주개체, 선행종(predecessors) 또는 모종(parents)으로 도입된 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 숙주세포, 비-인간 숙주개체, 선행종 또는 모종이 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 구체적으로는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 숙주세포는 진핵세포이다. 상기 진핵세포는 진균세포(fungus), 식물세포 또는 동물세포를 포함한다. 진균세포의 예로는 효모, 구체적으로는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)의 효모, 더욱 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)일 수 있다. 또한, 동물세포의 예로는 곤충세포 또는 포유동물 세포가 있고, 구체적인 동물세포의 예로는 HEK293, 293T, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A 등이 있다. 또한, 통상의 기술분야에 잘 알려져 있는 적당한 세포주들은 ATCC(American Type Culture Collection)와 같은 세포주 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 VZV gE 항원은 박테리아, 이스트, 포유동물 세포, 식물, 형질전환 동물과 같은 다양한 종류의 유기체에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 치료제에 대한 규제 및 제조된 단백질이 천연형과 유사하여야 한다는 점에서 포유동물의 세포를 사용할 수 있다. 상기 포유동물 세포의 예로는 불사의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cell), NS/O 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포), COS 세포 등이 있고, 본 발명의 일 실시예에 의하면 CHO DG44 세포를 사용할 수 있다.
상기 세포주에 본 발명에 따른 발현 벡터를 도입하기 위해서는 통상의 기술분야에 공지된 기술을 사용할 수 있고, 예로는 전기충격 유전자전달법(eletroporation), 원형질 융합법, 인산칼슘(CaPO4) 침전법 및 염화 칼슘(CaCl2) 침전법 등이 있다.
구체적으로, 상기 (a) 배양액을 수득하는 단계는, (a-1) 상기 재조합 세포주를 종배양하는 단계; 및 (a-2) 상기 종배양한 세포주를 생산배양하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "종배양(seed culture)"은 세포주를 대량으로 얻는 것을 목적으로 하는 배양을 의미한다. 상기 종배양은 세포수가 가장 활발하게 증가할 수 있는 온도 조건에서 배양될 수 있다. 다시 말해서, 세포주의 일정 세포수를 확보하기 위하여 종배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생산배양(production culture)"은 재조합 단백질을 생산하기 위하여 세포주를 대량 배양하는 것을 의미한다.
상기 (a-1) 종배양하는 단계는, VZV gE 항원을 생산하는 세포주를 계대배양, 현탁배양 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, VZV gE 항원을 생산하는 세포주를 계대배양 및 현탁배양 방식으로 종배양하고, 현탁배양 방법으로 생산배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "계대배양(subculture)"은 배양 주기에 따라 동일한 또는 다른 신선한 배지로 세포주를 옮겨가며 배양하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 계대배양은 세포주를 1일 내지 7일, 2일 내지 5일, 또는 3일 내지 4일 간격으로, 동일한 신선한 배지에 옮겨 접종하여 배양할 수 있다. 이때, 접종하는 세포수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4x105 cells/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더불어, 계대배양에서의 CO2 농도는 4.0% 내지 6.0%, 4.5% 내지 5.5%, 또는 5.0%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "현탁배양(suspension culture)"은 배양액에 세포가 부유한 상태에서 하는 배양법을 의미하며, 혈액세포나 복수의 암세포와 같이 생체 내에서도 부유 상태로 증식하는 세포는 진탕이나 회전을 시키지 않더라도 부유배양할 수 있지만 대부분의 경우는 각반자를 회전시키거나(각반배양), 배양병마다 진탕하거나(진탕배양), 또는 배양기를 회전시켜(선회배양) 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 현탁배양은 86 rpm 내지 96 rpm, 88 rpm 내지 94 rpm, 또는 90 rpm 내지 92 rpm의 교반속도의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 현탁배양에서 접종하는 세포수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4x105 cells/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더불어, pH는 pH 6.7 내지 pH 7.1, 또는 pH 6.8 내지 pH 7.0일 수 있다. 또한, 용존산소농도는 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 60%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
세포배양, 특히 동물세포의 배양을 통해 재조합 단백질을 생산하는 경우에, 배양기간을 늘리면서 생산성을 높이기 위해 세포의 성장에 적합한 온도에서 배양하다가 그보다 낮은 온도에서 배양하여 세포분열주기를 정지시켜 재조합 단백질의 생산으로 전환시키는 것이 일반적이다((Enhancement of productivity of recombinant α-amidating enzyme by low temperature culture, Furukawa K et al., Cytotechnol, 1999, Vol. 31, 85 - 94), (Enhancing Effect of Low Culture Temperature on Specific Antibody Productivity of Recombinant Chinese Hamster Ovary Cells: Clonal Variation, Yoon S K et al., Biotechnol Prog, 2004, Vol. 20, 1683 - 1688). 그러나, 본 발명자들은 VZV gE 항원의 생산을 위한 세포주 배양의 경우에는 그러한 배양 온도의 전환 없이 세포주 성장에 적합한 온도보다 낮은 온도에서 생산배양하거나, 항온 조건에서 종배양 및/또는 생산배양하거나 또는 일정한 낮은 온도 조건에서 종배양 및 생산배양하는 것이 수율 및 순도 측면에서 유리한 것을 확인하였다.
구체적으로, 상기 (a-1) 종배양하는 단계는, 상기 세포주를 34℃ 내지 38℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다. 또한, 상기 (a-2) 생산배양하는 단계는, 상기 세포주를 34 내지 35.5℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포주를 36 내지 38℃, 36.5 내지 37.5℃ 또는 37℃의 온도에서 종배양할 수 있고, 이후 종배양된 세포주를 34 내지 35.5℃, 34.5 내지 35.5℃ 또는 35℃의 온도에서 생산배양할 수 있다. 또한, 상기 세포주를 34 내지 35.5℃, 34.5 내지 35.5℃ 또는 35℃의 온도에서 종배양할 수 있고, 이후 종배양된 세포주를 34 내지 35.5℃, 34.5 내지 35.5℃ 또는 35℃의 온도에서 생산배양할 수 있다. 또한, 상기 세포주를 34 내지 35.5℃의 온도 범위 내에서 일정한 온도로 종배양 및 생산배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 생산배양은 현탁배양법에 의한 것일 수 있다. 이 때, 상기 현탁배양은 62 rpm 내지 72 rpm, 64 rpm 내지 70 rpm, 또는 66 rpm 내지 68 rpm의 교반속도의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 현탁배양에서 접종하는 세포수는 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL, 3x105 cells/mL 내지 4x105 cells/mL, 또는 4x105 cells/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 세포수는 VZV gE 항원의 생산배양에 있어서 최적의 세포 밀도에 해당한다. 세포 밀도가 2x105 cells/mL 미만인 경우 세포수가 너무 적어 수득되는 단백질의 양이 적고, 5x105 cells/mL를 초과하는 경우 세포 파괴물(cell debris) 등의 HCP(Host Cell Protein) 또한 많이 생산되어 정제 공정에서 HCP를 의약품 기준에 부합되는 농도로 제거하기가 어렵다는 문제점이 있다. 더불어, pH는 pH 6.7 내지 pH 7.1, 또는 pH 6.8 내지 pH 7.0일 수 있다. 또한, 용존산소농도는 10% 내지 90%, 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 60%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양은 플라스크(flask) 또는 생물반응기(bioreactor)에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스크 및 생물반응기의 종류 및 배양 조건은 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 변경 가능하다. 구체적으로는 동물세포의 부유배양이 가능한 wave bioreactor 및 stirred tank bioreactor 등이 사용될 수 있고, 배양액의 pH를 CO2나 탄산나트륨 및 탄산수소나트륨 등의 염기 용액을 이용하여 pH 6.8 내지 pH 7.2로 조절하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 종배양은 세포주를 Shake Flask에 접종하여 계대배양 및 현탁배양하여 세포수를 확보할 수 있고, 상기 생산배양은 상기 세포수를 확보한 세포주를 생물반응기에 접종하여 현탁배양하여 재조합 단백질을 수득할 수 있다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; 바이러스-비활성제를 처리하여 바이러스를 불활화시키는 단계; 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 농축 및 여과를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피, 바이러스 불활화 공정, 농축 및 여과 공정은 최적의 생산 수율을 달성하기 위하여 다양한 순서로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는, (b-1) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; (b-2) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (b-3) 바이러스-비활성제를 처리하여 바이러스를 불활화시킨 후, 농축 및 투석여과를 수행하는 단계; (b-4) 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수득하는 단계; 및 (b-5) 상기 용출액을 농축 및 투석여과한 후에, 나노여과를 수행하는 단계가 일련의 순서대로 수행되는 것일 수 있다.
또한, 상기 (b) 배양액을 정제하는 단계 전에, 배양액으로부터 세포 파괴물(cell debris)을 제거하기 위한 처리 과정을 거칠 수 있다. 예를 들어, 상기 배양액을 여과한 배양 여과액에 대하여 정제 단계를 수행할 수 있다. 이때, 여과에 사용되는 여과재는 뎁스필터일 수 있다. 또한, 여과재의 구멍 직경이 1㎛ 이하, 0.5㎛ 이하, 0.45㎛ 이하, 0.3㎛ 이하, 0.25㎛ 이하, 0.2㎛ 이하일 수 있고, 여러 직경의 여과재를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "크로마토그래피"는 공정의 특정한 완충 조건 하에, 용질의 특성, 예컨대 pI, 소수성, 크기 및 구조로 인해 용질을 보다 더 또는 보다 덜 강하게 흡착하거나 보유하는 흡착제를 통한 혼합물의 퍼콜레이션(percolation)에 의해, 혼합물 중 관심 용질, 예를 들어 관심 단백질을 혼합물 중 다른 용질로부터 분리하는 공정을 의미한다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계에서, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 상기 음이온 교한 크로마토그래피는 배양액 또는 배양여과액에 포함된 배지 조성액 및 불순물을 제거할 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE 셀룰로스, 포로스 PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50(Applied Biosystems), 모노Q, 미니Q, 소스 15Q 및 3OQ, Q, DEAE 및 ANX 세파로스 패스트 플로우, Q 세파로스 고 성능, QAE SEPHADEXTM 및 Q 세파로스 패스트 플로우(GE Healthcare), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT(J.T. Baker), 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA(Biochrom Labs Inc.), 유노스피어 Q, 마크로-프렙 DEAE 및 마크로-프렙 하이 Q(Biorad) 등의 레진이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 Q 세파로스 패스트 플로우레진일 수 있다.
또한, pH 7.0±0.2이 되도록 평형화 시킨 후, 정제 대상인 배양액을 150±15 cm/hr의 유속으로 로딩할 수 있다. 상기 레진의 종류, pH 및 유속 등의 조건은 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 변경 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 음이온 교환 크로마토그래피는 염화나트륨의 농도가 150 mM 이하, 0.1 mM 내지 150 mM, 10 mM 내지 150 mM, 또는 100 mM 내지 150 mM인 세척 완충액을 사용할 수 있다. 또한, 염화나트륨의 농도가 400 mM 내지 600 mM, 450 mM 내지 550 mM, 또는 500 mM인 용출 완충액을 사용할 수 있다. 상기 염화나트륨의 농도 범위의 세척 완충액 및 용출 완충액을 사용하여 정제하는 경우, VZV gE 항원을 포함하는 배양액의 불순물 함량을 최소화할 수 있다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 배지 조성액 및 불순물을 제거할 수 있다. 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸 FF, 부틸 HP, 옥틸 FF, 페닐 FF, 페닐 HP, 페닐 FF (high sub), 페닐 FF (low sub), 캅토 페닐 임프레스(Capto Phenyl ImpRes), 캅토 페닐 (high sub), 캅토 옥틸, 캅토 부틸임프레스, 캅토 부틸 (GE healthcare), 토요펄® 슈퍼 부틸-550C, 토요펄® 헥실-650C, 부틸-650C, 페닐-650C, 부틸 600 M, 페닐-600M, PPG-600M, 부틸-650M, 페닐-650M, 에테르-650M, 부틸-650S, 페닐-650S, 에테르-650S, TSK겔 페닐-5PW, TSK겔 에테르-5PW(Tosoh Bioscience) 등의 레진이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 토요펄 부틸-650M(Tosoh Bioscience)일 수 있다.
또한, pH 7.0±0.2이 되도록 컬럼을 평형화 시킨후, 정제 대상인 배양액, 예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피의 용출액을 100±10 cm/hr의 유속으로 로딩할 수 있다. 이때, 정제 수행 전 대상 용액에 1 내지 10 M, 2 내지 8 M, 3 내지 7 M, 또는 5M 의 염화나트륨을 첨가할 수 있다. 또한, 염화나트륨이 포함된 세척 완충액을 사용할 수 있고, 염화나트륨이 포함되지 않은 용출 완충액을 사용할 수 있다. 상기 레진의 종류, pH 및 유속 등의 조건은 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 변경 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계에서, 바이러스-비활성제를 처리하여 바이러스를 불활화시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 바이러스 불활화 과정은 정제 대상인 VZV gE 항원이 포함된 용액의 잠재적 외피 바이러스를 불활성시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 바이러스-비활성제는 인산 용액일 수 있다. 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용출액에 상기 바이러스-비활성제를 첨가하여 pH 2.8 내지 pH 3.2, pH 2.9 내지 pH 3.1, 또는 pH 3.0이 되도록 조절할 수 있다. 상기 바이러스 불활화 단계에서 pH가 2.8 미만인 경우, VZV gE 항원의 구조가 변성될 수 있고, pH가 3.2를 초과하는 경우 바이러스가 불활화되지 않을 우려가 있다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계에서, 혼합 모드 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 상기 혼합 모드 크로마토그래피는 VZV gE 항원이 포함된 용액에서 다이머(dimer) 및 불순물을 제거할 수 있다. 혼합 모드 크로마토그래피는 베이커본드® ABX (J.T. Baker), 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 및 II 및 플루오라이드 히드록시아파타이트(Bio-Rad) 및 MEP 및 MBI 하이퍼셀(Pall Corporation) 등의 레진이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 세라믹 히드록시아파타이트일 수 있다.
또한, pH 7.0±0.2이 되도록 컬럼을 평형화 시킨후, 정제 대상인 배양액, 예를 들면, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용출액을 농축 및 여과한 용액을 100±10 cm/hr의 유속으로 로딩할 수 있다. 상기 혼합 모드 크로마토그래피는 당업자가 통상적으로 조절 가능한 범위 내에서 레진, 완충액 및 pH 등의 조건을 변경 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계에서, 농축 및 여과를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 농축 및 여과 공정은 배양액의 정제 과정에서 여러 번 수행될 수 있으며, 각 크로마토그래피나 바이러스 불활화 단계의 사이 또는 이후에 수행될 수 있다.
예를 들어, 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하기 전에, 혼합 모드 크로마토그래피에 적합한 조건을 갖는 용액이 되도록 농축 및 여과를 수행할 수 있다. 예를 들어, 한외 여과법(ultrafiltration) 및/또는 투석 여과법(diafiltration)에 의하여 VZV gE 분획을 농축할 수 있으며, 1회 이상의 접선 유동 여과(TFF) 단계를 포함할 수 있다.
또한, 혼합 모드 크로마토그래피를 수행한 후에, VZV gE 항원의 농도를 조절하기 위하여 농축 및 여과를 수행할 수 있다. 이때, 여과액의 pH 및 전도도가 원하는 수치에 도달할 때까지 투석 여과법을 수행할 수 있으며, 이후 단백질의 농도를 조절하기 위하여 한외여과법을 이용할 수 있다.
또한, 상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는, 농축 및 여과된 혼합 모드 크로마토그래피 용출액을 나노여과하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 나노여과는 나노 필터를 통한 여과 시스템을 이용할 수 있다. 나노여과는 VZV gE 항원을 포함하는 용액으로부터　바이러스를 분리하기 위해, 기공 크기가 예를 들어, 75 nm, 50 nm 미만 또는 15 nm 미만과 같은 나노필터가 이용될 수 있다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는, 상기 나노여과된 여과액을 제형 완충액으로 희석한 후, 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 여과는 기공의 크기가 0.05 내지 0.8 μm, 0.07 내지 0.6 μm 또는 0.1 내지 0.4 μm인 마이크로 필터를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 (b) 배양액을 정제하는 단계를 거쳐 나노여과된 여과액을 희석하고, 마이크로 필터를 이용하여 여과한 경우, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상의 수율로 단백질을 수득할 수 있다. 또한, 정제된 배양액의 HCP 함량은 약 180 ppm 이하, 170 ppm 이하, 160 ppm 이하, 150 ppm 이하, 100 ppm 이하, 80 ppm 이하, 70 ppm 이하, 60 ppm 이하, 50 ppm 이하, 30 ppm 이하 또는 10 ppm 이하일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원의 발현 벡터 제작 및 형질전환
국제공개번호 WO 2019/225962 A1에 개시된 바리셀라 조스터 바이러스(VZV)의 표면 단백질(gE) 항원 변이체 유전자(MGgE; 서열번호 2)를 한국 등록 특허 제10-1591823호에 개시된 pMSID2 벡터에 클로닝하여 pMSID2-MGgE 발현벡터를 제작하였다(도 2). 다음으로, chemical defined medium(CDM4CHO (+0/20 nM MTX; Methotrexate))에 적응된 CHO DG44(Thermo Fisher Scientific, USA) 숙주세포에 상기 발현 벡터를 형질감염시켜 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원((MGgE, 서열번호 1)을 고발현하는 세포주(MGgE-CHO DG44)를 제작하였다.
실시예 1.1. 항원 및 세포주에 따른 단백질 생산성 확인
항원 및 세포주의 종류에 따른 단백질의 생산성을 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 제작한 pMSID2-MGgE 발현벡터 및 한국 등록특허 제 10-1357204호에 개시된 트렁케이션된 gE 항원(GSKgE; 서열번호 4)을 코딩하는 유전자를 상기 pMSID2 벡터에 cloning하여 제작한 pMSID2-GSKgE 발현벡터를 각각 chemical defined medium(CD forti CHO (+50 nM MTX)에 적응된 CHO-S 숙주세포를 사용하여 세포주(MGgE-CHO-S 및 GSKgE-CHO-S)를 제작하였다.
상기 MGgE-CHO DG44, MGgE-CHO-S 및 GSKgE-CHO-S를 각각 chemical defined medium에서 6일간 배양 후 VGV gE의 발현량을 웨스턴블랏 및 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 확인하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4를 참조하면, MGgE의 경우 GSKgE보다 CHO-S 세포주에서 생산성이 우수하였고, MGgE는 CHO-S 세포주보다 CHO DG44에서 생산성이 더욱 우수하였다. 특히, MGgE는 CDM4CHO (+20 nM MTX) 배지에 적응된 CHO DG44(S)의 세포주에서 생산성이 가장 높았다.
실시예 2. MGgE 생산을 위한 배양 방법의 확립
실시예 2.1. 세포주의 세포수 확보를 위한 종배양
상기 실시예 1에서 제작한 MGgE-CHO DG44 세포주를 500 mL flask에 3x105 cells/mL 이상으로 총 100 mL이 되도록 접종하고 36℃ 내지 38℃, 4% 내지 6% CO2 조건에서 배양한 후, 2 내지 4일 간격으로 flask의 부피를 늘려가면서 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL의 세포주를 총 200 mL 내지 800 mL이 되도록 접종하는 단계를 반복하여 세포수를 확보하였다. 플라스크에서 확보된 세포를 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL의 농도로 생물반응기에 접종한 후 36℃내지 38℃, pH 6.7 내지 pH 7.1, 10% 내지 90%의 용존산소 및 86 rpm 내지 96 rpm의 교반속도의 조건에서 현탁배양하여 세포수를 확보하였다.
실시예 2.2. MGgE 항원의 생산배양
상기 실시예 2.1에서 세포수를 확보한 MGgE-CHO DG44 세포주를 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL의 세포농도로 생물반응기에 접종한 후 34℃ 내지 35.5℃의 온도로 일정하게, pH 6.7 내지 pH 7.1, 10% 내지 90%의 용존산소 및 62 rpm 내지 72 rpm의 교반속도의 조건에서 현탁배양하였다.
실시예 2.3. MGgE 항원의 정량
이하 실시예에서 MGgE 항원의 함량을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, PBS에 VZV gE 항체(Cat. #sc-17549, 200 μg/mL)를 1 μg/mL 농도로 희석한 뒤 96well ELISA plate에 well 당 100 μL씩 넣고 4℃에서 오버나이트 인큐베이션(coating)하였다. 세척용액(0.05% tween 20 / PBS (phosphate-buffered saline))으로 plate를 3회 세척 후 BSA를 2% 함유하는 PBS 용액으로 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA plate를 다시 세척한 후 희석된 샘플을 첨가하여 2시간 동안 인큐베이션하고 다시 세척하였다. 배양액 샘플은 원심분리 후 상등액을 -20℃ 이하에 보관한 뒤 측정 1시간 전에 상온에서 해동하여 사용하였다. VZV gE 항체(Cat. #sc-56995, 100 μg/mL)를 1 μg/mL 농도로 희석하여 well 당 100 μL씩 넣고 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Plate를 세척 후 Goat anti-mouse IgG-HRP를 1/1000 농도로 희석한 뒤 well 당 100 μL씩 넣고 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Plate를 세척하고 TMB(3,3,5,5'-테트라메틸 벤지딘)를 첨가하여 HRP 반응을 유도한 후 1 N H2SO4를 well 당 100 μL씩 분주하여 반응을 멈추고, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도를 표준곡선 수식에 대입하고 희석배수를 곱하여 샘플의 함량을 계산하였다.
실험예 1. 배양 온도 전환에 따른 생산성 확인
생산배양 단계 중 세포가 충분히 성장되었다고 판단되는 시점에 배양 온도 전환이 MGgE 항원의 생산성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상기 실시예 2.1에서 세포수를 확보한 MGgE-CHO DG44 세포주를 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL의 세포농도로 생물반응기에 접종하여 현탁배양한 후, 세포주의 세포농도가 각각 약 60x105 cells/mL, 80x105 cells/mL 및 150x105 cells/mL가 되었을 때 배양 온도를 32℃로 낮춰 생산배양하였다. 또한, 상기 실시예 2.1에서 세포수를 확보한 MGgE-CHO DG44 세포주를 37℃의 항온조건에서 생산배양한 후, MGgE 항원의 생산성을 비교하였다(표 1, 도 5a 및 도 5b 참조).
Process parameter w/o temp. shift Temp. shift (37 →32°C)
(1) (2) (3)
Temperature (°C) 37.0±0.5 37.0±0.5 → 32.0±0.5
Temperature shift point (x105 cells/mL) N/A Approximately 60 Approximately 80 Approximately 150
Process parameter w/o temp. shift Temp. shift (37 →32°C)
(1) (2) (3)
Culture duration
(day)		 11.5 14 14 14
Harvest productivity (mg/L) 1576±28 1096 1248 1183±115
qP (pg/cell/day) 13.7±0.7 11.9 11.5 7.7±0.5
그 결과, 표 1 및 도 5a, 도 5b를 참조하면, 온도를 전환한 경우 세포주가 생존하는 배양 기간은 증가하였으나, MGgE 항원의 생산성(qP)은 오히려 항온 조건에서 보다 낮은 것을 알 수 있다.
이는 MGgE 항원의 생산배양시, MGgE-CHO DG44 세포주 배양온도를 온도 전환 없이 일정 범위 내에서 유지하는 것이 생산성을 향상시킨다는 점을 시사한다.
실험예 2. 생산온도에 따른 MGgE 항원의 생산성 확인
상기 실시예 2.2의 MGgE 항원의 생산배양 단계에서 2x105 cells/mL 내지 5x105 cells/mL의 세포농도 생물반응기에 접종한 MGgE-CHO DG44 세포주를 33 내지 37℃ 범위 내에서 선별된 항온 조건으로 생산배양하였다(표 2, 도 6a 및 도 6b).
Process parameter 33.0°C 33.5°C 34.0°C 34.5°C 35.0°C 35.5°C 37.0°C
Temperature 33.0°C 33.5°C 34.0°C 34.5°C 35.0°C 35.5°C 37.0°C
Process performance
Integral VCD
(x105 cells/mL·day)		 121.4 645.7 1681.4 1848.1 1705.7 1312.2 849.6
Culture duration (day) 11 16 14 14 14 12 10
Harvest productivity (mg/L) 205 880 2711 3268 3247 2196 1142
qP (pg/cell/day) 16.9 13.6 16.1 17.7 19.0 16.7 13.4
그 결과, 표 2, 도 6a 및 도 6b를 참조하면, 일반적인 CHO 세포가 성장하기 적당한 온도인 37℃보다 낮은 저온 배양 조건(34℃ 내지 35.5℃의 항온 조건에서 배양기간이 늘어나고, 생산성이 증가하였다. 또한, 33.5℃이하의 조건에서는 세포의 성장이 느려지고 생산성도 낮아졌다. 한편, qP는 배양 중 세포수와 관련이 있는 바, 33 ℃에서 qP의 수치가 다소 높게 계산된 것은 생산성이 좋지 않음에도 세포수가 다른 배치보다 매우 적기 때문이다(Integral VCD 값 참조). 즉, 34℃ 내지 35.5℃의 저온 조건이 MGgE-CHO DG44 세포주에서 MGgE 항원의 생산성을 현저히 향상시켰음을 알 수 있다.
실시예 3. MGgE 항원의 정제
실시예 3.1. 수확 및 분류(Harvest and clarification)
상기 실험예 2의 생산배양 조건인 35℃에서 배양한 배양액(MG1120)에서 배양액 내의 세포 파괴물(cell debris)을 제거하기 위해 뎁스필터(COHC Millipore, 미국)로 수확 및 분류하였다.
여과시 압력 조건은 0.9 bar 이하로 유지하였고, cell debris가 제거된 여과액을 0.45 + 0.2 μm filter(Sartopore II, Sartorius, 독일)로 여과하여 배양여과액을 수득하였다.
실시예 3.2. 음이온 교환 크로마토그래피(Anion exchange chromatography) - 세척 완충액 및 용출 완충액의 염화나트륨 농도에 따른 수득률 비교
상기 실시예 3.1.에서 수득한 배양여과액에 포함된 배지 조성액 및 불순물을 제거하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, Q sepharose FF(GE Healthcare, USA) 레진을 컬럼에 충진한 후 평형 완충액(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 7.0±0.2이 되도록 평형화 시켰다. 이후 실시예 3.1.에서 수득한 배양여과액을 유속 150±15 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였다. 그 후, 평형 완충액과 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액으로 순차적으로 세척한 다음 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 MGgE 항원을 용출시켜 회수하였다.
상기 세척 완충액 및 용출 완충액에 포함된 염화나트륨의 농도를 달리하였을 때, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 수득률을 비교하였다.
구체적으로, 150 mM, 200 mM 및 250 mM의 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액과 500 mM의 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다(표 3).
세척 완충액 조건 gE 총량 (ug) 수율
(%)		 HCP 총량 (ug) 수율
(%)		 용출액
pH NaCl conc.
(mM)		 로드액 용출액 로드액 용출액 MGgE 총량
(ug)		 HCP 총량
(ug)		 HCP/MGgE
(%)
7 150 253601 163781 64.6 171929 5401 3.1 163781 5400.8 3.3
200 253601 87608 34.5 171929 3082 1.8 87608 3081.6 3.5
250 200780 29096 14.5 231663 1802 0.8 29096 1802.4 6.2
그 결과, 표 3을 참조하면, 세척 완충액의 염화나트륨의 농도가 150 mM일 때 MGgE 당 불순물의 함량이 가장 낮았다.
이에, 150 mM의 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액과 400 mM, 500 mM 및 600 mM의 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다(표 4).
용출 완충액 조건 gE 총량 (ug) 수율
(%)		 HCP 총량 (ug) 수율
(%)		 용출액
pH NaCl conc.
(mM)		 로드액 용출액 로드액 용출액 MGgE 총량
(ug)		 HCP 총량
(ug)		 HCP/MGgE
(%)
7 400 253601 81152 32.0 171929 3093 1.8 81152 3093 3.8
500 253601 87608 34.5 171929 3082 1.8 87608 3082 3.5
600 200780 86710.4 43.2 231663 3669 1.6 86710 3669 4.2
그 결과, 표 4를 참조하면, 500 mM의 염화나트륨을 포함하는 용출 완충액을 사용하는 경우 MGgE 당 불순물의 함량이 가장 낮았다.
따라서, MGgE 항원의 정제 단계 중 음이온 교환 크로마토그래피에서의 세척 완충액 및 용출 완충액에 포함된 염화나트륨의 최적 농도는 각각 150 mM 및 500 mM이다.
실시예 3.3. 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography)
상기 실시예 3.2에서 수득한 음이온 교환 크로마토그래피 용출액에서 제거하지 못한 배지 조성액 및 불순물을 제거하기 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, Toyopearl Butyl-650M(Tosoh) 레진을 컬럼에 충진한 후 평형 완충액(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 7.0±0.2이 되도록 평형화 시켰다. 이후 실시예 3.2에서 수득한 음이온 교환 크로마토그래피 용출액에 5 M 염화나트륨을 첨가하고 유속 100±10 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였다. 그 후, 평형 완충액과 1 M의 염화나트륨이 들어있는 세척 완충액으로 순차적으로 세척한 다음 염화나트륨이 들어있지 않은 용출 완충액을 사용하여 MGgE 항원을 용출시켜 회수하였다.
실시예 3.4. 바이러스 불활화(Virus inactivation)
MGgE 항원이 포함된 용액의 잠재적 외피 바이러스(enveloped virus)를 불활성시키기 위해 용매를 첨가하여 바이러스의 불활화 단계를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3.3에서 수득한 소수성 상호작용 크로마토그래피 용출액에 인산을 첨가하여 pH가 3.0±0.2이 되도록 조절하였으며, 상온에서 시간을 30분(control) 동안 100±20 rpm으로 교반하여 바이러스를 불활화시켰다. 그 후 다이소듐포스페이트(disodiumphosphate)를 사용하여 pH가 6.5±0.5가 되도록 조절하였다.
또한, 바이러스의 불활화 시간을 60분, 90분 및 120분으로 달리하여 MGgE 항원의 안정성을 확인하였다(표 5).
pH 불활화 시간
(분)		 함량 (μg/mL) 순도 (%)
UV 함량 gE ELISA SE-HPLC
3.0 30 (control) 598 776 93.61
60 593 827 93.13
90 585 760 92.80
120 571 795 93.48
초기값 대비 120 반응 후 % 95% 103% 100%
그 결과, 표 5를 참조하면, 120분간의 불활화에도 MGgE 항원의 함량 및 순도는 유의하게 변하지 않았다. 따라서, MGgE는 바이러스 불활화에 효과적인 pH 3.0 조건에서 바이러스의 불활화 시간이 120분인 경우에도 안정하였다.
실시예 3.5. 1차 농축 및 투석여과(First concentration and diafiltration)
상기 실시예 3.4에서 수득한 용매가 첨가된 MGgE가 포함된 용액에서 저분자 이온을 제거하고 혼합 모드 크로마토그래피 과정에 적합한 조건을 가지도록 1차 농축 및 투석여과 단계를 수행하였다.
구체적으로, 용매가 첨가된 MGgE 항원이 포함된 용액은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; Sartocon cassette(50K)) 시스템을 사용하여 한외여과를 수행하였으며 다음 공정인 Mixed mode chromatography 공정의 평형 완충액을 사용하여 상기 여과액의 pH가 7.2±0.2, 전도도가 2.5 mS/cm 이하가 될 때까지 투석여과를 수행하였다.
실시예 3.6. 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed mode chromatography)
실시예 3.5에서 수득한 투석 및/또는 농축된 MGgE 항원이 포함된 용액에서 다이머(dimer) 및 불순물을 제거하기 위해 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, 세라믹 재질인 하이드록시아파타이트(Ceramic Hydroxyapatite, Bio-Rad) 레진을 컬럼에 충진 후 평형 완충액(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 7.2±0.2가 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 3.5.의 투석 및/또는 농축된 MGgE 항원이 포함된 용액을 유속 100±10 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하면서 미흡착액을 회수하고 이어서 평형 완충액으로 컬럼을 세척하여 함께 회수하였다.
실시예 3.7. 2차 농축 및 투석여과(Second concentration and diafiltration)
실시예 3.6에서 수득한 혼합 모드 크로마토그래피 미흡착액의 단백질 농도를 조절하고 나노여과 과정에 적합한 조건을 가지도록 2차 농축 및 투석여과를 수행하였다.
혼합 모드 크로마토그래피 미흡착액은 한외여과/투석여과 (Ultrafiltration/Diafiltration; Sartocon cassette(50K)) 시스템을 사용하였으며 다음 공정인 나노여과 공정의 평형 완충액을 사용하여 상기 여과액의 pH가 7.4±0.2, 전도도가 15.5 mS/cm 이상이 될 때까지 투석여과를 수행하였다. 그 후 단백질 농도가 7.0±0.5 mg/mL이 되도록 한외여과로 농축하였다.
실시예 3.8. 나노여과(Nano filtration)
나노여과는 바이러스 제거단계로, 나노 필터(Planova 20N, Asahi)에 제형 완충액(formulation buffer)를 사용하여 pH가 7.4±0.2가 되도록 평형화시켰다.
이후 실시예 3.7에서 투석 농축된 MGgE 항원이 포함된 용액을 1.0±0.2 bar 압력 조건하에서 나노 필터를 통해 바이러스를 제거한 후, 평형 완충액으로 나노 필터를 세척하였다. 나노여과된 여과액과 세척액을 함께 혼합한 후 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 3.9. 희석 및 여과(Dilution and filtration)
상기 실시예 3.8에서 수득한 나노여과된 여과액의 단백질 농도가 5.0±0.5 mg/mL이 되도록 제형 완충액(formulation buffer)를 사용하여 희석한 다음 0.2 μm 필터를 이용해 여과하였다.
이후, 수득한 MGgE 항원이 포함된 용액을 소분하여 -20℃ 이하에 보관하였다.
실험예 3. 정제 단계별 수율 평가
상기 실시예 3에서 각 단계마다 MGgE 항원의 함량을 측정하여 정제 단계별 수율을 확인하였다(표 6). 표 6의 MGgE의 단백량과 관련하여, * 표시된 Harvest and clarification 및 Anion exchange chromatography 단계를 거친 각각의 배양액에 대해서는 ELISA 시험으로 확인하였고, 그 이후의 단계의 배양액은 UV를 이용하여 측정하였다.
공정 MGgE HCP SE-HPLC
단백량
(g)		 수율 (%) ppm LRV %
Harvest and clarification 334.0 * - - - -
254.5 * 76% - - -
Anion exchange chromatography 251.0 * - 199488.8 - -
199.8 * 80% 13854.9 1.16 85.48
Hydrophobic interaction chromatography 231.3 - 10914.2 - -
126.9 55% 4432.8 0.39 91.86
Virus inactivation 125.5 - 4432.8 - -
125.1 100% 3335.2 0.12 99.21
1st concentration and diafiltration 124.6 - 3335.2 - -
105.0 84% 3258.0 0.01 95.24
Mixed mode chromatography 104.1 - 3258.0 - -
107.3 103% 423.6 0.89 97.43
2nd concentration and diafiltration 106.8 - 423.6 - -
108.0 101% 216.3 0.29 99.26
Nano filtration 101.0 - 216.3 - -
91.5 91% 197.3 0.04 99.27
Dilution and filtration 89.4 - - - -
100.5 - - - 99.32
Drug substance (Antigen) 100.5 - 180.4 - -
97.5 97% 172.6 0.02 99.32

Claims (15)

  1. (a) 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus, VZV)의 표면 단백질(gE) 항원을 생산하는 재조합 세포주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 배양액을 정제하는 단계;를 포함하는, VZV gE 항원의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 배양액을 수득하는 단계는,
    (a-1) 상기 재조합 세포주를 종배양하는 단계; 및
    (a-2) 상기 종배양한 세포주를 생산배양하는 단계;를 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는,
    음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    바이러스-비활성제를 처리하여 바이러스를 불활화시키는 단계;
    혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
    농축 및 여과를 수행하는 단계;를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 (b) 배양액을 정제하는 단계는,
    (b-1) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (b-2) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (b-3) 바이러스-비활성제를 처리하여 바이러스를 불활화시킨 후, 농축 및 투석여과를 수행하는 단계;
    (b-4) 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수득하는 단계; 및
    (b-5) 상기 용출액을 농축 및 투석여과한 후에, 나노여과를 수행하는 단계;가 일련의 순서대로 수행되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 VZV gE 항원은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포주는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로 형질전환된 것인, 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 (a-1) 종배양하는 단계는, VZV gE 항원을 생산하는 세포주를 계대배양, 현탁배양 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 배양하는 것인, 방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 (a-1) 종배양하는 단계는, 상기 세포주를 34 내지 38℃의 온도에서 배양하는 것인, 방법.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 (a-2) 생산배양하는 단계는, 상기 세포주를 34 내지 35.5℃의 온도에서 배양하는 것인, 방법.
  10. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 음이온 교환 크로마토그래피는 염화나트륨의 농도가 0.1 mM 내지 150 mM인 세척 완충액을 사용하는 것인, 방법.
  11. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 음이온 교환 크로마토그래피는 염화나트륨의 농도가 400 mM 내지 600 mM인 용출 완충액을 사용하는 것인, 방법.
  12. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 바이러스-비활성제는 인산 용액인 것인, 방법.
  13. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 바이러스를 불활화시키는 단계는 pH는 2.8 내지 3.2의 조건에서 수행되는 것인, 방법.
  14. 제4항에 있어서,
    상기 (b-5) 단계의 나노여과는, 나노 필터를 통한 여과 시스템을 이용하는 것인, 방법.
  15. 제4항에 있어서,
    상기 (b-5) 단계 이후, 수득한 나노여과된 여과액을 제형 완충액으로 희석한 후, 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023179588A1 (zh) * 2022-03-21 2023-09-28 厦门大学 截短的水痘-带状疱疹病毒囊膜糖蛋白gE

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100189231B1 (ko) * 1993-09-13 1999-06-01 루드빅 프롬버거, 레오폴드 페르뮐러 셀룰로오스 시이트의 제조를 위한 장치 및 방법
KR20070110413A (ko) * 2005-03-03 2007-11-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 바리셀라 조스터 바이러스 백신
KR101591823B1 (ko) 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
KR20180059371A (ko) * 2016-11-25 2018-06-04 재단법인 목암생명과학연구소 바리셀라 조스터 바이러스 백신
KR20190099269A (ko) * 2016-12-23 2019-08-26 세럼 인스티튜트 오브 인디아 프라이비트 리미티드 포유류 세포 배양에서 항체 생산성을 증강시키고 하류 제제화 프로세스 동안 응집을 최소화하기 위한 개선된 방법, 및 그로부터 수득된 안정한 항체 제제
WO2019225962A1 (ko) 2018-05-23 2019-11-28 재단법인 목암생명과학연구소 바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체 및 이의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013631A (en) 1998-06-19 2000-01-11 Xoma Corporation Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs
GB0910591D0 (en) * 2009-06-19 2009-07-29 Immunobiology Ltd Method for the purification of protein complexes
KR102238133B1 (ko) 2013-11-15 2021-04-09 제넨테크, 인크. 환경-친화적 세제를 사용한 바이러스 불활성화 방법
MX2017011121A (es) 2015-03-13 2017-11-28 Bristol Myers Squibb Co Uso de lavados alcalinos durante la cromatografia para remover impurezas.
CN105175548B (zh) 2015-08-13 2019-02-05 齐鲁制药有限公司 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100189231B1 (ko) * 1993-09-13 1999-06-01 루드빅 프롬버거, 레오폴드 페르뮐러 셀룰로오스 시이트의 제조를 위한 장치 및 방법
KR20070110413A (ko) * 2005-03-03 2007-11-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 바리셀라 조스터 바이러스 백신
US7939084B1 (en) 2005-03-03 2011-05-10 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Vaccine against varicella zoster virus
KR101357204B1 (ko) 2005-03-03 2014-02-06 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 바리셀라 조스터 바이러스 백신
KR101591823B1 (ko) 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
KR20180059371A (ko) * 2016-11-25 2018-06-04 재단법인 목암생명과학연구소 바리셀라 조스터 바이러스 백신
KR20190099269A (ko) * 2016-12-23 2019-08-26 세럼 인스티튜트 오브 인디아 프라이비트 리미티드 포유류 세포 배양에서 항체 생산성을 증강시키고 하류 제제화 프로세스 동안 응집을 최소화하기 위한 개선된 방법, 및 그로부터 수득된 안정한 항체 제제
WO2019225962A1 (ko) 2018-05-23 2019-11-28 재단법인 목암생명과학연구소 바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체 및 이의 용도

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIANA WEINBERG ET AL., J INFECTIOUS DISEASES, vol. 200, no. 7, 2009, pages 1068
FURUKAWA K ET AL.: "Enhancement of productivity of recombinant a-amidating enzyme by low temperature culture", CYTOTECHNOL, vol. 31, 1999, pages 85 - 94, XP019236635, DOI: 10.1023/A:1008059803038
JUDITH BREUER ET AL., EXPERT REVIEW OF VACCINES, 2017
YOON S K ET AL.: "Enhancing Effect of Low Culture Temperature on Specific Antibody Productivity of Recombinant Chinese Hamster Ovary Cells: Clonal Variation", BIOTECHNOL PROG, vol. 20, 2004, pages 1683 - 1688

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023179588A1 (zh) * 2022-03-21 2023-09-28 厦门大学 截短的水痘-带状疱疹病毒囊膜糖蛋白gE

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