CN113164583A

CN113164583A - 稳定的融合前rsv f蛋白

Info

Publication number: CN113164583A
Application number: CN201980074164.XA
Authority: CN
Inventors: J·P·M·朗格戴克
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-07-23
Also published as: KR20210091749A; AU2019377989A1; CL2021001212A1; CO2021006308A2; JOP20210106A1; EA202191355A1; WO2020099383A1; PE20211469A1; US20220017574A1; MX2021005607A; SG11202104522UA; ECSP21042554A; IL282892A; JP2022513025A; CR20210306A; EP3880243A1; CA3117275A1; BR112021008975A2

Abstract

本发明提供了稳定的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白、包含所述蛋白质的免疫原性组合物、以及其用于预防和/或治疗RSV感染的用途。

Description

稳定的融合前RSV F蛋白

本发明涉及医学领域。本发明特别涉及重组的融合前RSV F蛋白、涉及编码这些RSV F蛋白的核酸分子、以及其例如在疫苗中的用途。

背景技术

在20世纪50年代发现呼吸道合胞病毒(RSV)后，该病毒很快成为人类中与下呼吸道感染和上呼吸道感染相关的公认的病原体。据估计，全世界每年有6400万RSV感染，导致16万人死亡(世界卫生组织急性呼吸道感染(WHO Acute Respiratory Infections)2009年9月更新)。最严重的疾病尤其发生在早产儿、老年人和免疫受损的个体中。在2岁以下的儿童中，RSV是最常见的呼吸道病原体，占因呼吸道感染而住院的约50％，并且住院高峰发生在2-4月龄。据报道，几乎所有儿童到两岁时都被RSV感染过。一生中的重复感染归因于天然免疫无效。在老年人中，RSV疾病负担与由非大流行性甲型流感感染引起的相似。

RSV是属于肺病毒(Pneumoviridae)亚科的副粘病毒。它的基因组编码各种蛋白质，包括称为RSV糖蛋白(G)和RSV融合(F)蛋白的膜蛋白，它们是用于中和抗体的主要抗原靶标。对抗F1蛋白的融合介导部分的抗体可以预防细胞中的病毒吸收，并且因此具有中和作用。

RSV F通过从不稳定的融合前构象到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒和宿主细胞膜融合。已经确定了RSV F(McLellan JS等人(2010,2013,2013)；Swanson KA等人(2011))以及来自相关副粘病毒的融合蛋白的两种构象的结构，提供了对这种融合蛋白的复杂机制的深刻理解。与其他I类融合蛋白一样，无活性前体(RSV F₀)需要在细胞内成熟过程中通过弗林蛋白酶样蛋白酶进行切割。RSV F含有两个弗林蛋白酶切割位点，这导致三个蛋白质：F2、p27和F1，其中后者在其N-末端含有疏水性融合肽(FP)。为了从融合前构象重折叠成融合后构象，在残基137和216之间的包括FP和七肽重复区A(HRA)的重折叠区域1(RR1)必须从螺旋、环和链的组装转化成长的连续螺旋。然后，位于RR1的N-末端区段的FP能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接下来，在融合前F刺突中形成C-末端茎并包括七肽重复区B(HRB)的重折叠区域2(RR2)重新定位到RSV F的头部的另一侧并且将HRA卷曲螺旋三聚体与HRB结构域结合以形成六螺旋束。RR1卷曲螺旋的形成和RR2的重新定位以完成六螺旋束是在重折叠过程中发生的最显著的结构变化。

目前还没有可用的对抗RSV感染的疫苗，但是由于疾病负担高而高度需要该疫苗。RSV融合糖蛋白(RSV F)是一种引人注目的疫苗抗原，因为它是中和人类血清中抗体的主要靶标。人类血清中的大多数中和抗体可对抗融合前构象，但是由于其不稳定性，融合前构象具有在溶液中和在病毒粒子表面上过早重折叠成融合后构象的倾向。如上所述，晶体结构揭示了融合前状态和融合后状态之间的大的构象变化。重排的程度表明，只有一部分针对RSV-F融合后构象的抗体能够与病毒表面上的融合前刺突的天然构象发生交叉反应。因此，产生对抗RSV的疫苗的努力集中于开发含有RSV F蛋白的融合前形式的疫苗(参见，例如WO20101149745、WO 2010/1149743、WO 2009/1079796、WO 2012/158613)，但时至今日仍然没有可用的疫苗。

因此，仍然需要有效的对抗RSV的疫苗，特别是包含处于融合前构象的RSV F蛋白的疫苗。本发明的目的是提供用于获得此类稳定的融合前RSV F蛋白的手段，用于在接种对抗RSV的疫苗中使用。

发明内容

本发明提供了稳定的、重组的、融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白(即稳定处于融合前构象的重组的RSV F蛋白)及其片段。融合前RSV F蛋白或其片段包含对融合前构象F蛋白具有特异性的至少一个表位，例如，如通过对融合前构象具有特异性的抗体与蛋白质的特异性结合确定的。在某些实施例中，融合前RSV F蛋白是可溶性多聚体蛋白，例如三聚体蛋白。本发明还提供了编码融合前RSV F蛋白或其片段的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体，例如腺载体。

本发明还涉及稳定处于融合前构象的RSV F蛋白的方法，并且涉及通过所述方法可获得的融合前RSV F蛋白。

本发明进一步涉及组合物，优选地免疫原性组合物，这些组合物包含如本文所述的RSV F蛋白、核酸分子和/或载体，并且涉及其在诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答中的用途，特别地涉及其作为对抗RSV的疫苗的用途。本发明还涉及用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)免疫应答的方法，这些方法包括向该受试者施用有效量的如本文所述的融合前RSV F蛋白、编码所述RSV F蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。优选地，诱导型免疫应答的特征在于诱导对抗RSV的中和抗体和/或对抗RSV的保护性免疫。在特定的方面，本发明涉及用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)F抗体的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含如本文所述的融合前RSV F蛋白、编码所述RSV F蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。

附图说明

图1：示出了RSV A亚型的RSV F蛋白的胞外结构域的共有氨基酸序列，该共有氨基酸序列用于构建实例中所述的A亚型RSV F蛋白突变体。前体多肽含有带有接头的C-末端延伸和折叠子三聚化结构域(带下划线的)。共有RSV F序列与野生型(非传代)A型RSV F序列非常相似(Kumaria等人(2011))。

图2：示出了B亚型的RSV F蛋白的胞外结构域的共有氨基酸序列，该共有氨基酸序列用于构建实例中所述的B亚型RSV F蛋白突变体。前体多肽含有带有接头的C-末端延伸和折叠子三聚化结构域(带下划线的)。共有RSV F序列与野生型(非传代)RSV F序列非常相似(Kumaria等人(2011))。

图3：A亚类及其变体的共有F的融合前F稳定性。如实例1中所述，在转染细胞的上清液中测量处于融合前构象的F蛋白的含量。收获转染细胞的上清液，将其在4℃下储存，并在储存1、4、11和18天时测试融合前F的含量。衰变曲线示出，与先前描述的包含单个D486N突变的稳定的A亚类F蛋白相比，突变I79M、P101S、P101Q、P101T、I152V或Q354L稳定了融合前F蛋白(如WO2017/005844中所述)。

图4：B亚类及其变体的共有F的融合前F稳定性。如实例1中所述，在转染细胞的上清液中测量处于融合前构象的F蛋白的含量。收获转染细胞的上清液，将其在4度下储存，并在储存1、4、11和18天时测试融合前F的含量。衰变曲线示出，与B亚类F-D486N相比，突变T152M和K226M稳定了融合前F蛋白(如WO 2017/005844中所述)。

图5：F前RSV(RSV180305；SEQ ID NO:20)的纯化。此变体含有根据本发明的D486N取代和两个另外的取代，这些取代进一步稳定了融合前构象(P101Q和I152V)，以及通过突变S46G、L203I、S215P、T357R、N371Y、D486N和D489Y稳定处于融合前构象的F前RSV(RSV172527；SEQ ID NO:21)的纯化，并且该变体含有根据本发明的另外的突变P101Q和I152V。(A)和(B)：RSV180305含有C-末端C-标签，并且如实例2中所述从300ml Hek293F细胞中纯化。箭头指示合并的级分(参见图5B)。在4℃下储存4周后，将纯化的RSV180305(C)和RSV172527(D)通过SEC-MALS分析。

图6：RSV172527(SEQ ID NO:21)的SDS-PAGE分析：蛋白质样品含有在非还原(泳道2)和还原(泳道4)条件下来自SEC色谱图的合并峰。将凝胶用考马斯亮蓝染色。

图7：将纯化的F前蛋白RSV180305(SEQ ID NO:20)和RSV172527(SEQ ID NO:21)的ELISA与对照融合前F蛋白RSV150042(SEQ ID NO:22)(例如，如WO 2017/174568中所述的PRPM)进行对比，并测试其与单克隆抗体CR9501和CR9502以及Mab CR9506的结合，这些单克隆抗体CR9501和CR9502对RSV F的融合前构象具有特异性(其分别包含如WO 2012/006596中所述的抗体58C5和30D8的可变区)，该Mab CR9506与RSV F的融合前和融合后构象两者结合并且包含含有SEQ ID NO:25的重链可变区和含有SEQ ID NO:26的轻链可变区。绘制为平均值±SE。

图8：纯化的F前蛋白(A)RSV180305和(B)RSV172527的温度稳定性。用SyproOrange荧光染料通过差式扫描荧光测定法(DSF)测定确定的解链温度(Tm℃)(如实例5中所述)。

具体实施方式

呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(F蛋白)参与了病毒膜与感染所需的宿主细胞膜的融合。将RSV F mRNA翻译成被称为F0的574个氨基酸前体蛋白，该前体蛋白在N-末端含有信号肽序列(例如，SEQ ID NO:13或14的氨基酸残基1-26)，该信号肽序列在内质网中被信号肽酶去除。F0在两个位点(在氨基酸残基109/110和136/137之间)处被细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶)切割，去除短的糖基化间插序列(也称为p27区域)，该糖基化间插序列包含氨基酸残基110至136，并产生被称为F1和F2的两个结构域(或亚基)。F1结构域(氨基酸残基137-574)在其N-末端含有疏水性融合肽，并且C-末端含有跨膜(TM)(氨基酸残基530-550)和胞质区域(氨基酸残基551-574)。F2结构域(氨基酸残基27-109)通过两个二硫桥共价连接至F1。F1-F2异二聚体在病毒粒子中组装为同源三聚体。

如上所述，目前还没有可用的对抗RSV感染的疫苗。一种产生疫苗的潜在方法是提供基于纯化的RSV F蛋白的亚基疫苗。然而，对于这种方法希望的是纯化的RSV F蛋白处于与RSV F蛋白的融合前状态的构象相似的构象，该构象随时间的推移是稳定的(即保持在融合前构象)，例如，如通过RSV F蛋白与对融合前构象具有特异性的抗体与RSV F蛋白的特异性结合确定的，并且能够以足够的量产生。此外，对于可溶性的基于亚基的蛋白质疫苗，RSVF蛋白需要通过缺失跨膜(TM)和胞质区域来截短以产生可溶性的分泌型F蛋白(sF蛋白)。因为该TM区域负责膜的锚定及增加稳定性，所以无锚定的可溶性F蛋白比全长蛋白明显地更不稳定，并且将甚至更容易地重折叠成融合后的末端状态。为了获得处于稳定的融合前构象且显示出高表达水平和高稳定性的可溶性F蛋白，因此需要将该融合前构象进行稳定化。还因为全长(膜结合的)RSV F蛋白是亚稳态的，因此对于全长RSV F蛋白(即包括TM和胞质区域)，例如对于任何减活或基于载体的疫苗方法来说，融合前构象的稳定化也是希望的。

为了稳定处于融合前构象且被切割成F1和F2亚基的可溶性RSV F，将基于次要纤维蛋白(fibritin)的三聚化结构域融合到可溶性RSV-F C-末端的C-末端(McLellan等人,(2010,2013))。这种次要纤维蛋白结构域或‘折叠子(Foldon)’衍生自T4次要纤维蛋白，并且早期被描述为人工天然三聚化结构域(Letarov等人,(1993)；S-Guthe等人,(2004))。然而，这种三聚化结构域的融合单独不会导致稳定的融合前RSV-F蛋白(Krarup等人,(2015))。实际上，这些努力尚未产生适合在人类中进行测试的候选物。

最近，我们描述了稳定处于融合前构象的RSV F蛋白的几种突变的组合(例如，WO2014/174018和WO 2014/202570)。因此，已经描述了稳定的融合前RSV F蛋白，其包含例如位置215上的氨基酸残基的突变，优选地位置215上的氨基酸S到P的突变。此外，已经描述了可溶性融合前RSV F蛋白，其包含截短的F1结构域，并且包含位置215上的氨基酸残基的突变，优选地位置215上的氨基酸残基S到P的突变，其中该蛋白质包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚化结构域。已经描述了另外的融合前RSV F蛋白，其中这些蛋白质包含一个或多个其他稳定化突变，如位置486上的氨基酸残基D到N的突变、位置203上的氨基酸残基L到I的突变、位置357上的氨基酸残基T到K或R的突变、和/或位置371上的氨基酸残基N到Y的突变，任选地与位置215上的突变组合。已经描述了另外的融合前RSV F蛋白，其中这些蛋白质还包含一个或多个其他突变，如位置489上的氨基酸残基D到Y的突变、位置398上的氨基酸残基S到L的突变、和/或位置394上的氨基酸K到R的突变。

本发明提供了新颖的重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含一种或多种稳定化氨基酸，其中该一种或多种稳定化氨基酸存在于位置79、101、152、226和/或位置354上，任选地与位置486上的稳定化氨基酸组合。根据本发明，已经发现，位置79、101、152、354、和/或226(根据SEQ ID NO13或14编号)上存在的一种或多种特异性稳定化氨基酸，任选地与位置486上存在的氨基酸残基N组合，稳定了处于融合前构象的蛋白质。

因此，根据本发明，已经证明，指示位置上存在的特异性稳定化氨基酸增加了处于融合前构象的蛋白质的稳定性。根据本发明，特异性氨基酸可以已经存在于氨基酸序列中，或者其可以通过该位置上的氨基酸的取代(突变)被引入到根据本发明的特异性氨基酸中。

在某些实施例中，本发明提供了包含RSV F蛋白的氨基酸序列的重组的F蛋白，其中位置79上的氨基酸是M，位置101上的氨基酸是S、Q或T，位置152上的氨基酸是V或M，位置226上的氨基酸是M，和/或位置354上的氨基酸是L，并且其中任选地位置486上的氨基酸是N。

在某些实施例中，本发明提供了包含RSV F蛋白的氨基酸序列的RSV A亚型的重组的F蛋白，其中位置79上的氨基酸是M，位置101上的氨基酸是S、Q或T，位置152上的氨基酸是V或M，和/或位置354上的氨基酸是L，并且其中任选地位置486上的氨基酸是N。

在某些实施例中，本发明提供了包含RSV F蛋白的氨基酸序列的RSV B亚型的重组的F蛋白，其中位置152上的氨基酸是V或M，和/或位置226上的氨基酸是M，并且其中任选地位置486上的氨基酸是N。

在某些实施例中，本发明提供了包含选自下组的一个或多个稳定化突变的重组的融合前F蛋白，该组由以下组成：位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置152上的氨基酸残基的突变、位置226上的氨基酸残基的突变、和位置354上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸的突变组合。

在特定实施例中，本发明提供了包含如下的重组的融合前F蛋白：位置486上的氨基酸残基的突变，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)，与选自下组的一个或多个稳定化突变组合，该组由以下组成：位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置152上的氨基酸残基的突变、位置354上的氨基酸残基的突变、和位置226上的氨基酸的突变。

在某些实施例中，本发明提供了包含选自下组的一个或多个稳定化突变的RSV A亚型的重组的融合前F蛋白，该组由以下组成：位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置152上的氨基酸残基的突变、和位置354上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸残基的突变组合，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)。

在某些实施例中，本发明提供了包含如下的RSV B亚型的重组的融合前F蛋白：位置152上的氨基酸残基的突变和/或位置226上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸残基的突变组合，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)。

在某些实施例中，位置79上的氨基酸残基的突变是氨基酸异亮氨酸(I)到甲硫氨酸(M)的突变(I79M)。

在某些实施例中，位置101上的氨基酸残基的突变是氨基酸脯氨酸(P)到丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或苏氨酸(T)的突变(P101S、P101Q或P101T)。

在某些实施例中，位置152上的氨基酸残基的突变是氨基酸异亮氨酸(I)到缬氨酸(V)或甲硫氨酸(M)的突变(I152V或I152M)。

在某些实施例中，位置354上的氨基酸残基的突变是氨基酸谷氨酰胺(Q)到亮氨酸(L)的突变(Q354L)。

在某些实施例中，位置226上的氨基酸残基的突变是氨基酸赖氨酸(K)到甲硫氨酸(M)的突变(K226M)。

在某些实施例中，融合前F蛋白包含选自下组的一个或多个另外的稳定化突变，该组由以下组成：

(a)位置46上的氨基酸残基S到G的突变；

(b)位置203上的氨基酸残基L到I的突变；

(c)位置215上的氨基酸残基S到P的突变；

(d)位置357上的氨基酸T到K的突变；

(e)位置371上的氨基酸N到Y的突变；

(f)位置487上的氨基酸残基E到Q、N或I的突变；以及

(g)位置489上的氨基酸残基D到Y的突变；以及

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含两种或更多种稳定化氨基酸。在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含两个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含三种或更多种稳定化氨基酸。在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含三个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含四种或更多种稳定化氨基酸或者四个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含五种或更多种稳定化氨基酸或者五个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含六种或更多种稳定化氨基酸或者六个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含七种或更多种稳定化氨基酸或者七个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含八种或更多种稳定化氨基酸或者八个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，重组的融合前F蛋白包含九种或更多种稳定化氨基酸或者九个或更多个稳定化突变。

在优选的实施例中，重组的融合前F蛋白来自RSV A亚型，并且至少包含位置101上的氨基酸P到Q的突变和位置152上的氨基酸I到V的突变，任选地与以下突变组合：位置46上的氨基酸残基S到G的突变、位置203上的氨基酸残基L到I的突变、位置215上的氨基酸残基S到P的突变、位置357上的氨基酸残基T到R的突变、位置371上的氨基酸残基N到Y的突变、位置486上的氨基酸残基D到N的突变、和位置489上的氨基酸残基D到Y的突变。

在优选的实施例中，重组的融合前F蛋白来自RSV B亚型，并且至少包含位置152上的氨基酸I到M的突变和位置226上的氨基酸K到M的突变，任选地与以下突变组合：位置46上的氨基酸残基S到G的突变、位置203上的氨基酸残基L到I的突变、位置215上的氨基酸残基S到P的突变、位置357上的氨基酸残基T到R的突变、位置371上的氨基酸残基N到Y的突变、位置486上的氨基酸残基D到N的突变、和位置489上的氨基酸残基D到Y的突变。

因此，本发明提供了新的重组的稳定的融合前RSV F蛋白，即稳定处于融合前构象的RSV F蛋白或其片段。本发明的稳定的融合前RSV F蛋白或其片段处于融合前构象，即它们包含(显示)对融合前构象F蛋白具有特异性的至少一个表位。对融合前构象F蛋白具有特异性的表位是在融合后构象中不存在的表位。不希望被任何特定理论所束缚，相信RSV F蛋白的融合前构象可以含有与在天然RSV病毒粒子上表达的RSV F蛋白上的那些相同的表位，并且因此可以提供用于引发保护性的中和抗体的优点。

在某些实施例中，本发明的融合前RSV F蛋白或其片段包含被如下融合前特异性单克隆抗体识别的至少一个表位：包含SEQ ID NO:1的重链CDR1区、SEQ ID NO:2的重链CDR2区、SEQ ID NO:3的重链CDR3区、以及SEQ ID NO:4的轻链CDR1区、SEQ ID NO:5的轻链CDR2区、和SEQ ID NO:6的轻链CDR3区的融合前特异性单克隆抗体(下文称为CR9501)，和/或包含SEQ ID NO:7的重链CDR1区、SEQ ID NO:8的重链CDR2区、SEQ ID NO:9的重链CDR3区、以及SEQ ID NO:10的轻链CDR1区、SEQ ID NO:11的轻链CDR2区、和SEQ ID NO:12的轻链CDR3区的融合前特异性单克隆抗体(称为CR9502)(表2)。CR9501和CR9502包含重链和轻链可变区，并且因此分别包含抗体58C5和30D8(先前已经显示出以其融合前构象而不是融合后构象与RSV F蛋白特异性结合)的结合特异性(参见WO 2012/006596)。

本发明还提供了用于稳定RSV F蛋白的融合前构象的方法，所述方法包括：向该RSV F蛋白中引入一个或多个稳定化突变，其中该一个或多个稳定化突变选自由以下组成的组：

位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置152上的氨基酸残基的突变、位置354上的氨基酸残基的突变、和位置226上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸的突变组合，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)。

在某些实施例中，本发明提供了用于稳定A亚型RSV F蛋白的方法，所述方法包括：引入选自下组的一个或多个稳定化突变，该组由以下组成：位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置354上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸残基的突变组合，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)。

在某些实施例中，本发明提供了用于稳定B亚型RSV F蛋白的方法，所述方法包括：引入位置152上的氨基酸残基的突变和/或位置226上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸残基的突变组合，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)。

在某些实施例中，这些方法包括引入选自下组的一个或多个另外的稳定化突变，该组由以下组成：

(a)位置46上的氨基酸残基S到G的突变；

(b)位置203上的氨基酸残基L到I的突变；

(c)位置215上的氨基酸残基S到P的突变；

(d)位置357上的氨基酸T到K的突变；

(e)位置371上的氨基酸N到Y的突变；

(f)位置487上的氨基酸残基E到Q、N或I的突变；以及

(g)位置489上的氨基酸残基D到Y的突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入两个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入三个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入四个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入五个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入六个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入七个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入八个或更多个稳定化突变。

在某些实施例中，这些方法包括引入九个或更多个稳定化突变。

在优选的实施例中，RSV F蛋白来自A亚型，并且该方法包括至少引入位置101上的氨基酸P到Q的突变和位置152上的氨基酸I到V的突变。

在另一个优选的实施例中，RSV F蛋白来自B亚型，并且该方法包括至少引入位置152上的氨基酸T到M的突变和位置226上的氨基酸K到M的突变。

本发明进一步提供了通过所述方法可获得的如本文所述的重组的融合前RSV F蛋白及其用途。

在某些实施例中，本发明的重组的融合前RSV F蛋白是三聚体蛋白。

如上所述，本发明还涵盖融合前RSV F蛋白的片段。该片段可以来自氨基末端(例如，通过切割信号序列)和羧基末端缺失(例如，通过缺失跨膜区域和/或胞质尾区)之一或两者。可以选择片段以包含F蛋白的免疫活性片段，即在受试者中引起免疫应答的部分。这可以使用计算机、体外和/或体内方法(这些对技术人员来说都是常规的)容易地确定。

在某些实施例中，根据本发明的编码的蛋白质或其片段包含信号序列，也称为前导序列或信号肽，其对应于SEQ ID NO:13或14的氨基酸1-26。信号序列典型地是短(例如5-30个氨基酸长)的氨基酸序列，这些氨基酸序列存在于大多数新合成的蛋白质的N-末端，这些新合成的蛋白质指向分泌途径，并且典型地被信号肽酶切割以产生游离信号肽和成熟蛋白。

在某些实施例中，根据本发明的蛋白质或其片段不包含信号序列。

在某些实施例中，融合前RSV F蛋白(的片段)是可溶性蛋白(即非膜结合的)。在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSV F蛋白或其片段包含截短的F1结构域，并且包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚化结构域或用于三聚体的更高级组装的组装结构域。根据本发明，显示了通过将异源三聚化结构域连接至截短的F1结构域的C-末端氨基酸残基，与如本文所述的一个或多个稳定化突变组合，提供了显示出高表达并且结合至融合前特异性抗体的可溶性RSV F蛋白，指示这些蛋白质处于融合前构象。

在某些实施例中，异源三聚化结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:15)。

如上所述，在某些实施例中，本发明的蛋白质或其片段包含截短的F1结构域。如本文所使用的，“截短的”F1结构域是指不是全长F1结构域的F1结构域，即其中在N-末端或在C-末端一个或多个氨基酸残基已经缺失。根据本发明，至少跨膜结构域和胞质尾区已经缺失以允许表达为可溶性胞外结构域。

在某些实施例中，将三聚化结构域连接至RSV F1结构域的氨基酸残基513。在某些实施例中，三聚化结构域因此包含SEQ ID NO:15，并且将其直接或通过接头连接至RSV F1结构域的氨基酸残基513。

在某些实施例中，与野生型RSV F蛋白和/或与包含位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)的RSV F蛋白相比，本发明的融合前RSV F蛋白的表达水平提高。在某些实施例中，与不含所述稳定化取代的野生型F蛋白相比，在收获蛋白质5至10天后，融合前的含量(定义为与融合前特异性CR9501抗体结合的F蛋白的级分)显著更高。

根据本发明的融合前RSV F蛋白由于存在一种或多种稳定化氨基酸(已经存在或通过突变引入)而稳定处于融合前构象，即加工蛋白质(例如像纯化、冻融循环、和/或储存等)时不易变成融合后构象。

在某些实施例中，与不含一个或多个突变的RSV F蛋白相比，根据本发明的融合前RSV F蛋白在4℃储存时具有增加的稳定性。在某些实施例中，这些蛋白质在4℃储存时稳定持续至少15天，优选地至少18天、优选地至少30天、优选地至少60天、优选地至少6个月、甚至更优选地至少1年。“储存时稳定”意指将蛋白质在4℃的溶液(例如，培养基)中储存至少30天后，这些蛋白质仍然显示对融合前特异性抗体(例如，CR9501和/或CR9502)具有特异性的至少一个表位。在某些实施例中，在融合前RSV F蛋白在4℃储存时，这些蛋白质显示该至少一个融合前特异性表位持续至少6个月、优选地持续至少1年。

在某些实施例中，与不含所述一个或多个突变的RSV F蛋白相比，根据本发明的融合前RSV F蛋白具有增加的热稳定性，如通过测量如实例6中所述的解链温度确定的。

在某些实施例中，在适合的配制缓冲液中经受1至6次冻融循环后，这些蛋白质显示至少一个融合前特异性表位。

在某些实施例中，这些蛋白质包含HIS-标签、strep-标签或c-标签。His-标签或多组氨酸-标签是蛋白质中的氨基酸基序，该氨基酸基序由至少五个组氨酸(H)残基组成；strep-标签是由8个残基组成的氨基酸序列(WSHPQFEK(SEQ ID NO:23))；c-标签是由4个残基组成的氨基酸基序(EPEA；SEQ ID NO:24)。这些标签经常在蛋白质的N-或C-末端，并且通常用于纯化目的。

已知RSV作为具有两个抗原性亚型A和B的单个血清型存在。这两种类型的成熟加工的F蛋白的氨基酸序列大约93％是相同的。如贯穿本申请所使用的，氨基酸位置是参照A亚型(SEQ ID NO:13)或B亚型(SEQ ID NO:14)的临床分离株的F蛋白的共有序列给出的。如在本发明中所使用的，用语“在RSV F蛋白的位置“x”处的氨基酸”因此意指与SEQ ID NO:13(对于A亚型)或SEQ ID NO:14(对于B亚型)的RSV F蛋白中的位置“x”处的氨基酸对应的氨基酸。注意，在贯穿本申请所使用的编号系统中，1是指未成熟F0蛋白的N-末端氨基酸(SEQID NO:13或14)。当使用另一种RSV毒株的F蛋白时，该F蛋白的氨基酸位置将通过在必要时插入空位使其他RSV毒株的序列与SEQ ID NO:13或14的F蛋白比对，参考SEQ ID NO:13(对于A亚型)或SEQ ID NO:14(对于B亚型)的F蛋白的编号来编号。可以使用本领域熟知的方法进行序列比对，例如，通过CLUSTALW、Bioedit或CLC Workbench。

如贯穿本申请所使用的，核苷酸序列是从5'到3'方向提供，并且氨基酸序列是从N-末端到C-末端提供，如本领域中所习惯的。

根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸中的任何一种。标准氨基酸可以基于它们的性质分成几种类别。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些性质对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用很重要。一些氨基酸具有特殊的性质，如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，其诱导蛋白质骨架转动；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔性。表1示出了标准氨基酸的缩写和性质。

本领域技术人员将理解可以通过常规的分子生物学程序对蛋白质进行突变。如与不包含这些一个或多个突变的RSV F蛋白相比，根据本发明的突变优选地导致融合前RSV F蛋白的表达水平增加和/或稳定化增加。

本发明进一步提供了编码根据本发明的RSV F蛋白的核酸分子。

在优选的实施例中，对编码根据本发明的蛋白质的核酸分子进行密码子优化，以在哺乳动物细胞(优选地，人类细胞)中表达。密码子优化的方法是已知的并且先前已经描述(例如WO 96/09378)。与野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，则认为序列是密码子优化的。在本文，非优选密码子是在生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的密码子，并且更优选的密码子是在生物体中比非优选密码子更经常地使用的密码子。对于特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地多于一个非优选密码子，优选地最多的或所有非优选密码子，被更优选的密码子置换。优选地，在生物体中最经常使用的密码子用于密码子优化的序列。被优选的密码子置换一般导致更高表达。

本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸分子可以编码相同的蛋白质。还应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由核酸分子编码的蛋白质序列的核苷酸取代，以反映有待表达蛋白质的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括或可以不包括内含子。

核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因技术股份公司(GeneArt)、金斯瑞公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。

本发明还提供了包含如上所述的核酸分子的载体。在某些实施例中，因此根据本发明的核酸分子是载体的一部分。此类载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且可以例如被设计为能在原核和/或真核细胞中复制。此外，许多载体可以用于真核细胞的转化并将整个或部分整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所希望的核酸的稳定的宿主细胞。所使用的载体可以是适合克隆DNA并且可以用于转录目的核酸的任何载体。根据本发明的适合的载体是例如：腺载体、甲病毒、副粘病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒载体等。本领域技术人员能够选择适合的表达载体，并以功能性方式插入本发明的核酸序列中。

包含编码融合前RSV F蛋白的核酸分子的宿主细胞也形成本发明的一部分。融合前RSV F蛋白可以通过重组DNA技术产生，该重组DNA技术涉及在宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、人类细胞系(如HEK293细胞、PER.C6细胞)或酵母、真菌、昆虫细胞等)、或转基因动物或植物中表达这些分子。在某些实施例中，细胞来自多细胞生物体，在某些实施例中，它们是脊椎动物或无脊椎动物来源的。在某些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，细胞是人类细胞。通常，宿主细胞中重组蛋白(如本发明的融合前RSV F蛋白)的产生包括将以可表达形式编码蛋白质的异源核酸分子引入该宿主细胞中，在有助于该核酸分子表达的条件下培养这些细胞，以及允许该蛋白质在所述细胞中表达。以可表达形式编码蛋白质的核酸分子可以是表达盒的形式，并且通常需要能够引起核酸表达的序列，如一种或多种增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等。本领域技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中基因的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同的来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或人工设计的。

细胞培养基可从不同的供应商获得，并且可以常规地选择适合的培养基用于宿主细胞以表达目的蛋白，在此是融合前RSV F蛋白。适合的培养基可以含有或可以不含血清。

“异源核酸分子”(在本文还称为“转基因”)是非天然存在于宿主细胞中的核酸分子。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体中。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。可以添加另外的调节序列。许多启动子可用于表达一种或多种转基因并且是技术人员已知的，例如这些可以包含病毒、哺乳动物、合成启动子等。用于获得在真核细胞中的表达的适合的启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95。聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素聚A信号(US 5,122,458))可以存在于一种或多种转基因后面。可替代地，几种广泛使用的表达载体在本领域中可获得并且可获自商业来源，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、来自碧迪科学公司(BD Sciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于重组表达目的蛋白，或用于获得适合的启动子和/或转录终止子序列、聚A序列等。

细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料工艺操作，因为它们操作和规模扩大最直接了当。如今，基于灌注原理的连续工艺正变得更常见的并且也是适合的。适合的培养基也是技术人员熟知的，并且通常可以从商业来源大量获得，或者根据标准方案定制。例如，可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。用于培养细胞的适合的条件是已知的(参见例如Tissue Culture[组织培养],Academic Press[学术出版社],Kruse和Paterson编辑,(1973)，以及R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual of basic technique[动物细胞培养：基本技术手册],第四版(Wiley-Liss Inc.[威利利斯公司],2000,ISBN 0-471-34889-9))。

本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F蛋白和/或核酸分子和/或载体的组合物。本发明因此提供了包含融合前RSV F蛋白的组合物，该融合前RSV F蛋白显示在RSV F蛋白的融合前构象中存在但在融合后构象中不存在的一种表位。本发明还提供了包含编码这种融合前RSV F蛋白的核酸分子和/或载体的组合物。本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体的免疫原性组合物。本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

本发明还提供了根据本发明的稳定的融合前RSV F蛋白、核酸分子、和/或载体用于在受试者中诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答的用途。进一步提供了用于在受试者中诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答的方法，这些方法包括向该受试者施用根据本发明的融合前RSVF蛋白、和/或核酸分子、和/或载体。还提供了根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子、和/或载体，用于在受试者中诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答中使用。进一步提供了根据本发明的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体用于制造用于在受试者中诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答的药物的用途。

本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子或载体可以用于预防(防治)和/或治疗RSV感染。在某些实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受RSV感染的患者群组。此类患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、孕妇(用于母体免疫)、住院患者、以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。

根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体可以用于例如由RSV所引起的疾病或病症的独立治疗和/或防治，或与其他防治和/或治疗性治疗(如(现有或将来的)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体)组合。

本发明进一步提供了用于利用根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子、和/或载体在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法。在特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法包括向有需要的受试者施用有效量的如上所述的融合前RSV F蛋白、核酸分子、和/或载体。治疗有效量是指蛋白质、核酸分子或载体有效用于预防、缓解和/或治疗由被RSV感染所引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少RSV的传播或者抑制或减少与被RSV感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如本文所使用的，缓解可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。

为向受试者(例如人类)施用，本发明可以采用药物组合物，这些药物组合物包含如本文所述的融合前RSV F蛋白、核酸分子、和/或载体、以及药学上可接受的运载体或赋形剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该运载体或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的运载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的制药配方开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[2000]；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients[药用赋形剂手册],第3版,A.Kibbe编辑,英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。尽管还可以运用冻干制剂，但RSV F蛋白或核酸分子优选地是作为无菌溶液配制和施用。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。然后将这些溶液冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0至9.5，例如pH 5.0至7.5范围内。RSV F蛋白典型地在具有适合的药学上可接受的缓冲液的溶液中，并且该组合物还可以含有盐。任选地，稳定剂(如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可以将RSV F蛋白配制成可注射制剂。

在某些实施例中，根据本发明的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知可进一步提高对所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的RSV F蛋白的免疫应答。适合的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等)；真核蛋白(例如，其抗体或片段(例如，针对抗原本身或CD1a、CD3、CD7、CD80)和受体的配体(例如，CD40L、GMCSF、GCSF等)，其在与受体细胞相互作用时刺激免疫应答。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05-5mg，例如每剂量铝含量为0.075-1.0mg。

融合前RSV F蛋白还可以与纳米粒子(例如像聚合物、脂质体、病毒体、病毒样粒子)组合或缀合来施用。这些融合前F蛋白可以在含或不含佐剂的情况下与纳米粒子组合、包裹在纳米粒子中、或与纳米粒子缀合。封装在脂质体内描述于例如US 4,235,877中。与大分子缀合披露于例如US 4,372,945或US 4,474,757中。融合前RSV F蛋白也可以与自组装蛋白缀合。

在其他实施例中，这些组合物不包含佐剂。

在某些实施例中，本发明提供了用于产生对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的方法，这些方法包括提供根据本发明的RSV F蛋白、核酸或载体并且将其配制成药学上可接受的组合物。术语“疫苗”是指含有在受试者中有效诱导一定程度的对抗某一病原体或疾病的免疫性的活性组分的药剂或组合物，它将至少引起与被该病原体或该疾病感染相关的症状的严重程度、持续时间或其他表现形式的降低(多至完全没有)。在本发明中，疫苗包含有效量的融合前RSV F蛋白和/或编码融合前RSV F蛋白的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体，它导致对抗RSV F蛋白的免疫应答。这提供了在受试者中预防引起住院的严重下呼吸道疾病并且降低由RSV感染和复制引起的并发症(如肺炎和细支气管炎)的频率的方法。根据本发明的术语“疫苗”表示它是药物组合物，并且因此典型地包括药学上可接受的稀释剂、运载体或赋形剂。它可以包含或可以不包含另外的活性成分。在某些实施例中，它可以是组合疫苗，该组合疫苗进一步包含诱导例如对抗RSV的其他蛋白质和/或对抗其他感染原的免疫应答的其他组分。另外的活性组分的施用可以例如通过分开施用或通过施用本发明的疫苗与另外的活性组分的组合产物来进行。

可以将组合物施用至受试者，例如人类受试者。用于单独施用的组合物中的RSV F蛋白的总剂量可以是例如约0.01μg至约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。在用于单独施用的组合物中，包含编码RSV F蛋白的DNA的(腺)载体的总剂量可以是例如约0.1x10¹⁰vp/ml至2x10¹¹，优选地介于约1x10¹⁰vp/ml和2x10¹¹vp/ml之间，优选地介于5x10¹⁰vp/ml和1x10¹¹vp/ml之间。

根据本发明的组合物的施用可以使用标准施用途径执行。非限制性实施例包括胃肠外施用，如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜施用，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射来施用组合物。技术人员已知施用组合物(例如疫苗)以诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同可能性。

如本文所使用的，受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、棉鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者是人类受试者。

蛋白质、核酸分子、载体、和/或组合物还可以在同源或异源初免-加强方案中作为初次来施用或作为加强来施用。如果执行加强疫苗接种，则典型地，这种加强疫苗接种将在该组合物第一次向受试者(在此类情况下称为“初次疫苗接种”)施用后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时间处施用至同一受试者。在某些实施例中，施用包括初次施用和至少一次加强施用。

此外，本发明的蛋白质可以用作诊断工具，例如通过确定这种个体的血清中是否存在能够结合本发明的蛋白质的抗体来测试个体的免疫状态。因此,本发明还涉及用于检测患者中RSV感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使获得自所述患者的生物样品与根据本发明的蛋白质接触；以及b)检测抗体-蛋白复合物的存在。

实例

实例1：RSV F变体的融合前构象在培养物上清液中的稳定性

用作稳定性研究对照的RSV F序列是基于A亚型的共有序列(SEQ ID NO:13)或B亚型的共有序列(SEQ ID NO:14)，因为该共有序列将与对应于临床分离株的野生型(非传代)序列非常相似(Kumaria等人(2011))。为了检测的目的，将F蛋白在C-末端与strep-标签融合。为了评估RSV F中各种点突变的稳定性，在AlphaLISA中测量处于融合前构象的F蛋白的含量。

通过将5μl的RSV F样品添加到25μl的融合前特异性Mab CR9501(0.8nM)、抗人IgG受体珠和链霉亲和素供体珠(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))在测定缓冲液中的混合物中进行测定。在室温下将混合物孵育2.5小时后，测量在615nm下的化学发光。只有处于融合前构象的RSV F才会同时被两种抗体结合，因此在该测定中会产生信号。在收获后的第0、4、11和18天进行测量，并将融合前F信号的减少与wt F信号及具有稳定化D486N突变的F蛋白的信号进行比较。不稳定的融合前F蛋白可以通过CR9501结合的时间依赖性丧失来鉴定(Fwt和F-D486N)，而与不含本发明的稳定化点突变的对照F蛋白(例如，wtF和F-D486N)相比，更稳定的融合前构建体在收获当天显示出更高的融合前F含量，和/或在4℃下储存一段时间后融合前F含量下降更慢或没有下降。图3示出，与A亚类F-D486N变体相比，添加突变V76G、I79M、P101S、P101Q、P101T、I152V或Q354L中的一个或多个稳定了融合前F蛋白。图4示出，与B亚类F-D486N变体相比，添加突变T152M和/或K226M稳定了融合前F蛋白。

实例2：稳定的融合前RSV F多肽-稳定化突变的制备

由于表观不稳定性，基于共有RSV F(SEQ ID NO:13或14)的可溶性融合前蛋白不能被纯化(如图3、4所示)。为了评估图3中所示的一些稳定化突变，除先前描述的D486N稳定化突变(Krarup等人,2015)之外，还产生了含稳定融合前构象的两个突变，特别是突变P101Q和I152V的RSV-F蛋白(RSV180305；SEQ ID NO:20)。此外，产生了另一种稳定的融合前F蛋白(RSV172527；SEQ ID NO:21)，其中在融合前RSV F蛋白中引入P101Q和I152V取代，该融合前RSV F蛋白已经含有几个先前描述的稳定化取代，特别是突变S46G、L203I、S215P、T357R、N371Y、D486N和D489Y。这些构建体在基因技术股份公司(生命技术公司(LifeTechnologies)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))进行合成和密码子优化。将这些构建体克隆到pCDNA2004中或通过该领域内公知的标准方法(包括定点诱变和PCR)产生，并且测序。使用的表达平台是HEK293细胞。根据制造商的说明书使用293Fectin(生命技术公司)对细胞进行瞬时转染，并在37℃和10％CO₂下培养5或6天。收获培养物上清液，并以300g旋转5分钟以去除细胞和细胞碎片。随后使用0.22um真空过滤器无菌过滤旋转过的上清液，并在4℃储存直至使用。

通过在pH 5.0的阳离子交换(HiTrap Capto SP ImpRes柱；GE医疗生物科学公司(GE Healthcare Biosciences)，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)，随后是使用Resource-Q柱进行的阴离子交换，使用两步纯化方案对融合前RSV F蛋白进行纯化，该方案包括CaptureSelect^TM C-标签亲和柱用于C-标签蛋白RSV180305或用于非标签蛋白RSV172527。使用Superdex 200柱(GE医疗公司(GE Healthcare))，将RSV180305(SEQ ID NO:20)和RSV172527(SEQ ID NO:21)两者通过尺寸排阻色谱法进一步纯化，分别如图5a和5b中所示。在4℃下储存4周后，对合并的样品进行的SEC-MALS分析表明纯化的蛋白质是三聚体蛋白，并且还观察到纯化的RSV180305含有小部分的聚集体。

实例3：SDS-PAGE分析。

在还原或非还原条件下，在4％-12％(w/v)Bis-Tris NuPAGE凝胶，1x MOPS(生命技术公司)上分析纯化的RSV172527。所有程序均根据制造商的说明书进行。对于纯度分析，将凝胶用Krypton Infrared蛋白质染色(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))进行染色。非还原和还原的RSV172527是纯的，并且在F₀和F₁胞外结构域的预期高度下分别可见条带。

实例4：ELISA

在4℃下储存4周后，在ELISA中测试纯化的融合前RSV F蛋白RSV180305、RSV172725和对照融合前F蛋白(RSV150042)(SEQ ID NO:22，如先前在WO2017/174568中所述)与融合前特异性中和抗体的结合。将1/2AreaPlate-96 HB板(白色，高蛋白质结合亲和力(珀金埃尔默公司))用抗RSV单克隆抗体的测试组涂覆。Mab CR9501和CR9502对RSV F的融合前构象具有特异性，并且Mab CR9506结合RSV F的融合前和融合后构象两者。CR9506与莫维珠单抗(motavizumab)竞争(数据未显示)，并与同一线性表位结合。将抗体在PBS中以1μg/ml稀释，并将其在PBS中于4℃涂覆至板上过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温)洗涤，并在PBS中用1％牛血清白蛋白封闭。将所有孵化都在室温下进行1h。每个步骤后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次。在含有1％牛血清白蛋白的洗涤缓冲液中制备纯化的RSVF蛋白的滴定。按照标准程序对CR9506进行生物素化，并将其以0.05μg/ml与BM化学发光ELISA底物(POD)(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))一起使用进行检测。如图7中所示，所有纯化的RSV F蛋白都以类似的方式与融合前特异性Mab(CR9501和CR9502)和对两种构象都具有特异性的Mab(CR9506)结合，从而表明根据本发明的F蛋白处于融合前构象。

实例5：RSV F蛋白的温度稳定性

通过差示扫描荧光测定法(DSF)确定纯化的蛋白质的温度稳定性。将纯化的融合前F蛋白与SYPRO橙色荧光染料(生命技术公司S6650)在96孔光学qPCR板中混合。通过实验确定最佳的染料和蛋白质浓度(数据未显示)。蛋白稀释液均在PBS中进行，并且将仅含有染料的阴性对照样品用作参考扣除。使用以下参数在qPCR仪器(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)ViiA 7)中进行测量：从25℃-95℃以0.015℃/秒的速率斜升。不断地收集数据。使用GraphPad PRISM软件(版本5.04)绘制解链曲线。使用非线性EC50位移方程在50％最大荧光下计算解链温度。RSV180305的解链温度为65.9度(图8a)，并且RSV172527的解链温度为72.9度(图8b)。参考融合前RSV F(RSV150042)的解链温度为65.0(数据未显示)。

表1.标准氨基酸、缩写和性质

表2.抗体CR9501和CR9502的氨基酸序列

序列

RSVFA共有全长(SEQ ID NO:13)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

RSVFB共有胞外结构域(SEQ ID NO:14)

MELLIHRSSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELL

SEQ ID NO:15(次要纤维蛋白)

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

CR9501重链(SEQ ID NO:16):

QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

CR9501轻链(SEQ ID NO:17):

EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

CR9502重链(SEQ ID NO:18):

EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC

CR9502轻链(SEQ ID NO:19):

QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS

RSV180305(SEQ ID NO:20)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQAANNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYV RKDGEWVLLSTFLGGSEPEA

RSV172527(SEQ ID NO:21)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTQAANNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAERCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFYASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYV RKDGEWVLLSTFL

RSV150042(SEQ ID NO:22)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYV RKDGEWVLLSTFL

CR9506重链(SEQ ID NO:25)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSRSLITWVRQAPGQGLEWMGEISLVFGSAKNAQKFQGRVTITADESTSTAHMEMISLKHEDTAVYYCAAHQYGSGTHNNFWDESELRFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

CR9506轻链(SEQ ID NO:26)

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTIACRASQSIGTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTHFTLAISSLQAEDFATYSCQQSYTIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

参考文献

Krarup et al.,Nature Comm.6:8143,(2015)

Kumaria et al.,Virology Journal,8:372,(2011)；

Letarov et al.,Biochemistry Moscow 64:817-823(1993)；

McLellan,et al.Science 342,592-598(2013)；

McLellan,et al.Nat Struct Mol Biol 17,248-250(2010)；

McLellan,et al.Science 340,1113-1117(2013)；

S-Guthe et al.,J.Mol.Biol.337:905-915.(2004).

Swanson,et al.(2011)

Claims

1.一种重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含一种或多种稳定化氨基酸，其中该一种或多种稳定化氨基酸存在于位置79、101、152、226和/或位置354上，任选地与位置486上的稳定化氨基酸组合。

2.如权利要求1所述的重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其中位置79上的氨基酸是M，位置101上的氨基酸是S、Q或T，位置152上的氨基酸是V或M，位置226上的氨基酸是M，和/或位置354上的氨基酸是L，并且其中任选地位置486上的氨基酸是N。

3.如权利要求1或2所述的重组的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含选自下组的一个或多个稳定化突变，该组由以下组成：位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置152上的氨基酸残基的突变、位置354上的氨基酸残基的突变、和位置226上的氨基酸残基的突变，任选地与位置486上的氨基酸的突变组合。

4.如权利要求3所述的重组的融合前F蛋白，其包含位置486上的氨基酸残基的突变，优选地位置486上的氨基酸D到N的突变(D486N)，与选自下组的一个或多个稳定化突变组合，该组由以下组成：位置79上的氨基酸残基的突变、位置101上的氨基酸残基的突变、位置152上的氨基酸残基的突变、位置354上的氨基酸残基的突变、和位置226上的氨基酸残基的突变。

5.如权利要求3或4所述的重组的融合前F蛋白，其中位置79上的氨基酸残基的突变是氨基酸异亮氨酸(I)到甲硫氨酸(M)的突变。

6.如权利要求3或4所述的重组的融合前F蛋白，其中位置101上的氨基酸残基的突变是氨基酸脯氨酸(P)到丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或苏氨酸(T)的突变。

7.如权利要求3或4所述的重组的融合前F蛋白，其中位置152上的氨基酸残基的突变是氨基酸异亮氨酸(I)到缬氨酸(V)或甲硫氨酸(M)的突变。

8.如权利要求3或4所述的重组的融合前F蛋白，其中位置354上的氨基酸残基的突变是氨基酸谷氨酰胺(Q)到亮氨酸(L)的突变。

9.如权利要求3或4所述的重组的融合前F蛋白，其中位置226上的氨基酸残基的突变是氨基酸赖氨酸(K)到甲硫氨酸(M)的突变。

10.如权利要求1-9中任一项所述的重组的融合前F蛋白，其中该重组的融合前F蛋白包含两个或更多个稳定化突变。

11.如权利要求1-9中任一项所述的重组的融合前F蛋白，其中该重组的融合前F蛋白包含三个或更多个稳定化突变。

12.如权利要求1-9中任一项所述的重组的融合前F蛋白，其中该重组的融合前F蛋白包含三个或更多个稳定化突变。

13.如权利要求1-9中任一项所述的重组的融合前F蛋白，其中该重组的融合前F蛋白包含四个或更多个稳定化突变。

14.如权利要求1-9中任一项所述的重组的融合前F蛋白，其中该重组的融合前F蛋白包含五个或更多个稳定化突变。

15.如权利要求1-9中任一项所述的重组的融合前F蛋白，其中该重组的融合前F蛋白包含六个或更多个稳定化突变。

16.如前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其中该蛋白质包含对融合前构象F蛋白具有特异性的至少一个表位，其中该至少一个表位被如下融合前特异性单克隆抗体识别：包含SEQ ID NO:1的重链CDR1区域、SEQ ID NO:2的重链CDR2区域、SEQ ID NO:3的重链CDR3区域、以及SEQ ID NO:4的轻链CDR1区域、SEQ ID NO:5的轻链CDR2区域、和SEQ IDNO:6的轻链CDR3区域的融合前特异性单克隆抗体，和/或包含SEQ ID NO:7的重链CDR1区域、SEQ ID NO:8的重链CDR2区域、SEQ ID NO:9的重链CDR3区域、以及SEQ ID NO:10的轻链CDR1区域、SEQ ID NO:67的轻链CDR2区域、和SEQ ID NO:11的轻链CDR3区域的融合前特异性单克隆抗体。

17.如前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其中该蛋白质是三聚体蛋白。

18.如前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F蛋白，其包含截短的F1结构域和连接至所述截短的F1结构域的异源三聚化结构域。

19.如权利要求18所述的融合前RSV F蛋白，其中该异源三聚化结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:15)。

20.如权利要求18或19所述的融合前RSV F蛋白，其中将该三聚化结构域连接至该RSVF蛋白的氨基酸残基513。

21.一种核酸分子，其编码如前述权利要求1-20中任一项所述的融合前RSV F蛋白。

22.如权利要求21所述的核酸分子，其中该核酸分子已经被密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。

23.一种载体，其包含如权利要求21或权利要求22所述的核酸分子。

24.一种组合物，其包含如权利要求1-20中任一项所述的融合前RSV F蛋白、如权利要求21或权利要求22所述的核酸分子、和/或如权利要求23所述的载体。

25.如权利要求1-20中任一项所述的融合前RSV F蛋白、如权利要求21或权利要求22所述的核酸分子、和/或如权利要求23所述的载体，用于在诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答中使用。

26.如权利要求1-20中任一项所述的融合前RSV F蛋白、如权利要求21或权利要求22所述的核酸分子、和/或如权利要求23所述的载体，用作疫苗。

27.如权利要求1-20中任一项所述的融合前RSV F蛋白、如权利要求21或权利要求22所述的核酸分子、和/或如权利要求23所述的载体，用于在防治和/或治疗RSV感染中使用。