CN115850396B - 一种rsv纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RSV纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用。本发明通过将RSV的Pre‑F相关序列及铁蛋白纳米颗粒进行突变设计，并将Pre‑F突变蛋白和铁蛋白突变体在真核细胞中进行融合表达，得到具备多个Pre‑F在表面集中展示的铁蛋白‑PreF融合蛋白纳米颗粒，该铁蛋白‑PreF融合蛋白纳米颗粒的氨基酸序列为SEQ ID No.20‑27中任一种。通过实验表明：将本发明制备的铁蛋白‑PreF融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对真病毒可产生较高的中和效价，同时通过稳定性实验和安全性实验证明：本发明制备的铁蛋白‑PreF融合蛋白还具备足够的物理稳定性和较好的安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种RSV纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)于1955年首次被发现，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)，肺炎病毒属(Pneumovirus)，依据G蛋白的序列可分为A和B两个亚型。RSV为非节段性的负链RNA病毒，其基因组长度为15.2kb，有10个基因，共编码11种蛋白，包括非结构蛋白(NS1，NS2)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、RNA依赖RNA聚合酶(L)、转录延伸因子(M2-1)、调控因子(M2-2)和3种包膜糖蛋白(黏附蛋白(G)、融合蛋白(F)和小疏水蛋白(SH))。
RSV是引起呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)的病毒性病原体，感染主要引起下呼吸道感染症状，其中严重症状的患者占有相当高的比例(如毛细支气管炎和肺炎)，需要住院治疗，具有较高的死亡率。RSV可以通过人与人之间接触传播，或者通过咳嗽或打喷嚏而吸入传播，也可通过接触污染物而获得感染，主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其它类型的细胞，可引起细胞融合在一起形成合胞体。
疫苗研究是目前防治RSV最为集中的领域，早在20世纪60年代，福尔马林灭活RSV疫苗被研制出来进行临床研究，这也是首个进入临床试验的RSV疫苗，但该疫苗不仅没有产生对RSV疾病的保护作用，且在后来的自然感染中，接种过疫苗的儿童发生了严重的疾病增强(ERD)现象，住院率明显增加，甚至引起死亡，因此，该疫苗最终未能进入临床应用。
近些年，随着反向遗传学、疫苗学、分子病毒学、基因组学、免疫学等技术水平的不断提升和发展，RSV疫苗的研究也取得了重大的突破，许多种类的RSV疫苗，如减毒活疫苗、灭活疫苗、嵌合载体疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、复制缺陷型病毒载体疫苗、核酸疫苗等在临床研究试验阶段表现出了临床应用潜力。然而截止目前，世界范围内还没有有效的RSV疫苗上市，其中最主要的问题是RSV疫苗的免疫效价低和生产稳定性低。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫效价高、稳定性高且安全性好的RSV疫苗。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种蛋白。
本发明提供的蛋白为将Pre-F蛋白氨基酸序列进行如下a1)-a18)中至少一种突变后得到的蛋白：
a1)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a2)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a3)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸突变为丙氨酸；
a4)将Pre-F蛋白氨基酸序列第144位的天冬酰胺突变为甘氨酸，且在第144位和第145位氨基酸之间插入半胱氨酸；
a5)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸突变为半胱氨酸；
a6)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸缺失；
a7)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸；
a8)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a9)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸突变为精氨酸；
a10)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸突变为半胱氨酸；
a11)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺；
a12)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a13)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸突变为酪氨酸；
a14)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺突变为谷氨酸；
a15)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸突变为甘氨酸；
a16)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；
a17)将Pre-F蛋白氨基酸序列第420位的半胱氨酸突变为酪氨酸；
a18)将Pre-F蛋白氨基酸序列第469位的精氨酸突变为天冬酰胺；
所述Pre-F蛋白为如下任一种：
(A1)SEQ ID No.1所示的蛋白；
(A2)在(A1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(A3)将(A1)-(A2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(A4)与(A1)-(A2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
进一步的，所述蛋白为如下任一种：
(M1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示的蛋白；
(M2)在(M1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(M3)将(M1)-(M2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(M4)与(M1)-(M2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
为了实现上述目的，本发明又提供了一种融合蛋白。
本发明提供的融合蛋白包括上述蛋白和铁蛋白突变体；
所述铁蛋白突变体为将铁蛋白氨基酸序列进行如下b1)-b3)中至少一种突变后得到的蛋白：
b1)将铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
b2)将铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
b3)将铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸突变为精氨酸；
所述铁蛋白为如下任一种：
(B1)SEQ ID No.10所示的蛋白；
(B2)在(B1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(B3)将(B1)-(B2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(B4)与(B1)-(B2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
进一步的，所述铁蛋白突变体为如下任一种：
(N1)SEQ ID No.11所示的蛋白；
(N2)在(N1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(N3)将(N1)-(N2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(N4)与(N1)-(N2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
更进一步的，所述融合蛋白为如下任一种：
(C1)SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ ID No.15或SEQIDNo.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19所示的蛋白；
(C2)在(C1)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(C3)将(C1)-(C2)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(C4)与(C1)-(C2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
上述(A2)或(M2)或(B2)或(N2)或(C2)所述的融合蛋白中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述(A3)或(M3)或(B3)或(N3)或(C3)所述的融合蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为在上述a1)-a18)或b1)-b3)所述氨基酸突变位点以外进行不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述任一所述蛋白或融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种生物材料。
本发明提供的生物材料为下述D1)-D5)中至少一种：
D1)编码上述蛋白或融合蛋白的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的重组细胞系、含有D2)所述表达盒的重组细胞系、或含有D3)所述重组载体的重组细胞系。
上述生物材料中，编码所述蛋白的核酸分子为E1)或E2)：
E1)SEQ ID No.20第1-1422位或SEQ ID No.21第1-1422位或SEQ ID No.22第1-1422位或SEQ ID No.23第1-1422位或SEQ ID No.24第1-1422位或SEQ ID No.25第1-1422位或SEQ ID No.26第1-1422位或SEQ ID No.27第1-1422位所示的DNA分子；
E2)与E1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。
编码所述融合蛋白的核酸分子为F1)或F2)：
F1)SEQ ID No.20或SEQ ID No.21或SEQ ID No.22或SEQ ID No.23或SEQ IDNo.24或SEQ ID No.25或SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示的DNA分子；
F2)与F1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白或融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白或融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白或融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ IDNo.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ IDNo.15或SEQ ID No.16或SEQ ID No.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白或融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述生物材料中，所述细胞可为原核生物细胞或真核生物细胞。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述蛋白或融合蛋白的制备方法。
本发明提供的上述蛋白或融合蛋白的制备方法包括如下步骤：使编码上述蛋白或融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述融合蛋白。
进一步的，所述方法包括如下步骤：将编码所述蛋白或融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述蛋白或融合蛋白。
更进一步的，所述蛋白或融合蛋白的核酸分子通过重组质粒导入CHO K1Q细胞。
所述重组质粒为将所述蛋白或融合蛋白的核酸分子插入载体质粒后得到的质粒。
在本发明的具体实施例中，所述载体质粒为pKS001载体质粒。所述重组质粒为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP或pKS001-RSV-PreF-H-NP。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述蛋白或上述融合蛋白或上述生物材料或按照上述方法制备得到的蛋白或融合蛋白的新用途。
本发明提供了上述蛋白或上述融合蛋白或上述生物材料或按照上述方法制备得到的蛋白或融合蛋白在如下Y1)-Y4)任一种中的应用；
Y1)作为免疫原；
Y2)制备抗呼吸道合胞病毒的产品；
Y3)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品；
Y4)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的产品。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种疫苗。
本发明提供的疫苗的活性成分为上述蛋白或上述融合蛋白或上述生物材料或按照上述方法制备得到的蛋白或融合蛋白。
进一步的，所述疫苗还包括佐剂。
再进一步的，所述佐剂可为铝佐剂。所述铝佐剂可为氢氧化铝、磷酸铝中的一种或多种。
更进一步的，所述融合蛋白与所述氢氧化铝佐剂的质量比可为1:50。
上述疫苗在如下Y1)-Y3)任一种中的应用也属于本发明的保护范围；
Y1)制备抗呼吸道合胞病毒的产品；
Y2)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品；
Y3)制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的产品。
上述任一所述应用或产品或方法中，所述产品可为疫苗。
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过特异性的抗原突变设计增强了Pre-F蛋白的有效免疫原性、稳定性和安全性，并通过在纳米颗粒表面的展示将所需要的表位外露，进一步增强了免疫原性。通过实验证明：本发明制备的疫苗可以在低剂量时获得较好的免疫效果，其中，RSV-PreF-C-NP组中和效价可达到19836。
2、本发明解决了野生抗原稳定性差的问题，本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白在进入生物体内之后能够诱导出具备中和活性的呼吸道合胞病毒抗体，从而赋予该机体相应的免疫保护。
3、本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白能够有效激发机体的细胞免疫机制，并且引起的免疫反应是Th1/Th2平衡的，可以避免Th2偏激所导致的免疫过激反应，具备较好的安全性。
本发明通过将RSV的Pre-F相关序列及铁蛋白纳米颗粒进行突变设计，并将Pre-F突变蛋白和铁蛋白突变体颗粒在真核细胞中进行融合表达，得到具备多个Pre-F在表面集中展示的铁蛋白-PreF融合蛋白纳米颗粒，该铁蛋白-PreF融合蛋白纳米颗粒通过稳定和暴露所需要展现的抗原表位，破坏或隐藏不需要的抗原表位，有效的提高了抗原的免疫原性、生产稳定性和安全性。通过实验表明：将本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对真病毒可产生较高的中和效价，同时通过稳定性实验和安全性实验证明：本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白还具备足够的物理稳定性和较好的安全性。
附图说明
图1为pKS001载体的结构示意图。
图2为铁蛋白-PreF融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。A：泳道1是RSV-PreF-A-NP纯化后的洗脱产物，泳道2、泳道3分别是流穿和上清，泳道4是分子量标记物(Solarbio，货号：PR1910，下同)。B：泳道1是RSV-PreF-B-NP纯化后的洗脱产物，泳道2、泳道3分别是流穿和分子量标记物。C：泳道1是RSV-PreF-C-NP纯化后的流穿，泳道2是RSV-PreF-C-NP纯化后的洗脱产物，泳道3、泳道4分别是RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP纯化后的洗脱产物。D：泳道1是RSV-PreF-F-NP纯化后的洗脱产物，泳道2是分子量标记物。E：泳道1、泳道2分别是RSV-PreF-G-NP纯化后的流穿、洗脱产物。F：泳道1是分子量标记物，泳道2是RSV-PreF-H-NP纯化后的流穿，泳道3是间隔空白泳道，泳道4是RSV-PreF-H-NP纯化后的洗脱产物。
图3为纯化后铁蛋白-PreF融合蛋白的WB检测结果。从左往右依次为RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP纯化产物的WB检测结果。
图4为铁蛋白-PreF融合蛋白的纳米颗粒形态图。A-H分别是RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP纯化产物对应的电镜照片。
图5为铁蛋白-PreF融合蛋白疫苗的免疫原性研究结果。
图6为铁蛋白-PreF融合蛋白免疫小鼠后的中和效价值的Log2。
图7为铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP免疫后的小鼠血清中IgG1和IgG2a的ELISA效价及历史福尔马林灭活疫苗的对照效价。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或者可通过已知方法制备得到。
下述实施例中的RSV病毒A型Long株记载于文献“Cultures of HEp-2cellspersistently infected by human respiratory syncytial virus differ inchemokine expression and resistance to apoptosis as compared to lyticinfections of the same cell type”中。
下述实施例中的RSV病毒B型BA9株记载于文献“Genetic Diversity andMolecular Epidemiology of Circulating Respiratory Syncytial Virus in CentralTaiwan,CHINA,2008-2017”中。
下述实施例中的强生公司开发的同类疫苗记载于文献“preF mmunogenicity andprotective efficacy of adenoviral and subunit RSVvaccines based on stabilizedprefusion F protein in preclinical models”中。
下述实施例中的福尔马林灭活疫苗FI-RSV记载于文献“Enhanced pulmonaryhistopathology induced by respiratory syncytial virus(RSV)challenge offormalin-inactivated RSV-immunized BALB/c mice is abrogated by depletion ofinterleukin-4(IL-4)and IL-10”中。
实施例1、铁蛋白-PreF融合蛋白的设计、制备与纯化
将RSV的Pre-F相关序列进行突变与设计，得到Pre-F突变蛋白，并使其与铁蛋白相关序列进行融合，形成铁蛋白-PreF一体的亚单位，然后利用铁蛋白的自组装性能，成为具备良好Pre-F抗原展示效果的纳米颗粒。具体步骤如下：
一、铁蛋白-PreF融合蛋白的设计
1、RSV的Pre-F相关序列的设计
为了展示和稳定需要的表位，破坏或掩盖不需要的表位，将RSV的Pre-F蛋白氨基酸序列(Pre-F蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)进行如下1)-18)中至少一种突变，得到Pre-F突变蛋白：
1)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)。
2)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)。
3)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)。
4)将Pre-F蛋白氨基酸序列第144位的天冬酰胺(N)突变为甘氨酸(G)，且在第144位和第145位氨基酸之间插入半胱氨酸(C)。
5)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)。
6)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸(C)缺失。
7)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)。
8)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)。
9)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)。
10)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)。
11)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸(E)突变为天冬酰胺(N)。
12)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)。
13)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸(R)突变为酪氨酸(Y)。
14)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺(N)突变为谷氨酸(E)。
15)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸(S)突变为甘氨酸(G)。
16)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺(N)突变为半胱氨酸(C)。
17)将Pre-F蛋白氨基酸序列第420位的半胱氨酸(C)突变为酪氨酸(Y)。
18)将Pre-F蛋白氨基酸序列第469位的精氨酸(R)突变为天冬酰胺(N)。
在本发明中，所述Pre-F突变蛋白分别为RSV-PreF-A、RSV-PreF-B、RSV-PreF-C、RSV-PreF-D、RSV-PreF-E、RSV-PreF-F、RSV-PreF-G和RSV-PreF-H。
Pre-F突变蛋白RSV-PreF-A、RSV-PreF-B、RSV-PreF-C、RSV-PreF-D、RSV-PreF-E、RSV-PreF-F、RSV-PreF-G和RSV-PreF-H的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2-SEQ ID No.9所示。
2、纳米颗粒序列的设计
为了提升颗粒的稳定性和完整度，将铁蛋白氨基酸序列(铁蛋白氨基酸序列如SEQID No.10所示)进行如下1)-3)中至少一种突变，得到铁蛋白突变体：
1)将铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)。
2)将铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)。
3)将铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸(Y)突变为精氨酸(R)。
在本发明中，铁蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
二、铁蛋白-PreF融合蛋白的制备
1、重组质粒的构建
1)铁蛋白-PreF的基因融合设计
将Pre-F突变蛋白和铁蛋白突变体通过linker(SGSGGGSG)进行融合，制备铁蛋白-PreF融合蛋白，该铁蛋白-PreF融合蛋白自N端至C端依次由Pre-F突变蛋白、linker(SGSGGGSG)和铁蛋白突变体组成。
铁蛋白-PreF融合蛋白分别为RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.12-SEQ ID No.19所示，编码基因序列分别如SEQ IDNo.20-SEQID No.27所示。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成含有上述各铁蛋白-PreF融合蛋白编码基因序列的质粒，并将其分别命名为质粒RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP。
2)重组质粒的构建
用限制性内切酶Hind III-HF和Not I-HF(NEB，货号分别为R3104V和R3189L)对pKS001载体质粒(中山康天晟合生物技术有限公司，货号为A14101)进行双酶切，得到骨架载体。pKS001载体质粒结构示意图如图1所示。
用限制性内切酶Hind III-HF和Not I-HF分别对质粒RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP进行双酶切，分别得到目的片段。
用Quick连接酶(NEB，货号为M2200L)分别将骨架载体与各个目的片段连接后转化大肠杆菌感受态Trans10(北京全式金生物技术股份有限公司，货号为CD101)，筛选阳性克隆并提取质粒进行测序验证，将测序验证正确的质粒分别命名为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP和pKS001-RSV-PreF-H-NP。
测序结果表明：重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP和pKS001-RSV-PreF-H-NP分别为将pKS001载体的HindIII-HF和Not I-HF酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26和SEQ ID No.27所示的DNA分子，且保持pKS001载体其他序列不变后得到的质粒。
2、铁蛋白-PreF融合蛋白的表达
将上述重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP和pKS001-RSV-PreF-H-NP分别在CHO K1Q细胞(康晟生物医药有限公司，货号为A14101)中进行电转和表达，并筛选高表达的细胞株。
使用苏州壹达生物科技有限公司的电转仪EBXP-F1进行电转，具体电转步骤如下：
1)电转前准备：电转前30min将Buffer、细胞培养液、D-PBS提前取出恢复至室温。
2)收集细胞、计数：细胞混悬均匀后置于离心管，进行计数。
3)离心：取所需培养液细胞置于一新的离心管内，在离心机(苏州市国飞实验室仪器有限公司，货号：TDL-5A)中1000rpm离心5min。
4)DPBS清洗：弃去上清培养液，获得所需细胞，加入1mL D-PBS(赛默飞Gibco，货号：2334304)重悬细胞，1000rpm离心5min。
5)DNA、细胞、buffer混合：弃去D-PBS，加入所需量电转缓冲液(苏州壹达生物科技有限公司，货号：H10305)和10ug质粒，轻轻吹打混匀。
6)电转：将混有质粒的细胞悬液按照200ul+DNA体积/杯，加入到H1电转杯(苏州壹达生物科技有限公司，货号：H10201)中，将电转杯插入基座内，按照表1所示电转条件进行电转。
表1、电转条件
7)培养：将电转后的细胞加入含有10mL CDO4培养基(康晟生物医药有限公司，货号：A11004)的T25方瓶(无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：707003)培养48小时。
细胞克隆的培养与筛选的具体如下步骤：将上述T25方瓶中的细胞取样，使用细胞计数仪(赛诺菲，型号：Countess II FL)进行活率监控。在活率高于70％的情况下，按照每孔10000个细胞进行96孔板的铺板，在含有25mM MSX(Sigma，货号：M5379-1G)的CD04培养液中培养，通过ELISA方法选取阳性克隆，继续进行扩大培养至125mL(无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：781011)摇瓶，在125mL摇瓶中培养，约5-7天后，使用计数仪检测活率下降至50-80％之间时，取上清液进行ELISA检测。
ELISA检测方法如下：上清液按照10倍、100倍、1000倍、10000倍进行稀释、包被，使用1500倍稀释的F蛋白抗体(普健生物(武汉)科技有限公司，货号：62814)作为一抗，羊抗人IgG-HRP(索莱宝，货号SE101-1ml)作为二抗，使用酶标仪(上海科华，货号：RD-SH-012)进行信号读取，选出信号最强的作为最高表达样品。收获最高表达样品的上清液进行下一步纯化。
三、铁蛋白-PreF融合蛋白的纯化
按照文献Flexible RSV Prefusogenic Fusion Glycoprotein ExposesMultiple Neutralizing Epitopes that May Collectively Contribute to ProtectiveImmunity中的方法，通过Capto Lentil Lectin(Cytiva，货号：17548902)、Q Sepharose FF(Cytiva，货号：17051060)、Capto Core 400(Cytiva，货号：17372402)、Superose6prepgrade(Cytiva，货号：10321079)，对表达细胞株培养液上清进行纯化。具体纯化步骤如下：
将选定的细胞上清培养液进行8000r/min高速离心20分钟，使用0.45um滤膜(津腾，货号：JTSF 025013/014)进行过滤，得到约100mL溶液，补平衡液至200mL。使用平衡液平衡QFF柱，A1泵上样，流速1.5mL/min。上样完成后，用平衡液冲洗至吸收值回落至上样前并稳定。洗脱液(20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.5)梯度洗脱，流速2mL/min，0-100％B，50min。收集洗脱峰。将上清液浓缩5-10倍，在流速1mL/min的流速下过Superose 6prep grade柱子，收集吸收峰的样品，得到铁蛋白-PreF融合蛋白溶液，浓缩后用于SDS-PAGE和western blot分析。
SDS-PAGE分析具体步骤如下：向80uL铁蛋白-PreF融合蛋白溶液中加入5×蛋白上样loading 20uL，95℃处理10min后离心。取15uL上清用于SDS-PAGE分析，染色处理观察蛋白表达情况。
Western blot(WB)分析具体步骤如下：
1、SDS-PAGE电泳：制备10％厚度为1.0mm的SDS-PAGE胶，在1×SDS电泳缓冲液中进行凝胶电泳，取20ul蛋白样品上样，使用80V电压待样品进入分离胶后，切换到130V。
2、半干法转膜：使用转移电泳槽(君意，货号：JY-ZY3)。准备1张与分离胶大小一致的PVDF膜和6张滤纸，并用1×膜转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％ SDS，20％甲醇)浸湿，电泳结束后切掉多余浓缩胶和分离胶，按照阳极电极-三层浸湿滤纸-PVDF膜-蛋白胶-三层浸湿滤纸-阴极电极的方向搭建石墨电极-转移膜胶复合体，接通电源，根据凝胶面积按1.0mA/cm2恒流转膜60min。
3、封闭：用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液浸润膜，在37℃封闭1h。
4、一抗孵育：将封闭好的膜浸润到加有一抗(Invitrogen，RSV Fusion ProteinPolyclonal Antibody，货号：XD3556234B)的1×PBST缓冲液，置于37℃孵育60min。孵育结束后，使用1×PBST在70rpm摇床清洗膜三次，每次10min。
5、二抗孵育：加入1×PBST稀释的二抗(Bioworld，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP，货号：AA092030)，37℃孵育45min。孵育结束后，使用1×PBST在70rpm摇床清洗膜三次，每次10min。
6、显色：使用DAB显色试剂盒(Solarbio，货号：DA1016)进行显色。
铁蛋白-PreF融合蛋白溶液的SDS-PAGE电泳检测结果如图2所示。WB检测结果如图3所示。结果表明：上述重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP和pKS001-RSV-PreF-H-NP均分别在CHO K1Q细胞中成功表达得到大小约为74KD的目的蛋白(铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP)。
实施例2、铁蛋白-PreF融合蛋白的纳米颗粒形态分析
分别将实施例1中制备的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP的纯化产物进行负染。具体负染操作如下：
将超薄碳膜利用Harrick Basic Plasma Cleaner PDC-32G-2仪器进行预抽真空3min，然后medium挡位辉光放电30s，取出。移液枪取4um样品滴到碳膜上，水平放置1min后，用滤纸吸干，然后滴加7um 2％的醋酸铀，放置1min，用滤纸吸干，放置数分钟后使用FEITecnai Arctica TEM D683透射电镜对负染后的纯化样品进行电镜观察。
结果如图4所示，结果表明：铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP的纯化产物样品在电镜中均可以观察到规则的纳米颗粒，并经过透射电镜分析，可以看到清晰的纳米颗粒形态，颗粒完整性较好。
实施例3、铁蛋白-PreF融合蛋白的免疫原性研究
一、免疫
1、实验材料与方法
实验材料：6-8周雌性Balb/c小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司，货号：B201-02)。
实验方法：选取64只6-8周Balb/c小鼠，随机分成8组，每组8只，每组处理方法如下：
RSV-PreF-A-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-A-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-B-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-B-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-C-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-D-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-D-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-E-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-E-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-F-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-F-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-G-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-G-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
RSV-PreF-H-NP：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射，每次注射1ug的铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-H-NP、50ug氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100ul PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。
二、ELISA法检测血清中的抗体
免疫后第28天(约6周)采取小鼠血清用于ELISA分析，ELISA分析具体步骤如下：使用每孔200ng的RSV的F蛋白(义翘神州，货号：11049-V08B)进行包被，小鼠血清作为一抗，按照250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、781250倍、3906250倍进行梯度稀释，鼠二抗(Cell Signaling Technology，货号：7076S)作为二抗，使用酶标仪(上海科华，货号：RD-SH-012)进行信号读取。
经过2次免疫后的小鼠血清在ELISA中产生的效价检测结果如图5所示。结果表明：在稀释至781250倍时，铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP仍然有检测到ELISA信号。其中，铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP的ELISA效价最高。
三、小鼠血清CPE中和试验
使用Hep-2细胞在含有10％牛血清的DMEM培养基中培养RSV病毒A型Long株的TCID50为2.81E+07。选取上述各组小鼠血清各8份，使用含有2％牛血清的DMEM培养基进行稀释。从40倍稀释开始，按照3倍稀释梯度稀释至29160倍，然后与等体积200TCID50的病毒液混合，37℃放置1小时，每孔200ul铺到Hep-2细胞板，每只小鼠血清设置3个复孔，37℃培养5-7天，观察细胞病变情况。
结果如表2和图6所示。结果表明：RSV-PreF-C-NP组中和效价均值最高，达到19836，RSV-PreF-C-NP组中和效价均值的Log2达到14.3。而且本发明中的RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-E-NP中和效价均超出了强生公司开发的同类疫苗免疫后第六周的针对A型毒株的最高效值的Log2(强生公司开发的同类疫苗免疫后第六周的针对A型毒株的最高效值的Log2约为11，换算效价约2100)。
表2、中和效价均值
| 编号 | 组别 | 中和效价均值 |
| 1 | RSV-PreF-A-NP | 2143 |
| 2 | RSV-PreF-D-NP | 5217 |
| 3 | RSV-PreF-C-NP | 19836 |
| 4 | RSV-PreF-B-NP | 1372 |
| 5 | RSV-PreF-E-NP | 3343 |
| 6 | RSV-PreF-G-NP | 1372 |
| 7 | RSV-PreF-F-NP | 361 |
| 8 | RSV-Pre-H-FNP | 1 |
按照上述实验方法，将RSV病毒A型Long株替换为RSV病毒B型BA9株，使用上述各组小鼠血清进行同样程序的效价分析。
结果如表3所示。结果表明：RSV-PreF-C-NP小鼠血清中和效价均值为10568，log2值为13.4。本发明中的RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-E-NP均接近或超过效价2100。
以上结果表明：将本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对RSV主要流行毒株A型和B型均可产生较高的中和效价。
表3、中和效价均值
| 编号 | 组别 | 中和效价均值 |
| 1 | RSV-PreF-A-NP | 1807 |
| 2 | RSV-PreF-D-NP | 4359 |
| 3 | RSV-PreF-C-NP | 10568 |
| 4 | RSV-PreF-B-NP | 1031 |
| 5 | RSV-PreF-E-NP | 3859 |
| 6 | RSV-PreF-G-NP | 1217 |
| 7 | RSV-PreF-F-NP | 214 |
| 8 | RSV-Pre-H-FNP | 1 |
实施例4、铁蛋白-PreF融合蛋白的稳定性试验
为了验证本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白的稳定性，将纯化后的各组铁蛋白-PreF融合蛋白进行物理稳定性(物理环境挑战)试验，具体步骤如下：
将5份40ug/uL的铁蛋白-PreF融合蛋白溶液以及梯度稀释后的铁蛋白-PreF融合蛋白溶液分别放置在pH7.4(25℃)、pH3.8(25℃)、pH10(25℃)、50℃(pH7.4)、70℃(pH7.4)的环境中1小时(分别对应图中从左往右1-5列)，采用与细胞克隆筛选相同的方法进行ELISA分析。
结果表明：各组融合蛋白在不同pH和温度处理后的抗原结合活性均保持在原始未处理蛋白的75％以上。说明本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白均具备足够的物理稳定性。如表4所示为RSV-PreF-C-NP蛋白的稳定性结果，其他各组的结果类似。
表4、物理环境挑战后ELISA信号强度保留百分比
注：表中结果为10、100、1000、10000倍共4个稀释梯度的平均值。
实施例5、铁蛋白-PreF融合蛋白的安全性实验
为了验证本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白免疫后所引发的免疫反应中Th1\Th2的平衡性(参考文献：Immunological Lessons from Respiratory Syncytial VirusVaccine Development)，选择铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP免疫后的小鼠血清进行了IgG1和IgG2a的ELISA分析，ELISA分析采用与血清ELISA检测相同的设置，二抗分别使用IgG1特异性二抗(abcam，货号：GR3395386-5)和IgG2a特异性二抗(abcam，货号：GR3413688-1)。同时以福尔马林灭活疫苗FI-RSV以及强生公司开发的同类疫苗作为对照。
结果如图7所示，结果表明：血清中IgG1和IgG2a的滴度达到了约6(见图7中的RSVNP IgG1和RSVNP IgG2a)，而且其比例约等于1，明显优于福尔马林灭活疫苗(见图7中的FI-RSVNP IgG1和FI-RSV IgG2a)，甚至优于强生公司开发的同类疫苗(IgG2a约5.8和IgG1约5)。说明本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射后引起的免疫反应是Th1/Th2平衡的，可以避免Th2偏激所导致的免疫过激反应(简称VED)，具备较好的安全性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种蛋白，所述蛋白为如下任一种：
（M1）SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白；
（M2）在（M1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的蛋白。
2.一种融合蛋白，其包括权利要求1所述的蛋白和铁蛋白突变体；所述铁蛋白突变体为如下任一种：
（N1）SEQ ID No.11所示的蛋白；
（N2）在（N1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的蛋白。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下任一种：
（C1）SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的蛋白；
（C2）在（C1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的蛋白。
4.编码权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述融合蛋白的核酸分子。
5.含有权利要求4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系。
6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：使编码权利要求1所述蛋白的核酸分子或编码权利要求2或3所述融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述蛋白或融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将编码权利要求1所述蛋白的核酸分子或编码权利要求2或3所述融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述蛋白或融合蛋白。
8.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的融合蛋白或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系或按照权利要求6或7所述方法制备得到的蛋白或融合蛋白在如下 X1）-X3）任一种中的应用；
X1）制备抗呼吸道合胞病毒的疫苗；
X2）制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗；
X3）制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的疫苗。
9.一种疫苗，其活性成分为权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的融合蛋白或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系或按照权利要求6或7所述方法制备得到的蛋白或融合蛋白。
10.权利要求9所述的疫苗在如下Y1）-Y3）任一种中的应用；
Y1）制备抗呼吸道合胞病毒的疫苗；
Y2）制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗；
Y3）制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒所致疾病的疫苗。
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