CN117777251A

CN117777251A - 一种rsv纳米颗粒疫苗及其制备方法

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Publication number: CN117777251A
Application number: CN202410211732.9A
Authority: CN
Inventors: 赵娜; 李建平
Original assignee: Puda Biotechnology Taizhou Co ltd
Current assignee: Puda Biotechnology Taizhou Co ltd
Priority date: 2024-02-27
Filing date: 2024-02-27
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒RSV pre‑F重组蛋白纳米颗粒疫苗及其制备方法。本发明通过将RSV Pre‑F蛋白进行氨基酸突变，并将Pre‑F突变蛋白和铁蛋白颗粒在真核细胞中进行融合表达，得到8个Pre‑F蛋白三聚体在铁蛋白颗粒表面集中展示的PreF‑Ferritin融合蛋白纳米颗粒，该PreF‑Ferritin融合蛋白纳米颗粒通过稳定和暴露所需要展现的抗原表位，破坏或隐藏不需要的抗原表位，有效的提高了抗原的免疫原性、生产稳定性。通过实验表明：将PreF‑Ferritin融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对RSV病毒可产生较高的中和效价。

Description

一种RSV纳米颗粒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒RSV pre-F重组蛋白纳米颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，HRSV)是导致婴幼儿、免疫力低下的青壮年和老年人下呼吸道感染的重要病毒性病原体之一，具有高度传染性，主要通过飞沫和直接接触传播。对于感染HRSV病毒的婴儿，极易引发其肺部的小气道炎症，对于感染的老年人，容易恶化现有的肺部和心脏疾病，从而引起死亡。据统计，儿童以及老年人群中，HRSV具有高感染率、高重症发病率及死亡率，已成为严重的公共卫生问题，WHO已将HRSV疫苗的研发列为优先项目之一。

RSV是一种有包膜的非节段性单股负链RNA病毒，属于单胞病毒目、肺炎病毒科、正肺病毒属。RSV有球形和丝状颗粒 2种形状，外膜有突起，大小为150~300 nm。RSV 的基因组全长约15.2 kb，基因组编码11种蛋白质，包括3种非结构蛋白(NS1，NS2和M2-2)和8种结构蛋白。在8种结构蛋白中，3种蛋白位于病毒表面膜上：小疏水蛋白(Smallhydrophobic，SH)、黏附蛋白G(attachment glycoproteinG，G)和融合蛋白(fusionglycoprotein，F)糖蛋白；5种蛋白位于病毒内部：核衣壳蛋白(nucleoprotein，N)，磷蛋白(phosphoprotein，P)，基质蛋白M(matrixprotein，M)，M2基因表达的M2-1蛋白和RNA依赖的RNA聚合酶L(largepolymeraseprotein，L)蛋白。其中F蛋白和G蛋白对病毒的感染性和发病机制至关重要，是引起宿主产生中和性抗体的抗原决定因子。

从20世纪60年代起，人们就开始了对HRSV疫苗的研究，第一代HRSV疫苗采用了全病毒灭活的策略，称为FI-RSV。该疫苗在婴幼儿接种后并没有产生保护性应答，反而使得接种儿童在随后的初次感染中产生了增强的呼吸道疾病(Enhanced RespiratoryDisease，ERD)并导致两名婴儿死亡。这使得HRSV疫苗的研发陷入停滞，在之后30多年的时间里，HRSV疫苗的研发工作一直处在谨慎缓慢的推动中。后续研究发现RSV的膜表面蛋白 F作为 I类膜蛋白在介导病毒膜融合的过程中会发生剧烈的构象转变，从 Pre-F构象转变成 Post-F构象，从而完成病毒的早期感染过程。由于Pre-F存在结构不稳定性，研究者长期将Post-F作为 F蛋白的主要构象并应用于疫苗研究中，而这也最终导致了疫苗的有效性不足。2013年，厦门大学与美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)合作，鉴定出一株可稳固Pre-F 的高中和单抗，从而解析 Pre-F 的分子结构并应用于疫苗免疫原设计中，获得了稳定 Pre-F 构象的 F 蛋白-DS-Cavl，该蛋白在小鼠和食蟹猕猴上诱导出了前所未有的血清中和应答。这也标志着RSV疫苗研究从经验主义转向理性设计，拉开了结构指导疫苗设计的序幕，PreF作为靶抗原已成为RSV疫苗的优先选择。

随着技术的不断进步与成熟，对PreF结构、功能和稳定策略研究的不断深入以及各种疫苗平台的建立，以PreF为靶蛋白的RSV疫苗正在各种平台上进行研发。截至2023年初，共有六款候选疫苗正在进行III期临床试验，其中五款采用了稳固的Pre-F形式。Pfizer、GSK以及Moderna公司率先披露的III期临床试验的数据中，三种疫苗均展现了优于以往的保护效力。GSK的疫苗应用增强T细胞应答型佐剂加强RSVA2的Pre-F蛋白免疫，在60岁以上人群中针对RSV相关下呼吸道疾病的保护率可达82%。Pfizer采用了无佐剂形式的Pre-F蛋白双价疫苗策略，在针对60岁以上老年人和孕妇的临床试验中都得到了较好的数据，孕妇接种该疫苗后通过母传抗体对90天内新生儿HRSV相关严重下呼吸道疾病的保护率可达81%，6个月内的保护率仍有69%。Moderna公司采用了与其新冠疫苗相同的mRNA疫苗技术，在针对60岁以上老年人的III期临床试验中的相关下呼吸道保护率达84%。

从当前全球已启动多项临床试验中不难看出，RSV疫苗研发总体面临着保护性弱，目标人群复杂，评价免疫相关保护标准不统一，临床终点标准尚不明确，缺乏理想的动物模型等诸多严峻的挑战，RSV疫苗的研发依然任重道远。因此，需要继续开发创新，研制出一种安全性好、免疫原性高的RSV疫苗，从而降低RSV引起的疾病和经济负担，也显得尤为重要。

目前针对纳米颗粒疫苗(nanoparticles vaccine)是新型疫苗研发的重点方向，主要采用化学偶联、融合表达等策略，将抗原高效连接到生物合成的蛋白骨架上的一种疫苗。相关研究发现RSV纳米颗粒蛋白的热稳定性及免疫原性要高于非纳米颗粒RSV蛋白，但具体的效果如何也还需进一步的深入研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种呼吸道合胞病毒RSV pre-F重组蛋白纳米颗粒疫苗及其制备方法。

本发明提供了一种RSV重组蛋白纳米颗粒疫苗，通过将经氨基酸突变修饰RSVPre-F蛋白连接到自组装的铁蛋白纳米颗粒载体上，进一步增加了PreF抗原的物理稳定性，同时可将PreF重复呈现在纳米颗粒表面，增加了抗原和中和表位的密度，更为有效地刺激机体产生免疫反应。

本发明通过利用RSV蛋白纳米颗粒疫苗诱导有效的中和抗体反应，进一步研制出一种新型安全有效的RSV PreF纳米颗粒疫苗(nanoparticles vaccine)，对加大国产化产品的研发及加快我国疫苗和药物临床试验的开展，以最大程度保护儿童、老人免遭 RSV 感染相关疾病的侵害，弥补高危人群RSV 感染的干预措施的空白，都具有十分重要的意义。

本发明提供的RSV纳米颗粒疫苗在无需额外添加佐剂或者减少佐剂添加的情况下能够快速激活抗原提呈细胞，并促进对抗原的摄取和交叉提呈，进而强化后续的免疫应答水平；且相较于RSV重组蛋白疫苗具有更高的结构稳定性及抗原簇功能，在中和抗体诱导效果上具有明显优势。本发明对于解决 RSV 感染导致的疾病具有重要意义，有望为临床提供一种安全、有效具有广泛应用前景的疫苗。

本发明解决技术问题的技术方案具体如下：

在本发明的第一方面，提供了一种RSV蛋白，所述的RSV蛋白是经过氨基酸突变修饰的RSV Pre-F重组蛋白，所述的RSV Pre-F重组蛋白为通过以下两种方式获得的任意一种：

（1）在序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变，将第324位的T突变为C，第437位的N突变为C；

（2）先将序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，再将第324位的T突变为C，第437位的N突变为C。

进一步地，所述RSV Pre-F重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO .4所示。

在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白是经过氨基酸突变修饰的RSV PreF-Ferritin纳米颗粒融合蛋白，所述的融合蛋白为通过以下两种方式获得的任意一种：

（1）在氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的野生型pre-F蛋白全长序列基础上，进行氨基酸点突变，并在其C末端连接氨基酸序列如SEQ ID NO .5所示的Ferritin序列；突变方式如下：将如SEQ ID NO .1序列所示的野生型融合前F蛋白氨基酸序列第324位的T突变为C，第437位的N突变为C；

（2）将氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接Ferritin序列，得到序列如SEQ ID NO .2所示的突变体，在SEQ ID NO .2序列基础上再进行氨基酸点突变；突变方式如下：将如SEQ ID NO .2序列所示的融合前F蛋白氨基酸序列第324位的T突变为C，第437位的N突变为C。

进一步地，所述RSV PreF -Ferritin纳米颗粒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0.3所示。

在本发明的第三方面，提供了一种生物材料，为下述（1）-（4）中至少一种：

（1）编码如第一方面所述RSV蛋白或如第二方面所述融合蛋白的核酸分子；

（2）含有（1）所述核酸分子的重组表达载体；

（3）含有（1）所述核酸分子的重组微生物或含有（2）所述重组表达载体的重组微生物；

（4）含有（1）所述核酸分子的重组细胞系或含有（2）所述重组表达载体的重组细胞系。

在本发明的第四方面，提供了如第一方面所述RSV蛋白或如第二方面所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：将编码如第一方面所述RSV蛋白或如第二方面所述融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述RSV蛋白或融合蛋白。

进一步地，所述的制备方法，包括如下步骤：将编码如第一方面所述RSV蛋白或如第二方面所述融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述RSV蛋白或融合蛋白。

在本发明的第五方面，提供了如第一方面所述RSV蛋白或如第二方面所述融合蛋白或如第三方面所述的生物材料或按照第四方面所述方法制备得到的蛋白或融合蛋白在如下（1）-（4）任一种中的应用：

（1）作为免疫原；

（2）制备抗RSV的产品；

（3）制备预防和/或治疗RSV感染的产品；

（4）制备预防和/或治疗RSV所致疾病的产品。

在本发明的第六方面，提供了一种疫苗，其活性成分为如第一方面所述RSV蛋白或如第二方面所述融合蛋白或如第三方面所述的生物材料或按照第四方面所述方法制备得到的蛋白或融合蛋白。

进一步地，所述疫苗的制剂形式为水剂或冻干剂。

进一步地，所述疫苗中含有佐剂。

更优选地，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的任意一种。

在本发明的第七方面，提供了如第六方面所述的疫苗在如下（1）-（3）任一种中的应用：

（1）制备抗RSV的产品；

（2）制备预防和/或治疗RSV感染的产品；

（3）制备预防和/或治疗RSV所致疾病的产品。

本发明具有如下技术效果：

（1）RSV疫苗中通过特异性的抗原突变设计增强了Pre-F蛋白的有效免疫原性、稳定性，并通过在纳米颗粒表面的展示将所需要的表位外露，进一步增强了免疫原性。通过实验证明：本发明制备的RSV纳米颗粒疫苗可以在低剂量时获得较好的免疫效果，其中，RSVPreF-Ferritin组的中和效价可达到8560。

（2）本发明解决了野生抗原稳定性差的问题，本发明制备的PreF-Ferritin融合蛋白在进入生物体内之后能够诱导出具备中和活性的RSV抗体，从而赋予该机体相应的免疫保护。

（3）本发明通过将RSV Pre-F蛋白进行氨基酸突变设计，并将Pre-F突变蛋白和铁蛋白颗粒在真核细胞中进行融合表达，得到8个Pre-F蛋白三聚体在铁蛋白颗粒表面集中展示的PreF-Ferritin融合蛋白纳米颗粒，该PreF-Ferritin融合蛋白纳米颗粒通过稳定和暴露所需要展现的抗原表位，破坏或隐藏不需要的抗原表位，有效的提高了抗原的免疫原性、生产稳定性。通过实验表明：将本发明制备的PreF-Ferritin融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对RSV 病毒可产生较高的中和效价。

（4）本发明制备的RSV preF-Ferritin纳米颗粒疫苗可以减少佐剂的使用或者不使用佐剂，而依旧可以达到较好的免疫效果；从而也可以减少佐剂使用所带来的副作用，安全性更高，生产成本降低。

附图说明

图1为RSV PreF-Ferritin蛋白纯度检测SDS-PAGE胶图。

图2为RSV PreF-Ferritin蛋白透射电镜图。

图3为修饰前后RSV蛋白疫苗免疫鼠的抗体滴度检测结果（不含佐剂）。

图4为修饰前后RSV蛋白疫苗免疫鼠的抗体滴度检测结果（含佐剂）。

图5为制剂a0(preF)和制剂b0(preF-Ferritin)鼠免疫血清中蛋白抗体滴度检测结果。

图6为制剂a1(preF+Alum)和制剂b1(preF-Ferritin+Alum)鼠免疫血清中蛋白抗体滴度检测结果。

图7为制剂a2(preF+CpG+Alum)和制剂b2(preF-Ferritin+CpG+Alum)鼠免疫血清中蛋白抗体滴度检测结果。

图8为制剂a2(preF+CpG+Alum)和制剂b1(preF-Ferritin+Alum)鼠免疫血清中蛋白抗体滴度检测结果。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1：制备RSV重组蛋白

（一）蛋白的构建

本发明中所使用的术语“野生型”表示自然界中存在，未经过人工的任何修饰或加工产物。本领域技术人员了解，野生RSV F蛋白可以是多种序列，这些序列可能存在细微差别，但生物活性基本一致。

本发明中提及的野生型全长F蛋白参照GenBank提供的序列，具体序列为SEQ IDNO .1所示(Fusion glycoprotein F0 OS=Human respiratory syncytial virus A(strain A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1)。

（1）氨基酸的突变修饰

本发明的RSV Pre-F纳米颗粒蛋白，可以通过如下两种方式获得：

方式一：在氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的野生型pre-F蛋白全长序列基础上，进行氨基酸点突变，并在其C末端连接氨基酸序列如SEQ ID NO .5所示的Ferritin（铁蛋白）序列；具体的突变方式如下：将如SEQ ID NO .1序列所示的野生型融合前F蛋白氨基酸序列第324位的T突变为C，第437位的N突变为C。

方式二：将氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接Linker Ferritin（铁蛋白）序列，得到序列如SEQ IDNO .2所示的突变体，在SEQ ID NO .2序列基础上再进行氨基酸点突变；其中具体的突变方式如下：将如SEQ ID NO .2序列所示的野生型融合前F蛋白氨基酸序列第324位的T突变为C，第437位的N突变为C，得到F蛋白全长突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。

在本实施例中，采用方式二来获得 Pre-F纳米颗粒蛋白全长突变体。

本实施例还涉及RSV Pre-F重组蛋白，可以通过如下两种方式获得：

（2）先将序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，再将第324位的T突变为C，第437位的N突变为C，得到如SEQ ID NO.4所示的Pre-F蛋白全长突变体。

在本实施例中，采用方式二来获得 RSV Pre-F重组蛋白。

SEQ ID NO .1—SEQ ID NO .5序列分别如下所示：

SEQ ID NO .1：

>sp|P03420|FUS_HRSVA Fusion glycoprotein F0 OS=Human respiratorysyncytial virus A (strain A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

SEQ ID NO .2：

>RSV F-Ferritin

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSGGDIIKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS

SEQ ID NO .3：

>RSV F -Ferritin T324C N437C

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTCNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSCGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSGGDIIKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS

SEQ ID NO .4：

>RSV F T324C N437C

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTCNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSCGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFEK

SEQ ID NO .5：

>Ferritin

DIIKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS

（2）目的基因的合成

RSV PreF-Ferritin蛋白目的基因和RSV PreF蛋白目的基因分别采用如下方式合成：

1）RSV PreF-Ferritin蛋白目的基因的合成

将完整的野生型pre-F经过截短，去掉跨膜区及胞内区，并在其C末端连接LinkerFerritin序列，得到序列如SEQ ID NO.2所示的突变体，再在SEQ ID NO .2序列基础上再进行氨基酸点突变，将第324位的T突变为C，第437位的N突变为C，得到序列如SEQ ID NO.3所示的F蛋白全长突变体。根据RSV PreF-Ferritin蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.3及宿主细胞的密码子偏好性，确定对应的编码序列，并在该区段基因C端加入限制性核酸内切酶EcoRI序列，N端加入限制性核酸内切酶XbaI序列，化学合成设计的核苷酸序列。

2）RSV PreF蛋白目的基因的合成

将完整的野生型pre-F经过截短，去掉跨膜区及胞内区后，在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，并将第324位的T突变为C，第437位的N突变为C，得到如SEQ ID NO.4所示的Pre-F蛋白全长突变体。根据RSV Pre-F蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.4及宿主细胞的密码子偏好性，确定对应的编码序列，并在该区段基因C端加入限制性核酸内切酶EcoRI序列，N端加入限制性核酸内切酶XbaI序列，化学合成设计的核苷酸序列。

（3）质粒扩增及目的基因提取

pUC19质粒载体经EcoRI和XbaI限制酶双酶切后与合成的基因连接，导入扩增宿主DH5α，用LB(Amp+)琼脂固体培养基筛选单克隆；将含有目的基因的单克隆接种于LB(Amp+)液体培养基中，37℃，200rpm培养扩增，利用Sigma-Aldrich GenEluteTMHP质粒中量制备试剂盒提取质粒pUC19-preF；利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切提取的质粒，利用TaKaRaMiniBestAgarose Gel Extraction Kit回收目的基因片段。

（4）真核表达载体的构建

利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切哺乳动物细胞表达质粒pGN-M，该质粒包含CMV启动子和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，利用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment PurificationKit Ver.4.0回收载体DNA片段；载体DNA片段与目的基因片段通过粘末端方式连接并导入DH5α扩增宿主，筛选获得包含真核表达质粒pGN-M_preF的单克隆；接种于LB(Amp+)进行扩增培养，利用无内毒素质粒中提试剂盒TaKaRa MidiBEST Endo-free PlasmidPurificationKit抽提扩增的质粒。

（二）蛋白的表达和克隆筛选

以ATCC采购的CHO K1细胞为宿主细胞，细胞复苏后培养于10％新生牛血清的DMEM培养基(Sigma-Aldrich)中，每3天传代1次。代传2代后，观察细胞长势良好，然后CHO K1细胞按0 .75×10⁶细胞/孔的三个9 .6cm²孔中，其中加有Iscove’s优化DMEM培养基(Sigma-Aldrich)，并加有10％胎牛血清(IMEM+FBS) (Gibco)。细胞在湿度饱和的培养箱中，5％CO2和37℃下，每个孔中加有4μg的pcDNARSV载体，DNA与Lipofectamine 2000 (Sigma-Aldrich)混合后加至其中两个孔中，Lipofectamine 2000单独加至第三个孔中作为阴性对照。48小时后，去除培养基，以200×g离心5分钟，将离心上清液储存在-20℃。加入IMDM+FBS培养液及10μg/mL的Blasticidin-HCl(Invitrogen)至转染细胞的一个孔中，用PBS洗另一个转染细胞孔，然后用50mM的 Tris-HCl，pH8 ，150mM NaCl，1％ (v/v) Triton X-100containing complete，EDA-free蛋白酶抑制剂混合液了溶解细胞 (Roche Diagnostics)。在4℃下，以16000×g速度离心10分钟，将裂解液储存于-20℃。用Western blot来检测上清液和裂解液中是否有重组蛋白。在选择性培养基中培养5天后，用胰蛋白酶(Invitrogen)洗脱细胞，然后再接种至9cm的Petri培养皿上进行系列稀释来分离单克隆细胞。再在后继7-11天中，挑选出42个单颗克隆，转移至一个96孔板上的孔中。用Westernblot来检测培养上清液，筛选高表达蛋白。分泌最高量RSV 蛋白的克隆进行下一轮筛选，最终扩增细胞，并筛选30个新克隆保存。

将所选的克隆扩增至三个T175瓶(NETS)中。加入胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，再悬浮于250mL旋转瓶中装有100mL的ProCHO4(Lonza)，加有1×ProHT、4mM L-谷氨酰胺和2％FBS(Lonza)。在37℃的加湿培养箱中37℃下，5％CO2下，搅拌速度为90rpm，盖稍微打开以确保空气扩散进行培养。每日取样，用台盼蓝染色(Sigma-Aldrich)，对细胞进行计数，并每3-5天传代一次，当活细胞浓度高于0.3×10⁶细胞/mL，活细胞数超过90％时的平台期后。当细胞适应并生长良好，逐渐去除BFS，此时细胞被认为完全适合无血清悬浮生长。

（三）在生物反应器中生产蛋白

在3升生物反应器中配置1.5升灌流培养，配置旋转过滤(10μm)分离器。培养参数设置为：通过加热毯控制温度在37℃，通过CO2或0.3M氢氧化钠调节pH在6.9，搅拌速度为200-300RPM，用最大流量为200mL/min的N2和O2混合气体调节溶氧(dO2)为饱和空气的40％。灌注率为0.3至0.8V稀释/每天，每天从培养液中取样进行细胞计数。采用台盼蓝染色，并用离线检测上清液中葡萄糖和乳酸浓度。

总共收集12 .5升无细胞培养液，在4℃下，以8000×g离心30分钟，用0 .45μm膜过滤，再用10kDa膜包进行超滤浓缩。用缓冲液进行超滤洗滤，并浓缩样品溶液体积至0.5升，加入0.5升PBS后，再浓缩至0.5升。以上步骤重复5次。

（四）蛋白的纯化

将样品溶液上样Q-Sepharose fast flow(GE Bioscience)柱，用20mM Tris-HClpH7.5洗柱。然后用加入了200mM氯化钠的20mM Tris-HCl pH7.5洗柱，进一步去除被吸附的蛋白杂质。用增加氯化钠溶液浓度至300mM的溶液洗脱pre-F蛋白。在合并液中加入硫酸铵至浓度为800mM，上样至Butyl-Sepharose (GE Bioscience)柱，用磷酸盐缓冲液 (PBS，6mMNa2HPO4，1 .5mM KH2PO4，0 .15M氯化钠pH 6.8)加入了800mM硫酸铵洗柱，用含有400mM硫酸铵的PBS溶液洗柱，最终用纯化水洗脱RSV蛋白。最终上样 Sephacryl S-400HR (GEBioscience) ，用PBS洗柱，收集蛋白峰，加入助溶剂，在真空冻干机上冻干，储存于-70℃下，待用。

RSV修饰后preF、RSV修饰后preF-Ferritin和RSV修饰前preF蛋白，均采用上述方法分别制备。

从图1中可以看出PreF-Ferritin蛋白分子量为69kDa，图2的电镜图像显示该分子形成均匀的纳米颗粒（24聚体），1个Pre-F铁蛋白纳米颗粒表面呈现8个preF蛋白三聚体，使得该PreF-Ferritin纳米颗粒蛋白结构更加稳定，以及暴露所需要展现更多的抗原表位，可有效提高RSV preF蛋白抗原的免疫原性及稳定性。

实施例2：免疫制剂的制备

制剂a0/制剂b0/制剂c0：

利用实施例1的方法获得的RSV修饰后preF/preF-Ferritin/修饰前preF蛋白200ug/mL，加入磷酸盐缓冲液pH5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.7mL/瓶，4℃下保存，待免疫用。

制剂a1/制剂b1/制剂c1：

利用实施例1的方法获得的RSV修饰后preF/preF-Ferritin/修饰前preF蛋白200ug/mL，加入磷酸盐缓冲液pH5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤，加入无菌磷酸铝胶(Benetag)，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.7mL/瓶，4℃下保存，待免疫用。

制剂a2/制剂b2：

利用实施例1的方法获得的RSV修饰后preF/preF-Ferritin蛋白200ug/mL，加入CpG(Genscript)后，加入磷酸盐缓冲液pH5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤，而后加入无菌磷酸铝胶(Benetag)，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.7mL/瓶，4℃下保存，待免疫用。

实施例3：修饰前后RSV蛋白疫苗免疫小白鼠及采血

取4-6周雌性BALB/c小白鼠，随机分组，每组10只，共4组，每组分别的免疫制剂是利用实施例2制备的：制剂a0、制剂a1、制剂c0、制剂c1，每隔两周皮下免疫一次，每次0.1mL，共免疫两次，免疫35天后采血，而后血液在室温下放置4小时，在10000RPM，室温下离心，吸取离心上清血清，-70℃下保存待检测。

实施例4：ELISA法检测修饰前、修饰后RSV重组蛋白疫苗鼠免疫血清中pre-F蛋白抗体滴度

配制纯化pre-F蛋白储备液1mg/mL(1×PBS溶液)，存储于4℃冰箱。稀释蛋白储液至包被缓冲液4μg/mL，加100μL包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入150μL封闭缓冲液，在37℃下孵育2小时，用洗板缓冲液每孔300μl洗3次，可在4℃下保存一周。

将实施例3中鼠注射疫苗获得的相应待测血清稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，每孔100 μl，从第一排开始向下进行2倍系列稀释，在37℃下孵育2小时。用洗板缓冲液洗每孔300μl，洗涤3次，按照1：2000稀释加入AP标记羊抗鼠二抗，100 uL/孔，37℃孵育1小时。洗板机按照程序洗板3次，加入pNPP底物液，100 uL/孔，酶标仪设定波长405 nm，读数。

检测结果如图3-4所示，图3的结果显示：在免疫制剂均不含有佐剂的情况下，经过氨基酸修饰后的RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a0）免疫小鼠的抗体滴度明显高于修饰前RSVpreF蛋白疫苗（制剂c0）；并且免疫小鼠的血清经过不同倍数的稀释，在各个浓度下，经过氨基酸修饰后RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a0）抗体滴度仍然显著高于修饰前RSV preF蛋白疫苗（制剂c0），且随着血清稀释倍数的逐渐增大，修饰前、后RSV preF蛋白的抗体滴度均呈降低趋势。

图4的结果显示：在免疫制剂中均含有佐剂的情况下，经过氨基酸修饰后的RSVpreF重组蛋白疫苗（制剂a1）免疫小鼠的抗体滴度明显高于修饰前RSV preF蛋白疫苗（制剂c1）；并且免疫小鼠的血清经过不同倍数的稀释，在各个浓度下，经过氨基酸修饰后RSVpreF重组蛋白疫苗（制剂a1）抗体滴度仍然高于修饰前RSV preF蛋白疫苗（制剂c1），且随着血清稀释倍数的逐渐增大，修饰前、后RSV preF蛋白的抗体滴度均呈降低趋势。

由此可见，相较于修饰前RSV preF蛋白，经氨基酸修饰后RSV PreF重组蛋白疫苗，可以获取到更高保护效价的血清，说明本发明制备的经氨基酸修饰过的RSV PreF重组蛋白疫苗免疫效果更好。

实施例5：RSV重组蛋白疫苗与RSV重组蛋白纳米颗粒疫苗免疫小白鼠及采血

取4-6周雌性BALB/c小白鼠，随机分组，每组9只，共6组，每组分别的免疫制剂是利用实施例2制备的：制剂a0、制剂a1、制剂a2、制剂b0、制剂b1、制剂b2，每隔两周皮下免疫一次，每次0 .1mL，共免疫两次，第二次免疫后采血，而后血液在室温下放置4小时，在10000RPM，室温下离心，吸取离心上清血清，-70℃下保存待检测。

实施例6：ELISA法检测RSV重组蛋白疫苗及RSV重组蛋白纳米颗粒疫苗鼠免疫血清中pre-F蛋白抗体滴度

配制纯化pre-F蛋白储备液1mg/mL(1×PBS溶液)，存储于4℃冰箱。稀释蛋白储液至包被缓冲液4μg/mL，加100μL包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入150μL封闭缓冲液，在37℃下孵育1小时，用洗板缓冲液每孔300μl洗3次，可在4℃下保存一周。

将实施例5中鼠注射疫苗获得的相应待测血清稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，每孔100 μl，从第一排开始向下进行4倍系列稀释，在37℃下孵育2小时。用洗板缓冲液洗每孔300μl，洗涤3次，加入100μL HRP标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释)，在37℃下孵育1小时。用洗板缓冲液每孔300μl洗涤3次，加入TMB底物溶液，每孔100 μl，在450nm读盘。

检测结果如图5、6、7和8所示，其中图5的结果显示：在免疫制剂中均不添加佐剂的情况下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b0）免疫小鼠的抗体滴度要高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a0）；并且免疫小鼠的血清经过不同倍数的稀释，特别是在1:400、1:1600、1:6400、1:25600稀释倍数下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b0）抗体滴度显著高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a0），且随着血清稀释倍数的逐渐增大，两种制剂的抗体滴度均逐渐降低。

图6的结果显示：在免疫制剂中均添加同一种佐剂的情况下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b1）免疫小鼠的抗体滴度明显高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a1）；并且免疫小鼠的血清经过不同倍数的稀释，特别是在1:100、1:400、1:1600、1:6400、1:25600稀释倍数下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b1）抗体滴度要显著高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a1），且随着血清稀释倍数的逐渐增大，两种制剂的抗体滴度均逐渐降低。

图7的结果显示：在免疫制剂中均添加同两种佐剂的情况下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b2）免疫小鼠的抗体滴度明显高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a2）；并且免疫小鼠的血清经过不同倍数的稀释，在不同浓度下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b2）抗体滴度均显著高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a2），且随着血清稀释倍数的逐渐增大，两种制剂的抗体滴度均逐渐降低。

图8的结果显示：在免疫制剂中分别添加不同佐剂的情况下，即制剂a2比制剂b1多添加了一种CpG佐剂，但RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b1）免疫小鼠的抗体滴度要高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a2）；并且免疫小鼠的血清经过不同倍数的稀释，特别是在1:100、1:400、1:1600的稀释倍数下，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b1）抗体滴度要显著高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a2），且随着血清稀释倍数的逐渐增大，两种制剂的抗体滴度均逐渐降低。

由此可见，在制剂中添加或不添加佐剂，以及添加不同佐剂的情况下，相较于RSVpreF重组蛋白疫苗，RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗可以获取到更高保护效价的血清，说明本发明制备的RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗免疫效果更好。且添加佐剂的疫苗所获得的血清保护效价要高于不添加佐剂的，说明佐剂的添加对疫苗的免疫效果具有一定的增强辅助作用；而从图8的结果表明虽然制剂a2比制剂b1多添加了一种CpG佐剂，但RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗（制剂b1）免疫小鼠的抗体滴度要高于RSV preF重组蛋白疫苗（制剂a2），说明本发明制备的RSV preF-Ferritin重组蛋白疫苗可以减少佐剂的使用，而依旧可以达到较好的免疫效果；另一方面也可以减少佐剂使用所带来的副作用，安全性更高，生产成本降低。

实施例7：RSV-Ferritin病毒A2中和实验结果

（1）制剂免疫鼠及采血

取4-6周雌性BALB/c小白鼠，随机分组，每组9只，共3组，每组分别的免疫制剂是利用实施例2制备的：制剂a1、制剂b1、制剂c1，每隔两周皮下免疫一次，每次0 .1mL，共免疫两次，第二次免疫后采血，而后血液在室温下放置4小时，在10000RPM，室温下离心，吸取离心上清血清，-70℃下保存待检测。

（2）RSV A2病毒中和滴度

使用 Hep-2 细胞在含有10%牛血清的 DMEM 培养基中培养 RSV 病毒 A 型。按照Hep2细胞数20000/孔，完全培养基100uL/孔，接种于96孔板，37℃、5%CO2中培养24h至细胞密度60-80%；更换培养基，吸去96孔板中培养基，加入维持培养基，100uL/孔；热灭活血清，56℃水浴30分钟。按照15uL/管，分装共计至少4管，血清保存于-80℃；96孔V形板中稀释抗血清，按照合适稀释倍数抗血清，稀释后每孔70uL，每个稀释度2个重复孔；病毒和不同稀释度抗血清的混合，病毒用DMEM稀释为100 TCID50，70uL/孔加入上述96孔V形板中。37℃孵育1h；按照100uL/孔吸出转至上述Hep2细胞板上；37℃、5%CO2中培养3-5天左右；每天观察CPE情况，细胞用含0.25%结晶紫的5%戊二醛进行染色。

表1.RSV-Ferritin病毒A2中和实验结果

RSV A2病毒中和滴度试验检测结果显示，PreF-Ferritin小鼠血清中和滴度均值为 8560，是RSV Pre-F小鼠血清中和滴度约1.76倍，更是修饰前pre-F蛋白疫苗免疫小鼠血清中和滴度约5倍多。由此可见，将本发明制备的RSV PreF-Ferritin纳米颗粒疫苗注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对 RSV主要流行毒株 A 型可产生较高的中和抗体滴度。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在申请待批本发明的权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种RSV蛋白，其特征在于，所述的RSV蛋白是经过氨基酸突变修饰的RSV Pre-F重组蛋白，所述的RSV Pre-F重组蛋白为通过以下两种方式获得的任意一种：

2.根据权利要求1所述的RSV蛋白，其特征在于，所述RSV Pre-F重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO .4所示。

3.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是经过氨基酸突变修饰的RSV PreF-Ferritin纳米颗粒融合蛋白，所述的融合蛋白为通过以下两种方式获得的任意一种：

（2）将氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接Ferritin序列，得到序列如SEQ ID NO .2所示的突变体，在SEQID NO .2序列基础上再进行氨基酸点突变；突变方式如下：将如SEQ ID NO .2序列所示的融合前F蛋白氨基酸序列第324位的T突变为C，第437位的N突变为C。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述RSV PreF -Ferritin纳米颗粒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。

5.一种生物材料，其特征在于，为下述（1）-（4）中至少一种：

（1）编码如权利要求1-2任意一项所述RSV蛋白或如权利要求3-4任意一项所述融合蛋白的核酸分子；

（2）含有（1）所述核酸分子的重组表达载体；

6.如权利要求1-2任意一项所述RSV蛋白或如权利要求3-4任意一项所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：将编码如权利要求1-2任意一项所述RSV蛋白或如权利要求3-4任意一项所述融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述RSV蛋白或融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将编码如权利要求1-2任意一项所述RSV蛋白或如权利要求3-4任意一项所述融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述RSV蛋白或融合蛋白。

8.如权利要求1-2任意一项所述RSV蛋白或如权利要求3-4任意一项所述融合蛋白或如权利要求5所述的生物材料或按照权利要求6或7所述方法制备得到的蛋白或融合蛋白在如下（1）-（4）任一种中的应用：

（1）作为免疫原；

（2）制备抗RSV的产品；

（3）制备预防和/或治疗RSV感染的产品；

（4）制备预防和/或治疗RSV所致疾病的产品。

9.一种疫苗，其活性成分为如权利要求1-2任意一项所述RSV蛋白或如权利要求3-4任意一项所述融合蛋白或如权利要求5所述的生物材料或按照权利要求6或7所述方法制备得到的蛋白或融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制剂形式为水剂或冻干剂。

11.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中含有佐剂。

12.根据权利要求11所述的疫苗，其特征在于，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的任意一种。

13.如权利要求9所述的疫苗在如下（1）-（3）任一种中的应用：

（1）制备抗RSV的产品；

（2）制备预防和/或治疗RSV感染的产品；

（3）制备预防和/或治疗RSV所致疾病的产品。