CN107050446A - 经修饰的季节流感‑rsv联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种经修饰的季节流感‑RSV联合疫苗及其制备方法，包括：流感病毒蛋白抗原、RSV蛋白抗原及纳米颗粒载体，其中纳米颗粒载体表面羟基化，流感病毒蛋白抗原和RSV蛋白抗原与纳米颗粒载体表面的羟基反应，连接在纳米颗粒表面。本发明采用纳米颗粒作为新型蛋白载体，高效稳定的连接抗原蛋白，通过成功构建同时具有流感病毒抗原及RSV抗原的纳米颗粒，经小鼠实验证明，可以引起良好的系统免疫反应，纳米颗粒作为载体可重复合成，稳定性好，不仅可以抵抗体内各种酶的消化，而且具有耐受高压灭菌等众多优点。采用纳米颗粒作为新型蛋白载体，方法简单，操作简便，可连接多种蛋白和多糖抗原，无需过多修饰，具有良好的应用前景。

Description

经修饰的季节流感-RSV联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种经修饰的季节流感-RSV联合疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

一、病原微生物与疫苗

能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。传染是指病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，并引起一系列病理生理的过程。当病原微生物侵入机体后，病原微生物与机体互相作用，互相改变对方的活性与功能，因此能否引起传染病，一方面取决于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面还取决于机体的抵抗力即免疫力。病原性细菌引起传染的能力大小，就是细菌的毒力或致病性。细菌毒力的有无和毒力的强弱主要取决于它的侵袭力、产毒素性和引起超敏反应的能力。

细菌产生的毒素可分为外毒素和内毒素两大类。外毒素是病原菌在生长繁殖期间分泌到周围环境种的一种代谢产物，主要由革兰氏阳性菌产生，少数革兰氏阴性菌也能产生。其化学组成是蛋白质，抗原性强，毒性也强，但极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。常见的如：白喉棒杆菌产生的白喉外毒素、破伤风梭菌产生的破伤风毒素、霍乱弧菌产生的肠毒素、肉毒梭菌产生的肉毒毒素等。大多数革兰氏阴性细菌能产生内毒素，实际上它存在于细菌细胞壁的外层，属于细胞壁的组成部分，一般情况下并不分泌到环境中，只有当细菌溶解后才释放出来，因而称为内毒素，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。

同种生物的不同个体，当它们与病原菌接触后，有的患病，有的则安然无恙，原因在于不同个体的免疫力不同。免疫就是指机体识别和排除抗原异物(如病原微生物等)的一种保护性反应。一般来讲，它对机体是有利的，在异常条件下，也可能损害机体。人体的免疫分为非特异性免疫和特异性免疫。其中特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或产物所产生的特异抵抗力。而疫苗即是科学家研制出来使机体产生特异性免疫抵抗病原微生物对人体侵害的生物制品，通常由病原微生物本身加以制备而成的。细菌、病毒和立克次氏体等病原微生物制成疫苗，注射机体后，使机体产生特异性或致敏性淋巴细胞，分泌抗体，达到特异性免疫效果。

而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫苗保护人体不受致病性微生物的侵害。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。用以预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。更先进的有用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白缀合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗。通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的病原微生物对人类健康的挑战。

二、呼吸道疾病及免疫概述

呼吸系统是所有动物与环境进行氧气和二氧化碳交换的器官对于哺乳动物来说是指从鼻腔和咽喉开始直到肺叶的部分。呼吸道感染是临床常见的病症通常从感染发生到出现临床症状再到入院治疗的过程中宿主免疫系统己经处在免疫调理期间。在这个过程中最先起作用的固有免疫体系已经不足以清除病原体从而适应性免疫体系进一步跟进。导致呼吸道感染的病原体主要有病毒和细菌，以往研究表明当病毒和细菌同时感染宿主时通常导致严重肺炎具有较高的病死率。而多种呼吸道病毒同时感染时宿主免疫系统将不能有效清除病原体并能在感染发生的期间引发多种并发症。由于直接与外界接触，因此极易直接接触外界环境中的各类抗原，从而引发各类的呼吸道疾病。各类型的呼吸道疾病在各个国家各类医院中都是最为常见的疾病，并且呼吸道由于涉及的组织多，组织环境复杂，易受外界影响，因此各类呼吸道疾病的预防就显得尤为关键。

呼吸道感染是临床常见疾病，在众多病原体中能导致呼吸道急性炎症并具有较高致病率和致死率的两个病毒是流感病毒(Influenza Virus，or Flu)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，or RSV)。呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、腺病毒、副流感、流感病毒则是重要的呼吸道病原体。临床结果显示，在呼吸道感染发生的肺炎、支气管炎和哮喘病人中RSV占首位，严重影响了人类健康和生命安全。

在呼吸道致病病原体中，其中所占比例最高的是病毒引起，在病毒性呼吸道疾病中，又以流感和呼吸道合胞病毒为主，如在临床1个月至5岁的婴幼儿，6岁至24岁的青少年，以及25岁至65岁人群感冒样病例中，由病毒引起的病例约占化％，在共感染2种以上呼吸道病毒的人群中，RSV检测阳性的人群比例约为50％，其次是A型和B型流感病毒，分别为9.84％和10.巧％，由于呼吸道病毒的传播范围广，引起的急性呼吸道炎症比较严重，流感病毒和呼吸道合胞病毒的感染人群几乎覆盖了所有年龄阶段，况且这两种病毒都没有可以大规模使用的有效疫苗，且在感染后对人类社会造成的危害和损失是不可估量的，在送样的情况下，开展对这两个病毒的研究是必须和必然的。

三、季节流感及其流行病学

流感病毒为正粘病毒科，为分节段负链RNA病毒。根据病毒的核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲型、乙型、丙型。甲型流感具有高度变异、广泛的感染宿主范围，对公众健康的威胁最大。根据病毒表面的血凝素(HA)甲型流感病毒又分为HA1-16亚型，依据神经氨酸酶NA分为NA1-9亚型。目前在人群中流行的甲型流感病毒主要有H1、H2、H3及N1、N2亚型，近年来感染人的新型流感病毒2009H1N1、H7N9禽流感病毒，前者造成流感大流行，后者的致死率达27.2％。

A型流感病毒和B型流感病毒都含有8节段的负极性单链RNA。A型流感病毒基因组至少编码11个多肽。节段1-3编码3个多肽，组成病毒RNA依赖的RNA聚合酶。节段1编码聚合酶复合物蛋白PB2。另外的聚合酶蛋白PB1和PA分别由节段2和节段3编码。另外，某些A型流感病毒株的节段1还编码一个小蛋白PB1-F2，是由PB1编码区内的另一个阅读框架产生的。节段4编码血凝素(HA)表面糖蛋白，参与细胞粘附以及使病毒在感染期内进入细胞。节段5编码核壳体核蛋白(NP)多肽，这是一种与病毒RNA相连的主要结构蛋白。节段6编码神经酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。节段7编码两种基质蛋白，被称为M1和M2，是由经不同方式剪接的mRNA翻译的。节段8编码NS1和NS2(NEP)，这是两种非结构蛋白，由经其他方式剪接的mRNA翻译的。

HA、NA糖蛋白在病毒感染、复制过程中起着重要作用，也是重要抗原，能刺激机体产生中和性保护抗体。抗HA抗体是目前用于评估流感疫苗有效性的重要指标，尽管抗NA抗体能减轻临床症状，但既往基于β甲醛丙酮酸的生色反应，由于使用试剂有毒、操作繁琐，适合大批量筛查，因而抗NA抗体检测未被广泛推广。1990年，Claude R.Lambré报道基于花生四烯酸结合半乳糖基团检测的酶链免疫检测法，随后发现抗HA抗体如与病毒相互作用，该作用也能构象上影响与NA的结合，从而出现抗NA抗体假阳性。2009年，Sandbulte MR研究团队使用仅含流感病毒NA的病毒样颗粒(VLP)用于抗NA抗体检测，该方法已申请专利，因制备的VLP产量受限，体系中也可能有杆状病毒，对VLP技术缺乏掌握的实验室或疫苗厂家难以开展。

血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是流感病毒粒子表面的2种纤突样糖蛋白，HA大约含550个氨基酸，以同源三聚体形式存在于囊膜表面，是被宿主中抗体识别的主要抗原，它在流感病毒入侵前识别宿主细胞受体并与其结合以利于病毒的吸附与穿膜，HA前体被宿主蛋白酶裂解，流感病毒才具有感染性。

接种疫苗是预防流感发生与传播的最有效方式。目前市场应用的流感疫苗主要有三种：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗。这些疫苗对同亚型流感病毒感染预防有效，但在不同亚型病毒之间的保护效果较弱。此外，流感病毒的变异速度非常快，流感疫苗每年都要更换，给疫苗的生产制备造成了诸多不便。世界卫生组织是依据当年全世界范围流感病毒变化情况来预测并推荐下一年流感疫苗生产用组分的，预测的准确度将会直接影响疫苗的保护效率，如预测失败将造成流感爆发流行的潜在威胁。因此，研制出一种具有广泛保护作用的通用型疫苗对于应对流感病毒突变后的突然爆发，迅速建立人群免疫屏障，阻断流感大流行蔓延，降低其危害性方面具有极其重要的实际意义。

FLUMist是一种减毒活疫苗，可保护儿童和成人不患流感。FLUMist疫苗株含有来源于当前流行的野生型病毒株的HA和NA基因节段及来源于普通主供体病毒(commonmasterdonor virus)(MDV)的六个基因节段：PB1、PB2、PA、NP、M和NS。FLUMist的A型流感病毒株的MDV(MDV-A)是在连续降低温度的条件下在原代鸡肾组织培养物中通过野生型A/AnnArbor/6/60病毒株(A/AA/6/60)的系列传代而得到的。MDV-A可在25℃时有效复制(ca，冷适应)，但是其生长在38℃和39℃时受到抑制(ts，温敏)。另外，这种病毒在被感染的雪貂肺内不能复制(att，减毒的)。这种温敏表型相信是限制其在人呼吸道内最冷区域之外的部位复制而导致其毒性减弱的原因。动物模型试验和临床试验表明这种特性是相当稳定的。与通过化学诱变制备的流感病毒株的这种ts表型不同，MDV-A的ts特性通过在感染的仓鼠内传代或从儿童中分离出的经传代的分离株的这种特性不会还原。

流感病毒由于其变异率高，宿主广泛。目前应用的流感疫苗的有效率在60％～85％之间，其主要抗原成份为流感病毒膜蛋白HA和NA。而由于流感病毒为RNA病毒，其变异率为10⁵～10³之间，这导致流感疫苗病毒株每年都需更换，为流感疫苗的制备带来不便。

流感病毒一般由于接触到宿主的鼻腔及呼吸道黏膜后，进入宿主细胞，完成病毒基因组的复制和转录。因此作为人体免疫的第一道防线，黏膜免疫的及时激活对于防治流感等疾病具有重要的现实意义。

四、呼吸道合胞病毒及其流行病学

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，投入临床的疫苗很少，为其防控提出了挑战。至今仅有美国MedImmune公司研制生产的流感三价减毒活疫苗通过FDA审批。RSV是婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院达70％，2周岁以内的儿童甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。

RSV属副粘病毒科肺病毒属的非节段性单股负链RNA病毒，含A、B两个血清型。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，分别由三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusion protein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白易变异，并非感染和细胞融合所必须的；F蛋白能够稳定遗传，单独的F蛋白就可引起细胞融合病变。针对RSV F和G糖蛋白的全身性中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSV F和G蛋白已作为公认的保护性抗原和毒力致病分子。

对于RSV而言，20世纪60年代，Fulginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡和80％住院以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，已有多种疫苗类型正在研制，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。近年来，随着流感病毒反向遗传学技术日亦成熟及流感病毒载体等多种蛋白载体的日渐成熟，以载体蛋白作为递送系统成功研发的RSV疫苗候选株能够产生双重免疫保护效果，且安全性高、易于操作，具有广阔的发展前景，有望为RSV疫苗研究提供新的思路。美国MedImmune公司研制生产的帕丽珠(palivizumab)主要针对RSV A型F蛋白抗原表位II中263-275位氨基酸，作为全球第一支特异性针对RSV F蛋白中和表位的人源化单克隆抗体，帕丽珠证实可以显著降低接种人群的自然感染率，在RSV的预防和早期干预过程中发挥重要作用。目前已通过FDA批准，成功上市，在全球范围内率先结束了RSV无苗可防，无药可治的局面。

五、纳米颗粒及其在免疫学中的应用概况

纳米颗粒是指任何小于100～1000nm的颗粒，纳米颗粒大小与细胞组分相近，能够利用细胞内吞作用进入细胞。纳米颗粒的作用主要包括以下几方面：1、负载多种理化性质不同的抗原，保护抗原不被降解；2、促进树突状细胞(dendritic cell，DC)等抗原呈递细胞对抗原疫苗的摄取和呈递；3、调控抗原在细胞和组织中的输运和释放；4、部分纳米材料还能诱导DC等抗原呈递细胞活化。聚合物纳米颗粒具有较大的比表面积，能够较好地负载疫苗而发挥疫苗的免疫效力。因此，基于纳米材料尤其是聚合物纳米颗粒的新型疫苗载体系将成为突破瓶颈的重要技术手段。

随着纳米颗粒的深入研究，以及不断出现的新的以纳米颗粒为载体的疫苗的成功问世，为申请人研究流感-RSV疫苗提供了研究思路。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种经修饰的季节流感-RSV联合疫苗及其制备方法。

本发明的第一个目的在于提供一种经修饰的季节流感-RSV联合疫苗，采用的技术方案如下：

经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，包括：流感病毒蛋白抗原、RSV蛋白抗原及纳米颗粒载体，纳米颗粒载体表面羟基化，流感病毒蛋白抗原和RSV蛋白抗原与纳米颗粒载体表面的羟基反应，连接在纳米颗粒表面。

优选地，流感病毒蛋白包括包括但不限于血凝素HA、神经氨酸酶NA、核蛋白NP、基质蛋白M(M1+M2)、非结构蛋白NS、聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)中的一种或多种。

优选地，RSV蛋白包括F蛋白、G蛋白、F优势表位、G优势表位或其组合。

更优选地，流感病毒蛋白抗原和/或RSV蛋白抗原为经基因工程重组后纯化的蛋白或蛋白片段。

本发明中采用流感病毒蛋白抗原与RSV蛋白抗原进行纳米载体的连接反应，但流感病毒与RSV的抗原不应限定于此，任何可以引起流感病毒和RSV免疫反应的抗原、任何来源的此类抗原均应认为落入本发明的保护范围之内。

本发明主要的目的是提供一种经修饰的季节流感-RSV联合疫苗，当然本发明中提到的纳米载体可连接的蛋白范围不应限定于此，采用本发明中的纳米颗粒载体，可以连接任何理论上可以进行氨基羟基反应的物质。

纳米颗粒载体包括非生物原的纳米颗粒或生物原的纳米颗粒，非生物原的纳米颗粒包括树状分子、碳富勒烯、固体脂质纳米颗粒、纳米乳剂、可生物降解的聚丙交酯-乙交酯；生物原的纳米颗粒包括寡核苷酸、多糖以及可作为抗原、变应原、病原体分子。

优选地，非生物原纳米颗粒为硅基纳米颗粒。

更优选地，硅基颗粒为硅酸盐纳米颗粒。

本发明的第二个目的在于提供一种制备上述经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的制备方法，制备方法包括如下步骤：

s1：将硅酸放入无水乙醇中，形成浓度为0.1～0.5mol/L的硅酸醇液，加入分散剂，加入后分散剂在体系中的含量为硅酸的0.1～1.2，密封超声反应并搅拌，反应时间为30～60min；

s2：通过旋转蒸发仪将s1的悬浊液进行减压蒸馏，直至形成粘稠状浆液，然后将粘稠状浆液进行微超声，直至完全蒸干，形成分散性颗粒；

s3：将分散性颗粒中加入至反应釜中，加入催化剂与氨水，密封反应3～8h，然后梯度升温反应2～4h，自然冷却；加入发泡材料，密封反应温度为30～50℃，梯度升温反应，最终温度为130～150℃，并持续30min以上；

s4：将s3得到反应颗粒与多肽类阳离子聚合物混合10～15min，密封黑暗条件下恒温搅拌12～15h，经冷冻干燥即可羟基修饰的纳米颗粒；

s5：选择A型流感病毒的通过基因工程手段或其他生物手段得到的流感病毒蛋白片段，和RSV蛋白，取冻干的蛋白用注射用水复溶；干燥后的纳米颗粒用水复溶；

s6：溶于复溶后以每种蛋白与纳米颗粒以体积比为1：2～10进行混合，加入催化剂进行脱水反应，混合均匀后黑暗搅拌24h以上，离心。

优选地，s1中涉及的各试剂和参数具体为：

将硅酸放入无水乙醇中，形成浓度为0.1～0.5mol/L的硅酸醇液，加入医用级聚乙烯吡咯烷酮，加入后分散剂在体系中的含量为硅酸的0.1～1.2，密封超声反应并搅拌，超声频率10-15kHz，反应时间为30～60min。

优选地，s2中涉及的各试剂和参数具体为：

通过旋转蒸发仪将s1的悬浊液进行减压蒸馏，压力为0.03～0.05MPa，直至形成粘稠状浆液，然后将粘稠状浆液进行水浴低频率超声，频率为1.3-2.5kHz，60℃以下超声，直至完全蒸干，形成分散性颗粒。

优选地，s3中涉及的各试剂和参数具体为：

将分散性颗粒中加入至反应釜中，加入氧化铝与氨水，密封反应3～8h，然后梯度升温反应2～4h，自然冷却；加入发泡材料，密封反应温度为30～50℃，梯度升温反应要求最后温度为130～150℃，并持续30min以上。

更优选地，氧化铝为采用二氧化钛负载量为1～3％的氧化铝。

优选地，s4中涉及的各试剂和参数具体为：

将s3得到反应颗粒与多肽类阳离子聚合物混合10～15min，密封黑暗条件下恒温搅拌12～15h，恒温20～30℃，搅拌速度300～500r/min。

氨基与羟基在催化剂的催化下脱水缩合反应是本领域常规技术手段，在此不做赘述。

与现有技术相比，本发明采用纳米颗粒作为新型蛋白载体，高效稳定的连接抗原蛋白，通过成功构建同时具有流感病毒抗原及RSV抗原的纳米颗粒，经小鼠实验证明，可以引起良好的系统免疫反应，可作为新型疫苗推广使用。

纳米颗粒作为载体可重复合成，稳定性好，不仅可以抵抗体内各种酶的消化，而且具有耐受高压灭菌等众多优点。采用纳米颗粒作为新型蛋白载体，方法简单，操作简便，可连接多种蛋白和多糖抗原，无需过多修饰，产生的疫苗无需进行再处理，不会由于疫苗的生产过程导致接种者产生各类不适反应，降低了不良反应的发生率，并且可以同时连接至少一种抗原，接种后可同时产生免疫反应。本发明中的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗可根据需要制备各种剂型，接种方式简便高效，大大减轻了患者的身体及经济负担。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1：

一、硅酸盐纳米颗粒的制备

纳米颗粒种类繁多，本实施例中选用其中一种的制备工艺进行说明。

硅酸盐纳米颗粒，原料易得，制备工艺较为简单，便于修饰后作为载体使用。本发明中硅酸盐的制备过程具体如下：

s1：将硅酸放入无水乙醇中，形成浓度为0.3mol/L的硅酸醇液，然后加入分散剂医用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，加入后分散剂在体系中的含量为硅酸的0.8，超声搅拌，超声频率15kHz，超声搅拌采用密封超声反应，反应时间为60min；

将分散剂加入乙醇中能够具有良好的溶解性，同时硅酸在乙醇内呈悬浊状，两者结合的情况下，硅酸分散性更佳；超声反应能够在硅酸表面形成醇活化，超声的离合能也会分解PVP，同时PVP无毒，是良好的分散剂材料。

s2：通过旋转蒸发仪将s1的悬浊液进行减压蒸馏，压力为0.05MPa，直至形成粘稠状浆液，然后将粘稠状浆液进行微超声，直至完全蒸干，形成分散性颗粒；

微超生选择水浴低频超声，超声频率为2.0Hz，分散时温度不能过高，本实施例中温度为50℃。这样的实验条件可以保证硅酸表面的醇活化效果，便于后续的实验，以及官能团的转化。

s3：将分散性颗粒中加入至反应釜中，加入催化剂与氨水，密封反应3h，然后梯度升温反应4h，自然冷却；加入发泡材料，密封反应温度为50℃，梯度升温反应要求最后温度为150℃，并持续30min以上；

催化剂采用二氧化钛负载量为1～3％的氧化铝，催化剂先进行紫外光照进行二氧化钛活化，大大提高反应深度与反应速率；反应釜中进行的反应均以有机溶剂作为溶剂，包括乙醇、乙酸乙酯等，且溶剂不需要加水稀释。

梯度升温除了反应需要外，120℃以上能够将硅酸失水转化为二氧化硅，得到反应颗粒。

s4：将s3得到反应颗粒与多肽类阳离子聚合物混合15min，密封黑暗条件下恒温搅拌15h，恒温30℃，搅拌速度300r/min，经冷冻干燥即可羟基修饰的纳米颗粒。

二、纳米颗粒连接蛋白

选择A型流感病毒的通过基因工程手段或其他生物手段得到的流感病毒蛋白片段，包括但不限于血凝素HA、神经氨酸酶NA、核蛋白NP、基质蛋白M(M1+M2)、非结构蛋白NS、聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)中的一种或多种，本实施例中选择A型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)菌株本身表达的HA与NA蛋白进行连接。

选择呼吸道荷包病毒RSV A型的通过基因工程手段或其他生物手段得到的RSV蛋白，包括但不限于F蛋白、G蛋白、F优势表位、G优势表位或其组合，本实施例中选择RSV病毒表达的F蛋白和G蛋白进行连接。

取冻干的蛋白用注射用水复溶，复溶后的蛋白溶液浓度为0.5mg/ml；干燥后的纳米颗粒用水溶解，溶解后的纳米颗粒浓度为2mg/ml。溶于复溶后以每种蛋白与纳米颗粒以体积比为1：4进行混合，加入催化剂，混合均匀后黑暗搅拌24h以上。使蛋白的氨基与纳米颗粒的表面羟基充分反应。混合后10000rpm离心10min，沉淀即为装载后的产物。

沉淀加入PBS缓冲液(pH＝5.0)溶解，溶解后浓度为0.5mg/ml，即为本实施例中制备的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗原液。

三、经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的抗体滴度检验

取20只BALB/C小鼠随机分为4组，第一至第四组分别是联合疫苗免疫组、市售流感疫苗免疫组、RSV疫苗免疫组及阴性对照组。

市售流感疫苗选择孚洛克(流感病毒亚单位疫苗，批号20110801)由天士力金纳生物技术(天津)有限公司生产，RSV疫苗选择解放军微生物流行病研究所实验室重组的F-G蛋白亚单位疫苗，阴性对照为PBS与佐剂的混合对照。

首次免疫时每只小鼠腹腔注射200μl；同时用PBS经腹腔注射对照组小鼠，每只200μl；首次免疫后第二周和第三周，再次进行腹腔注射，每只200μl。

于末次免疫一周后经小鼠眼眶取血，分离血清；用PBS将各组小鼠血清从1：10000开始倍比稀释至1：5120000，间接ELISA检测抗体效价。腹腔免疫检测血清IgG滴度(几何平均值)。

检测结果见表1，其中第一组至第四组检测血清IgG滴度(1：)。

表1腹腔免疫后小鼠抗体滴度表

	平行1	平行2	平行3	平行4	平行5
						第一组	20898	23145	25779	20993	28621
第二组	27755	28476	28830	26532	26770
						第三组	26803	26577	28719	25761	26879
第四组	0	0	0	0	0

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，纳米颗粒载体的制备条件和蛋白抗原不同，具体如下：

s1：将硅酸放入无水乙醇中，形成浓度为0.5mol/L的硅酸醇液，然后加入分散剂医用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，加入后分散剂在体系中的含量为硅酸的0.3，超声搅拌，超声频率10kHz，超声搅拌采用密封超声反应，反应时间为45min；

s2：通过旋转蒸发仪将s1的悬浊液进行减压蒸馏，压力为0.03MPa，直至形成粘稠状浆液，然后将粘稠状浆液进行60℃1.5Hz微超声，直至完全蒸干，形成分散性颗粒；

s3：将分散性颗粒中加入至反应釜中，加入催化剂与氨水，密封反应5h，然后梯度升温反应2h，自然冷却；加入发泡材料，密封反应温度为30℃，梯度升温反应要求最后温度为130℃，并持续40min以上；

催化剂采用二氧化钛负载量为3％的氯化铝，反应釜中进行的反应均以乙醇作为溶剂，且溶剂不需要加水稀释。

s4：将s3得到反应颗粒与多肽类阳离子聚合物混合12min，密封黑暗条件下恒温搅拌15h，恒温20℃，搅拌速度500r/min，经冷冻干燥即可羟基修饰的纳米颗粒。

选择流感病毒M蛋白、RSV F蛋白冻干粉，注射用水复溶，复溶后的蛋白溶液浓度为0.5mg/ml；干燥后的纳米颗粒用水溶解，溶解后的纳米颗粒浓度为2mg/ml。溶于复溶后以每种蛋白与纳米颗粒以体积比为1：2进行混合，加入催化剂，混合均匀后黑暗搅拌24h以上。使蛋白的氨基与纳米颗粒的表面羟基充分反应。混合后10000rpm离心10min，沉淀即为装载后的产物。

沉淀加入PBS缓冲液(pH＝5.0)溶解，溶解后浓度为0.5mg/ml，即为本实施例中制备的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗原液。

本实施例中得到的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗原液腹腔免疫小鼠，得到的免疫结果如表2所示。

表2腹腔免疫后小鼠抗体滴度表

	平行1	平行2	平行3	平行4	平行5
						第一组	18993	25245	21832	19862	20191
第二组	28215	25326	22890	24132	20123
						第三组	17655	22348	28611	24661	22479
第四组	0	0	0	0	0

由表1和表2可以看出，人工合成的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗与市售疫苗相比，可以引起同等滴度的免疫反应，且免疫效果良好。不同的蛋白抗原之间引起免疫反应的差异仅有蛋白性质带来。

四、经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的稳定性检验

修饰后的季节流感-RSV联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周，外观检查和鉴别试验未见异常，pH值和抗原含量保持相对稳定，进行小鼠试验也未发现抗体水平发生明显差异。说明经修饰的季节流感-RSV联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周的稳定性良好。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，其特征在于，它包括：流感病毒蛋白抗原、RSV蛋白抗原及纳米颗粒载体，其中纳米颗粒载体表面羟基化，流感病毒蛋白抗原和RSV蛋白抗原与纳米颗粒载体表面的羟基反应，连接在纳米颗粒表面。

2.根据权利要求1所述的经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，其特征在于，流感病毒蛋白包括包括但不限于血凝素HA、神经氨酸酶NA、核蛋白NP、基质蛋白M(M1+M2)、非结构蛋白NS、聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，其特征在于，RSV蛋白包括F蛋白、G蛋白、F优势表位、G优势表位或其组合。

4.根据权利要求1所述的经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，其特征在于，流感病毒蛋白抗原和/或RSV蛋白抗原为经基因工程重组后纯化的蛋白或蛋白片段。

5.根据权利要求1所述的经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，其特征在于，纳米颗粒载体包括非生物原的纳米颗粒或生物原的纳米颗粒。

6.根据权利要求5所述的经修饰的季节流感-呼吸道合胞病毒(RSV)联合疫苗，其特征在于，纳米颗粒为硅酸盐纳米颗粒。

7.根据权利要求1所述的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的制备方法，其特征在于：制备方法包括如下步骤：

s1：将硅酸放入无水乙醇中，形成浓度为0.1～0.5mol/L的硅酸醇液，加入分散剂，加入后分散剂在体系中的含量为硅酸的0.1～1.2，密封超声反应并搅拌，反应时间为30～60min；

s2：通过旋转蒸发仪将s1的悬浊液进行减压蒸馏，直至形成粘稠状浆液，然后将粘稠状浆液进行微超声，直至完全蒸干，形成分散性颗粒；

s3：将分散性颗粒中加入至反应釜中，加入催化剂与氨水，密封反应3～8h，然后梯度升温反应2～4h，自然冷却；加入发泡材料，密封反应温度为30～50℃，梯度升温反应，最终温度为130～150℃，并持续30min以上；

s4：将s3得到反应颗粒与多肽类阳离子聚合物混合10～15min，密封黑暗条件下恒温搅拌12～15h，经冷冻干燥即可羟基修饰的纳米颗粒；

s5：选择A型流感病毒的通过基因工程手段或其他生物手段得到的流感病毒蛋白片段，和RSV蛋白，取冻干的蛋白用注射用水复溶；干燥后的纳米颗粒用水复溶；

s6：溶于复溶后以每种蛋白与纳米颗粒以体积比为1：2～10进行混合，加入催化剂进行脱水反应，混合均匀后黑暗搅拌24h以上，离心。

8.根据权利要求10所述的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的制备方法，其特征在于，s1具体为：

将硅酸放入无水乙醇中，形成浓度为0.1～0.5mol/L的硅酸醇液，加入医用级聚乙烯吡咯烷酮，加入后分散剂在体系中的含量为硅酸的0.1～1.2，密封超声反应并搅拌，超声频率10-15kHz，反应时间为30～60min。

9.根据权利要求10所述的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的制备方法，其特征在于：s2具体为：

通过旋转蒸发仪将s1的悬浊液进行减压蒸馏，压力为0.03～0.05MPa，直至形成粘稠状浆液，然后将粘稠状浆液进行水浴低频率超声，频率为1.3-2.5kHz，60℃以下超声，直至完全蒸干，形成分散性颗粒。

10.根据权利要求10所述的经修饰的季节流感-RSV联合疫苗的制备方法，其特征在于：s3具体为：

将分散性颗粒中加入至反应釜中，加入氧化铝与氨水，密封反应3～8h，然后梯度升温反应2～4h，自然冷却；加入发泡材料，密封反应温度为30～50℃，梯度升温反应要求最后温度为130～150℃，并持续30min以上。