CN116650632B - 一种流感病毒和rsv的联合疫苗、其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种流感病毒和RSV联合疫苗、其制备方法与应用，所述联合疫苗包括：I、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液和II、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液，所述联合疫苗将野生型抗原进行突变，获得的融合蛋白具有更高的免疫原性、稳定性和安全性，多个病毒抗原联合应用，相互无抑制作用，并可以协同提高疫苗的免疫原性，广谱抗原，可同时刺激机体产生针对多种亚型的流感病毒以及多种RSV亚型的体液或者细胞免疫保护效力。

Description

一种流感病毒和RSV的联合疫苗、其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及预防流感病毒和RSV感染的流感病毒和RSV的联合疫苗、其制备方法与应用。
背景技术
无论是下呼吸道感染还是上呼吸道感染，绝大部分是由病毒引起的，称病毒性呼吸道感染，常见的病毒包括流感病毒和RSV。
流感病毒（Influenza virus）是流行性感冒病毒的简称。属于正黏液病毒科，为单链RNA膜病毒，其RNA含有八个片断。流感病毒的基因结构使其有不断交换基因片断进而形成优势变异的条件。根据核蛋白和膜表面蛋白抗原，它分为甲（A）、乙（B）、丙（C）和丁（D）型，流感病毒的外层有两种不同糖蛋白构成辐射状突起，即血凝素（H）和神经氨酸酶（N）。流感病毒的抗原变异就是指H和N抗原结构的改变。其中人类主要以甲型和乙型感染为主，甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为18个亚型（H1～H18），N有11个亚型（N1～N11）。常见的乙型流感病毒包括BY和BV。
RSV是呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）的简称，于 1955 年首次被发现，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae），肺炎病毒亚科（Pneumovirinae），肺炎病毒属（Pneumovirus），依据 G 蛋白的序列可分为 A 和 B 两个亚型。RSV 为非节段性的负链 RNA 病毒，其基因组长度为 15.2kb，有 10 个基因，共编码 11 种蛋白，包括非结构蛋白（NS1，NS2）、核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、RNA 依赖 RNA 聚合酶（L）、转录延伸因子（M2-1）、调控因子（M2-2）和 3 种包膜糖蛋白（黏附蛋白（G）、融合蛋白（F）和小疏水蛋白（SH））。
RSV 是引起呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）的病毒性病原体，感染主要引起下呼吸道感染症状，其中严重症状的患者占有相当高的比例（如毛细支气管炎和肺炎），需要住院治疗，具有较高的死亡率。RSV 可以通过人与人之间接触传播，或者通过咳嗽或打喷嚏而吸入传播，也可通过接触污染物而获得感染，主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其它类型的细胞，可引起细胞融合在一起形成合胞体。
根据现有的数据，流感病毒和RSV的流行时间窗口有很大程度的重合。因而开发同时针对流感病毒和RSV的联合疫苗将会在免疫接种方案和成本上提供极大的方便和优势。
然而，无论是流感病毒还是RSV，都是一种RNA病毒，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异，并且变异速度极快，因此经常会因为突变而出现免疫逃逸的现象，导致疫苗的保护性下降。随着流感病毒和RSV的不断进化，现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。因此，研究和开发更为有效的、针对各种突变毒株的通用型疫苗对于预防流感病毒和RSV感染具有重要的意义和广泛的临床应用前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种具有预防流感病毒和RSV感染，更为有效的、针对各种突变毒株的通用型疫苗，具体的，
本发明第一方面，提供一种联合疫苗，所述联合疫苗包括：I、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液和II、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液，其中，
I、所述血凝素来自至少一种流感病毒亚型；
II、所述来自RSV的融合蛋白包括pre-F蛋白的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型pre-F蛋白的突变，所述突变包括第67、88、110、144、159、173、202、227、236、248、289、309、334、344、370、389、419和/或468位中一个或者多个位点的突变。
进一步的，所述组分I、II在下文进行更为详细的说明。
I、 包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液:
优选的，所述流感病毒至少包括一种或者多种流感病毒亚型，更优选的，所述流感病毒来自甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒。
更优选的，所述流感病毒至少包括甲型流感病毒，例如H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8等等。
在一个具体的实施方式中，所述流感病毒至少包括H1N1和H3N2亚型；
更优选的，所述流感病毒包括甲型和乙型流感病毒。
在一个具体的实施方式中，所述流感病毒至少包括H1N1、H3N2亚型、乙型BY和BV亚型。
所述联合疫苗中，所述每种流感病毒亚型的血凝素含量为15-50µg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为15、18、20、22、25、18、30、35、40、45、48、50µg/ml。
II、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液：
所述来自RSV的融合蛋白包括pre-F蛋白的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型pre-F蛋白的突变，所述突变包括第67、88、110、144、159、173、202、227、236、248、289、309、334、344、370、389、419和/或468位中一个或者多个位点的突变。
优选的，所述突变包括在第88位的突变，更优选的，所述突变包括：
II-1）在第88和289位的突变；
II-2）在第88和389位的突变；
II-3）在第88、289、309和468位的突变；
II-4）第67、88、144和389位的突变；
II-5）在第67、88、110、144、289、309、389和468位的突变。
优选的，所述突变包括在第202和334位的突变，更优选的，所述突变包括：
II-6）在第202位、334和389位的突变；
II-7）在第202位、289和334的突变；
II-8）在第159、202、248、334、344和389位的突变；
II-9）在第67、110、144、202、227、248、334、344和389位的突变；
II-10）在第159、202、289、334、344和468位的突变；
II-11）在第67、110、144、159、202、236、248、289、309、334、370、389、419和468位的突变。
优选的，所述突变包括在143和144之间插入半胱氨酸，
优选的，所述突变包括替换、插入和/或缺失，
更优选的，所述突变包括如下a1）-a19）中至少一种突变后得到的蛋白：
a1）将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a2）将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a3）将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸突变为丙氨酸；
a4）将Pre-F蛋白氨基酸序列第143位和第144位氨基酸之间插入甘氨酸；
a5）将Pre-F蛋白氨基酸序列在第144位天冬酰胺突变为半胱氨酸；
a6）将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸突变为半胱氨酸；
a7）将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸缺失；
a8）将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸；
a9）将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；
a10）将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸突变为精氨酸；
a11）将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸突变为半胱氨酸；
a12）将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺；
a13）将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a14）将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸突变为酪氨酸；
a15）将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺突变为谷氨酸；
a16）将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸突变为甘氨酸；
a17）将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；
a18）将Pre-F蛋白氨基酸序列第419位的半胱氨酸突变为酪氨酸；
a19）将Pre-F蛋白氨基酸序列第468位的精氨酸突变为天冬酰胺。
上述突变位点和突变类型可以进行任一的组合，例如：
a1-1）所述突变包括在第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
a1-2）所述突变包括在第88位和第289位的突变为天冬酰胺；
a1-3）所述突变包括在第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺和第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；
a1-4）所述突变包括在第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸和第334位的精氨酸突变为酪氨酸；
a1-5）所述突变包括在第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸、第334位的精氨酸突变为酪氨酸和第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；或者，
a1-6）所述突变包括在第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸、第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺和第334位的精氨酸突变为酪氨酸。
所述Pre-F蛋白（或者野生型Pre-F蛋白）氨基酸参考序列如SEQ ID No.1所示，可以理解的是，不同亚型或者不同株病毒的野生型Pre-F蛋白氨基酸不一定相同，可能会有替换、插入或者删除的突变，上述参考序列如SEQ ID No.1所示，但也可以是其它结构不同的野生型序列，其突变位点对应于SEQ ID No.1的上述位点，所述对应理解为基于氨基酸结构和/或功能分析后的对应关系。
在一个具体的实施方式中，所述Pre-F蛋白包括如下任一种：
（A1）SEQ ID No.2-9所示的蛋白；
（A2）在（A1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
（A3）将（A1）-（A2）任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
（A4）与（A1）-（A2）任一种具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白。
优选的，所述来自RSV的融合蛋白还包括铁蛋白突变体；
所述铁蛋白突变体为将野生型铁蛋白氨基酸序列进行如下b1）-b3）中至少一种突变后得到的蛋白：
b1）将野生型铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；
b2）将野生型铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸突变为天冬酰胺；
b3）将野生型铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸突变为精氨酸；
优选的，所述野生型铁蛋白氨基酸参考序列如SEQ ID No.10所示，可以理解是，不同亚型或者不同株病毒的野生型铁蛋白氨基酸不一定相同，可能会有替换、插入或者删除的突变，上述参考序列如SEQ ID No.10所示，但也可以是其它结构不同的野生型序列，其突变位点对应于SEQ ID No.10的第15、96和/或119，所述对应理解为基于氨基酸结构和/或功能分析后的对应关系。
在一个具体的实施方式中，所述铁蛋白包括如下任一种：
（B1）SEQ ID No.11所示的蛋白；
（B2）在（B1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
（B3）将（B1）-（B2）任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
（B4）与（B1）-（B2）任一种具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白。
更进一步的，所述来自RSV的融合蛋白包括如下任一种：
（C1）SEQ ID No.12-19所示的蛋白；
（C2）在（C1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
（C3）将（C1）-（C2）任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
（C4）与（C1）-（C2）任一种具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
上述（A2）或（B2）或（C2）所述的融合蛋白中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述（A3）或（B3）或（C3）所述的融合蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为在上述a1）-a19）或b1）-b3）所述氨基酸突变位点以外进行不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述任一所述蛋白或融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述来自RSV的融合蛋白的含量为1-10μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为1.0、1.5、2.0、2.4、2.8、3.0、3.6、4.0、4.2、4.8、5.0、5.4、5、8、6.0、6.2、6.6、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10μg/ml等等。
优选的，所述联合疫苗还可包括III、佐剂（adjuvant）和/或IV、疫苗递送系统（vaccine delivery system）。
III、佐剂
所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂（如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等）、细菌佐剂（如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等）、铝佐剂及其他无机成分佐剂（如钙佐剂）、细胞因子和核酸佐剂（如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等）、乳剂佐剂（如弗氏佐剂）。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。在本发明的一个或多个实施方案中，所述佐剂为氢氧化铝佐剂（Al(OH)3佐剂）、CpG1018佐剂（购自广州锐博生物技术有限公司，批号0210426）、CpG-cjx1佐剂（序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’，SEQ ID No.29）、CpG7909佐剂（序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，SEQ ID No.30）中的至少任一种。
优选的，所述疫苗原液：佐剂质量比为1：（40-60），可以是上述范围内的任意范围或者任意值，例如1:40、1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60等等。
所述佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂，更优选的，所述CpG佐剂包括CpG1018佐剂、CpG-cjx1和/或CpG7909佐剂。
进一步地，所述佐剂可为Al(OH)3（氢氧化铝）佐剂。
进一步的，所述佐剂包括铝佐剂和CpG双佐剂，更优选的，所述双佐剂中，所述铝佐剂与CpG佐剂的质量比可为(22-28) :1，具体可为22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1，优选为25:1。所述铝佐剂为AL(OH)3（氢氧化铝），所述CpG佐剂为CpG-cjx1佐剂。
所述联合疫苗中，铝佐剂的含量可为400-600μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为400、420、450、480、500、520、550、580、600μg/ml。
所述联合疫苗中，CpG佐剂的含量可为10-30μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为10、12、15、18、20、23、26、28、29、30μg/ml等等。
本领域技术人员所熟知的是，为了增强抗原蛋白的免疫原性，除了加入具有免疫增强作用的化合物作为佐剂外，还可通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构；或在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球中。
IV、疫苗递送系统：
所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。
进一步的，所述联合疫苗还包括一种或者是多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
本发明所述用于预防感染的疫苗可为肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。
优选的，所述I、来自流感病毒的血凝素来自于H1N1、H3N2亚型、乙型BY和BV亚型，每种亚型的血凝素含量为15-50µg/ml，
所述II、来自RSV的融合蛋白包括SEQ ID No.2-9的任意序列或SEQ ID No12-19的任意序列，所述来自RSV的融合蛋白的含量为1-10μg/ml。
所述III佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂，铝佐剂的含量可为400-600μg/m，所述CpG佐剂的含量可为10-30μg/ml。
本发明第二方面，提供一种上述联合疫苗的制备方法，所述制备方法包括：
3）制备包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液，和，
4）制备包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液。
步骤1）-2）的进一步详细说明如下：
步骤1）、制备包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液：
优选的，所述步骤1）包括流感病毒扩增、收获、裂解和灭活。
更优选的，所述收获后对收获液进行澄清和过滤，获得澄清液，所述过滤包括初过滤和精细过滤。进一步优选的，所述初过滤膜孔径为1.0-3.0μm，优选为2.0μm，所述精细过滤膜孔径小于1.0μm，例如0.8、0.6、0.45、0.3μm等等。
更优选的，所述过滤步骤后包括对澄清液进行超滤浓缩获得浓缩液。进一步优选的，所述超滤浓缩包括用450-550KD，优选500KD的超滤膜分别对单价病毒澄清液进行超滤浓缩，将单价病毒澄清液浓缩至1/40-1/60，优选1/51体积，补加缓冲液进行循环洗滤。洗滤至单价病毒澄清液原倍体积后停止洗滤，浓缩至原倍体积的1/40-1/60，优选1/51体积后收获病毒浓缩液。在一个具体的实施方式中，所述缓冲液为 0.01mol/L PBS。
更优选的，所述超滤浓缩步骤后对浓缩液离心，更优选的，所述离心采用蔗糖密度梯度离心法对单价病毒浓缩液进行离心纯化。
更优选的，所述离心纯化步骤后对离心液进行脱糖，获得单价病毒梯度后液。在一个具体的实施方式中，选用450-550KD，优选500KD的超滤膜对单价病毒离心液进行洗滤脱糖。洗滤至单价病毒离心液的15-25，优选20倍体积，再浓缩至单价病毒浓缩液的原倍体积。即为单价病毒梯度后液。
更优选的，所述步骤2）还包括纯化步骤，所述纯化步骤可以在收获后、裂解后，或者灭活后。进一步优选的，所述纯化包括层析纯化，在一个具体的实施方式中，所述纯化步骤包括在脱糖步骤后进行层析纯化，进一步优选的，所述层析纯化中按照1：（3500-4500），优选1:4000比例加入非离子型去污剂，例如吐温80进行层析纯化。
更优选的，所述裂解步骤包括用裂解剂对病毒液进行裂解，病毒液中蛋白浓度为0.5 ~ 2.5mg/ml。进一步优选的，所述裂解剂包括但不仅限于TritonX-100、去氧胆酸钠等等。
更优选的，所述灭活步骤包括灭活剂对病毒液进行灭活，获得单价原液，病毒液中蛋白浓度为0.5 ~ 2.5mg/ml。进一步优选的，所述灭火剂包括但不仅限于甲醛、β-丙内酯(BPL)等等。
更优选的，所述步骤2）还包括将单价原液进行混合获得裂解的多价流感疫苗原液。
步骤2）、制备包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液：
优选的，所述步骤2）包括来自RSV的融合蛋白人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
更为优选的，生物表达的步骤包括：
H1）构建含有编码所述突变蛋白或者融合蛋白的核酸分子的重组表达载体；
H2）将所述重组表达载体导入宿主细胞，得到重组细胞；
H3）培养所述重组细胞，经分离和/或纯化得到所述突变蛋白或者融合蛋白。
在上述制备方法中，本发明还提供了以下生物材料：
本发明提供的生物材料为下述D1）-D5）中至少一种：
D1）编码上述突变蛋白或融合蛋白的核酸分子；
D2）含有D1）所述核酸分子的表达盒；
D3）含有D1）所述核酸分子的重组载体、或含有D2）所述表达盒的重组载体；
D4）含有D1）所述核酸分子的重组微生物、含有D2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
D5）含有D1）所述核酸分子的重组细胞系、含有D2）所述表达盒的重组细胞系、或含有D3）所述重组载体的重组细胞系。
所述突变蛋白或融合蛋白参见本发明第一方面II来自RSV的融合蛋白的定义。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA。
在一个具体的实施方式中，编码所述突变蛋白或融合蛋白的核酸分子包括E1）-E3）：
E1）、SEQ ID No.20-27任意序列的第1-1422或者全长所示的DNA分子；
E2)、E1）的互补或者简并序列；
E3）、与E1）或E3）限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。
进一步地，D2）所述表达盒、D3）所述重组载体、D4）所述重组微生物和D5）所述重组宿主细胞均可表达上述突变蛋白、融合蛋白和/或D1）所述核酸分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白或融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述突变蛋白或融合蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述突变蛋白或融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2-19所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，具有80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白或融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、Ti质粒、病毒载体（如逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒等）。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pUC57载体和/或pKS001载体。
本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）、产碱菌属（Alcaligenes sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽胞杆菌属（Bacillus sp.）等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为TOP10感受态细胞。
本文所述宿主细胞（也称为受体细胞）可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥（Arabidopsisthaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）、小鼠乳腺癌细胞（C127细胞）、人胚胎肾细胞（HEK293细胞）、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等）、禽类细胞（例如鸡或鸭细胞）、两栖类细胞（例如非洲爪蟾（Xenopuslaevis）细胞或大鲵（Andrias davidianus）细胞）、鱼类细胞（例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞）、昆虫细胞（例如Sf21细胞或Sf-9细胞）等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为CHO-K1Q细胞。
在一个具体的实施方式中，所述步骤2）包括如下步骤：将编码所述来自RSV的突变蛋白或融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述突变蛋白或融合蛋白。
更进一步的，所述蛋白或融合蛋白的核酸分子通过重组质粒导入CHO K1Q细胞。
所述重组质粒为将所述突变蛋白或融合蛋白的核酸分子插入载体质粒后得到的质粒。
在本发明的具体实施例中，所述载体质粒为pKS001载体质粒。所述重组质粒为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP或pKS001-RSV-PreF-H-NP。
优选的，所述制备方法还包括步骤3）、将步骤1）和2）的疫苗原液混合后，添加佐剂和缓冲液，以获得预期的浓度。
优选的，所述疫苗原液：佐剂质量比为1：（40-60），可以是上述范围内的任意范围或者任意值，例如1:40、1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60等等。
更优选的，所述佐剂如本发明第一方面所定义。
更优选的，所述缓冲液包括PBS等。
本发明第三方面，还提供一种上述任一联合疫苗应用，所述应用包括下述任一种：
F1）在制备用于预防和/或治疗流感病毒和RSV感染引起的疾病的产品中的应用；
F2）在制备用于诱导流感病毒和RSV抗原免疫反应的产品中的应用；
F3）在预防和/或治疗流感病毒和RSV感染引起的疾病中的应用；
F4）在用于诱导流感病毒和RSV抗原免疫反应中的应用；
F5）在预防流感病毒和RSV感染中的应用。
本文所述产品可为试剂或药物。
F1）和F2)中所述产品可为流感病毒和RSV抗体，所述抗体包括全长抗体或抗原结合片段（如Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体（ScFv）、纳米抗体（单域抗体）、双特异性抗体或最小识别单位（MRU）等但不限于此）。
上述应用中，所述流感病毒和RSV感染引起的疾病可包括呼吸系统感染、消化系统感染、心血管系统感染、和/或神经系统感染等，
优选，所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染，
优选，所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻，
更优选，所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，
更优选，所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤，
本发明第四方面，还提供了一种产生免疫应答的方法，所述方法可包括给受试者施用上述任一的联合疫苗。
上述方法中，给受试者施用所述联合疫苗后，可在受试者中引发针对流感病毒和RSV的免疫反应。所述免疫反应可为细胞免疫反应，或体液免疫反应，或细胞免疫反应和体液免疫反应。
所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。
本文所述受试者可为人类或非人类动物。
进一步地，所述非人类动物可为非人类哺乳动物。
所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。
本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者（流感病毒和RSV感染后恢复的受试者）。
本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。
本发明第五方面，还提供一种预防和/或治疗流感病毒和RSV感染引起的疾病的方法，所述方法可包括给受试者施用所述联合疫苗。
上述方法中，所述流感病毒和RSV感染引起的疾病可包括呼吸系统、消化系统、心血管系统和/或神经系统感染。
上述方法中，所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染。
上述方法中，所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤。
上述方法中，所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻。
上述方法中，给受试者施用所述联合疫苗后，可在受试者中引发针对流感病毒和RSV的免疫反应。所述免疫反应可为细胞免疫反应，或体液免疫反应，或细胞免疫反应和体液免疫反应。
所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。
本文所述受试者可为人类或非人类动物。
进一步地，所述非人类动物可为非人类哺乳动物。
所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。
本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者（感染后恢复的受试者）。
本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。
本发明第六方面，还提供上述生物材料本身，包括：
来自RSV的融合蛋白，所述融合蛋白见本发明第一方面II、来自RSV的融合蛋白的定义；
D1）-D5）分别所定义的核酸分子、表达盒、重组载体、重组微生物、重组宿主细胞和/或重组细胞系。
本发明第七方面，提供上述生物材料或利用上述生物材料获得的突变蛋白、融合蛋白和/或疫苗在如下Y1）-Y4）任一种中的应用：
Y1）作为免疫原；
Y2) 制备抗流感和呼吸道合胞病毒的产品；
Y3）制备预防和/或治疗流感和呼吸道合胞病毒感染的产品；
Y4）制备预防和/或治疗流感和呼吸道合胞病毒所致疾病的产品。
本发明第八方面，提供包含上述生物材料的产品，所述产品包括例如疫苗或者药物组合物等等。
优选的，所述疫苗或者药物组合物包括本发明第一方面定义的佐剂、递送系统或药学上可接受的载体。
需要说明的是，本发明中的任意形式的编号，例如I、II、III、A、B、a、b等形式的编号因仅仅是为了区分彼此而进行的命名，并不表明时间或空间的先后顺序，有另外说明除外。
本发明疫苗中，
RSV疫苗中通过特异性的抗原突变设计增强了Pre-F蛋白的有效免疫原性、稳定性和安全性，并通过在纳米颗粒表面的展示将所需要的表位外露，进一步增强了免疫原性。通过实验证明：本发明制备的疫苗可以在低剂量时获得较好的免疫效果，其中，RSV-PreF-C-NP组中和效价可达到19836。
本发明解决了野生抗原稳定性差的问题，本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白在进入生物体内之后能够诱导出具备中和活性的呼吸道合胞病毒抗体，从而赋予该机体相应的免疫保护。
本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白能够有效激发机体的细胞免疫机制，并且引起的免疫反应是Th1/Th2平衡的，可以避免Th2偏激所导致的免疫过激反应，具备较好的安全性。
本发明通过将RSV的Pre-F相关序列及铁蛋白纳米颗粒进行突变设计，并将Pre-F突变蛋白和铁蛋白突变体颗粒在真核细胞中进行融合表达，得到具备多个Pre-F在表面集中展示的铁蛋白-PreF融合蛋白纳米颗粒，该铁蛋白-PreF融合蛋白纳米颗粒通过稳定和暴露所需要展现的抗原表位，破坏或隐藏不需要的抗原表位，有效的提高了抗原的免疫原性、生产稳定性和安全性。通过实验表明：将本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对真病毒可产生较高的中和效价，同时通过稳定性实验和安全性实验证明：本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白还具备足够的物理稳定性和较好的安全性。
概括来说，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）联合疫苗中的RSV疫苗，本发明对野生型Pre-F以及铁蛋白进行突变，增强了疫苗的有效免疫原性、稳定性和安全性，同时对铁蛋白进行突变，进一步提高了疫苗的抗原性和稳定性。
（2）联合疫苗中，广谱抗原，可同时刺激机体产生针对多种流行株的多种亚型的流感病毒以及多种RSV亚型的高滴度中和抗体，能有效中和各亚型流感病毒毒株和RSV毒株。
（3）联合疫苗中，采用佐剂包括铝佐剂和吉诺卫自主研发设计的全硫代修饰的线性CpG ODN佐剂，可同时刺激B细胞和T细胞免疫，微量蛋白即可激发小鼠非常高的免疫反应，短时间内即可达到良好的保护效果。
（4）联合疫苗中，两种抗原组分疫苗之间没有相互抑制，能很好兼容，同时具备安全性和稳定性。
（5）联合疫苗中，两种抗原组分疫苗之间还具有协同作用，能相互促进，增加机体产生对病毒的抗体滴度，提高体液或者细胞免疫保护效力。
（6）本发明的联合疫苗适用人群广，幼儿成人均有效，而目前上市的亚单位疫苗仅批准用于成人。
（7）本发明的联合疫苗预防的疾病均为季节性的呼吸道系统疾病，联合使用方便，减少受试者的疫苗接种次数，同时预防多种疾病，从而降低因多次来接种点而感染疾病的风险和多次接种所带来的不良反应的发生率，包括多次接种而导致的更多剂量的防腐剂及佐剂带来的不良反应，多次注射给婴儿和父母所带来的身体和心理的痛苦等等。
附图说明
图1为实施例2中pKS001载体的结构示意图。
图2为实施例2中铁蛋白-PreF融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。A：泳道1是RSV-PreF-A-NP纯化后的洗脱产物，泳道2、泳道3分别是流穿和上清，泳道4是分子量标记物（Solarbio，货号：PR1910，下同）。B：泳道1是RSV-PreF-B-NP纯化后的洗脱产物，泳道2、泳道3分别是流穿和分子量标记物。C：泳道1是RSV-PreF-C-NP纯化后的流穿，泳道2是RSV-PreF-C-NP纯化后的洗脱产物，泳道3、泳道4分别是RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP纯化后的洗脱产物。D：泳道1是RSV-PreF-F-NP纯化后的洗脱产物，泳道2是分子量标记物。E：泳道1、泳道2分别是RSV-PreF-G-NP纯化后的流穿、洗脱产物。F：泳道1是分子量标记物，泳道2是RSV-PreF-H-NP纯化后的流穿，泳道3是间隔空白泳道，泳道4是RSV-PreF-H-NP纯化后的洗脱产物。
图3为实施例2纯化后铁蛋白-PreF融合蛋白的WB检测结果。从左往右第2-5和7-10列依次为RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP纯化产物的WB检测结果。
图4为实施例3铁蛋白-PreF融合蛋白的纳米颗粒形态图。A-H分别是RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP纯化产物对应的电镜照片。
图5为实施例4铁蛋白-PreF融合蛋白疫苗的免疫原性研究结果。
图6为实施例4铁蛋白-PreF融合蛋白免疫小鼠后的中和效价值的Log2。
图7为实施例6铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP免疫后的小鼠血清中IgG1和IgG2a的ELISA效价及福尔马林灭活疫苗的对照效价。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 制备四价流感病毒裂解疫苗原液:
生产工艺流程： 流感病毒株工作种子→接种 9~11 日龄鸡胚→收集尿囊液 →2.0μm+0.45μm 澄清处理后单价病毒收获液→500KD 超滤膜超滤浓缩→蔗糖密度梯度离心→500KD 超滤膜洗滤→Sepharose 4FF 层析→裂解→30KD 超滤膜洗滤→灭活→30KD 超滤膜洗滤→0.22μm 除菌→ 单价原液→半成品→成品。
1.1 疫苗原液生产工艺的研究
1.1.1 流感病毒株的来源
本研究用的流感病毒株及检测用抗血清具体见下表1：
表1：流感病毒株及检测用抗血清
经 SPF 鸡胚传代至工作种子批，经检定符合《中华人民共和国药典》(2015年版、三部)的质量标准要求，该毒株工作种子批经中国食品药品检定研究院检测， 结果如下：
H1N1血凝滴度为 1 ：320；病毒滴度为 7. 1lgEID50/ml 。
H3N2血凝滴度为 1 ：320；病毒滴度为 7.4lgEID50/ml。
Bv 血凝滴度为 1 ：320；病毒滴度为 7.7lgEID50 /ml。
By 血凝滴度为 1 ：160；病毒滴度为 6.6lgEID50/ml。
1.1.2 鸡胚的来源
疫苗研究及生产采用的鸡胚为来源于封闭式房舍内，健康鸡群的 9~11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。鸡胚来源为吉林省九军牧业有限公司、吉林省广超牧业有限公司、吉林嘉鸿牧业有限公司等。
1.1.3 流感病毒株于鸡胚内复制
参照 《中华人民共和国药典》(2015 年版、三部) 流感病毒裂解疫苗制备规程，第2.3.2项病毒接种和培养的描述于鸡胚尿囊腔接种经适当稀释的工作种子批毒种(各型流感毒株应分别按工作种子批病毒稀释度的要求进行接种)，置33~35℃；培养 48~7 2 小时。
1.1.4 生产工艺研究
1.1.4.1 单价病毒收获液的澄清及过滤
鸡胚尿囊收获液的颜色呈微黄色、外观比较浑浊。因此我们采用了先经膜孔径为2.0μm 滤膜进行粗滤，再经膜孔径为 0.45μm 滤膜进行精细过滤的串联方式澄清。
1.1.4.2 单价病毒收获液的超滤浓缩
用 500KD 的超滤膜分别对单价病毒收获液进行超滤浓缩。将单价病毒收获液浓缩至1/51体积，补加 0.01mol/L PBS 缓冲液进行循环洗滤。洗滤至单价病毒收获液原倍体积后停止洗滤，浓缩至原倍体积的1/51体积后收获病毒浓缩液。
1.1.4.3 浓缩液的离心
采用蔗糖密度梯度离心法对单价病毒浓缩液进行纯化。将4个型别单价病毒浓缩液经超速离心机转速 30000rpm；离心3小时后，收获单价病毒离心液。
1.1.4.4 单价病毒离心液的脱糖
单价病毒浓缩液经蔗糖密度梯度离心法纯化后，病毒液内的蔗糖浓度为40%左右。我们采用洗滤的方法降低蔗糖浓度，选用500KD的超滤膜对单价病毒离心液进行洗滤脱糖。洗滤至单价病毒离心液的20倍体积，再浓缩至单价病毒浓缩液的原倍体积。即为单价病毒梯度后液。
1.1.4.5 单价病毒梯度后液的层析纯化
单价病毒梯度后液按 1:4000的比例加入吐温80 (吐温80 是非离子型去污剂，它可以减少蛋白质之间的相互吸附力)。将单价病毒梯度后液置于20~25℃；作用2~ 3小时。用Sepharose 4FF凝胶过滤层析系统进行层析 (流速50cm/h)。
1.1.4.6 裂解条件的工艺研究
本研究选用TritonX-100作为流感病毒的裂解剂。确认蛋白浓度应在0.5 ~2.5mg/ml 范围内，用 Triton X-100溶液，一次性加入到病毒纯化液中，使Triton X-100最终浓度(M：V)为 0.8%，20~25℃裂解2小时。应用40倍体积的PBS，选用30KD超滤膜洗滤去除裂解剂。
1.1.4.7 灭活条件的工艺研究
本发明选用甲醛作为流感病毒的灭活剂。确认蛋白浓度应在0.5~2.5mg/ml 范围内，加入甲醛溶液。按照终浓度为180μg/ml加入甲醛溶液。将灭活液密封放置于2~ 8℃，每天手动摇匀10分钟，灭活5天。应用20倍体积的PBS，选用 30KD超滤膜洗滤去除甲醛。
1.1.4.8 单价原液
将去除裂解剂及灭活剂的单价病毒灭活液经膜孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤后，即为单价原液。
1.1.4.9 四价流感裂解疫苗原液
各型别单价原液的血凝素含量应达到132µg/ml时，方可对四种单价原液进行混合，混合后进行分装，装量为每支0.5ml。即含各型流感病毒株血凝素应为16.5µg。
实施例2 RSV铁蛋白-PreF融合蛋白的设计、制备与纯化
本实施例和下述实施例中的 RSV 病毒 A 型 Long 株记载于文献“Cultures ofHEp-2 cells persistently infected by human respiratory syncytial virus differin chemokine expression and resistance to apoptosis as compared to lyticinfections of the same cell type”中。
本实施例和下述实施例中的 RSV 病毒 B 型 BA9 株记载于文献“GeneticDiversity and Molecular Epidemiology of Circulating Respiratory SyncytialVirus in Central Taiwan,2008-2017”中。
本实施例和下述实施例中的强生公司开发的同类疫苗记载于文献“preFmmunogenicity and protective efficacy of adenoviral and subunit RSVvaccinesbased on stabilized prefusion F protein in preclinical models”中。
本实施例和下述实施例中的福尔马林灭活疫苗 FI-RSV 记载于文献“Enhancedpulmonary histopathology induced by respiratory syncytial virus (RSV)challenge of formalin-inactivated RSV-immunized BALB/c mice is abrogated bydepletion of interleukin-4 (IL-4) and IL-10”中。
将RSV的Pre-F相关序列进行突变与设计，得到Pre-F突变蛋白，并使其与铁蛋白相关序列进行融合，形成铁蛋白-PreF一体的亚单位，然后利用铁蛋白的自组装性能，成为具备良好Pre-F抗原展示效果的纳米颗粒。具体步骤如下：
一、铁蛋白-PreF融合蛋白的设计
1、RSV的Pre-F相关序列的设计
为了展示和稳定需要的表位，破坏或掩盖不需要的表位，将RSV的野生型Pre-F蛋白氨基酸序列（野生型Pre-F蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示）进行如下1）-19）中至少一种突变，得到Pre-F突变蛋白：
1）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 67 位的异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N）。
2）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 88 位的丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N）。
3）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 110 位的半胱氨酸（C）突变为丙氨酸（A）。
4）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第143位和第144位氨基酸之间插入甘氨酸。
5）将Pre-F蛋白氨基酸序列在第144位天冬酰胺突变为半胱氨酸。
6）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 159 位的酪氨酸（Y）突变为半胱氨酸（C）。
7）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 173 位的半胱氨酸（C）缺失。
8）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 202 位的丙氨酸（A）突变为半胱氨酸（C）。
9）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 227 位的异亮氨酸（I）突变为天冬酰胺（N）。
10）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 236 位的丝氨酸（S）突变为精氨酸（R）。
11）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 248 位的丝氨酸（S）突变为半胱氨酸（C）。
12）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 289 位的谷氨酸（E）突变为天冬酰胺（N）。
13）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 309 位的丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N）。
14）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 334 位的精氨酸（R）突变为酪氨酸（Y）。
15）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 344 位的天冬酰胺（N）突变为谷氨酸（E）。
16）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 370 位的丝氨酸（S）突变为甘氨酸（G）。
17）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 389 位的天冬酰胺（N）突变为半胱氨酸（C）。
18）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 419 位的半胱氨酸（C）突变为酪氨酸（Y）。
19）将 Pre-F 蛋白氨基酸序列第 468 位的精氨酸（R）突变为天冬酰胺（N）。
在本发明中，所述 Pre-F 突变蛋白分别为 RSV-PreF-A、RSV-PreF-B、RSV-PreF-C、RSV-PreF-D、RSV-PreF-E、RSV-PreF-F、RSV-PreF-G 和 RSV-PreF-H（以下也可以分别简称为 Pre-F 突变蛋白A、B、C、D、E、F、G、H）。
其中，
RSV-PreF-A：包括第88位的突变修饰（SEQ ID No.2）；
RSV-PreF-B：包括第67、88、143与144位之间插入甘氨酸、144、389位的突变修饰（SEQ ID No.3）；
RSV-PreF-C：包括第88、289、309、468位的突变修饰（SEQ ID No.4）；
RSV-PreF-D：包括第67、88、110、143与144位之间插入甘氨酸、144、289、309、389和468位的突变修饰（SEQ ID No.5）；
RSV-PreF-E：包括第159、202、248、、334、344、370位的突变修饰（SEQ ID No.6）；
RSV-PreF-F：包括第67、110、143与144位之间插入甘氨酸、144、202、227、248、334、344和389位的突变修饰（SEQ ID No.7）；
RSV-PreF-G：包括第159、202、289、334、344和468位的突变修饰（SEQ ID No.8）；
RSV-PreF-H：包括第67、110、143与144位之间插入甘氨酸、144、159、202、236、248、289、309、334、370、389、419、468位的突变修饰（SEQ ID No.9）。
2、纳米颗粒序列的设计
为了提升颗粒的稳定性和完整度，将野生型铁蛋白氨基酸序列（野生型铁蛋白氨基酸序列如 SEQ ID No.10 所示）进行如下 1）-3）中至少一种突变，得到铁蛋白突变体：
1）将铁蛋白氨基酸序列第 15 位的天冬酰胺（N）突变为谷氨酰胺（Q）。
2）将铁蛋白氨基酸序列第 96 位的丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N）。
3）将铁蛋白氨基酸序列第 119 位的酪氨酸（Y）突变为精氨酸（R）。
在本发明中，铁蛋白突变体的氨基酸序列如 SEQ ID No.11 所示。
二、铁蛋白-PreF 融合蛋白的制备
1、重组质粒的构建
1）铁蛋白-PreF 的基因融合设计
将 Pre-F 突变蛋白和铁蛋白突变体通过 linker（SGSGGGSG,SEQ ID No.28）进行融合，制备铁蛋白-PreF 融合蛋白，该铁蛋白-PreF 融合蛋白自 N 端至 C 端依次由 Pre-F 突变蛋白、linker（SGSGGGSG,SEQ ID No.28）和铁蛋白突变体组成。
铁蛋白-PreF 融合蛋白分别为 RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP 和 RSV-PreF-H-NP(以下也可以分别简称为融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H），其氨基酸序列分别如 SEQ ID No.12 -SEQ ID No.19 所示，编码基因序列分别如 SEQ ID No.20 - SEQ ID No.27 所示。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成含有上述各铁蛋白-PreF 融合蛋白编码基因序列的质粒，并将其分别命名为质粒 RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP 和 RSV-PreF-H-NP(以下也可以分别简称为质粒A、B、C、D、E、F、G、H）。
2）重组质粒的构建
用限制性内切酶 Hind III-HF 和 Not I-HF（NEB，货号分别为 R3104V 和R3189L）对 pKS001 载体质粒（中山康天晟合生物技术有限公司，货号为 A14101）进行双酶切，得到骨架载体。pKS001 载体质粒结构示意图如图 1 所示。
用限制性内切酶 Hind III-HF 和 Not I-HF 分别对质粒 RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP 和 RSV-PreF-H-NP 进行双酶切，分别得到目的片段。
用 Quick 连接酶（NEB，货号为 M2200L）分别将骨架载体与各个目的片段连接后转化大肠杆菌感受态 Trans10（北京全式金生物技术股份有限公司，货号为 CD101），筛选阳性克隆并提取质粒进行测序验证，将测序验证正确的质粒分别命名为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP 、 pKS001-RSV-PreF-B-NP 、 pKS001-RSV-PreF-C-NP 、pKS001-RSV-PreF-D-NP 、 pKS001-RSV-PreF-E-NP 、 pKS001-RSV-PreF-F-NP 、 pKS001-RSV-PreF-G-NP 和pKS001-RSV-PreF-H-NP（以下也可以分别简称为重组质粒A、B、C、D、E、F、G、H）。
测序结果表明：重组质粒A、B、C、D、E、F、G、H 分别为将pKS001 载体的 Hind III-HF 和 Not I-HF 酶切位点间的 DNA 片段分别替换为 SEQ ID No.20-27 所示的 DNA 分子，且保持 pKS001 载体其他序列不变后得到的质粒。
2、铁蛋白-PreF 融合蛋白的表达
将 上 述 重 组 质 粒A、B、C、D、E、F、G、H分别在 CHO K1Q 细胞（康晟生物医药有限公司，货号为 A14101）中进行电转和表达，并筛选高表达的细胞株。
使用苏州壹达生物科技有限公司的电转仪 EBXP-F1 进行电转，具体电转步骤如下：
1）电转前准备：电转前 30min 将 Buffer、细胞培养液、D-PBS 提前取出恢复至室温。
2）收集细胞、计数：细胞混悬均匀后置于离心管，进行计数。
3）离心：取所需培养液细胞置于一新的离心管内，在离心机（苏州市国飞实验室仪器有限公司，货号：TDL-5A）中 1000rpm 离心 5min。
4）DPBS 清洗：弃去上清培养液，获得所需细胞，加入 1mL D-PBS（赛默飞 Gibco，货号：2334304）重悬细胞，1000rpm 离心 5min。
5）DNA、细胞、buffer 混合：弃去 D-PBS，加入所需量电转缓冲液（苏州壹达生物科技有限公司，货号：H10305）和 10μg 质粒，轻轻吹打混匀。
6）电转：将混有质粒的细胞悬液按照 200μl+DNA 体积/杯，加入到 H1 电转杯（苏州壹达生物科技有限公司，货号：H10201）中，将电转杯插入基座内，按照表2所示电转条件进行电转。
表 2、电转条件
7）培养：将电转后的细胞加入含有 10mL CDO4 培养基（康晟生物医药有限公司，货号：A11004）的 T25 方瓶（无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：707003）培养48 小时。
细胞克隆的培养与筛选的具体如下步骤：将上述 T25 方瓶中的细胞取样，使用细胞计数仪（赛诺菲，型号：Countess II FL）进行活率监控。在活率高于70%的情况下，按照每孔 10000 个细胞进行 96 孔板的铺板，在含有 25mM MSX（Sigma，货号：M5379-1G）的 CD04培养液中培养，通过 ELISA 方法选取阳性克隆，继续进行扩大培养至 125mL（无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：781011）摇瓶，在 125mL 摇瓶中培养，约 5-7 天后，使用计数仪检测活率下降至 50-80%之间时，取上清液进行 ELISA检测。
ELISA 检测方法如下：上清液按照 10 倍、100 倍、1000 倍、10000 倍进行稀释、包被，使用 1500 倍稀释的 F 蛋白抗体（普健生物（武汉）科技有限公司，货号：62814）作为一抗，羊抗人 IgG-HRP（索莱宝，货号 SE101-1ml）作为二抗，使用酶标仪（上海科华，货号：RD-SH-012）进行信号读取，选出信号最强的作为最高表达样品。收获最高表达样品的上清液进行下一步纯化。
三、铁蛋白-PreF 融合蛋白的纯化
按照文献 Flexible RSV Prefusogenic Fusion Glycoprotein ExposesMultiple Neutralizing Epitopes that May Collectively Contribute to ProtectiveImmunity 中的方法，通过 Capto Lentil Lectin（Cytiva，货号：17548902）、Q SepharoseFF （Cytiva，货号：17051060）、Capto Core 400（Cytiva，货号：17372402）、Superose 6prep grade（Cytiva，货号：10321079），对表达细胞株培养液上清进行纯化。具体纯化步骤如下：
将选定的细胞上清培养液进行 8000r/min 高速离心 20 分钟，使用 0.45um 滤膜（津腾，货号：JTSF 025013/014）进行过滤，得到约 100mL 溶液，补平衡液至 200mL。使用平衡液平衡 QFF 柱，A1 泵上样，流速 1.5mL/min。上样完成后，用平衡液冲洗至吸收值回落至上样前并稳定。洗脱液（20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.5）梯度洗脱，流速2mL/min，0-100%B，50min。收集洗脱峰。将上清液浓缩 5-10 倍，在流速 1mL/min 的流速下过 Superose 6prep grade 柱子，收集吸收峰的样品，得到铁蛋白-PreF 融合蛋白溶液，浓缩后用于 SDS-PAGE 和 western blot 分析。
SDS-PAGE 分析具体步骤如下：向 80μl 铁蛋白-PreF 融合蛋白溶液中加入 5×蛋白上样 loading 20μl，95℃处理 10min 后离心。取 15μl 上清用于 SDS-PAGE 分析，染色处理观察蛋白表达情况。
Western blot（WB）分析具体步骤如下：
1、SDS-PAGE 电泳：制备 10% 厚度为 1.0mm 的 SDS-PAGE 胶，在 1×SDS 电泳缓冲液中进行凝胶电泳，取 20μl 蛋白样品上样，使用 80V 电压待样品进入分离胶后，切换到 130V。
2、半干法转膜：使用转移电泳槽（君意，货号：JY-ZY3）。准备 1 张与分离胶大小一致的 PVDF 膜和 6 张滤纸，并用 1×膜转移缓冲液（39mM 甘氨酸，48mM Tris，0.037%SDS，20% 甲醇）浸湿，电泳结束后切掉多余浓缩胶和分离胶，按照阳极电极-三层浸湿滤纸-PVDF 膜-蛋白胶-三层浸湿滤纸-阴极电极的方向搭建石墨电极-转移膜胶复合体，接通电源，根据凝胶面积按 1.0mA/cm2 恒流转膜 60min。
3、封闭：用含有 5%脱脂奶粉的 PBST 封闭缓冲液浸润膜，在 37℃封闭 1h。
4、一抗孵育：将封闭好的膜浸润到加有一抗（Invitrogen，RSV Fusion Protein
Polyclonal Antibody，货号：XD3556234B）的 1×PBST 缓冲液，置于 37℃孵育60min。孵育结束后，使用 1×PBST 在 70rpm 摇床清洗膜三次，每次 10min。
5、二抗孵育：加入 1×PBST 稀释的二抗（Bioworld，Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP，货号：AA092030），37℃孵育 45min。孵育结束后，使用 1×PBST 在 70rpm 摇床，清洗膜三次，每次 10min。
6、显色：使用 DAB 显色试剂盒（Solarbio，货号：DA1016）进行显色。铁蛋白-PreF融合蛋白溶液的 SDS-PAGE 电泳检测结果如图 2 所示。WB 检测结果如图 3 所示。
结果表明：上述重组质粒均分别在CHO K1Q 细胞中成功表达得到大小约为 74KD的目的蛋白（融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H ）。
实施例 3、铁蛋白-PreF 融合蛋白的纳米颗粒形态分析
分别将实施例2中制备的融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H 的纯化产物进行负染。具体负染操作如下：
将超薄碳膜利用 Harrick Basic Plasma Cleaner PDC-32G-2 仪器进行预抽真空3min，然后 medium 挡位辉光放电 30s，取出。移液枪取 4um 样品滴到碳膜上，水平放置1min 后，用滤纸吸干，然后滴加 7um 2%的醋酸铀，放置 1min，用滤纸吸干，放置数分钟后使用 FEI Tecnai Arctica TEM D683 透射电镜对负染后的纯化样品进行电镜观察。
结果如图 4 所示，结果表明：融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H 的纯化产物样品在电镜中均可以观察到规则的纳米颗粒，并经过透射电镜分析，可以看到清晰的纳米颗粒形态，颗粒完整性较好。
实施例 4、铁蛋白-PreF 融合蛋白的免疫原性研究
一、免疫
1、实验材料与方法
实验材料：6-8 周雌性 Balb/c 小鼠（斯贝福（北京）生物技术有限公司，货号：B201-02）。
实验方法：选取 64 只 6-8 周 Balb/c 小鼠，随机分成 8 组，每组 8 只，每组处理方法如下：
包含融合蛋白A、B、C、D、E、F、G或H的疫苗 ：分别在第 0 天、21 天进行两次大腿肌肉注射所述疫苗，所述疫苗包括 1μg 的融合蛋白A、B、C、D、E、F、G或H，以及50μg 氢氧化铝佐剂（长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106）和 100μl PBS 缓冲液（Solarbio，货号 P1020）。
二、ELISA 法检测血清中的抗体
免疫后第 28 天（约 6 周）采取小鼠血清用于 ELISA 分析，ELISA 分析具体步骤如下：使用每孔 200ng 的 RSV 的 F 蛋白（义翘神州，货号：11049-V08B）进行包被，小鼠血清作为一抗，按照 250 倍、1250 倍、6250 倍、31250 倍、156250 倍、781250 倍、3906250倍进行梯度稀释，鼠二抗（Cell Signaling Technology，货号：7076S）作为二抗，使用酶标仪（上海科华，货号：RD-SH-012）进行信号读取。
经过 2 次免疫后的小鼠血清在 ELISA 中产生的效价检测结果如图 5 所示。结果表明：所有融合蛋白在不同浓度时均能产生一定的抗体滴度，在稀释到1250倍时，除了融合蛋白F，其它融合蛋白的ELISA OD值均能保持在0.34以上，稀释至6250倍时，融合蛋白G的ELISA OD值有所下降，但依然能保持在0.16左右，其它融合蛋白也能保持在0.32以上，即便是在稀释至 781250 倍时，融合蛋白 D、C、B、E、H 仍然有检测到 ELISA信号。其中，融合蛋白C 的 ELISA 效价最高，总体来说融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H均能维持一定的效价，除了融合蛋白F，其它融合蛋白均能维持稳定，高水平的效价。
三、小鼠血清 CPE 中和试验
使用 Hep-2 细胞在含有 10%牛血清的 DMEM 培养基中培养 RSV 病毒 A 型Long 株的TCID50 为 2.81E+07。选取上述各组小鼠血清各 8 份，使用含有 2%牛血清的DMEM 培养基进行稀释。从 40 倍稀释开始，按照 3 倍稀释梯度稀释至 29160 倍，然后与等体积200 TCID50 的病毒液混合，37℃放置 1 小时，每孔 200μl 铺到 Hep-2 细胞板，每只小鼠血清设置 3 个复孔，37℃培养 5-7 天，观察细胞病变情况。
结果如表 3 和图 6 所示。结果表明：融合蛋白C组中和效价均值最高，达到19836， RSV-PreF-C-NP 组中和效价均值的 Log2 达到 14.3。而且本发明中的融合蛋白A、D、C、E 中和效价均超出了强生公司开发的同类疫苗免疫后第六周的针对 A 型毒株的最高效值的 Log2（强生公司开发的同类疫苗免疫后第六周的针对 A 型毒株的最高效值的Log2 约为 11，换算效价约 2100）。
表 3、中和效价均值
按照上述实验方法，将 RSV 病毒 A 型 Long 株替换为 RSV 病毒 B 型 BA9 株，使用上述各组小鼠血清进行同样程序的效价分析。
表 4、中和效价均值
结果如表 4 所示。结果表明：RSV-PreF-C-NP 小鼠血清中和效价均值为 10568，log2值 为 13.4 。 本 发 明 中 的 RSV-PreF-A-NP 、 RSV-PreF-D-NP 、 RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-E-NP 均接近或超过效价2100。
以上结果表明：将本发明制备的铁蛋白-PreF 融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对 RSV 主要流行毒株 A 型和 B 型均可产生较高的中和效价。
实施例5、铁蛋白-PreF 融合蛋白的稳定性试验
为了验证本发明制备的铁蛋白-PreF 融合蛋白的稳定性，将纯化后的各组铁蛋白-PreF 融合蛋白进行物理稳定性（物理环境挑战）试验，具体步骤如下：
将 5 份 40μg/μl 的铁蛋白-PreF 融合蛋白溶液以及梯度稀释后的铁蛋白-PreF融合蛋白溶液分别放置在 pH7.4（25℃）、pH3.8（25℃）、pH10（25℃）、50℃（pH7.4）、70℃（pH7.4）的环境中 1 小时（分别对应图中从左往右 1-5 列），采用与细胞克隆筛选相同的方法进行 ELISA 分析。
结果表明：各组融合蛋白在不同 pH 和温度处理后的抗原结合活性均保持在原始未处理蛋白的 75%以上。说明本发明制备的铁蛋白-PreF 融合蛋白均具备足够的物理稳定性。如表 5 所示为 RSV-PreF-C-NP 蛋白的稳定性结果，其他各组的结果类似。
表 5、物理环境挑战后 ELISA 信号强度保留百分比
注：表中结果为 10、100、1000、10000 倍共 4 个稀释梯度的平均值。
实施例 6、铁蛋白-PreF 融合蛋白的安全性实验
为了验证本发明制备的铁蛋白-PreF 融合蛋白免疫后所引发的免疫反应中Th1\Th2 的平衡性（参考文献：Immunological Lessons from Respiratory SyncytialVirusVaccine Development），选择铁蛋白-PreF 融合蛋白 RSV-PreF-C-NP 免疫后的小鼠血清进行了 IgG1 和 IgG2a 的 ELISA 分析，ELISA 分析采用与血清 ELISA 检测相同的设置，二抗分别使用 IgG1 特异性二抗（abcam，货号：GR3395386-5）和 IgG2a特异性二抗（abcam，货号：GR3413688-1）。同时以福尔马林灭活疫苗 FI-RSV 以及强生公司开发的同类疫苗作为对照。
结果如图 7 所示，结果表明：血清中 IgG1 和 IgG2a 的滴度达到了约 6（见图 7中的 RSVNP IgG1 和 RSVNP IgG2a），而且其比例约等于 1，明显优于福尔马林灭活疫苗（见图 7 中的 FI-RSVNP IgG1 和 FI-RSV IgG2a），甚至优于强生公司开发的同类疫苗（IgG2a 约 5.8 和 IgG1 约 5）。说明本发明制备的铁蛋白-PreF 融合蛋白注射后引起的免疫反应是 Th1/Th2 平衡的，可以避免 Th2 偏激所导致的免疫过激反应（简称 VED），具备较好的安全性。
实施例7流感和RSV联合疫苗的制备
将实施例1和实施例2中制备的两种疫苗原液按最终疫苗抗原含量 2倍等体积混合后，用选自注射用水、0.01MPBS （ pH6.8-7.2）和含有氢氧化铝的0.01MPBS （ pH 6.8-7.2）的溶液稀释，置于磁力搅拌器低速搅拌1h，最终H1N1、 H3N2、BV、BY四种型别血凝素为16.5μg/剂/0.5ml（血凝素共66μg/剂/0.5ml），RSV-PreF-C-NP抗原为1μg/剂/0.5ml，其中含有浓度为50μg/剂/0.5ml的氢氧化铝。
实施例8 流感和RSV联合疫苗的免疫原性实验
1.流感和RSV联合疫苗的免疫原性实验
取6-8周龄Balb/c雌性小鼠75只，随机分为15组，将如实施例7所述制备的联合疫苗（流感+RSV二联疫苗），按照0.5ml剂量通过腹腔注射接种小鼠，进行疫苗的免疫原性研究。第0，21d共免疫两次，通过检测二免21d 血清针对HIN1/H3N2/BY/BV血抑效价（测定方法见国家流感中心出具的sop：红细胞凝集抑制试验鉴定流感/禽流感病毒方法，文件编号：CNICSOP07025）和针对RSV-A和RSV-B 真病毒中和抗体效价，筛选到最佳联合疫苗处方。
结果见表6和表7：
表6：流感RSV联合疫苗免疫后抗流感抗体水平
由表6可知，免疫后42天（二免后21天），流感和RSV联合疫苗（组别10-15）和流感疫苗（组别5、9）相比，流感病毒抗体滴度基本相当；加佐剂组（组别9、13-15）抗体效价均比不加佐剂组（组别5、10-12）均略有提高，尤其是针对甲型流感病毒的抗体效价，有显著性的提高。
以上试验说明，RSV疫苗组分对流感疫苗组分没有影响，佐剂对流感疫苗有免疫促进作用。
表 7 ：流感RSV联合疫苗免疫后抗RSV-A和RSV-B真病毒病毒中和抗体水平
由表7可知，免疫后42天（二免后21天），流感和RSV联合疫苗（组别10-15）和RSV疫苗组（组别2-4、6-8）相比，针对RSV-A、RSV-B真病毒中和抗体效价均有提高，RSV-PreF-D-NP与流感联合疫苗的中和抗体效价最高。而加佐剂组（组别6-9、13-15）与不加佐剂组（组别2-5、10-12）相比，针对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体效价有明显提高，说明佐剂对RSV疫苗有显著的免疫促进作用。
以上试验说明，流感疫苗各组分对RSV疫苗组分没有抑制作用，对于RSV-PreF-D-NP组还有协同作用，联合疫苗可以显著提高RSV-PreF-D-NP对真病毒的中和抗体。
综上：本发明为含铝佐剂的四价流感裂解疫苗和RSV纳米颗粒疫苗的联合疫苗，联合后，两种抗原组分疫苗之间没有相互抑制，能很好兼容，针对流感病毒四个型别和针对RSV两个型别均可以产生较高的中和抗体效价，对部分流感亚型抗体滴度水平有协同提高作用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (12)

1.一种联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：I、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液和II、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液，其中，
I、所述血凝素来自流感病毒亚型，所述流感病毒亚型为甲型H1N1、H3N2亚型和乙型BY和BV亚型；
II、所述来自RSV的融合蛋白包括pre-F蛋白的突变蛋白和铁蛋白突变体，所述融合蛋白如
（C1）SEQ ID No.15所示的蛋白；或
（C2）在（C1）所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗还包括III、佐剂和/或IV、疫苗递送系统。
3.根据权利要求2所述的联合疫苗，其特征在于，所述佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂。
4.根据权利要求3所述的联合疫苗，其特征在于，所述CpG佐剂包括CpG1018佐剂、CpG-cjx1和/或CpG7909佐剂。
5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗原液：佐剂质量比为1：（40-60）。
6.根据权利要求3-5任一所述的联合疫苗，其特征在于，所述I、来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液的每种亚型的血凝素含量为15-50µg/ml，
所述II、来自RSV的融合蛋白的含量为1-10μg/ml，
所述III、佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂，铝佐剂的含量为400-600μg/ml，所述CpG佐剂的含量为10-30μg/ml。
7.权利要求1-6任一所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
1）制备包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液，和，
2）制备包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将编码所述来自RSV的融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述编码RSV的融合蛋白的核酸分子包括E1）-E2）：
E1）、SEQ ID No.23所示的DNA分子；
E2）、E1）的互补或者简并序列；
所述步骤1）包括流感病毒扩增、收获、裂解和灭活。
10.权利要求1-6任一所述的联合疫苗的应用，其特征在于，所述应用包括下述任一种：
F1）在制备用于预防和/或治疗流感病毒和RSV感染引起的疾病的产品中的应用；
F2）在制备用于诱导流感病毒和RSV抗原免疫反应的产品中的应用，
其中，所述流感病毒为甲型H1N1、H3N2亚型和乙型BY和BV亚型。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或药物组合物。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述F1）和F2)中所述产品包括流感病毒和RSV的抗体，所述抗体包括全长抗体或抗原结合片段，所述抗原结合片段包括Fab片段、Fv片段、Fab′片段、单链抗体、单域抗体或最小识别单位。
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