JP7487858B2 - 水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法 - Google Patents
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Description
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)は、主に小児及び青少年に水痘を引き起こすウイルスである。一度感染すると、VZVは感覚根や脳神経節細胞に休眠状態で数年間残存し、成人期に免疫が低下した際に、再活性化して帯状疱疹を引き起こす。水痘は感染力が非常に強く、一度感染すると発熱や倦怠感を伴った全身の水疱状の発疹が引き起こされる。ほとんどの健常児では、水痘が重篤な状態に進行することは稀で、やがて自然治癒疾患に進行する。しかし、臓器移植又は化学療法を受けた患者では、水痘が重篤な症状に進行する多くの症例が生じることが知られている(Adriana Weinberg他、J Infectious Diseases、200(7):1068、2009;Judith Breuer他、Expert Review of Vaccines、2017、DOI:10.1080/14760584.2017.1394843)。
技術的課題
したがって、本発明者等は、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)表面タンパク質(gE)抗原の生産性を、その免疫原性に影響を与えることなく増加させることが可能な方法の研究を行なう一方で、VZVgE抗原の生産性を改善することができる培養及び精製方法を見出し、そして本発明を完成させた。
本発明の一態様では、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)表面タンパク質(gE)抗原を生産するための方法であって、(a)VZVgE抗原を産生する組換え細胞株を培養して培養液を得るステップ;及び(b)培養液を精製するステップを含む方法を提供する。
本発明による水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法は、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を高収率及び高純度で得ることができる有効な生産方法である。したがって、この方法は、水痘又は帯状疱疹を予防又は治療するためのワクチン組成物として使用するための水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するのに有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
以後、以下の実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲はそれらに限定されない。
国際公開第2019/225962号で開示された水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)表面タンパク質(gE)抗原バリアント遺伝子(MGgE;配列番号2)は、韓国特許第1591823号で開示されたpMSID2ベクターにクローニングされ、pMSID2-MGgE発現ベクターを構築した(図2)。次に、発現ベクターを、合成培地(CDM4CHO(+0/20nM MTX;メトトレキサート)に適合しているCHO DG44(Thermo Fisher Scientific、USA)宿主細胞にトランスフェクトし、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原(MGgE;配列番号1)を強く発現する細胞株(MGgE-CHO DG44)を作製した。
抗原及び細胞株の種類に応じたタンパク質生産性を確認するために、実施例1で構築したpMSID2-MGgE発現ベクター及び韓国特許第1357204号で開示された切断型gE抗原(GSKgE;配列番号4)をコードする遺伝子をpMSID2ベクターにクローニングすることによって構築したpMSID2-GSKgE発現ベクターをそれぞれ、合成培地(CD forti CHO(+50nM MTX))に適合させたCHO-S宿主細胞にトランスフェクトして、細胞株(MGgE-CHO-S及びGSKgE-CHO-S)を作製した。
実施例2.1.細胞株の一定数の細胞を得るための種培養
実施例1で作製したMGgE-CHO DG44細胞株を500mLフラスコ中の全量100mLに3×105細胞/mL以上で接種し、36℃~38℃及び4%~6%CO2の条件下で培養した。その後、フラスコの容量を増やしながら2~4日間隔で細胞株を2×105細胞/mL~5×105細胞/mLで全量200mL~800mLに接種するステップを繰り返し、一定数の細胞を得た。フラスコ内で得られた細胞をバイオリアクターに2×105細胞/mL~5×105細胞/mLの濃度で接種し、その後36℃~38℃、pH6.7~pH7.1、溶存酸素10%~90%、及び攪拌速度86rpm~96rpmの条件下で懸濁培養を実施した。このようにして、一定数の細胞が得られた。
一定数の細胞が実施例2.1で得られたMGgE-CHO DG44細胞株をバイオリアクターに2×105細胞/mL~5×105細胞/mLの細胞濃度で接種し、その後34℃~35.5℃の温度、pH6.7~pH7.1、溶存酸素10%~90%、及び攪拌速度62rpm~72rpmの条件下で懸濁培養を実施した。
以下の実施例では、MGgE抗原の含有量を測定するためにELISAを実行した。詳細には、VZVgE抗体(カタログ番号sc-17549、200μg/mL)をPBSで1μg/mLの濃度に希釈した後、得られたものをウェル当たり100μLで96ウェルELISAプレートに添加した。一晩インキュベ-ション(コーティング)を4℃で実行した。プレートを洗浄液(0.05%Tween20/リン酸緩衝生理食塩水(PBS))で3回洗浄した後、2%BSAを含有するPBS溶液で1時間インキュベートした。ELISAプレートを再度洗浄した後、希釈試料を添加して2時間インキュベートした。次に、プレートを再度洗浄した。培養液試料それぞれを遠心分離した後、上清を-20℃以下で保存した。試料は測定1時間前に室温で解凍して使用した。VZVgE抗体(カタログ番号sc-56995、100μg/mL)を1μg/mLの濃度に希釈し、ウェル当たり100μLで添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄した。次に、ヤギ抗マウスIgG-HRPを1/1000の濃度に希釈した後、プレートにウェル当たり100μLで添加した。プレートは室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、3,3,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)をプレートに添加してHRP反応を誘導した。次に、プレートにウェル当たり1NH2SO4を100μL分注して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。測定された吸光度を検量線の式に代入し、得られた値に希釈係数を掛けることによって、試料の含有量を計算した。
培養温度変化がMGgE抗原の生産性に及ぼす影響を確認するため、生産培養ステップ中に細胞が十分に増殖したと判断された時点で、実施例2.1で一定数の細胞が得られたMGgE-CHO DG44細胞株を、2×105細胞/mL~5×105細胞/mLの細胞濃度でバイオリアクターに接種し、懸濁培養を行った。その後、細胞株の細胞濃度がそれぞれ約60×105細胞/mL、80×105細胞/mL、150×105細胞/mLに達したとき、培養温度を32℃に低下させて生産培養を実施した。さらに、実施例2.1で一定の細胞数が得られたMGgE-CHO DG44細胞株を37℃の一定温度条件で生産培養し、その後MGgE抗原生産性を比較した(表1、図5A及び図5B参照のこと)。
実施例2.2におけるMGgE抗原の生産培養ステップでは、細胞濃度2×105細胞/mL~5×105細胞/mLでバイオリアクターに接種したMGgE-CHO DG44細胞株に、33℃~37℃の範囲内で選択した一定温度条件下で生産培養を行った(表2、図6A及び6B)。
実施例3.1.回収及び清澄化
実験実施例2における生産培養のための条件である35℃で培養した培養液(MG1120)については、培養液中の細胞片を除去するため、デプスフィルター(COHC Millipore、USA)を使用して回収及び清澄化を実行した。
陰イオン交換クロマトグラフィーを実行して、実施例3.1で得られた培養濾液中に含有される液体培地組成物及び不純物を除去した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、実施例3.2で得られた陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液に対して実行し、それまで除去されなかった液体培地組成物及び不純物を除去した。
MGgE抗原を含有する溶液中の潜在的なエンベロープウイルスを不活化するために、溶媒を添加してウイルス不活化ステップを実行した。
実施例3.4で得られた溶媒添加したMGgE抗原含有溶液から低分子イオンを除去し、溶液を混合モードクロマトグラフィー工程に適した状態にするため、1回目の濃縮及びダイアフィルトレーションステップを実行した。
実施例3.5で得られた透析及び/又は濃縮を行ったMGgE抗原含有溶液に、混合モードクロマトグラフィーを実行し、溶液から二量体及び不純物を除去した。
実施例3.6で得られた混合モードクロマトグラフィーの非吸着溶液中のタンパク質濃度を調整し、溶液をナノ濾過工程に適した条件にするために、2回目の濃縮及びダイアフィルトレーションステップを実行した。
ナノ濾過はウイルス除去ステップであり、ナノフィルター(Planova 20N、Asahi)を使用し、製剤化緩衝液を使用してpHを7.4±0.2に平衡化した。
実施例3.8でナノ濾過によって得られた濾液を製剤化緩衝液でタンパク質濃度が5.0±0.5mg/mLになるように希釈した後、0.2μmフィルターを使用して濾過を実行した。
実験実施例3.各精製ステップの収率評価
精製ステップの各ステップの収率は、実施例3の各ステップのMGgE抗原の含有量を測定することによって調べた(表6)。表6のMGgEのタンパク質含有量に関して、回収及び清澄化及び陰イオン交換クロマトグラフィーステップを行った*印の各培養液はELISA試験で測定し、その後のステップの培養液はUVで測定した。
Claims (11)
- 水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)表面タンパク質(gE)抗原を生産する方法であって、
(a)VZVgE抗原を生産する、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)を使用して作製された組換え細胞株を培養して培養液を得るステップ、及び
(b)前記培養液を精製するステップを含み、
前記培養液を得るステップ(a)が、
(a-1)前記組換え細胞株に種培養を実行するステップ、及び
(a-2)前記種培養を行った前記細胞株に対して生産培養を実行するステップを含み、
前記生産培養を実行するステップ(a-2)が、前記細胞株を34℃~35.5℃の温度で培養することを含み、並びに、
前記培養液を精製するステップ(b)が、
(b-1)陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するステップ、
(b-2)前記陰イオン交換クロマトグラフィーを通じて得られる溶出液に塩化ナトリウムを添加し、それを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに装填し、塩化ナトリウムを含有する洗浄緩衝液で洗浄することを含む、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するステップ、
(b-3)前記培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化し、次いで濃縮及びダイアフィルトレーションを実行するステップ、
(b-4)混合モードクロマトグラフィーを実行して溶出液を得るステップ、並びに
(b-5)前記溶出液を濃縮及びダイアフィルトレーションに供し、次いでナノ濾過を実行するステップを含み、前記ステップが一連の順序で実行される、方法。 - 前記VZVgE抗原が、配列番号1によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞株が、配列番号2によって表されるヌクレオチド配列からなる遺伝子で形質転換されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記種培養を実行するステップ(a-1)が、前記VZVgE抗原生産細胞株を、継代培養、懸濁培養、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つの方法によって培養することである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記種培養を実行するステップ(a-1)が、前記細胞株を34℃~38℃の温度で培養することを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーでは、塩化ナトリウム濃度が0.1mM~150mMの洗浄緩衝液を使用する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーでは、塩化ナトリウム濃度が400mM~600mMの溶出緩衝液を使用する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス不活化剤がリン酸溶液である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスを不活化するステップがpH2.8~3.2の条件下で実行される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ナノ濾過ステップ(b-5)では、ナノフィルターを用いた濾過系を使用する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b-5)の後に、前記ナノ濾過によって得られた濾液を製剤化緩衝液で希釈し、次いで濾過を実行するステップをさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
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