禽流感病毒、疫苗、组合物、制剂及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2007年4月18日申请的美国专利申请顺序号11/737,104和2006年4月21日申请的美国临时专利申请顺序号60/794,054的优先权,这两篇的公开内容通过引用全部结合到本文中。
发明背景
发明的技术领域
一般而言,本发明涉及流感疫苗,更具体地讲,涉及用于接种易感禽类的禽流感疫苗及其制剂。本发明也涉及预防或改善家禽的禽流感病毒病的新方法。
相关技术的描述
流感病毒中最著名的是甲型流感病毒和乙型流感病毒,它们是殃及全球的致病和致死的重要原因,每年都引起疾病爆发。大流行周期性、但间隔不规则地发生,引起特别高的致病率和死亡率。从历史上看,大流行是甲型流感病毒新亚型的结果,这是由分节段基因组重配(抗原性转变)产生的,同时每年的流行通常是甲型流感病毒和乙型流感病毒的表面抗原进化(抗原性漂移)的结果。人类流感病毒通常起源于禽流感病毒株,所以流感感染在此基础上是人畜共患病。也有证据表明,猪可作为产生对人类具有致病性的新型禽源性毒株的中间宿主(“混合渠道(mixing vessel)”)(Scholtissek等,Virology 1985,147:287)。1997年香港的H5N1甲型流感爆发表明,高致病性甲型流感病毒也可直接从禽类传播到人类(Claas等,Lancet 1998,351:472;Suarez等,J.Virol.1998,72:6678;Subbarao等,Science 1998,279:393;Shortridge,Vaccine 1999,17(增刊1):S26-S29)。在2003年,东南亚的H5N1病毒包含不同的共同流行的基因型,但是在2004年,却仅有一种基因型(称为“Z-基因型”)占优势(Li等,Nature 2004,430:209)。
目前的证据表明,人类致死事件是由于该基因型从鸟到人的直接传播,而且它也感染猫,由猫-猫直接传播(Kuiken等,Science 2004,306:241)。这些和其它有关该病毒宿主范围和传播分布发生变化的证据的出现,关系到H5N1病毒可能获得允许人-人传播的特性。人类对这样的新型H5N1病毒没有免疫力,所以可引起灾难性的流感大流行(Fouchier等,Nature 2005,435:419)。甲型流感病毒从大量的动物宿主流行毒株中产生新致病性毒株的潜力表明,疾病控制需要监测这些病毒并开发改进的抗病毒疗法和疫苗。在这样的监测工作中,需要警惕新病毒株发展的速度,包括改进技术,用于评价疫苗对新毒株的功效。
禽流感也称为“AI”,是鸡和其它家禽的急性高感染性病毒感染。可根据血凝素(HA;也可缩写为H)和神经氨酸酶(NA;也可缩写为N)分子的抗原差异,将流感病毒分为不同亚型,这两类分子在不同季节可以“重配(reassort)”或“突变(mutate)”。因为病毒不断突变,无法预见下一季节哪种毒株将会出现,所以其疫苗难以制备。疫苗制备用毒株在生产条件下通常不能迅速繁殖,所以如果等待特定毒株出现,然后再生产正确疫苗用于抵抗该菌株,这样的方案是不可行的。通常,特定毒株的流行将会持续数月,然后可能消失数年。
根据病毒的分组抗原(group antigen),可将流感病毒分为甲型、乙型和丙型。甲型、乙型和丙型流感病毒的区别在于病毒核壳(NP)和基质(M)蛋白的抗原差异。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原差异,将甲型流感病毒分为不同亚型。已经鉴定出神经氨酸酶NA蛋白的9种亚型(称为NA1至NA9)和血清血凝素HA蛋白的15种不同亚型(称为HA1至HA15)。在鸟类,已经分离出各自携带不同HA(或H)和NA(或N)亚型的病毒。
正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的甲型、乙型和丙型流感都具有分节段负链RNA基因组,可以在受感染细胞的细胞核中复制,具有组合编码容量约13kb,并含有10种病毒蛋白质的遗传信息。具体地讲,流感病毒具有8条负义RNA(nsRNA)基因区段,编码至少10种多肽,包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA,其经酶切后由亚基HA1和HA2缔合而成)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)(Krug等,载于The Influenza Viruses,R.M.Krug编著,Plenum Press,New York,1989,第89-152页)。
目前开发的反求遗传学系统允许操纵流感病毒基因组(Palese等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996,93:11354;Neumann和Kawaoka,Adv.Virus Res.1999,53:265;Neumann等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96:9345;Fodor等,J.Virol.1999,73:9679)。例如,已经证明质粒驱动的8个流感nsRNA自pol I启动子的表达和聚合酶复合蛋白的共表达,导致形成感染性甲型流感病毒(Hoffmann等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000,97:6108)。
流感病毒的病毒颗粒大小约为125nm,由与核蛋白缔合的负义病毒RNA核心、围绕脂质双层结构的病毒包膜组成。病毒包膜内层主要由基质蛋白组成,外层含有大部分来自宿主的脂质材料。所谓“表面蛋白”、神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)在病毒体表面呈钉状。新流感病毒的感染性取决于特异性宿主蛋白酶对HA的切割,而NA又参与后代病毒粒子从细胞表面的释放并能阻止新产生的病毒的聚集。
埋在病毒包膜中的HA和NA蛋白是流感病毒的主要抗原决定簇(Air等,Structure,Function,and Genetics,1989,6:341-356;Wharton等,载于The Influenza Virus,R.M.Krug编著,Plenum Press,New York,1989,第153-174页)。因为流感分节段基因组重配(reassortment),新的HA和NA变异体不断产生,新感染的生物体对它们没有记忆的免疫应答。HA糖蛋白是中和抗体的主要抗原,参与病毒颗粒与宿主细胞受体的结合。
不同病毒株的HA分子在核酸水平和氨基酸水平上都表现出明显的序列相似性。当对不同亚型的毒株进行比较时,这种相似性水平不同,某些毒株明确表现出比别的毒株更高水平的相似性(Air,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981,78:7643)。一种亚型的病毒株与其它亚型的病毒株之间氨基酸相似性水平不同(Air,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981,78:7643)。这种变异足以建立起不连续的亚型和不同毒株的进化谱系,但是使用常规生物信息学技术,仍可容易地对不同毒株的DNA序列和氨基酸序列进行比对(Air,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981,78:7643;Suzuki和Nei,Mol.Biol.Evol.2002,19:501)。
HA是一种病毒表面糖蛋白,由约560个氨基酸组成,代表25%的总病毒蛋白。它主要负责感染早期的病毒颗粒粘附并穿透宿主细胞。在病毒蛋白质中,血凝素主要经历翻译后的重排。血凝素合成完成后,该分子按照宿主细胞的胞外途径(HA即按此途径进行折叠),装配成三聚体并且糖基化。最终,HA切割成两个亚基即Hi和H2;这活化了该分子并提高病毒颗粒的感染力。
对于许多禽类而言,切割位点内碱性氨基酸序列上的差异关系到禽流感病毒产生局部有症状的感染或具有致命结果的全身感染的能力。因此提出,该特征在影响病毒的器官趋向性、宿主特异性及其致病性方面可能很重要。就病毒的致病性而言,具有多碱基位点HA的毒株发现在若干细胞类型中切割HO分子(呈活性状态的Hi和H2)的蛋白酶,因而发生多感染循环,大量产生感染性病毒颗粒并在短时间内引起所有区域普遍感染(HPAI株)。因此,感染具有急性-过急性进程,并有很高的死亡率。
神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒的第二种膜糖蛋白。NA是一种413个氨基酸的蛋白质,由1413个核苷酸的基因编码。NA参与破坏病毒血凝素的细胞受体,即通过将唾液酸分子与血凝素本身切割开来。据信这样可能容易释放病毒后代,即通过阻止新形成的病毒颗粒在细胞膜累积,以及通过促进病毒通过粘膜表面的粘液进行转运。NA是重要的抗原决定簇,它可能经历抗原性变异。
目前公共卫生行政机构批准用于美国和欧洲的流感疫苗是灭活流感疫苗以及美国的减毒FLUMIST活疫苗。在鸡胚中培养流行病学上重要的甲型流感病毒株和乙型流感病毒株,然后纯化病毒颗粒并经化学方法灭活,得到疫苗母液。世界卫生组织(WHO)每年都要选择当年最有可能流行的亚型进行疫苗开发。
尽管自1940年代早期流感疫苗已用于人类接种,而且自1960年代后期用于马的接种,但是由于存在着广泛的动物宿主,以及能引起大流行的新流感病毒出现的威胁,促使人们研究对抗病毒的新疗法。在过去几年里,流感领域出现若干重要进展(有关综述参见Cox和Subbarao,Lancet 1999,354:1277-82)。例如,一种实验性的鼻内给药的三价减毒活流感疫苗在保护幼童免遭甲型流感H3N2和乙型流感感染方面表现出高度有效性。改进目前的(死)流感病毒疫苗功效的其它方法还包括产生冷适应性和含有特定减毒突变的遗传工程流感病毒(有关综述参见Palese等,J.Infect.Dis.,1997,176增刊1:S45-9)。人们希望,这些遗传改变的病毒(其中来自流行株的HA基因和NA基因经重配结合)可用作安全的活流感病毒疫苗,以诱导人体长期持续的保护性免疫应答。尽管冷适应性疫苗看来对儿童和青年人有效,但对年长者而言,它们过分减毒,以至不能刺激理想的免疫应答,在美国,每年都有20000~40000人死于流感感染。
容易得到的疫苗将对出现的大流行性流感提供最有效的工具。在1997年香港爆发H5N1之后,已有由两种不同方法生产的疫苗在人群中进行过试验。常规用A/鸭/新加坡/3/97(A/duck/Singapore/3/97)生产的亚单位H5疫苗对人的免疫原性差,甚至对抗原性密切相关的毒株也很差,而且在多次接种后仍然很差(Nicholson等,Lancet 2001,357:1937;Stephenson等,Journal of Infectious Disease 2005,191:1210)。使用佐剂MF59可增加该H5疫苗的抗体效价(Stephenson等,Vaccine2003,21:1687)。用来自非致病性A/鸭/HK/836/80(H3N1)病毒的灭活“裂解”疫苗和来自A/HK/156/97(H5N1)病毒的修饰H5血凝素进行接种,仅诱导出可检测的中和抗体效价(Takada等,Journal of Virology1999,73:8303)。因此,尽管这些H5N1疫苗都具有良好耐受性,但是它们看来免疫原性差。目前缺乏有效针对H5N1病毒株的疫苗,所以这些病毒具有引起大流行性疾病的威胁。
血清抗体效价方法是测定接种或病毒感染后的免疫保护性的可接受的替代方法。主要采用的血清抗体效价方法是病毒中和效价测定和血凝素抑制(HI)效价测定。这些测定是根据在体外条件下人血清中的流感抗体与抗原交叉反应的能力。在特定情况下,对于各类测定,不仅要根据其提供稳定而有用结果的能力,而且要根据其使用的简便性和对设备的要求,来选择测定方法。
简而言之,病毒中和测定就是检测血清样品中的抗体阻断流感病毒感染培养细胞的能力。测定进行如下:制备血清样品的系列稀释液(效价),再将每种这样的稀释液与标准量的感染性病毒混合。然后将各稀释混合物与特定细胞培养物混合,测定所得感染率。病毒中和效价测定被认为是检测特定个体中存在的免疫保护性抗体水平的非常有用而可靠的试验方法。然而,这依赖于专业化的细胞培养设备,因此无法普遍应用。其方法也是费力而耗时,因而不太适合筛选大量样品。
血凝素抑制(HI)测定同样也是检测血清样品中的抗体与标准化参考病毒结合的能力。该测定是基于这一事实:流感病毒与红细胞结合并使之凝集。在HI测定中,将血清样品系列稀释液与标准量的参考病毒混合,经过设定的孵育周期后,加入到红细胞中。然后目测参考病毒与红细胞缔合形成复合物。抑制血凝素的血清最高稀释度就是血凝素抑制效价。尽管疫苗免疫原性不如其它测定敏感,但是HI测定因其技术和实验室要求相对简单而被广泛应用。
目前亚洲H5N1高致病性禽流感已经殃及亚洲大部分地区并进入欧洲和非洲。它同时殃及许多东南亚国家的乡村鸡只和商品化鸡只,这不同于过去在其它家禽(例如鸭和火鸡)和野生水禽中致病和致死的H5禽流感。需要能预防感染和疾病并用于各种禽类的有效疫苗,供野外使用(field use)。
在传统上,对高致病性禽流感(HPAI)在家禽中爆发的重要控制策略就是通过限制运动并扑杀受感染和处于危险状态的鸟类而根除之。然而,由于目前亚洲H5N1病毒在乡村家禽(包括鸭和火鸡)以及野生物种(尤其是迁徙鸟类)中广泛存在,所以必须考虑改变控制策略,其中疫苗看来是关键因素。
目前用于禽流感的市售疫苗是油乳剂死病毒疫苗,其主要用于控制鸡和火鸡的流行性低致病性禽流感(LPAI),或巴基斯坦和墨西哥的HPAI爆发。Halvorson,Avian Path.31:5-12(2002);Naeem,Proceedingsof the 4th International Symposium on Avian Influenza 31-35.(Athens,Georgia,USA,1998);Swayne和Suarez,Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.19:463-482(2000)。死疫苗和重组鸡痘疫苗目前都用于控制墨西哥的低致病性禽流感。同上。欧盟已经批准使用灭活油乳剂疫苗用于意大利,只要它们能够区分接种的鸟类和感染的鸟类。Capua等,Avian Path.32:47-55(2002)。
尽管已经证明,灭活油乳剂疫苗能够阻断H7N7(Van der Goot等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:18141-18146(2005))或目前的H5N1HPAI(Ellis等,Avian Path.33:405-412(2004))的传播,但是仍然要考虑的是,这些疫苗在野外上可能没有100%的功效而且完全不能阻止病毒释放。另外,其使用也不能区分接种的鸟类和感染的鸟类,这干扰了对群体内和地区内疾病状态的监控;而且也不能配制或测试它们在鸭子中的接种功效。
亚洲H5N1病毒在鸡胚中不能培养至高效价,而这本是人用和禽用流感疫苗的病毒生产的传统方法。因此,同类病毒疫苗的替代方法正在开发之中。活的载体疫苗可提供额外的安全性并能区分感染的鸟类和已接种的鸟类。
已经评价了表达H5的禽痘病毒(Qiao等,Avian Path.32:25-31(2003)、传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus)(Luschow等,Vaccine 19:4249-4259(2001)和腺病毒(Gao等,J.Virol.80:1959-1964(2006))的载体,显示出具有保护性功效,能减少但不能完全消除病毒释放。其它流感病毒株(尤其是那些共享H5血凝素型、但具有不同神经氨酸酶的毒株)已经在野外显示出具有某些功效(Ellis等,Avian Path.33:405-412(2004)),但是最有前途的方法还是使用反求遗传学,以产生在遗传背景中具有现有H5的流感病毒,从而能够在鸡胚中培养至高效价,但对禽类或哺乳动物却仅有低致病性。
反求遗传学已用于产生流感病毒重配株,其具有来自人H5N1分离株即A/HK/491/97(Subbarao等,Virol.305:192-200(2003))或禽H5N1分离株即A/鹅/广东/96(A/Goose/Guangdong/96)(Tian等,Virol.341:153-162(2005)的血凝素基因和神经氨酸酶基因。这两种重配株对鸡都没有致病性,而且已经将具有来自A/鹅/广东/96的H5和N1的重配病毒配制成福尔马林灭活制剂,用于在无特定病原体(SPF)的鸡、和非SPF的鹅和鸭中测试针对亲本HPAI H5N1的保护性功效。这些研究证明,重配疫苗可防止死亡并减少攻击病毒的释放。
重配疫苗中包含不同神经氨酸酶亚型,允许区分感染的鸟类和已接种的鸟类。使用来自H5和H7 LPAI病毒的血凝素基因和其余基因(包括来自A/WSN/33的N1)的重配株,已证明了这一原则(Lee等,Vaccine 22:3175-3181(2004))。具有这些重配株的油乳剂疫苗在SPF鸡中减少了亲本H5和H7LPAI株的复制。已经构建了具有来自A/鹅/香港/437-4/99(A/Goose/Hong Kong/437-4/99)的H5和来自A/鸭/德国/1215/73(A/Duck/Germany/1215/73)的N3的重配病毒(Liu等,Virol.314:580-590(2003))。当配制成油乳剂时,疫苗能够保护受到HPAI
H5N1病毒攻击后的SPF鸡,使其免于死亡。在适当的疫苗剂量下,在鸟类体内未检测到攻击病毒。
假设反求遗传学流感疫苗可用于这些“DIVA”方法,其中给予疫苗,所述疫苗具有的N不同于这些鸟所接种的病毒株,因而便于区分接种动物和感染鸟类。已公布的PCT WO 03/086453(通过引用全部结合到本文中)介绍了DIVA技术和可用于这些方法的代表性疫苗。
相对于从天然存在的病毒株制备的常规疫苗而言,反求遗传学疫苗提供大量明显的优势。通过反求遗传学技术,可将A病毒的特定基因用B病毒的相应基因替代。另外,还可修饰这些基因以降低病毒致病性,同时保留所得疫苗的保护性。
迫切需要基于现有亚洲H5N1株并克服这些困难而用于各种家禽的疫苗,以提供根除感染群体的替代方法。对这类禽流感病毒疫苗的要求是:它们(a)在接种禽类中能诱导快速免疫应答,和(b)能区分已接种的鸟类和感染的鸟类。因此,需要改进的禽流感疫苗,所述疫苗不仅诱导快速免疫应答和更高效价的反应,而且还能产生消杀效果(sterilizing effect),阻止攻击病毒的生长、释放和向其它易感物种的传播。
发明概述
本发明达到了这些和其它相关要求,即通过提供重配禽流感病毒和禽流感疫苗,提供包含一种或多种禽病毒和/或疫苗的组合物,提供其制剂,并提供本发明禽病毒和/或疫苗、组合物、和/或制剂的使用方法,其中病毒和疫苗包含来自高致病性禽流感病毒的HA基因、来自低致病性禽流感病毒的NA基因、以及包含来自低致病性禽流感病毒的其余禽流感病毒基因的病毒骨架。
本文所公开的低致病性禽流感病毒和疫苗能有效预防或改善禽流感,并提供额外的益处,即它们能阻止攻击流感病毒的生长、释放和/或向其它物种的传播。因此,本发明的低致病性禽流感病毒和疫苗包含:来自第一种H5禽流感高致病性毒株的HA部分;来自第二种低致病性毒株的NA部分,其中所述第二种低致病性毒株具有与HA部分所来源的病毒不同的N亚型;以及选自低致病性病毒的其余病毒基因组,其中所述低致病性病毒与N部分所来源的病毒相同或不同。
在某些实施方案中,HA部分来源于H5禽流感高致病性毒株,其在本文中实例是H5N1亚洲株,称为A/鸡/越南/C58/04(A/chicken/Vietnam/C58/04)。在其它实施方案中,NA部分来源于第二种低致病性毒株,其具有与HA部分所来源的病毒不同的NA亚型。通常,NA亚型来自具有N3、N5或N9亚型的欧洲或美洲谱系毒株。本文的实例是重配H5N3禽流感病毒,其中N3基因来源于低致病性H2N3禽流感病毒株,称为A/DK/德国/1215/73。在另一些实施方案中,其余病毒基因组选自低致病性病毒,其在本文中的实例是低致病性禽流感病毒,称为A/波多黎各/8/34H1N1(A/Puerto Rico/8/34 H1N1)。
因此,本文的实例是重配H5N3禽流感病毒和疫苗,所述病毒和疫苗包含:HA H5基因,其来自目前致病性亚洲爆发株A/Ck/越南/C58/04(H5N1);NA N3基因,其来自低致病性毒株A/DK/德国/1215/73(H2N3),这便于与野生型感染(N1)区分开来;和禽流感骨架,其来自低致病性毒株A/波多黎各/8/34(H1N1),该毒株已充分表征并且是对人或动物无致病性的安全的病毒。在已公布的PCT WO01/083794(通过引用全部结合到本文中)详细介绍了H5N3反求遗传学病毒的构建方法。
本文所述的H5N3禽病毒疫苗构建体的一个意想不到的特性是:当配制成含有合适佐剂的组合物时,当致病性流感病毒攻击已接种个体时,它可提供消杀效果,因而阻止致病性病毒在易感组织生长并流入个体所处环境中。比起本领域可用的现有疫苗而言,本发明的这一令人吃惊的特征特别有优势,因为它降低或消除了通过致病性病毒引起的疾病传播,否则它可从已免疫个体传播给未经免疫的易感个体。
因此,一方面,本发明涉及疫苗组合物,所述组合物能有效预防和/或改善禽流感,并能阻止致病性攻击流感病毒的生长、释放和从感染个体向未感染个体的传播,例如从感染的鸟类传播给未感染的鸟类。更具体地讲,本发明涉及包含反求遗传学病毒的疫苗组合物,所述反求遗传学病毒包含:(i)HA部分,其来自第一种高致病性H5禽流感病毒株,(ii)N部分,其来自具有与第一种高致病性H5禽流感病毒株的N亚型不同的N亚型的第二种低致病性禽流感病毒株,和(iii)骨架禽流感病毒基因组,其来自第三种低致病性病毒。
在某些实施方案中,第二种低致病性毒株和第三种低致病性毒株都来自同一禽流感病毒分离株。在替代实施方案中,第二种低致病性毒株和第三种低致病性毒株来自不同禽流感病毒分离株。
本发明的其它方面提供有效预防或改善禽流感病毒感染的禽流感疫苗组合物和制剂。这样的本发明制剂包含禽流感病毒的反求遗传学毒株(尤其是禽流感病毒的反求遗传学毒株的灭活形式),并任选包含一种或多种表面活性剂(包括脱水山梨醇油酸酯)。通常,禽流感病毒疫苗包含的血凝素(HA)总量至少约为75HA/剂的疫苗制剂。
有效预防或改善禽流感病毒感染的疫苗组合物包含配制在生物学上可接受的佐剂材料中的反求遗传学病毒,所述病毒的组成如下:来自H5禽流感高致病性毒株的HA部分;来自第二种低致病性毒株的N部分,其中所述第二种低致病性毒株具有与HA部分所来源的病毒不同的N亚型;以及选自低致病性病毒的其余病毒基因组,其中所述低致病性病毒与N部分所来源的病毒相同或不同;其中血凝素(HA)总量至少为约75HA/剂、或至少约125HA/剂、或约250HA/剂的所述疫苗组合物。
在某些方面,疫苗组合物和/或制剂可任选还包含一种或多种表面活性剂,例如一种或多种脱水山梨醇油酸酯和/或一种或多种环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物。在某些这样的实施方案中,脱水山梨醇油酸酯是吐温80(
80)和/或脱水山梨醇倍半油酸酯。在其它方面,疫苗组合物和/或制剂可包含配制在油包水乳剂中的本发明禽流感病毒。
本文的实例是疫苗组合物,其中骨架病毒基因组来源于H1N1禽流感病毒即A/波多黎各/8/34(aka PR8)。该低致病性毒株在需要安全跨越两个或更多不同物种的流感疫苗的应用中特别有优势。
本发明还提供包含至少两株禽流感病毒的疫苗组合物,其中HA/剂通常大于约75HA/剂,更通常大于约128HA/剂、或大于约200HA/剂、或大于约250-300HA/剂。
可以理解,对用于衍生本发明反求遗传学流感病毒疫苗的特定禽流感病毒株的选择,取决于特定地理区域流行的特定毒株,其中给予疫苗的前提条件是(a)其HA亚型通常与流行株或攻击株的HA亚型相同,和(b)其NA亚型与流行株或攻击株的NA亚型不同,这样就可以依靠DIVA技术。
本发明的其它方面提供预防或改善禽流感病毒感染爆发的方法,所述方法包括将含有灭活反求遗传学禽流感病毒的疫苗组合物给予家禽的步骤,其中血凝素(HA)总量至少为约75HA/剂的疫苗组合物。
例如,本发明提供预防或改善禽流感病毒感染爆发的方法,所述方法包括将本文所公开的病毒或疫苗组合物给予家禽的步骤。病毒或疫苗组合物可通过例如饮用水或喷雾给药。通常,合适剂量范围介于约1ng和约1μg之间,或介于约5ng和约250ng之间,或介于约20ng和约125ng之间,或介于约50ng和约100ng之间。给予的有效剂量通常为约0.25ml至2.0ml/家禽。可以单剂量给予病毒和/或疫苗,或重复给予两次或更多剂量。
根据本文下面给出的发明详述和所附权利要求书,本发明的这些和其它实施方案、特征和优势将会是显而易见的。
附图简述和序列标识
图1是鹅HK 437 H5和鸡VN C58 H5的比对。
SEQ ID NO:1是鹅HK 437 H5的氨基酸序列
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SEQ ID NO:2是鸡VN C58 H5的氨基酸序列
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NFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNAKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTI
GECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQIETRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQG
SGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLD
VWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNE
CMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLVLAIMVAGLSL
WMCSNGSLQCRICI)。
发明详述
本发明是根据出乎意料地发现反求遗传学技术可适用于由高致病性病毒产生低致病性禽流感病毒,同时又保持来自高致病性病毒的保护性。本文公开的单价低致病性禽流感病毒疫苗公开提供有效保护作用,而没有攻击病毒释放的证据。
参考以下定义,将会更好地理解本发明。
定义
本文所用的术语“流感病毒”用于定义这样的病毒物种:所述病毒的致病性毒株能引起称为流感的疾病。
术语“母株病毒”是指提供骨架的病毒株,所述骨架用于通过本文所述的反求遗传学方法构建低致病性流感病毒疫苗株。这些母株通常给疫苗病毒提供6或7个病毒节段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS和任选NA)。也就是说,母株病毒可任选用作NA基因的来源。就本文所述的H5N3禽流感病毒疫苗的具体情况而言,给出骨架基因的“母株病毒”是H1N1禽病毒分离株,称为A/波多黎各/8/34。
术语“多肽”是指氨基酸多聚体,而不是指特定长度的产物;因此,肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义之内。该术语也不指或不包含翻译后的多肽修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。
本文所用的“感染性”是指病毒在细胞中复制并产生病毒颗粒的能力。可通过测定病毒(即病毒载量)或通过观察动物的疾病进程,来评价感染性。
本文所用的“个体”或“患者”或“动物”是指支持负链RNA病毒感染、尤其是流感病毒感染的脊椎动物,包括但不限于鸟(例如水禽和鸡)和哺乳动物成员(例如狗、猫、狼、鼬(mustela)、啮齿动物(racine和鼠等)、马、牛、绵羊、山羊、猪和灵长类,后者包括人)。
本文所用的术语“免疫原性”是指病毒或多肽能够诱导体液或细胞免疫应答,优选这两种免疫应答都诱导。免疫原性的实体也是抗原性。免疫原性组合物是当给予动物时能诱导体液或细胞免疫应答或这两者的组合物。
当一种分子能够与免疫系统的抗原识别分子(例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)发生特异性相互作用时,该分子就具有“抗原性”。抗原性多肽含有至少约5个、优选至少约10个氨基酸的“表位”。多肽的抗原性部分在本文也称为“表位”,它可以是对抗体或T细胞受体识别具有免疫优势的部分,或者它可以是用于产生针对该分子的抗体的部分,即通过将抗原部分与载体多肽缀合,用于免疫。没有载体时,抗原性分子自身不一定具有免疫原性(即诱导免疫应答的能力)。
本文所用的术语“氨基酸取代”是指某分子的氨基酸序列的特定位置上氨基酸的存在。相对于占据该位置的任何其它氨基酸而言都可发生氨基酸取代。来自氨基酸序列改变的多肽可包括翻译后修饰的改变,例如糖基化、乙酰化、磷酸化或任何其它氨基酸修饰以及氨基酸取代。
本文所用的术语“反求遗传学系统”是指产生流感病毒颗粒、多肽、病毒粒子或核酸的方法,即通过遗传工程方法。这些方法包括但不限于Hoffmann在以下文献中描述的“质粒系统”(Hoffmann等,Vaccine 20:3165(2002);美国专利公布号2002/0164770A1,2002年11月7日申请,所述文献通过引用全部结合到本文中)。通常,反求遗传学系统可允许通过本领域技术人员已知的遗传工程方法来产生具有特定序列的病毒颗粒、多肽和/或核酸。这些系统在下文有更详细的描述。
本文所用的术语“受体结合位点”是指目标受体(例如红细胞上的唾液酸受体)结合的HA分子的部分。鹅HK 437 H5和鸡VN C58 H5的H5分子结构在本文公开为SEQ ID NO:1和2,并可参见图1所示的序列差异性比对。A/鸭/新加坡(A/duck/Singapore)的H5分子结构和该H5亚型的血凝素的受体结合位点的位置可参见I Ha等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:11181(2001)。
术语“诊断用参考病毒”是指具有高HA抗原性的病毒。这样的诊断用参考病毒可用于免疫测定,例如血凝素抑制测定。
术语“暴露病毒”是指单个动物已接触的病毒。这样的暴露可以在日常活动过程中,例如接触感染个体,例如使人暴露给感染性流感病毒。暴露也可以因为特定的临床攻击,例如在有意将实验动物暴露给病毒的实验室试验情况下。可以通过用流感疫苗免疫接种而特意产生这样的暴露。
术语“药学上可接受的”是指当给予人时,在生理学上可耐受的并且通常不产生变态反应或类似不良反应(例如翻胃、头昏等)的分子实体和组合物。优选本文所用的术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府管理机构批准的或者美国药典或其它公认的药典上列出的、可用于动物(尤其是人)的材料。
术语“载体”是指与化合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。这类药物载体可以是无菌液体,例如水和油,包括石油、动植物油或合成油,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或含水溶液、盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液优选用作载体,尤其是注射用溶液剂。合适的药物载体可参见E.W.Martin编著的"Remington′sPharmaceutical Sciences",第18版。
本文所用的术语“佐剂”是指提高针对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可用作缓慢释放抗原的组织缓释型制剂,也可作为淋巴系统活化剂,非特异性增强免疫应答(Hood等,Immunology,第二版,Menlo Park,CA:Benjamin/Cummings,1984,第384页)。通常,在没有佐剂的情况下单用抗原进行初次攻击,将不能诱导体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性剂(例如溶血卵磷脂)、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、匙孔
血蓝蛋白和潜在有用的人用佐剂(例如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)和短小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。优选的佐剂是药学上可接受的佐剂。
本文所用的术语“分离的”是指从天然环境(例如细胞或病毒)中取出相关材料。因此,分离的生物材料可不含某些或全部细胞组分,即自然存在天然材料的细胞组分(例如细胞质组分或膜组分)。如果某材料存在于细胞提取物或上清液中,可认为该材料就是分离的。就核酸分子而言,分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制片段。在另一个实施方案中,分离的核酸优选从发现其来源的染色体中切下,更优选不再连接或邻近其来源染色体的分离的核酸分子的非编码区(但可以连接其天然的调节区或其部分),或者不再连接或邻近位于该分离核酸分子所含有基因的上游或下游的其它基因。在又一个实施方案中,分离的核酸缺乏一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质粒、粘粒、人工染色体等中的序列,即当它形成嵌合重组核酸构建体的组成部分时。因此,在一个具体的实施方案中,重组核酸就是分离的核酸。分离的蛋白质可以与缔合在细胞或细胞膜上(如果是膜结合蛋白的话)的其它蛋白质或核酸或这两者缔合。从来源生物体的解剖位置取出分离的细胞器、细胞或组织。分离的材料可以是纯化的,但不一定非要纯化。
本文所用的术语“纯化的”是指在减少或排除无关材料(即污染物)存在的条件下分离的材料,所述污染物包括来自所获材料的天然材料。例如,纯化的病毒粒子优选基本不含宿主细胞或培养基组分,包括组织培养物或鸡胚蛋白、非特异性病原体等。本文所用的术语“基本不含”操作性地用于材料的分析试验的情况下。优选基本不含污染物的纯化材料为至少50%纯度;更优选至少90%纯度、还更优选至少99%纯度。纯度可通过色谱、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物学测定和本领域已知的其它方法来测定。
纯化方法是本领域众所周知的。可通过超滤或超离心(优选连续离心)来纯化病毒颗粒(参见Furminger,出处同上)。其它纯化方法也可以并涵盖在本发明之中。纯化材料可含有小于约50%、优选小于约75%、最优选小于约90%的其原来所缔结的细胞组分、培养基、蛋白质或其它不想要的组分或杂质(视需要而定)。术语“基本纯化的”是指用本领域已知的常规纯化技术所能达到的最高纯度。
在一个具体的实施方案中,术语“约”或“近似”是指在具有统计学意义的数值范围之内。这样的范围可以是在数量级的范围内,优选在给定数值或范围的50%之内、更优选20%之内、还更优选10%之内和甚至更优选5%之内。术语“约”或“近似”所涵盖的允许误差取决于研究下的特定系统,本领域普通技术人员可以容易地理解这一点。
反求遗传学方法
如上所述,本发明的基础是禽流感病毒及其疫苗的产生,这样的病毒及其疫苗是通过使用本文提出的工作实施例中详述的反求遗传学方法而产生的。简而言之,通过将来自第一种高致病性禽流感病毒的HA基因和来自第二种低致病性禽流感病毒的NA基因结合到来自第二种或第三种低致病性禽流感病毒的骨架(其包含其余禽流感病毒基因)中,而构建低致病性重配禽流感病毒。如上所述,本文公开和举例的示例性的低致病性重配禽流感病毒的构建如下:通过将来自A/Ck/越南/C58/04分离株(H5N1)的HA基因和来自A/DK/德国/1215/73分离株(H2N3)的NA基因结合到A/波多黎各/8/34骨架中,产生H5N3病毒。
目前开发的反求遗传学系统已可以操纵流感病毒基因组(Palese等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:1354(1996);Neumann和Kawaoka,Adv.Virus Res.53:265(1999);Neumann等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:9345(1999);Fodor等,J.Virol.73:9679(1999);美国专利申请20040029251)。例如,已经证明,质粒驱动的8个流感vRNA自pol I启动子的表达和自polII启动子的所有mRNA的表达,导致产生感染性甲型流感病毒(Hoffmann等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000,97:6108;美国专利公布号20020164770,所述文献中有关最小质粒反求遗传学系统和基因工程方法的描述都通过引用结合到本文中)。
这些重组方法可允许在多肽氨基酸序列上具有特定改变的特定流感病毒类型的产生。含有所需取代的HA分子可以是重组流感病毒的组成部分。可通过本领域技术人员已知的任何方法制备重组流感病毒,包括通过基因工程方法,例如“仅有质粒”系统(Hoffmann等,Vaccine 2002,20:3165)。重组流感病毒可来源于H5N1病毒。重组病毒可具有用于疫苗开发的H1N1病毒的遗传背景,例如A/PR/8/34病毒或任何甲型流感病毒,包括A/列宁格勒/134/17/57(A/Leningrad/134/17/57)、A/列宁格勒/134/47/57和A/安阿伯/6/60(A/Ann Arbor/6/60)的冷适应株。对应于HA分子序列的核酸可从病毒中分离出来并测序。
分离和修饰特定核酸和蛋白质的技术是本领域技术人员众所周知的。根据本发明,可使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已有充分解释。参见例如Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989(本文中"Sambrook等,1989");DNA Cloning:APractical Approach,第I和II卷(D.N.Glover编著,1985);Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait编著,1984);Nucleic AcidHybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins编著(1985)];TranscriptionAnd Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins编著(1984)];Animal CellCulture[R.I.Freshney编著(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)];B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);Ausubel,F.M.等(编著);Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons,Inc.,1994。这些技术包括定点诱变,使用具有改变的核苷酸的寡核苷酸,用于产生具有突变的PCR产物(例如由Stratagene生产的“Quikchange”试剂盒)。
低致病性禽流感病毒疫苗
现有低致病性禽流感病毒疫苗在本文中的实例是重配H5N3病毒,该病毒是通过将来自高致病性亚洲爆发株A/Ck/越南/C58/04(H5N1)的H5基因、来自低致病性禽流感病毒株A/DK/德国/1215/73(H2N3)的N3基因结合到低致病性禽流感病毒骨架A/波多黎各/8/34(H1N1;PR8)中而产生的。本发明的低致病性禽流感病毒确保针对另外的高致病性禽流感病毒的优化保护性。用来自A/DK/德国/1215/73的N3基因取代来自A/波多黎各/8/34的N1基因,以便使用DIVA程序,以测定单只鸟体内抗神经氨酸酶抗体效价是否是高致病性病毒感染对低致病性病毒接种的结果。
可采用本领域可行的技术,分离可用于衍生本发明疫苗的禽流感分离株。例如,来自感染鸡只的组织或血清可得自商业化肉用鸡群(broiler flock)。然后,病毒可在组织或其它合适介质中传代,以建立母种(master seed)病毒。采用可行方法,技术人员还可进一步进行表征。可采用可行方法,例如加热和化学处理,使病毒灭活。
包含低致病性禽流感病毒疫苗的制剂
本文还提供包含本发明的一种或多种低致病性禽流感病毒疫苗以及佐剂和/或乳剂制剂的疫苗制剂。与前述HA单位的浓度相比,本文公开的这类制剂在降低HA单位浓度时表现出改进的功效。更具体地讲,在本发明的制剂中,当HA单位介于约10ng和约1μg之间、更典型的是介于约20ng和约500ng之间、还更典型的是介于约50ng和约250ng之间、或介于约75ng和约200ng之间、最典型的是约100ng、约125ng、约150ng或约175ng时,低致病性禽流感病毒疫苗是有效的。
可使用可行技术配制本发明的疫苗组合物,优选使用药理学上可接受的载体。例如,在一个实施方案中,包括含水制剂。这样的制剂使用水、盐水或磷酸缓冲液或其它合适缓冲液。在再一个实施方案中,疫苗组合物优选为油包水或水包油乳剂。还包括双重乳剂,其特征通常为水包油包水乳剂。油有助于稳定制剂,还可作为佐剂或增强剂。合适的油包括但不限于白油、Drakeoil、角鲨烷或角鲨烯、以及其它动植物油或矿物油,无论是天然来源还是合成来源。
如上所述,本身含有增强抗原性的HA分子的修饰病毒具有更高免疫原性,这反过来又可提供更强的免疫应答和更好的疫苗潜力。
增加流感疫苗有效性的策略包括使用佐剂(Wood和Williams,出处同上)、共同给予免疫刺激分子(Salgaller和Lodge,J.Surg.Oncol.1998,68:122)和粘膜接种策略。粘膜免疫接种策略包括将病毒包裹在微胶囊内(美国专利号5,075,109、5,820,883和5,853,763)和使用免疫强效膜载体(WO 98/0558)。另外,可通过使用红细胞(rbc)或rbc血影细胞(美国专利号5,643,577)或通过使用蓝舌抗原(美国专利号5,690,938),增强口服给予免疫原的免疫原性。尽管这些方法对改进未来接种策略来说很有希望,但是要在特定环境下使用它们却需要验证和监测,以确保疫苗有效性。考虑到本文所述的本发明将会增强这些策略,包括通过增加检测其免疫原性效应的能力。
另外,疫苗组合物可含有本领域可用的其它合适佐剂。这些可包括例如氢氧化铝和磷酸铝、以及其它金属盐类。
疫苗组合物中还可包含额外的赋形剂,例如表面活性剂或其它润湿剂或制剂辅料。表面活性剂可包括脱水山梨醇单油酸酯(
系列)、以及环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物(
系列)、以及本领域可用的其它材料。疫苗中还可包含作为稳定剂或防腐剂的其它化合物。这些化合物包括但不限于碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精或葡萄糖等)以及防腐剂(例如福尔马林)。
疫苗组合物也可配制成基本不含外源水份的干粉剂,这样的粉剂可在临用前由最终的使用者重配。任选用死病毒或灭活病毒配制疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物优选含有来自其流感病毒组分的最少共约200HA。在本发明的一个实施方案中,疫苗含有来自各毒株的约128HA/剂,甚至更优选来自各毒株的约192HA/剂。
本发明的疫苗组合物也可包含针对其它疾病的其它家禽抗原,或者将本发明的疫苗组合物与后者一起给予。例如,针对鸡疱疹病毒、鸡贫血病毒(CAV)、新城疫病毒和传染性支气管炎(IB)病毒的疫苗抗原、以及呼肠孤病毒抗原可以包含在内,作为本发明疫苗组合物的组成部分。尤其优选一种或多种呼肠孤病毒抗原作为本发明疫苗组合物的组成部分。
保护性免疫应答的诱导方法
本发明也提供诱导针对禽流感病毒感染的保护性的方法。本文所公开的方法包括给予家禽动物包含上述的一种或多种低致病性禽病毒疫苗的疫苗和/或其制剂,其中所述一种或多种低致病性禽病毒疫苗含有的混合HA含量为大于约75HA/剂、更典型的是大于约125HA/剂、或大于约200HA/剂、或介于约250HA/剂和约300HA/剂之间。
技术人员可选择给药方式,这将取决于明确的应用考虑。例如,可通过饮用水、喷雾或滴眼剂,将疫苗组合物给予孵化后的雏鸡(几天至几周龄)。卵内给药也包括在本文中。例如,可以给鸡胚接种,通常在约18-19天。本发明的范围之内也包括其它方法,所述方法按照根据预期潜在接触致病禽流感病毒的载体的时间所确定的时间表的有效剂量,通过胃肠外、皮下、腹膜、口服、鼻内或通过其它可行方法(优选通过胃肠外、更优选肌内)给予本发明的疫苗组合物。
剂量的通常范围为约0.25ml至约2.0ml/家禽动物、更优选约0.5ml至约1.0ml/动物。因此,本文包括1剂、2剂或多剂,其中尤其优选剂量次数尽可能少。
如前所述,本发明涉及新的禽流感疫苗组合物及其在家禽中的使用方法。术语“家禽”包括但不限于所有商业化养殖的家禽动物,包括鸡、鸭、鹅、火鸡、孔雀、矮脚鸡等。
免疫测定
根据本发明,本领域已知用于检测抗体与抗原的免疫特异性结合的各种方法,都可用于检测结合和增加的抗原性。检测抗原抗体相互作用的早期方法包括通过在凝胶中沉淀来检测和分析复合物。检测分析物-检测物的抗体结合对的另一方法包括使用可与IgG(例如蛋白A)发生反应的放射性碘标记的检测抗体或放射性碘标记的蛋白质。这些早期方法是本领域技术人员众所周知的,有关综述参见Methods inEnzymology 1980,70:166-198。
只用一种抗体检测样品中分析物存在的后期方法包括竞争性结合测定。在该项技术中,使抗体(通常都会固定在固体支持物上)接触怀疑含有分析物的样品以及已知量的带标记的分析物。然后,这两种分析物(带标记的分析物和样品中的分析物)将会竞争抗体上的结合位点。测定游离的带标记分析物或结合的带标记分析物,根据这样的测定就可知道样品中竞争性分析物的量。该方法的更完整的描述可参见"Basic Principles of Antigen-Antibody Reaction"(Labat,Methods inEnzymology,70,3-70,1980)。在该实例中,带标记的分析物可以用放射性同位素标记或者用酶标记物标记。
新近的免疫测定使用双重抗体方法,用于测定分析物的存在。这些技术的有关综述参见以上参考文献Methods in Enzymology的同一卷。因此,根据本发明的一个实施方案,用一对针对每种待测标记的抗体就可测得一个标记的存在。所述抗体对中的一个在本文中称为“检测抗体”,而所述抗体对中的另一个在本文中称为“捕获抗体”。因此,本发明的一个实施方案使用双重抗体夹心方法,用于测定生物液体样品中的分析物。在该方法中,分析物夹在检测抗体和捕获抗体之间,捕获抗体是不可逆地固定在固体支持物上。检测抗体含有可检测标记,以便识别抗体-分析物夹心的存在,从而识别分析物的存在。
固体支持物的常用早期形式包括聚苯乙烯板、管或小珠,这些都是放射免疫测定和酶免疫测定领域中众所周知的。最近,各种多孔材料例如尼龙、硝基纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维和其它多孔聚合物已作为固体支持物使用。
可使用各种不同技术和相应传感器装置。自动化测定装置包括连续/随机存取测定仪。这类系统的实例包括PB Diagnostic System,Inc.的OPUSTM和Abbott Laboratories(North Chicago,I11)引进的IMXTM分析仪。PB Diagnostic Systems,Inc.的自动化测定仪可参见美国专利号5,051,237;5,138,868;5,141,871和5,147,609。
可用于本发明实践的免疫化学分析系统的更多类型是光学免疫传感器系统。通常,光学免疫传感器是利用光学原理将目标物的化学或生化浓度或活性定量转化为电信号的装置。这些系统可分为4种主要类型:反射技术;表面等离子共振;光纤技术和集成光学装置(Integrated optic device)。反射技术包括椭圆偏振光度法、多重积分反射光谱(multiple integral reflection spectroscopy)和荧光毛细管填充装置(fluorescent capillary fill device)。光纤技术包括倏逝场荧光(evanescentfield fluorescence)、光纤毛细管和光纤荧光传感器。集成光学装置包括平面倏逝场荧光(planer evanescent field fluorescence)、输入分级耦合器免疫传感器(input grading coupler immunosensor)、马赫-曾德尔干涉仪(Mach-Zehnder interferometer)、哈特曼干涉仪(Hartman interferometer)和示差干涉仪传感器。当结合对的一种反应物与固定化的结合对的第二种反应物结合时,检测到预定图像位置上产生的全息图像的存在,从而完成对结合反应的全息摄影检测(参见美国专利号5,352,582,1994年10月4日授予Lichtenwalter等)。光学免疫传感器实例的一般性综述文章可参见G.A.Robins,Advances in Biosensors 1991,1:229-256。这些装置的更具体的描述可参见例如美国专利号4,810,658、4,978,503和5,186,897;R.A.Brady等(Phil.Trans.R.Soc.Land.B.1987,316:143-160)和G.A.Robinson等(载于Sensors and Actuators,Elsevier1992)。
血清学测定广泛用于检测流感诊断以及研究病毒株的流行病学和抗原性。具体地讲,血凝素抑制(HI)测定因其实验室要求低和使用简便而广泛应用。考虑到本发明将会通过增加其灵敏度而改进HI测定的实用性。HI测定也可用于显示修饰HA分子的抗原性,并且有助于表征修饰HA分子,因为与非修饰分子的抗原性相比有所降低或增加。
HI测定可检测血清样品中的抗体与标准化参考结合的能力。在HI测定中,将血清样品系列稀释液(效价)与标准量的红细胞混合,目测其缔合成复合物。引起可见复合物的所测血清的最低水平就是测定结果。
如上所述,本发明提供用于治疗或预防流感病毒感染的疫苗的改进的生产方法和验证方法。具体地讲,本发明可使用反求遗传学技术进行疫苗制备。考虑了本发明可用于在接种后确认和验证免疫应答。尤其是、但并不排它地讲,本发明提供增强的抗体检测方法,该方法是在个体接触流感病毒后进行抗体检测,因为修饰HA分子的抗原性增强。这种增强的抗原性造成用于检测免疫应答的测定(例如HI测定)的灵敏度提高。
实施例
参考以下实施例,可以更好地理解本发明,这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明。
实施例1
H5N3禽流感疫苗的构建
病毒
流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、A/鸡/越南/C58/04(A/Chicken/Vietnam/C58/04)(H5N1)和A/DK/德国/1215/73(A/DK/Germany/1215/73)(H2N3)可得自St.Jude Children′s ResearchHospital的保藏机构。A/番鸭/越南/453/2004(A/MuscovyDuck/Vietnam/453/2004)H5N1可得自越南胡志明市地区动物健康中心(Regional Animal Health Centre,Ho Chi Minh City,Vietnam)。
RT-PCR和质粒构建
用Rneasy试剂盒(Qiagen),自A/鸡/越南/c58/04(H5N1)、A/PR/8/34(H1N1)和A/DK,德国/1215/73(H2N3)流感病毒分离RNA。用Uni12-引物(AGC AAA AGC AGG;SEQ ID NO:3),将RNA逆转录成cDNA。
然后,按照Hoffmann等(2001)Arch.Virol.146:2275-2289所述(通过引用结合到本文中),用节段特异性引物,扩增所得cDNA。具体地讲,按照下表1所描述的,可使用节段特异性引物:
表1
可用于扩增流感病毒节段的引物
基因 | 正向引物 | 反向引物 |
PB2 | Ba-PB2-1:TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCSEQ ID NO:4 | Ba-PB2-2341R:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTSEQ ID NO:5 |
PB1 | Bm-PB1-1:TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCASEQ ID NO:6 | Bm-PB1-2341R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTTSEQ ID NO:7 |
PA | Bm-PA-1:TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACSEQ ID NO:8 | Bm-PA-2233R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTSEQ ID NO:9 |
HA | Bm-HA-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGSEQ ID NO:10 | Bm-NS-890R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTSEQ ID NO:11 |
修饰的HA(1) | Bm-HA-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGSEQ ID NO:10 | Bm-H5-1025R:ATTACGTCTCTCCTCTTGTCTCAATTTGAGGGGTATTSEQ ID NO:12 |
修饰的HA(2) | Bm-H5-1020:ATTACGTCTCAGAGGACTATTTGGGGCTATAGCAGGSEQ ID NO:13 | Bm-NS-890R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTSEQ ID NO:11 |
基因 | 正向引物 | 反向引物 |
NP | Bm-NP-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTASEQ ID NO:14 | Bm-NP-1565R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTSEQ ID NO:15 |
NA | Ba-NA-1:TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTSEQ ID NO:16 | Ba-NA-1413R:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTSEQ ID NO:17 |
M | Bm-M-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGSEQ ID NO:18 | Bm-M-1027R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTSEQ ID NO:19 |
NS | Bm-NS-1:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGSEQ ID NO:20 | Bm-NS-890R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTSEQ ID NO:21 |
引物5′端具有限制性核酸内切酶BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)的识别序列。
可以按照Hoffmann等(2002)Vaccine 20:3165-3170所述(通过引用结合到本文中),构建编码甲型流感/PR/8/34的PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因的质粒。具体地讲,可用表1所列的引物,自A/PR/8/34(H1N1)cDNA扩增PB2、PB1、PA、NP、M和NS的流感基因。用BsmBI(PB1、PA、NP、M和NS)或BsaI(PB2)消化PCR片段,并将它们连接到克隆载体pHW2000(也用BsmBI或BsaI切割)上,从而克隆PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因。这些质粒称为pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW195-NP、pHW197-M和PHW198-NS。
自A/DK/德国/1215/73(H2N3)cDNA扩增NA基因。用表1所列的NA特异性引物(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17),通过PCR扩增NA基因。用BsaI消化PCR片段并连接到载体pHW2000上。
通过PCR,用表1所列的HA特异性引物(SEQ ID NO:10和SEQID NO:11),自A/鸡/越南/c58/04(H5N1)cDNA扩增HA基因。用BsmBI消化PCR片段并连接到载体pHW2000上。然后通过HA1与HA2之间的切割位点上的多碱性氨基酸区的缺失,修饰来自A/鸡/越南/C58/04(H5N1)的HA基因。通过编码未修饰HA的质粒的两个片段的PCR扩增,得到含有修饰HA基因的质粒。用于两个片段扩增的引物见表1(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12;SEQ ID NO:13和SEQID NO:11)。用BsmBI消化片段并通过三片段连接反应连接到pHW2000-BsmBI上。
为了确保基因上没有不想要的突变,对克隆病毒cDNA进行测序。
重组病毒的产生
按照Hoffman等(2002)Vaccine 20:3165-3170所述(通过引用结合到本文中),通过DNA转染产生重组病毒。具体地讲,可以共培养293T和MDCK细胞(各细胞系含0.2-1 x 106细胞)并用于转染实验。用含有各1μg质粒、18ul转化(transit)LT1(Panvera,WI)的终体积为1mlOPTIMEM-I(Gibco,NY)的DNA-脂质复合物转染共培养的细胞。转染可进行6小时,此时可除去DNA-脂质复合物并更换为新鲜培养基。将细胞再孵育额外的24小时,加入0.5μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶(Worthington)。72小时后,将上清液从细胞液中取出,将100ul注射到10日龄含胚鸡蛋中。
疫苗的制备
在10至11日龄含胚鸡蛋的尿囊腔中,在摄氏35度,使病毒繁殖48小时。收获尿囊液,加入比例为1:2000(体积比)的β-丙内酯(BPL),让尿囊液在室温下维持4小时,然后在摄氏4度维持24小时,以灭活病毒。将处理过的尿囊液在含胚鸡蛋中盲传两代后均未检出感染性,证实已经灭活。
通过Amicon超滤进行病毒浓缩
在5000rpm离心15分钟,使尿囊液中的灭活病毒澄清。上清尿囊液通过使用Amicon浓缩超滤装置浓缩至原体积的1/10。
病毒的纯化
浓缩的病毒可通过25%和70%蔗糖垫超速离心,沉淀再以27,000rpm于4摄氏度离心1小时,而得以纯化。将沉淀重悬于STE缓冲液中,超声处理2分钟,然后在25%-70%蔗糖连续梯度中,用SW28转子以24,000rpm离心2.5小时。用注射器取出病毒带,在STE中稀释,然后如上所述地沉淀。将沉淀重悬于合适体积的STE并进行超声处理,加入叠氮化钠,终浓度为200ppm。
疫苗的标准化
通过Wood等(1985)Avian Dis.29:867-872所述的单辐射免疫扩散技术(通过引用结合到本文中),可以使尿囊液、Amicon浓缩的疫苗和纯化疫苗中的血凝素蛋白含量标准化。
实施例2
灭活H5N3禽流感疫苗在SPF鸡中的功效
疫苗组合物
试验了不同剂量的灭活禽流感H5N3疫苗的功效。基本上按照实施例1所述来制备禽流感H5N3疫苗。制备了4种疫苗,其一是安慰剂疫苗,含有无病毒尿囊液。其余3种疫苗含有灭活禽流感病毒母液,得到的最终制剂含有1.2μg HA蛋白(307HAU)/0.6ml体积的剂量、0.5μgHA蛋白(128HAU)/0.5ml体积的剂量或0.25μg HA蛋白(64HAU)/0.5ml体积的剂量的抗原,这些剂量是根据辐射免疫扩散(或血凝抑制)测定所配制的病毒母液而得出的。按照血凝单位(HAU),疫苗相关剂量水平分别是64、128和307HAU/剂。在构建重配病毒期间在非洲绿猴肾细胞(Vero cell)中传代一次,接着经过6次SPF鸡胚传代,制备灭活抗原母液。
用矿物油作为载体,吐温80和司盘83作为乳化剂,将疫苗配制成油包水乳剂(60:40的油:水比例)。吐温和抗原组分与Drakeol和司盘83分开混合,并将水相缓慢加入油相,同时搅拌以形成预制乳剂。然后用固定头Silverson L4R匀浆器对该预制乳剂进行机械匀浆。
疫苗接种
疫苗经肌内在胸肌给予25只为一组的SPF白来亨鸡(Gallusdomesticus;来自Charles River/SPAFAS)。表2概括了接种方案。第1-3组用0.5ml疫苗接种,而第4组用0.6ml疫苗接种(参见表2),使用带20号1/2”-3/4”针头的3ml无菌一次性注射器。第5组的鸡只在第2周和第5周龄不接种。无抗原的安慰剂疫苗同样经肌内给予一组25只同窝孵化鸡(hatchmate),另外的25只同窝孵化鸡作为未接种的对照。当鸡在2周龄时进行初次接种,在5周龄时以同样方式进行加强接种。
表2
处理表
恰好在首次接种之前和在接种之后3周,采集鸡的血样,用于通过血凝抑制(HI)测定来检测禽流感抗体效价。采血前的血清样品都呈阴性。
攻击和采样
当鸡只达到8周龄时进行攻击。给予鸡只攻击病毒A/鸡/越南/c58/04,稀释度为1:1054,以达到30CLD50/鸡,经鼻内/气管内滴注给予1.0ml体积。在攻击后14天内每天观察所有鸡只的死亡率。
在2、5、8和10-11周龄时采集所有鸡只的血样。将血样在37摄氏度放置30分钟,然后移至4摄氏度过夜,让其凝血。将血清无菌地移入单个无菌管,用于通过血凝抑制测定进行血清学分析。将血清样品贮存于-30摄氏度或更低温度待检。
在攻击后3、5、7、10和14天,将采自活鸡气管和泄殖腔的拭子在SPF鸡胚中进行病毒重分离。将拭子放入装有1ml病毒转运培养基(由1:1的PBS/甘油混合物与2 x 106单位/L青霉素、2 x 106单位/L多粘菌素B、250mg/L庆大霉素、0.5 x 106单位/L制霉菌素、60mg/L氧氟沙星HCl和0.2gm/L磺胺甲噁唑组成)的试管中。将拭子冻存于-70摄氏度或更低温度待检。
血清学
血清学试验结果报告见下表3。
表3
通过血凝抑制测定,对接种前、初次接种后和加强接种后的血清进行
血清学分析
*鸡(#6,Pen9)因错误接种而排除在考虑之外
通过血凝抑制测定,接种前从所有鸡只采集的血清样品都不含可检出的禽流感特异性抗体。在初次接种后21天,接种安慰剂的对照鸡(第1组)和未接种鸡(第5组)仍然没有抗体,而接种灭活原型的各组(第2-4组)的几何平均效价水平分别为254、320和446。
在第二次接种后21天,未接种对照鸡(第5组)仍然没有可检测的针对禽流感的抗体。发现安慰剂接种组中有一只鸡(#6,Pen9)的效价为1280,而所有其它安慰剂接种鸡都仍然是血清学阴性。因为该鸡(#6)的未接种的同栏鸡只(pen-mate)都仍然是血清学阴性,所以将不适当暴露给禽流感的该栏鸡只排除在外。该鸡(#6)抗体反应的唯一可能的解释是在加强接种期间,它错误接受了一剂灭活原型疫苗,而不是安慰剂疫苗。这样的话,最适当的就是在计算血清学或攻击结果时,将该鸡排除在考虑之外。
所有接受灭活原型疫苗的各组鸡只反应的几何平均效价分别为3671、4101和4335。
针对死亡的保护作用
攻击后的死亡率数据概述于下表4。
表4
用A/鸡/越南/c58/04攻击后的死亡率
处理组 | 死亡数/攻击数 | 死亡率(%)/保护率(%) |
1* | 24/24* | 100/0* |
2 | 0/25 | 0/100 |
3 | 0/25 | 0/100 |
4 | 0/25 | 0/100 |
5 | 25/25 | 100/0 |
*鸡(#6,Pen9)因错误接种而排除在考虑之外
未接种对照组的所有鸡只在攻击后3天全部死亡。安慰剂接种组的所有鸡只(除一只以外)在攻击后4天全部死亡。在攻击中存活的这只鸡(鸡翼标记为第6号(#6,Pen 9))如上所述是排除在考虑之外的,未接种组和安慰剂接种组全都是100%死亡。这满足了针对对照组而建立的验证标准,即在攻击后需要死亡率至少为90%。
在攻击后,所有3组接种组的所有鸡只全部存活。保护率认为是100%(95% CI 86,100)。这满足了要求保护的针对死亡的保护作用的标准,即至少70%疫苗功效。
病毒重分离
病毒重分离数据概述于下表5(气管拭子)和下表6(泄殖腔拭子)。
表5
用A/鸡/越南/c58/04攻击后从气管进行病毒重分离
*鸡(#6,Pen 9)因错误接种而排除在考虑之外
表6
用A/鸡/越南/c58/04攻击后从泄殖腔进行病毒重分离
*鸡(#6,Pen 9)因错误接种而排除在考虑之外
在未接种对照组中,在攻击后3天、第一次采样前,所有鸡只都死亡,因此该组不可能有病毒重分离数据。
对于安慰剂接种组,第一个采样日之前,所有鸡只(除了2只以外)死亡。如上所述,第6号鸡(#6,Pen 9)错误接种了一剂试验疫苗,所以在攻击中呈抗体阳性,因此能存活。在攻击后的任何时间在采自该鸡气管或泄殖腔的拭子中都不能重新分离到病毒。在攻击后3天,死亡前一天,从另一只安慰剂接种的鸡(#113,Pen 10)的气管和泄殖腔重新分离出病毒。
对于第2组,给予研究中所测的最低抗原水平的疫苗(0.25μg,64HAU/剂),在攻击后3天和5天,从25只鸡中的一只的气管重新分离出病毒。此后,对于第2组的所有其它鸡只,直到研究结束都没有从气管或泄殖腔拭子中重新分离出病毒。
对于第3组,给予配制成含有中等抗原水平的疫苗(0.5μg,128HAU/剂),从25只所测鸡只中的2只的气管中重新分离到病毒,其各在一个采样点(一只在攻击后3天,另一只在攻击后5天)。采自这两只鸡的所有其它样品、以及采自第3组中所有其它鸡只的所有样品,都对病毒重分离呈阴性。
对于第4组,给予配制成研究中所测的最高抗原水平的疫苗(1.2μg,307HAU/剂),在任何时间所有所测25只鸡中的任一只的气管或泄殖腔都未重新分离出病毒。
因为未接种组和安慰剂对照组在采样前几乎全部死亡,所以这些组缺乏重分离数据,因此对重分离率就无法进行统计推断。
疫苗功效
在2周龄和5周龄用试验原型接种SPF鸡之后,通过血凝抑制测定检测高水平抗体,观察针对攻击死亡率的保护作用。从攻击后的接种鸡中重新分离出极少病毒,所以就不能说与对照相比,重分离率有显著下降(因为在这些组中可以评价所有在重分离前死亡的对照),显而易见,疫苗能导致释放的显著减少。对于这样明显的证据,有必要修改攻击方案,使未接种鸡或安慰剂接种鸡在攻击后不会马上死亡。这样做是很困难的,因为H5N1攻击株对鸡具有超强致病性。
测定了这类全病毒灭活疫苗的3种不同抗原水平。所有3种抗原水平的结果基本相同,所以在该项研究中没有测定最低保护剂量。用配制成含有小于0.25μg(64HAU)/剂的抗原的疫苗作进一步研究,这对确定最低剂量是必要的。目前,可以得出的结论是,用含有不小于0.25μg(64HAU)/剂的H5N3重配病毒的含佐剂油包水乳剂进行两次接种,对防止由越南H5N1强毒性野外分离株(virulent field isolate)引起的死亡是高度有效的,而且对防止强毒性H5N1的释放也有效。
疫苗提供针对死亡的100%的保护性。在不同时间点自所有活鸡气管拭子和泄殖腔拭子重新分离的攻击病毒都是最少的。结论是用含有不小于0.25μg(64HAU)/剂H5N3重配病毒的含佐剂的油包水乳剂进行两次接种,对防止由越南H5N1(H5N1 Vietnam)强毒性野外分离株诱导的死亡是高度有效的,而且对防止强毒性H5N1的释放也有效。
实施例3
在SPF鸡的灭活H5N3禽流感疫苗
基本上按照实施例1所述来制备5种疫苗。将疫苗配制成含有下表7(处理表)所列出的病毒含量/剂。HAU和EID50测定中所用的病毒浓度是根据灭活前病毒母液效价。所示H5蛋白抗原浓度(μg)是根据采用标准化单辐射免疫扩散(SRID)所测的灭活后抗原母液效价。根据这些母液抗原和所配制的%抗原液的测定,计算出每剂的所示抗原量。
用矿物油作为载体,吐温80和司盘83作为乳化剂,将疫苗配制成油包水乳剂(60:40的油:水比例)。吐温和抗原组分与Drakeol和司盘83分开混合,并将水相缓慢加入油相,同时搅拌以形成预制乳剂。然后用固定头Silverson L4R匀浆器对该预制乳剂进行机械匀浆。
表7
处理表
处理组 | 疫苗 | 鸡数目 | 采血 |
1 | 64HAU/107.0EID50/0.09μg H5(生产批号2285-26-06JUL05) | 25 | 21dpv |
2 | 128HAU/107.3EID50/0.18μg H5(生产批号2285-21-28JUN05) | 25 | 21dpv |
3 | 256HAU/107.6EID50/0.35μg H5(生产批号2250-55-09MAR05) | 25 | 21dpv |
4 | 512HAU/107.9EID50/0.71μg H5(生产批号2250-56-09MAR05) | 25 | 21dpv |
5 | 1024HAU/108.2EID50/1.42μg H5(生产批号2250-57-09MAR05) | 25 | 21dpv |
6 | 未接种对照 | 25 | 与接种组同一天 |
接种
对于每种疫苗,给25只鸡经皮下接种一次,总体积为0.5ml。将25只同窝孵化鸡作为未接种对照。所有鸡只都各自加有腿箍并同栏混合饲养,直至采血和结束或送去进行攻击。在接种后3周,采集所有鸡只的血样。
攻击
对于第1-4组和第6组,每组任选20只鸡,用高致病性禽甲型流感/鸡/越南/c58/04毒株(H5N1型)进行攻击。通过鼻内/气管内滴注,将30鸡致死剂量(CLD)的病毒给予每只鸡。如实施例2所述,该病毒剂量先前已证明在未接种的对照鸡中能有效引起死亡率为100%。
在攻击后观察鸡只的死亡率,共观察14天。另外,在攻击后4天,对采自所有存活鸡只的气管拭子和泄殖腔拭子进行病毒重分离。
血清学反应
对H5N3抗原母液/稀释液进行反滴定,用于HI测定,证实使用8HA单位的抗原/50uL。建立同源H5N3血清合并液用作阳性对照样品,证明HI活性在1:320或1:640的稀释度。PBS对照孔没有HI活性,而25个未接种的对照血清在1:10稀释度时没有HI活性。根据SO#309所列出的标准,这些结果表明,就一般情况而言,HI测定和效力试验已妥当地完成。
通过有效的HI测定,接种实验性原型疫苗的各组(和未接种的对照组)的抗体反应概述于下表8,各鸡只的结果报告见下表9-14。
表8
经血凝抑制测定,接种灭活原型H5N3疫苗的血清学反应的概述
-H5N3(BPL灭活)抗原母液2228-90-15FEB05用于所有HAI测定
*除去无反应者
表9
给予系列2285-26(64HAU/10
7.0
EID
50
/0.09μgH5/剂)的各鸡的血清学
反应和针对死亡的保护作用
鸡编号# | HI效价 | 死亡(+/-) | 重分离 |
401 | 20 | - | + |
402 | <10 | + | n.d. |
403 | <10 | + | n.d. |
404 | <10 | + | n.d. |
405 | 20 | n.d. | n.d. |
406 | 40 | n.d. | n.d. |
407 | ≥640 | - | - |
408 | 320 | - | - |
409 | 160 | - | - |
410 | ≥640 | - | - |
411 | 80 | - | - |
412 | ≥640 | - | - |
413 | ≥640 | - | - |
414 | ≥640 | - | - |
415 | ≥640 | n.d. | n.d. |
416 | 40 | - | + |
417 | ≥640 | - | - |
418 | 20 | n.d. | n.d. |
419 | 80 | - | - |
420 | ≥640 | - | - |
421 | 40 | - | - |
422 | ≥640 | - | - |
423 | ≥640 | n.d. | n.d. |
424 | ≥640 | - | - |
425 | <10 | + | n.d. |
n.d.=未测定,鸡只未攻击或在采拭子之前死亡
表10
给予系列2285-21(128HAU/10
7.3
EID
50
/0.18μgH5/剂)的各鸡的血清
学反应和针对死亡的保护作用
鸡编号# | HI效价 | 死亡(+/-) | 重分离 |
226 | 320 | - | - |
227 | ≥640 | - | - |
228 | 320 | - | - |
229 | 160 | - | - |
230 | ≥640 | - | - |
231 | ≥640 | - | - |
232 | <10 | + | n.d. |
233 | <10 | n.d. | n.d. |
234 | <10 | + | n.d. |
235 | ≥640 | n.d. | n.d. |
236 | ≥640 | - | - |
237 | <10 | n.d. | n.d. |
238 | ≥640 | - | - |
239 | ≥640 | - | - |
240 | <10 | - | - |
241 | ≥640 | n.d. | n.d. |
242 | ≥640 | - | + |
243 | ≥640 | - | - |
244 | <10 | + | n.d. |
245 | ≥640 | n.d. | n.d. |
246 | ≥640 | - | - |
247 | ≥640 | - | - |
248 | ≥640 | - | - |
249 | ≥640 | - | - |
250 | 320 | - | - |
n.d.=未测定,鸡只未攻击或在采拭子之前死亡
表11
给予系列2250-55(256HAU/10
7.6
EID
50
/0.35μgH5/剂)的各鸡的血清
学反应和针对死亡的保护作用
鸡编号# | HI效价 | 死亡(+/-) | 重分离 |
301 | ≥640 | - | - |
302 | ≥640 | - | - |
303 | 10 | - | + |
304 | <10 | + | n.d. |
305 | ≥640 | - | - |
306 | <10 | + | n.d. |
307 | ≥640 | n.d. | n.d. |
308 | 320 | - | - |
309 | ≥640 | n.d. | n.d. |
310 | ≥640 | - | - |
311 | ≥640 | - | - |
312 | ≥640 | - | - |
313 | ≥640 | - | - |
314 | ≥640 | n.d. | n.d. |
315 | ≥640 | - | - |
316 | 40 | - | + |
317 | <10 | + | n.d. |
318 | <10 | + | n.d. |
319 | ≥640 | - | - |
320 | ≥640 | n.d. | n.d. |
321 | 80 | n.d. | n.d. |
322 | ≥640 | - | - |
323 | ≥640 | - | - |
324 | ≥640 | - | - |
325 | ≥640 | - | - |
n.d.=未测定,鸡只未攻击或在采拭子之前死亡
表12
给予系列2250-56(512HAU/10
7.9
EID
50
/0.71μgH5/剂)的各鸡只的血
清学反应和针对死亡的保护作用
鸡编号# | HI效价 | 死亡(+/-) | 重分离 |
276 | ≥640 | - | - |
277 | ≥640 | - | - |
278 | ≥640 | - | - |
279 | ≥640 | n.d. | n.d. |
280 | ≥640 | - | - |
281 | ≥640 | - | - |
282 | ≥640 | - | - |
283 | ≥640 | - | - |
284 | <10 | + | n.d. |
285 | ≥640 | n.d. | n.d. |
286 | ≥640 | - | - |
287 | ≥640 | - | - |
288 | ≥640 | - | - |
289 | ≥640 | - | - |
290 | ≥640 | n.d. | n.d. |
291 | ≥640 | - | - |
292 | ≥640 | - | - |
293 | ≥640 | n.d. | n.d. |
294 | ≥640 | - | - |
295 | ≥640 | - | - |
296 | ≥640 | - | - |
297 | ≥640 | - | - |
298 | ≥640 | n.d. | n.d. |
299 | ≥640 | - | - |
300 | ≥640 | - | - |
n.d.=未测定,鸡只未攻击或在采拭子之前死亡
表13
给予系列2250-57(1024HAU/10
8.2
EID
50
/1.42μgH5/剂)的各鸡只的血
清学反应和针对死亡的保护作用
鸡编号# | HI效价 | 死亡(+/-) | 重分离 |
201 | ≥640 | n.d. | n.d. |
202 | ≥640 | n.d. | n.d. |
203 | ≥640 | n.d. | n.d. |
204 | ≥640 | n.d. | n.d. |
205 | ≥640 | n.d. | n.d. |
206 | ≥640 | n.d. | n.d. |
207 | ≥640 | n.d. | n.d. |
208 | ≥640 | n.d. | n.d. |
209 | ≥640 | n.d. | n.d. |
210 | <10 | n.d. | n.d. |
211 | <10 | n.d. | n.d. |
212 | ≥640 | n.d. | n.d. |
213 | ≥640 | n.d. | n.d. |
214 | ≥640 | n.d. | n.d. |
215 | ≥640 | n.d. | n.d. |
216 | ≥640 | n.d. | n.d. |
217 | ≥640 | n.d. | n.d. |
218 | ≥640 | n.d. | n.d. |
219 | ≥640 | n.d. | n.d. |
220 | ≥640 | n.d. | n.d. |
221 | <10 | n.d. | n.d. |
222 | ≥640 | n.d. | n.d. |
223 | ≥640 | n.d. | n.d. |
224 | ≥640 | n.d. | n.d. |
225 | ≥640 | n.d. | n.d. |
n.d.=未测定,鸡只未攻击或在采拭子之前死亡
表14
未接种对照组的各鸡对攻击诱导死亡的易感性和缺乏血清学反应
鸡编号# | HI效价 | 死亡(+/-) | 重分离 |
326 | <10 | + | n.d. |
327 | <10 | + | n.d. |
328 | <10 | + | n.d. |
329 | <10 | + | n.d. |
330 | <10 | + | n.d. |
331 | <10 | + | n.d. |
332 | <10 | + | n.d. |
333 | <10 | + | n.d. |
334 | <10 | + | n.d. |
335 | <10 | n.d. | n.d. |
336 | <10 | + | n.d. |
337 | <10 | n.d. | n.d. |
338 | <10 | + | n.d. |
339 | <10 | n.d. | n.d. |
340 | <10 | + | n.d. |
341 | <10 | + | n.d. |
342 | <10 | n.d. | n.d. |
343 | <10 | + | n.d. |
344 | <10 | + | n.d. |
345 | <10 | + | n.d. |
346 | <10 | n.d. | n.d. |
347 | <10 | + | n.d. |
348 | <10 | + | n.d. |
349 | <10 | + | n.d. |
350 | <10 | + | n.d |
n.d.=未测定,鸡只未攻击或在采拭子之前死亡
接种灭活原型的各组(第1-5组)反应的几何平均效价水平分别为109、174、199、527和328,当考虑所测各鸡的结果时。大量鸡只没有可检测的反应,表明对它们进行了错误接种或者它们就是对接种无反应。如果这些鸡只排除在考虑之外,则第1-5组的几何平均效价分别为195、533、403、640和640。注意:在几何平均效价的计算中,一只鸡没有可检测的反应(<1:10,所测的最低稀释度),就认为效价为5。对于反应记录为640(所测最高稀释度)的鸡只而言,实际终点必定比进行的试验更高,但这些鸡仍然算作效价为640。因此,几何平均效价是评价疫苗效果的极限值。
至于血清学反应,第1-5组接种增加的剂量水平,分别为18/25(72%)、19/25(76%)、20/25(80%)、24/25(96%)和22/25(88%),其反应的效价为1:40或更大。
因此,在各鸡的基础上进一步评价血清学试验结果,观察到一些鸡没有可检测的接种后抗体效价。考虑到先前效力研究的结果,其中试验同样的疫苗并发现能够引起可靠的抗体反应,这很可能是这些鸡的错误接种是一个显著性的因素。在随后的攻击结果讨论中提供了进一步解释。
攻击保护性
认为该研究的结果证明了针对由强毒性H5-型禽流感攻击所引起的死亡的功效。正如下表15所示的汇总数据明确表示的那样,高致病性禽流感病毒株A/鸡/越南/c58/04(H5N1型)在攻击后2天内引起未接种对照鸡100%死亡。同时,所有接种组在同样的攻击后都具有针对死亡的保护性,保护水平为80%或更高。然而,在该项研究中认为效力不满意的两种疫苗也具有针对攻击的保护性。认为这表明效力试验方法是严格的,所述方法对在试验条件下证实各批提供保护性的能力上具有保守标准。
表15
用灭活rgH5N3疫苗预防由甲型禽流感/鸡/越南/c58/04(H5N1型)引起
的死亡
处理组 | 抗原/剂 | 死亡数/攻击数 | 死亡率(%) | 预防率(95%CI) |
1(2285-26) | 64HAU107.0EID500.09μgH5 | 4/20 | 20% | 80%(56,94.3) |
2(2285-21) | 128HAU107.3EID500.18μgH5 | 3/20 | 15% | 85%(62.1,96.8) |
3(2250-55) | 256HAU107.6EID500.35μgH5 | 4/20 | 20% | 80%(56.3,94.3) |
4(2250-56) | 512HAU107.9EID500.71μgH5 | 1/20 | 5% | 95%(75.1,99.9) |
6(N/A) | Nonvac | 20/20 | 100 | 0 |
注意:第5处理组未受攻击
攻击后4天,对采自存活鸡气管和泄殖腔的拭子也进行了病毒重分离。同先前所见到的一样,未接种鸡在攻击后的死亡率为100%,这样就无法测定对照组的重分离,因此也就无法进行针对重分离的保护性的统计学评价。
因为每只鸡都有腿箍标识,所以每只鸡都可以追踪到血清学反应和保护性反应,如表9-14所报告。特别令人感兴趣的是经标准化效力试验测定的HAI效价以及病毒攻击后的死亡率和重分离之间的比较。如表16所示,对于阴性抗体反应(<10)的鸡只而言,攻击后的死亡率实际上是确定的。对于具有低抗体反应(10-40)的鸡只而言,完全阻止了死亡,但却没能阻止病毒释放。对于抗体反应为80或更高的鸡而言,基本阻止了死亡和从气管和/或泄殖腔的释放。
表16
不考虑疫苗剂量,在接种后受到攻击的鸡中,效力试验效价(HAI)与
针对高毒性H5N1禽流感的保护性之间的关系
效价组 | 效价组中的鸡数目 | 死亡率 | 重分离阳性率 |
<10 | 13 | 12/13 | 0/1 |
10-40 | 5 | 0/5 | 4/5 |
>40 | 62 | 0/62 | 1/62 |
与不具有可检测效价(<1:10)的鸡相比,具有可检测效价(≥1:10)的鸡死亡的预防率为100%(95% CI 94.6,100)。与效价<1:10的鸡相比,效价>1:40的鸡死亡的预防率为100%(95% CI 94.2,100)。中等效价水平(1:10-1:40)的鸡只数量不够多,对这样的效价的保护性无法进行统计推断。另外,在接种/血清学释放测定中,1:40或更大的阈值看来是适当的位置,以确保对批效力的适当证实。
这些结果指出,适当的疫苗给予方式是至关重要的。甚至是最好的疫苗,如果给药方式不佳而使鸡得到低于最佳的抗体反应,这也会使存活的鸡释放病毒。如果只是因为这一点,对于不仅希望能预防接触高致病性H5N1禽流感的鸡只死亡、而且要减少病毒释放的接种程序而言,应认真考虑一下双剂量方案。因此,在有条件许可(conditionallicense)支持下进行的野外安全性研究(field safety study)将会包括使用两次接种。
结论
对于含有剂量为64HAU/107.0EID50/0.09μg H5/剂或更高剂量的H5N3株的灭活疫苗而言,已经证明了针对由高致病性H5-型禽流感引起死亡的功效。
实施例4
H5N3灭活流感疫苗对鸭子的功效
疫苗
制备了几种疫苗,其一是安慰剂疫苗,含无病毒尿囊液。所有其它疫苗都含基本上按照实施例1和表17所述而制备的灭活禽流感病毒母液。在构建重配病毒期间在非洲绿猴肾细胞(Vero cell)中传代一次,接着经过6次SPF鸡胚传代,制备灭活抗原母液。
用矿物油作为载体,吐温80和司盘83作为乳化剂,将疫苗配制成油包水乳剂(60:40的油:水比例)。吐温和抗原组分与Drakeol和司盘83分开混合,并将水相缓慢加入油相,同时搅拌以形成预制乳剂。然后用固定头Silverson L4R匀浆器对该预制乳剂进行机械匀浆。
表17
所用的疫苗
接种
接种前,给鸭(Anas platyrhynchos;来自Ideal Poultry,Cameron,Texas)套上腿箍,其上有治疗组和分栏的记录。按照下表18-20所示给鸭接种。实验1的鸭在鸭胸经肌内接种0.5ml(组1-3)或0.6ml(组4),使用带20号1/2”-3/4”针头的3ml无菌一次性注射器。第5组的鸭未接种。当鸭在2周龄时进行初次接种,在5周龄时以同样方式进行加强接种。
实验2的鸭在鸭胸经肌内接种0.5ml,使用带20号1/2”-3/4”针头的3ml无菌一次性注射器。当鸭在2周龄时进行初次接种,在5周龄时以同样方式进行加强接种。
实验3的鸭同样在鸭胸经肌内接种0.5ml,除了第8组接受0.25ml系列#2228-51之外。当鸭在1周龄时进行接种,未给予加强接种。
表18
处理表-#1
表19
处理表-#2
表20
处理表-#3
攻击
在实验1中(参见表18),当鸭达到8周龄时进行攻击。将攻击病毒A/鸡/越南/c58/04(30CLD50(104.5EID50)/鸭)经鼻内滴注给予鸭,体积为1.0ml。在攻击后至少14天内每天观察所有鸭的死亡情况。
在实验2中(参见表19)。当鸭达到8周龄时进行攻击。将攻击病毒A/鸡/越南/c58/04(30CLD50(104.5EID50)/鸭)经鼻内滴注给予鸭,体积为1.0ml。在攻击后至少14天内每天观察所有鸭的死亡情况。
在实验3中(参见表20),当鸭达到8-9周龄(59天)时进行攻击。将攻击病毒A/鸭/泰国/D4AT/04(A/duck/Thailand/D4AT/04)(100DLD50(105.0EID50)/鸭)经鼻内滴注给予鸭,体积为1.0ml。在攻击后至少14天内每天观察所有鸭的死亡情况。
采样
在接种后和攻击后的不同时间点采集所有鸭的血样。将血样在37摄氏度放置30分钟,然后移至4摄氏度过夜,让其凝血。将血清无菌地移入单个无菌管,用于通过血凝抑制测定进行血清学分析。将血清样品贮存于-30摄氏度或更低温度待检。
在攻击后不同时间点,将采自活鸭气管和泄殖腔的拭子在SPF鸡胚中进行病毒重分离。将拭子放入装有1ml病毒转运培养基(由1:1的PBS/甘油混合物与2 x 106单位/L青霉素、2 x 106单位/L多粘菌素B、250mg/L庆大霉素、0.5 x 106单位/L制霉菌素、60mg/L氧氟沙星HCl和0.2gm/L磺胺甲噁唑组成)的试管中。将拭子冻存于-70摄氏度或更低温度待检。
实验1的疫苗功效
实验1的结果概述见下表21。
表21
灭活H5N3流感疫苗对鸭子的功效(实验1)
dpv=接种后的天数
dpb=加强接种后的天数
dpc=攻击后的天数
通过HI测定,各种剂量的疫苗(1.2μg、0.5μg和0.25μg)诱导可检测水平的抗体;初次接种后21天的几何平均效价分别为52、45和72。再次接种后,效价分别升至220、151和290。同时,安慰剂组在初次或再次接种后都没有可检测的抗体。攻击后,安慰剂-接种组的抗体效价上升很多,而抗原接种组的抗体效价不变。
在用A/鸡/越南/C58/04(H5N1)病毒攻击的安慰剂(或接种)的鸭子中,没有死亡或疾病征兆。然而,在攻击后3天,从安慰剂接种组的所有鸭子中都重新分离到病毒,而从接种组的任一只中都未重新分离到病毒。
对于0.25、0.5和1.2的疫苗剂量而言,阻止自气管拭子分离出病毒的疫苗功效分别为100%(95% CI,76.43%-100%)、100%(95% CI,73.06%-100%)和100%(95% CI,74.86%-100%)。对于0.25、0.5和1.2的疫苗剂量而言,阻止自泄殖腔拭子分离出病毒的疫苗功效分别为100%(95% CI,75.07%-100%)、100%(95% CI,71.47%-100%)和100%(95% CI,73.39%-100%)。
实验2的疫苗功效
实验2的结果概述见下表22。
表22
灭活H5N3流感疫苗对鸭子的功效(实验2)
dpv=接种后的天数
dpb=加强接种后的天数
dpc=攻击后的天数
在该实验中,接受比第一次实验更低抗原含量(0.0313、0.0625和0.125μg HA)的疫苗制剂的鸭子,其几何平均HI效价分别为<10、21和15。在初次接种后,最低剂量的疫苗(0.0313)仅在10只鸭子中的5只体内诱导出可检测的HI反应。用0.0625或0.125μg HA接种后,各组有8/10的鸭子具有可检测的HI抗体。在0.25μg组,所有10只鸭子对初次接种都有反应。一旦再次接种,所有组的HI效价都显著增加,范围为92(0.0313)至435(0.25),而安慰剂接种组仍呈阴性。攻击后,安慰剂-接种组的抗体效价上升很多,而抗原接种组的抗体效价基本上不变。
攻击后,攻击病毒仅在未接种对照组的10/10只鸭子中发生复制。在接受两个剂量的0.0313或0.0625μg HA的鸭子中未检测到病毒复制。相比之下,在0.125μg组中有2/10的鸭子、在0.25μg组中有1/20的鸭子释放最低检测水平的病毒达1天。与对照相比,在两个剂量的0.0313至0.0625μg之后,阻止气管释放的疫苗功效为100%(95% CI,68.05%-100%),而在两个剂量的0.25μg之后,阻止气管释放的疫苗功效为94.44%(95% CI,73.5%-9.82%)。与同栏混养的对照鸭相比,两个剂量的0.125μg之后,阻止气管释放的疫苗功效为88.89%(95% CI,51.87%-99.65%)。
实验3的疫苗功效
最初两次实验采用初次-加强免疫方案,所测的所有抗原水平都诱导出针对病毒释放的保护作用。因此,在第三次实验,测试了用更低抗原含量的疫苗的单次接种。
表23
灭活H5N3流感疫苗对鸭的功效(实验3)
dpc=攻击后的天数
攻击前的抗体效价范围为<10(0.015μgHA)至101(0.5μg HA)。在接种组鸭中,在攻击后,针对攻击病毒的HI抗体效价没有增加,但在安慰剂-对照组中却有所增加,这表明攻击病毒在接种鸭体内未复制。
在任何接种鸭中都未检出死亡或疾病征兆。相比之下,安慰剂组中有8/12死亡,其余都具有严重病征,包括神经异常和/或眼混浊。将鸭子按栏划分到治疗组,使得在所测疫苗提供的保护性差异上的统计学评价中不会排除分栏影响。尽管如此,还是根据各鸭只来进行保护性的统计学分析,用Bonferroni调整计算出p值。在这种情况下,与对照栏的鸭子相比,接种1.2、0.0625、0.0313或0.015μg疫苗剂量的鸭栏,其死亡率有明显的预防效果(p=0.0329),这些组的疫苗功效为100%(95% CI,34.94%-100%)。与对照栏相比,接种0.125、0.5和0.25μg疫苗剂量的各栏鸭只之间的死亡率差异没有统计学显著性(p=0.0897)。这可能反映了研究的低统计率,这是因为在BSL3+设施中可饲养的鸭子数量有限,而且疫苗在这些剂量上不一定有功效。与对照相比,在接受0.125μg和0.25μg疫苗剂量的鸭栏中疫苗预防死亡率的功效为100%(95% CI,38.63%-100%)。与对照相比,在接受0.5μg的疫苗剂量的鸭栏中疫苗预防死亡率的功效为100%(95% CI,22.03%-100%)。
结论
无论是从预防死亡和/或防止病毒从气管或泄殖腔释放方面看,所有所测剂量水平和/或接种方案都诱导保护性反应。对于配制,证明使用基于矿物油的佐剂体系(用司盘83和吐温80作为乳化剂,提供60/40的油:水比例的乳剂)对鸭特别有效。同样,在用于鸡和相关灭活双价禽流感产品(Poulvac i-AI H5N9,H7N1,由荷兰FDAH生产)的制剂上也证明该乳剂是非常有效的。
在实验1中,所有剂量水平在两次接种后都具有保护性,而实验2评价了使用更低剂量水平来界定保护所需的最低剂量。然而,甚至用更低抗原含量的疫苗进行两次接种,对于攻击后的病毒释放具有完全的保护性。由此产生了实验3的研究设计,在其中评价了单剂量疫苗(包括一种更低抗原含量的疫苗),用已知能引起鸭只死亡的泰国分离株进行了攻击。
因此,实验3代表了所进行的最严格的试验,其中鸭只在一周龄接受单剂量疫苗,在8-9周龄用对水禽具有高致病性的分离株进行攻击。在该模型中,证明单次接种4HAU的禽流感抗原(1/2体积的系列2228-51的剂量),能有效预防死亡并预防病毒自气管和泄殖腔释放。该实验也证明在给予单剂量疫苗后免疫力的持续时间为至少7周。
综上所述,这3次实验表明疫苗在两种不同情况下对鸭子的有效性。前两次实验证明疫苗能预防鸭的携带状态,因为接种的鸭在用不能引起水禽的明显临床症状或死亡、但对鸡具有高致病性的分离株攻击后,不释放病毒。第三次实验证明,疫苗能够预防鸭只在用已知的水禽致病性分离株攻击后的临床症状、死亡和病毒释放。
对于该疫苗,所推荐的接种方案将会结合在CSIRO/AAHL(Australia)进行的实验的结果报告,以及对禽流感的流行病学和鸭的商品化生产的常规饲养方法的适当考虑。所推荐的方案为含有256HAU/0.5ml的疫苗(抗原含量大于在现有报告中证明具有保护性的抗原含量,并且远远小于在安全性研究中所用的抗原含量),经皮下给予较少体积的日龄(day-of-age)剂量,然后在3周龄给予全体积的加强剂量(在参考CSIRO研究中证明有效的一种方案)。根据该方案,鸭可得到早期接种的益处,所给予的加强接种以转变在日龄(day of age)错误接种的任何鸟类和/或使免疫应答加强到非常高的水平。
实施例4
商品化鸭免疫前和灭活禽流感疫苗对高致病性禽流感病毒攻击的效
应评价
疫苗制备
将感染的尿囊液(在SPF鸡蛋中传代2次)在无菌PBSA中稀释,得到每0.5ml约为101.5鸭感染剂量50(DID50)或104.7鸡感染剂量50(EID50)的剂量。SPF鸡蛋中接种物的反滴定证实了攻击中的病毒效价。
接种
将60日龄商品化小鸭(北京鸭)随机分为3组,每组各20只。免疫接种前用c-ELISA对10只小鸭进行禽流感抗体筛选。所测各小鸭均为禽流感抗体阴性。
如下处置3组:
A组:在1日龄和3周龄接种(灭活H5疫苗Poulvac i-AI H5N9,H7N1),然后在6周龄通过鼻内(0.2ml)、眼内(0.1ml)和口服(0.2ml)途径,用0.5ml病毒悬液H5N1(含101.5DID50(104.7EID50))进行攻击。
B组:在1日龄和3周龄接种(灭活H5疫苗Poulvac i-AI H5N3),然后在6周龄通过鼻内(0.2ml)、眼内(0.1ml)和口服(0.2ml)途径,用0.5ml病毒悬液H5N1(含101.5DID50(104.7EID50))进行攻击。
C组:在6周龄通过鼻内(0.2ml)、眼内(0.1ml)和口服(0.2ml)途径,用0.5ml病毒悬液H5N1(含101.5DID50(104.7EID50))进行攻击。
日龄接种在颈上部经皮下给予0.2ml剂量。在3周龄在颈上部经皮下再次接种0.5ml剂量。
攻击前,将各组数量降至15只/组(14只对照),所有鸭只都各自用带编号的腿箍作为标识。就在攻击之前,自各鸭采血样用于血清学研究,然后在攻击后11天和14天,自各存活鸭采血样用于血清学研究。用1ml刻度注射器进行攻击。将接种物通过一个或两个鼻孔小心加入到睁开的双眼和口中。
在整个研究过程中每日观察鸭子的临床症状,在急性期每日两次观察鸭子的临床症状。为了监测攻击后的病毒释放,在攻击后的4、5、6和7天,自各受攻击鸭子采集气管拭子和泄殖腔拭子。然后所选样品用于在SPF鸡蛋或商品化蛋(如果SPF蛋不可行的话)中进行病毒分离。
死亡率和发病率
攻击后4天,所有对照鸭(C组)都不活跃和食欲不振,并伴有绿色腹泻和明显的体重减轻。在第10天,4只对照鸭死亡而没有临床症状,另有5只具有神经学症状(颤搐、歪头、甩头、翅膀麻痹),该组的14只中还剩5只。
在两组接种组(A组和B组)的每组中,所有15只在整个研究期间在临床上都表现良好。
血清学
通过颈静脉或翅脉穿刺,采集足够进行所有血清学实验的血液。收获血清并贮存于-20摄氏度或更低温度待检。所有未接种鸭在用H5N1病毒攻击前都对越南H5抗原呈HI活性阴性。有趣的是,两个接种组之间在接种后、攻击前的HI效价有差异,其中与给予双价疫苗的A组(n=15)(阴性至1:8)相比,B组H5N3的鸭只(n=15)具有更高效价(1:8至1:64)。
显然,C组中的5只存活对照鸭的血清转变成针对攻击,第11天的效价范围为1:32至1:256,而第14天范围为1:64至1:128。
A组(双价疫苗)中大部分鸭的血清在攻击前没有转变成针对越南H5,但是其中6只在第11天发生血清转变,在第14天大部分都发生了血清转变(1:32和1:128)。2只具有可检测的攻击前HI效价的鸭到第14天仍是单加倍稀释脱离血清转化(Two birds which had detectablepre-challenge HI titres were one doubling dilution away fromseroconversion by day 14)。这表明这2只鸭体内病毒复制可能受到比同组其它成员略大程度的抑制,比起未免疫鸭而言,这2只鸭的血清转变可能会晚几天才发生。在攻击后稍后时间里有必要进行血清学研究以证实这一点。
在B组(反求遗传学疫苗)中,所有鸭的血清在攻击前都转变成针对越南H5。然而,在攻击后没有鸭子表现出效价上升,表明该组鸭体内没有建立起病毒感染。
病毒释放
在攻击后4、5、6和7天,从各攻击鸭采集气管拭子和泄殖腔拭子。采集气管样品和泄殖腔样品之后,将样品放入含抗生素的等渗磷酸缓冲盐(PBS,pH7.0-7.4)中。在接种蛋之前,将悬液贮存于-80摄氏度。
除非另有说明,否则在SPF含胚禽蛋中进行病毒分离。将攻击后4天和7天采集的样品的上清液接种到经9-11天孵育的至少3个含胚禽蛋的尿囊中。将蛋在35-37摄氏度孵育至多5天。测定来自含已死或将死胚胎的蛋、以及在孵育末期所有尚存蛋的尿囊液的血凝(HA)活性。认为具有血凝活性的所有尿囊液都对所给予的AI病毒呈阳性。
C组:在攻击后4天或7天,对采自各对照鸭的气管拭子进行禽流感病毒重新分离,并且在第4天,对采自这些鸭子中的2只的泄殖腔拭子进行禽流感病毒重新分离。这些观察结果与在先前效价研究中给予同样攻击剂量的鸭子中所观察到的结果一致。
A组:在第4天自2只接种双价疫苗的鸭的气管、在第4天自这些鸭中的1只的泄殖腔拭子,进行禽流感病毒的重新分离。在攻击后7天,从该组的任何鸭子中没有重新分离到病毒。
B组:在攻击后4天或7天,从采自接种反求遗传学H5N3疫苗的任何鸭子的气管拭子和泄殖腔拭子中,都没有重新分离到禽流感病毒。
结论
在对照组鸭中观察到高水平的发病率(100%)和死亡率(65%)。综合病毒释放和存活者的血清转变的结果来看,这表明当将攻击病毒给予从未接触过攻击病毒的商品化鸭时,能够感染和引起疾病。
用双价灭活H5疫苗Poulvac i-AI H5N9,H7N1接种,不会导致该组大部分鸭的血清转变为针对越南H5,但是却可以保护鸭,以免产生禽流感疾病症状。在攻击后,大多数鸭的血清转变成针对H5,这表明该组鸭中发生了病毒复制。从这些鸭中重新分离到AI病毒,支持了这样的血清学解释。
用灭活H5疫苗Poulvac i-AI H5N3接种,导致所有鸭的血清都转化成针对越南H5,并在用H5N1病毒攻击后具有保护性,以免发病。该组鸭在病毒攻击后没有血清转化,表明在这些鸭中病毒复制受到抑制。从采自第4天或第7天的气管拭子或泄殖腔拭子中没有重新分离得到AI病毒,支持了这一点。
实施例5
疫苗组合物
根据已充分了解的矿物油乳剂的免疫刺激效应,选择佐剂,配制成油包水(W/O)乳剂。制剂中可以使用药用级的轻质矿物油(NF)Drakeoil 5。
为了得到稳定的油包水乳剂(W/O),可使用表面活性剂。选择表面活性剂脱水山梨醇倍半油酸酯(植物)、疏水型表面活性剂和聚山梨酯80(植物)、亲水型表面活性剂,是因为它们具有乳化性。目前已经知道使用这些表面活性剂的组合可以得到稳定的乳剂。
司盘83V(Arlacel 83V)=脱水山梨醇倍半油酸酯,一种单酯和二酯的等摩尔混合物;
CAS编号=8007-43-9,用于制备乳膏剂、乳剂和软膏剂。
吐温80V(Tween 80V)=聚山梨酯80=聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯;
CAS编号=9005-65-6,用于制备稳定的水包油乳剂。
脱水山梨醇酯(例如司盘83V)产生稳定的W/O乳剂,但是经常与不同比例的聚山梨酯(例如吐温80V)组合使用,以产生W/O乳剂。
用于配制产品的司盘83V和吐温80V都来源于植物。
根据已充分了解的矿物油乳剂的免疫刺激效应,选择佐剂,配制成油包水(W/O)乳剂。制剂中可以使用药用级的轻质矿物油(NF)Drakeoil5。
为了得到稳定的油包水乳剂(W/O),有必要使用表面活性剂。选择表面活性剂脱水山梨醇倍半油酸酯(植物)、疏水型表面活性剂和聚山梨酯80(植物)、亲水型表面活性剂,是因为它们具有乳化性。目前已经知道使用这些表面活性剂的组合可以得到稳定的乳剂。
司盘83V(Arlacel 83V)=脱水山梨醇倍半油酸酯,一种单酯和二酯的等摩尔混合物;
CAS编号=8007-43-9,用于制备乳膏剂、乳剂和软膏剂。
吐温80V(Tween 80V)=聚山梨酯80=聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯;
CAS编号=9005-65-6,用于制备稳定的水包油乳剂。
脱水山梨醇酯(例如司盘83V)产生稳定的W/O乳剂,但是经常与不同比例的聚山梨酯(例如吐温80V)组合使用,以产生W/O乳剂。
用于配制产品的司盘83V和吐温80V都来源于植物。
剂量体积0.5ml通常用于家禽业。
表24
产品组成(每剂)
配料名称 | 数量 | 功能 |
活性成分灭活禽流感病毒H5N3RG佐剂组成轻质矿物油脱水山梨醇倍半油酸酯(植物)聚山梨酯80(植物)辅料组成硫柳汞磷酸缓冲盐溶液 | ≥128HA230mg22.5mg4.3mg0.02mg加入到0.5ml | 活性成分佐剂乳化剂乳化剂防腐剂稀释剂 |
实施例6
试验了不同剂量的灭活禽流感疫苗的功效。将福尔马林灭活的重配H5N3病毒配制成原型油包水乳剂,其含有0.25μg血凝素(HA)蛋白/剂、0.5μgHA蛋白/剂或1.2μg HA蛋白/剂。按照血凝单位(HAU),这些疫苗相关剂量水平分别是64、128和307HAU/剂。在2周龄和5周龄,将疫苗原型经肌内给予各组的25只SPF白来亨鸡。无抗原的安慰剂疫苗同样经肌内给予一组25只同窝孵化鸡,另外的25只同窝孵化鸡作为未接种的对照。
恰好在首次接种之前和接种之后3周,采集鸡的血样,用于通过血凝抑制(HI)测定来检测禽流感抗体效价。采血前的血清样品都呈阴性。在初次接种后21天和加强接种后21天,所有接种组的血清样品都含有高水平的抗体。
在加强接种后3周,用从越南分离的高致病性H5N1禽流感病毒攻击鸡。疫苗提供针对死亡的100%保护率。在攻击后的不同时间点采集自所有活鸡的气管拭子和泄殖腔拭子中,重新分离到的攻击病毒最少。
接种前给鸡翼加上标记,鸡翼标记随机分到治疗组并分栏。在鸡胸经肌内接种。在鸡为2周龄时初次接种,在鸡为5周龄时以同样方式给予加强接种。
当鸡只达到8周龄时进行攻击。给予鸡只攻击病毒A/鸡/越南/c58/04,经鼻内/气管内滴注1.0ml体积。
在2、5、8和10-11周龄时采集所有鸡只的血样。在攻击后3、5、7、10和14天,采自活鸡的气管拭子和泄殖腔拭子用于在SPF蛋中进行病毒重分离。
血清抗体定量和病毒重分离方法是标准方法。
对于声称的预防死亡,原先设计的研究是用于评价死亡率的基本结果,测试各组间死亡率无差异的无效假说。用普适评价方程模型比较各组的死亡率,其中死亡率(0或1)作为二元因变量,所包含的处理作为自变量。必要时,可包括分栏的位置作为模型的共变量(covariate)。因为未接种组的死亡率为100%,而接种组没有死亡,所以卡方分析用于计算预防率及其相关置信区间。
对于声称的预防病毒释放,设计的研究是用于评价病毒分离率的基本结果,测试各组间病毒分离率无差异的无效假说。如下所述,未接种组和安慰剂接种对照组的总死亡率,使得对重分离结果进行统计学分析是不可能的,因此就没有进行。
用试验原型接种2周龄和5周龄的SPF鸡后,通过血凝抑制测定检测到高水平抗体,观察到针对攻击死亡的完全保护性。在攻击后,从接种鸡中重分离到的病毒最少,尽管不能就此认为,与对照相比,重分离率有显著下降(因为在这些组中可以评价重分离前死亡的所有对照),显然,疫苗能使病毒释放显著减少。为了明确证据,有必要修改攻击方案,使得未接种的鸡或安慰剂接种鸡在攻击后不会立即死掉。这证明很难,因为H5N1攻击株对鸡有超强致病性。
测试了这类全病毒灭活疫苗的3种不同抗原水平。所有3种抗原水平的结果基本相同,使得在该研究中不能确定最低保护剂量。有必要用配制成含有小于0.25μg(64HAU)/剂的抗原的疫苗作进一步研究,以确定最低量。目前的结论是,用含有不小于0.25μg(64HAU)/剂的H5N3重配病毒的含佐剂油包水乳剂进行两次接种,对防止由越南H5N1强毒性野外分离株引起的死亡是高度有效的,而且对防止强毒性H5N1的释放也有效。
尽管在各种实施方案中已经介绍了本发明,但是希望在不违背本说明书中描述的和所附权利要求书中具体要求保护的本发明的真实精神和范围的情况下,本领域技术人员可以理解对其进行的某些修改。本文所述的具体实施方案并不是对本发明范围的限制。的确,根据本说明书及其附图,除本文描述的那些修改之外,对本发明的各种修改是本领域技术人员显而易见的。这样的修改将会落入所附权利要求书的范围之内。还应理解的是,所有数值都是近似值,提供这些数值是为了进行描述。本文所引用的所有专利和专利申请都通过引用全部结合到本文中。
序列表
<110>惠氏公司(Wyeth)
St.Jude Children’s Research Hospital
Hoffmann,Erich
Krauss,Scott L.
Kumar,Mahesh
Webby,Richard J.
Webster,Robert G.
<120>禽流感病毒、疫苗、组合物、制剂及方法
<130>00630/2204339-WO0
<150>60/794,054
<151>2006-04-21
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<170>PatentIn version 3.3
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<212>PRT
<213>鹅
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