EA024250B1

EA024250B1 - Дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека и содержащая её вакцина, способы их приготовления и их применение для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых вирусом гриппа у людей

Info

Publication number: EA024250B1
Application number: EA200901161A
Authority: EA
Inventors: Уилльям Рипли Баллоу; Эммануэль Жюль Ханон
Original assignee: Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2016-08-31
Also published as: KR20100009576A; US20100189741A1; MA31381B1; DOP2009000239A; EA200901161A1; KR101188382B1; EP2136837B1; CA2683075C; IL200859A; TW200908994A; US20090136543A1; EP2455101A3; AU2008240761B2; US20170246290A1; PE20090146A1; ES2377761T3; CN101678096A; ATE537841T1; AR066405A1; CO6251369A2

Abstract

В изобретении предложена дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека в количестве от 0,2 до 1,5 мл, включающая антиген или антигенный препарат вируса гриппа, содержащий 15 мкг или менее 15 мкг гемагглютинина (НА) на штамм вируса гриппа, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа "масло в воде", где адъювант содержит (1) 5-6 мг сквалена, 2-3 мг эмульгатора и 5-7 мг токола на дозу для человека; (2) 2-3 мг сквалена, 1-1,5 мг эмульгатора и 2,5-3,5 мг токола на дозу для человека или (3) 0,5-1,5 мг сквалена, 0,25-0,75 мг эмульгатора и 0,5-1,5 мг токола на дозу для человека. Также предложена содержащая ее вакцина. Дозированная форма препарата по изобретению обеспечивает экономию антигена и снижение реактогенности. Предложены также способы приготовления дозированной формы и вакцины и их применение для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых вирусом гриппа у людей.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям против гриппа и к схемам вакцинации для иммунизации людей против гриппа, к их применению в медицине, в частности к их применению для усиления иммунных ответов на различные антигены, и к способам их приготовления. В частности, изобретение относится к вакцинам против гриппа, содержащим антиген или антигенный препарат вируса гриппа в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде, где указанный адъювант в виде эмульсии типа масло в воде содержит метаболизируемое масло и эмульгатор и, возможно, токол и/или стерол.

Предшествующий уровень техники

Вирусы гриппа представляют собой одни из самых распространенных вирусов в мире, поражающих как человека, так и домашний скот. Грипп приводит к значительным экономическим затратам, заболеваемости и даже смертности.

Вирус гриппа представляет собой оболочечный РНК-вирус с размером частиц около 125 нм в диаметре. Он состоит в основном из внутреннего нуклеокапсида или ядра из рибонуклеиновой кислоты (РНК), ассоциированного с нуклеопротеином, окруженного вирусной оболочкой с липидной бислойной структурой и наружными гликопротеинами. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из белков матрикса, а наружный слой - главным образом из липидного материала хозяина. Вирус гриппа содержит два поверхностных антигена, гликопротеины нейраминидазу (ΝΑ) и гемагглютинин (НА), которые выступают на поверхности частиц в виде шипов длиной от 10 до 12 нм. Именно эти поверхностные белки, особенно гемагглютинин, определяют антигенную специфичность подтипов гриппа. Вирусные штаммы классифицируются по виду хозяина, из которого их выделяют, географическому месту и году выделения, порядковому номеру и, для гриппа А, по серологическим свойствам подтипов НА и ΝΑ. Для вирусов гриппа А идентифицировано 16 подтипов НА (Н1-Н16) и девять подтипов ΝΑ (Ν1-Ν9) | \УеЪ81ег К.О. с1 а1. Ενοίιιΐίοη апб есо1оду оГ тЛиеп/а Α У1ти8е8. М1сгоЪю1. Кеу 992; 56Α52-179; РоисЫет ΚΑ е1 а1. Сйагас1еп/аПоп оГ а №ус1 1пЛиеп/а Α У1ти8 НетаддйПийп §иЪ!уре (Н16) ОЫатеб Ггот В1аскНеабеб Ои118. 1. У1го1. 2005;79:2814-2822)]. Вирусы всех подтипов НА и ΝΑ были выделены из водоплавающих птиц, но только три подтипа НА (Н1, Н2 и Н3) и два подтипа ΝΑ (Ν1 и Ν2) имеют установленные стабильные линии в человеческой популяции с 1918 года. Для вирусов гриппа В известен только один подтип НА и один (подтип) ΝΑ.

Вирусы гриппа А постоянно эволюционируют и подвергаются антигенной изменчивости |^УНеу И., 8кейе1 1. Тйе 81гис1иге апб 1йе ГипсОоп оГ 1йе йетаддйпййп тетЪгапе д1усорго1еш оГ тЛиеп/а у1ги8. Αηη. Кеу. Вюсйет. 1987; 56:365-394]. Отсутствие эффективного исправления ошибок вирусной РНКполимеразой приводит к высокой частоте транскрипционных ошибок, что может приводить к аминокислотным заменам в поверхностных гликопротеинах. Это называется антигенный дрейф. Сегментированный вирусный геном делает возможным второй тип антигенной изменчивости. Если два вируса гриппа одновременно инфицируют клетку хозяина, то генетическая рекомбинация, именуемая антигенный сдвиг, может создать новый вирус с новыми поверхностными или внутренними белками. Эти антигенные изменения, как дрейфы, так и сдвиги, являются непредсказуемыми и могут оказывать сильное влияние с иммунологической точки зрения, поскольку они в конечном счете приводят к появлению новых штаммов гриппа и позволяют вирусу ускользнуть от иммунной системы, вызывая общеизвестные практически ежегодные эпидемии. Обе эти генетические модификации приводили к новым вариантам вируса, ответственным за пандемии у людей.

Антигенный дрейф вируса гриппа В является менее частым явлением, чем в штаммах А, и антигенный сдвиг не известен. Хотя антигенно разные линии (обычно две, например В/Уатада1а и В/УюЮпа) вируса гриппа В могут время от времени циркулировать совместно в соотношениях, варьирующих от года к году и от страны к стране, общим для вакцин против гриппа является то, что они содержат только один штамм вируса гриппа В.

НА является наиболее важным антигеном в определении серологической специфичности разных штаммов вируса гриппа. Этот белок, имеющий массу 75-80 кДа, содержит многочисленные антигенные детерминанты, некоторые из которых находятся в участках, которые подвергаются изменениям последовательности в разных штаммах (штаммоспецифические детерминанты), а другие находятся в участках, которые являются общими для многих молекул НА (общие детерминанты).

Вирусы гриппа вызывают эпидемии практически каждую зиму с уровнями заболеваемости для вируса типа А или В до 40% в течение шестинедельного периода. Гриппозная инфекция приводит к различным болезненным состояниям, от бессимптомной инфекции через умеренную инфекцию верхних дыхательных путей до тяжелой вирусной пневмонии. Типичные эпидемии гриппа вызывают увеличение заболеваемости пневмонией и болезнями нижних дыхательных путей, о чем свидетельствуют повышенные показатели госпитализации и смертности. Тяжесть данного заболевания в первую очередь определяется возрастом хозяина, его иммунным статусом и местом инфицирования.

Пожилые люди в возрасте 65 лет и старше особенно восприимчивы - на их долю в развитых странах приходится 80-90% всех смертей, связанных с гриппом. Индивидуумы с хроническими заболеваниями или с ослабленным иммунитетом также имеют наибольшую вероятность испытывать такие осложнения.

- 1 024250

У маленьких детей заболевание также может протекать в тяжелой форме. Поэтому эти группы особенно нуждаются в защите. Помимо этих групп риска органы здравоохранения также рекомендуют вакцинировать медицинских работников.

Вакцинация играет решающую роль в контролировании ежегодных эпидемий гриппа. Доступные в настоящее время вакцины против гриппа представляют собой либо инактивированные, либо живые аттенуированные вакцины против гриппа. Инактивированные вакцины против гриппа состоят из трех возможных форм антигенного препарата: инактивированный цельный вирус, субвирионы, где очищенные вирусные частицы расщеплены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки (так называемая сплит-вакцина), или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина). Эти инактивированные вакцины вводят внутримышечно (в.м.), подкожно (п.к.) или интраназально (и.н.).

Вакцины против гриппа всех типов для межпандемического применения обычно представляют собой тривалентные вакцины. Они, как правило, содержат антигены, полученные из двух штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В. Стандартная инъецируемая доза 0,5 мл в большинстве случаев содержит (по меньшей мере) 15 мкг антигенного компонента, представляющего собой гемагглютинин, из каждого штамма, как измерено методом одномерной радиальной иммунодиффузии (8ΚΌ) (ί.Μ. \Уооб с! а1.: Ап ипргоусб кшд1с таб1а1 ппишпобЧГикюп (ссНпцщс Гот Нс аккау оГ тЛисп/а Ьастадд1ибшп апбдеп: абар!абоп Гог ро!спсу бйсттшабоп оГ шасЛуаЮб \\!ю1с уник апб киЬ|ипП уассшек. 1. ΒίοΙ. 8!апб. 5 (1977) 237-247; ί.Μ. \Уооб с! а1., 1йсгпабопа1 соПаЪогабус к1ибу оГ кшд1с таб1а1 бШикюп апб 1ттипое1сс1горНогск1К ЮсНпцщск Гог Не аккау оГ Ьастадд1ибтп апбдеп оГ тЛисп/а у1тик. ί. Вю1. 81апб. 9 (1981) 317330). Сообщалось также о квадривалентных вакцинах, содержащих в дополнение к трем классическим штаммам дополнительный штамм В (Соттип. Э1к. 1п!с11. 2006, 30, 350-357) или дополнительный штамм Η3Ν2 (Уассше 1992, 10, 506-511).

Межпандемические штаммы вируса гриппа для включения в вакцину против гриппа каждый сезон определяет Всемирная организация здравоохранения в сотрудничестве с национальными органами здравоохранения и производителями вакцин. Доступные в настоящее время межпандемические вакцины против гриппа считаются безопасными для всех возрастных групп (Эе ЭопаЮ с! а1. 1999, Уассше, 17, 30943101).

Тем не менее, на эффективность вакцины влияет возраст и иммунный статус реципиентов, а также соответствие вакцины циркулирующим штаммам вируса гриппа. Имеется немного оснований считать, что современные вакцины против гриппа работают у маленьких детей в возрасте до двух лет. Кроме того, уровни эффективности вакцин, о которых сообщают, для предупреждения типичной подтвержденной заболеваемости гриппом составляют 23-72% для пожилых людей, что значительно ниже, чем уровни эффективности 60-90%, о которых сообщалось для более молодых взрослых людей (СотасП. 1994, ί. Ат. Меб. Аккос, 21, 166-1665; Сгокк, 1995, Апп 1п1сгп. Меб. 123, 523-527). Было показано, что эффективность вакцины против гриппа коррелирует с сывороточными титрами ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ) антител к вирусному штамму, и в нескольких исследованиях было обнаружено, что пожилые люди демонстрируют меньшие титры ΗΙ антител после иммунизации вирусом гриппа по сравнению с более молодыми взрослыми людьми (Мигакко, 2002, Ехрсг1тсп1а1 дстоп1о1оду, 37, 427-439).

В межпандемические периоды в виде фона циркулируют вирусы гриппа, родственные вирусам из предыдущей эпидемии. Эти вирусы распространяются среди людей с варьирующими уровнями иммунитета против инфекций, перенесенных ранее в жизни. Такая циркуляция, обычно в течение периода 2-3 года, стимулирует отбор новых штаммов, которые изменились достаточно, чтобы вновь вызвать эпидемию среди всех слоев населения. Этот процесс называется антигенный дрейф. Дрейф-варианты могут иметь разные последствия в различных группах населения, регионах, странах или континентах в любой год, хотя в течение нескольких лет их общее воздействие часто является сходным. Типичные эпидемии гриппа вызывают увеличение заболеваемости пневмонией и болезнями нижних дыхательных путей, о чем свидетельствуют возросшие показатели госпитализации или смертности. Пожилые люди или индивидуумы с основными хроническими заболеваниями наиболее подвержены таким осложнениям, но и у маленьких детей заболевание также может протекать в тяжелой форме.

Через непредсказуемые промежутки времени появляются новые вирусы гриппа с ключевым поверхностным антигеном, гемагглютинином, совершенно другого подтипа по сравнению со штаммами, циркулирующими сезоном ранее. Здесь образующиеся антигены могут отличаться на 20-50% от соответствующего белка штаммов, которые ранее циркулировали у людей. Это явление, названное антигенным сдвигом, может приводить к тому, что вирус ускользает от коллективного иммунитета и порождает пандемию. Другими словами, пандемии гриппа возникают, когда появляется новый вирус гриппа, против которого популяция людей не имеет иммунитета. Полагают, что, по меньшей мере, последние пандемии возникли, когда вирус гриппа из другого вида, такой как вирус птичьего или свиного гриппа, перешагнул видовой барьер. Если такие вирусы могут распространяться от человека к человеку, то они могут распространиться по всему миру за период времени от нескольких месяцев до года, приводя к пандемии. Например, в 1957 году (пандемия азиатского гриппа) вирусы подтипа Η2Ν2 заменили вирусы Η1Ν1, которые циркулировали в человеческой популяции по меньшей мере с 1918 года, когда данный вирус был впервые выделен. Между 1957 и 1968 годами НА Н2 и ΝΑ N2 претерпевали антигенный дрейф до тех

- 2 024250 пор, пока в 1968 году (пандемия гонконгского гриппа) НА не был вытеснен появлением подтипа гриппа Η3Ν2, после чего ΝΑ N2 продолжила дрейф наряду с НА Н3 (Шкарта е! а1., 1991, Ер1Дет1о1. 1пГсс1. 106, 383-395).

Было проведено несколько клинических испытаний для оценки безопасности и иммуногенности в непримированных популяциях с моновалентными вакцинами-кандидатами, содержащими пандемический штамм, такой как не циркулирующие штаммы Η2Ν2 или Η9Ν2. В этих испытаниях исследовались препараты на основе расщепленных или цельных вирусов с разными концентрациями НА (1,9; 3,8; 3,8; 7,5 или 15 мкг НА на дозу) с адъювантом, представляющим собой квасцы, или без него. Вирусы гриппа подтипа Η2Ν2 циркулировали с 1957 до 1968 года, когда они были вытеснены штаммами Η3Ν2 во время гонконгской пандемии. Сегодня индивидуумы, которые родились после 1968 года, являются иммунологически наивными по отношению к штаммам Η2Ν2. Было показано, что эти вакцины-кандидаты являются иммуногенными и хорошо переносимыми. Результаты опубликованы в ΗеЬте, Ν е! а1. 2002, МеД. МюгоЪю1. 1ттипо1. 191, 203-208; в ΗеЬте Ν е! а1. 2004, Утк КекеагсЬ 103, 163-171; и было опубликовано два исследования с Η5Ν1 (Вгеккоп ЕЬ. е! а1. ТЬе Ьапсе!. 2006:367 (9523): 1657-1664; Тгеапог 1.1. е! а1. Ν Епд1 1 МеД. 2006; 354:1343-1351). В других публикациях сообщалось о результатах исследований с вакцинами против гриппа, содержащими адъювант МР59. В одном исследовании было показано, что две дозы вакцины, содержащей адъювант МР59, против гриппа Η5Ν3 повышали иммунитет к гриппу Η5Ν1 в примированной популяции (§(ерЬепкоп е! а1., Уассше 2003, 21, 1687-1693), а в другом исследовании сообщалось о перекрестных ответах антител на вирусы Η5Ν1, полученных после трех доз вакцины с адъювантом МР59 против гриппа Η5Ν3 (§(ерЬеп8оп е! а1., 1. 1пГес!. Охкеакек 2005, 191, 1210-1215).

Что касается осложнений вследствие сезонного гриппа, лица с повышенным риском заболевания в случае пандемии гриппа могут отличаться от определенных групп риска. Согласно ВОЗ у людей 50% случаев заболевания, вызванного штаммом Η5Ν1 птичьего гриппа, наблюдалось у людей в возрасте до 20 лет, 90% наблюдалось среди людей в возрасте до 40 лет (ВОЗ, еженедельная эпидемиологическая запись, 30 июня 2006 г.).

Во время пандемии имеющихся противовирусных средств может быть не достаточно для удовлетворения потребности или они могут быть неэффективными, и количество индивидуумов с повышенным риском заболеть гриппом больше, чем в межпандемические периоды, поэтому разработка подходящей вакцины, которую можно производить в больших количествах и эффективно распределять и вводить является важной. Один из путей заключается в том, чтобы быстро запустить производственные мощности для производства вакцины против пандемического гриппа. Однако, поскольку массовая вакцинация может начаться только после начала пандемии, в любом случае будут существенные задержки, вызванные тем, что для идентификации штамма и для выработки первой партии требуется время. Более того, будет иметь место фиксированный и поэтому ограниченный еженедельный выпуск вакцин производителями. Это означает, что существующий в настоящее время подход почти однозначно оставляет значительную часть населения вообще без защиты при возникновении пандемии. Вакцина для значительной части населения может стать доступной слишком поздно, и ожидается высокая смертность, по некоторым оценкам 180-360 миллионов смертей по всему миру.

Одним из путей решения этой существующей в настоящее время дилеммы является создание пандемической вакцины в преддверии пандемии и разработка моновалентной вакцины с наилучшим кандидатом пандемического штамма вместо тривалентных вакцин с целью уменьшения объема вакцины, в основном из-за того, что две дозы вакцины могут потребоваться для достижения защитных уровней антител у иммунологически наивных реципиентов (\УооД ЕМ. е! а1. МеД МпсоЪю1 1ттипо1. 2002; 191:197201. \УооД ЕМ. е! а1. РЫ1ок Тгапк К §ос ЬопД В Вю1 8ск 2001; 356:1953-1960). Эта вакцина затем может быть использована для накопления или для примирования населения в межпандемический период.

К сожалению, поскольку существующие в настоящее время производственные мощности полностью загружены в течение всего года производством сезонных тривалентных вакцин для ежегодной вакцинации в северном и южном полушариях, оба вышеупомянутых подхода нецелесообразны, поскольку отсутствуют дополнительные производственные мощности для получения этого самого лучшего кандидата пандемического штамма. Кроме того, следует отметить, что существует крайняя необходимость в поиске решения для восполнения нехватки межпандемических вакцин против гриппа, с которой регулярно приходится сталкиваться в периоды ежегодных сезонов гриппа. Одним из решений могло бы быть строительство дополнительных производственных мощностей, но на это потребуется несколько лет, что в любом случае нецелесообразно, если вспышка пандемии произойдет в ближайшие годы.

В настоящее время единственным способом быстро получить дополнительные мощности могло бы стать сокращение времени наработки ежегодной тривалентной вакцины. Периодическая нехватка вакцин против гриппа, возникающая каждый сезон в большинстве стран, препятствует оптимальному охвату населения, рассматриваемому как группа высокого риска развития тяжелого гриппозного заболевания и осложнений. Поскольку наработка антигена является фактором, ограничивающим скорость производства вакцин против гриппа, необходимо использовать альтернативные стратегии экономии антигена.

Некоторые подходы основаны на использовании адъювантов с целью повышения иммуногенности вакцины, чтобы иметь возможность снизить содержание антигена (экономия антигена) и, следовательно,

- 3 024250 увеличить число доступных доз вакцины. Использование адъюванта также может решить проблему потенциально слабой иммуногенности антигена у наивного населения. Было опубликовано несколько подходов. Были представлены примеры с использованием цельного инактивированного вируса Η2Ν2 или Η9Ν2 с солью алюминия в качестве адъюванта (Ν. Нейше е! а1. У1ги8 Кезеагсй 2004, 103, 163-171) или с использованием простой вакцины на основе субвириона Η5Ν1 или с вакцины на основе расщепленного вируса Η5Ν1 с адъювантом, представляющим собой гидроксид алюминия (Вгеззоп ТЕ е! а1. Тйе Ьапсе!. 2006:367 (9523): 1657-1664; Тгеапог 1.1. е! а1. Ν Εη§1 1 Меб. 2006; 354:1343-1351). Результаты этого последнего испытания указывают на то, что как простая, так и адъювантная вакцина на основе вируса Η5Ν1 являются безопасными при дозе антигена вплоть до 90 мкг (протестирована только простая субвирионная вакцина). Однако, применение такой высокой дозы антигена не совместимо со стратегией экономии антигена, которая важна в случае пандемии.

Субъединичная адъювантная противогриппозная адъювантная вакцина с адъювантом МР59 в виде эмульсии масло в воде коммерчески доступна для пожилых людей и населения, относящегося к группе риска, и она продемонстрировала свою способность индуцировать более высокий титр антител, чем титр, полученный с использованием неадъювантной субъединичной вакцины (Ие Иопа!о е! а1. 1999, Уассше, 17, 3094-3101). Однако, в более поздней публикации та же самая вакцина не продемонстрировала улучшенный профиль по сравнению с неадъювантной сплит-вакциной (Ршд-ВагЬега е! а1., 2004, Уассше 23, 283-289).

Таким образом, все еще имеется потребность в новых вакцинах, которые эффективны и решают вопрос экономии антигена. Эти новые вакцины должны обладать если не улучшенной, то приемлемой иммуногенностью, в частности против ослабленных или неиммуногенных пандемических штаммов или для индивидуумов с ослабленным иммунитетом, таких как пожилые люди. В идеале, эти новые вакцины должны обладать также потенциалом перекрестной защиты, так чтобы их можно было использовать в качестве препандемических или накапливаемых вакцин для примирования иммунологически наивной популяции против пандемического штамма до или после объявления пандемии.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что с целью улучшения снабжения вакцинами против гриппа могут быть разработаны новые эффективные иммуногенные противогриппозные препараты, которые содержат адъювант, с возможностью использования меньшего количества антигена вируса гриппа. Таким образом, предложены новые адъювантные композиции, использование которых делает возможным приготовление препарата с экономией антигена, обеспечивающего достаточную защиту всех возрастных групп с точки зрения опосредованного клетками иммунного ответа и/или гуморального ответа.

В частности, авторы изобретения установили, что такой препарат может быть основан на иммуногенных противогриппозных композициях, характеризующихся тем, что каждый или все индивидуальные компоненты адъюванта в иммуногенной композиции содержится/содержатся на более низком уровне по сравнению с уровнем, который ранее считался полезным. Это дает преимущество в том, что уровень иммуногенности против антигена сохраняется, а реактогенность в реципиенте-хозяине снижается.

Соответственно в первом аспекте настоящего изобретения предложена дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека в количестве от 0,2 до 1,5 мл, включающая антиген или антигенный препарат вируса гриппа, содержащий 15 мкг или менее 15 мкг гемагглютинина (НА) на штамм вируса гриппа, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде, где адъювант содержит (1) 5-6 мг сквалена, 2-3 мг эмульгатора и 5-7 мг токола на дозу для человека; (2) 2-3 мг сквалена, 1-1,5 мг эмульгатора и 2,5-3,5 мг токола на дозу для человека или (3) 0,5-1,5 мг сквалена, 0,25-0,75 мг эмульгатора и 0,5-1,5 мг токола на дозу для человека.

Предпочтительно, когда указанный эмульгатор представляет собой неионное поверхностноактивное вещество, более предпочтительно полиоксиэтилен-сорбитана моноолеат или сорбитана триолеат или их смесь.

Наиболее предпочтительно указанный полиоксиэтилен-сорбитана моноолеат выбран из группы, включающей в себя Ро1узогЬа! 80 или Т\\ееп® 80, и сорбитана триолеат представляет собой §рап85.

Предпочтительной является дозированная форма, как она определена выше, где указанный токол представляет собой альфа-токоферол.

Еще более предпочтительной является дозированная форма по изобретению, где адъювант дополнительно содержит лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК), выбранного из ТЬК-1, ТЬК-2, ТЬК-3, ТЬК-4, ТЬК-7, ТЬК-8, ТЬК-9 или их комбинации.

Предпочтительно, когда указанный лиганд ТЬК-4 выбран из производного липида А, которое представляет собой 3И-МРЬ (3-О-деацилированный монофосфориллипид А), ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетра-деканоиламино]-4-о-фосфоно-(в-О-глюкопиранозил]-2-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]-а-П-глюкопиранозилдигидрофосфат), ОМ 294 (ИР (3§,9К)-3-[(К)додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10диол, 1,10-бис(дигидрофосфат)) или ОМ 197 (МР-Ас ИР (3§,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат

- 4 024250

10-(6-аминогексаноат)), алкилглюкозаминидфосфатов (АОР) и химического соединения, выбранного из группы, включающей ЕК 803022, ЕК 803058, ЕК 803732, ЕК 804053, ЕК 804057, ЕК 804058, ЕК 804059, ЕК 804442, ЕК 804680 и ЕК 804764, раскрытые в описании.

Конкретными воплощениями дозированной формы согласно изобретению являются следующие: дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 10 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 8 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 4 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 2 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 1 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 0,5 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит 0,1 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит 2-7,5 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит 1 -5 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее или точно 5 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее или точно 2,5 мкг НА на штамм вируса гриппа;

дозированная форма, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее или точно 1 мкг НА на штамм вируса гриппа.

Одним из воплощений заявленного изобретения является дозированная форма, как она определена выше, в которой иммуногенный препарат является моновалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат из пандемического штамма.

Другим воплощением заявленной дозированной формы является дозированная форма, как она определена выше, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат, по меньшей мере, из двух штаммов вируса гриппа.

Еще одним воплощением заявленной дозированной формы является дозированная форма, как она определена выше, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат, по меньшей мере, из трех штаммов вируса гриппа.

Еще одним воплощением заявленной дозированной формы является дозированная форма, как она определена выше, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат, по меньшей мере, из четырех штаммов вируса гриппа.

Еще одним воплощением заявленной дозированной формы является дозированная форма, как она определена выше, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат, по меньшей мере, из пяти штаммов вируса гриппа.

Предпочтительно, когда в вышеуказанных воплощениях дозированной формы поливалентный иммуногенный препарат содержит вирусный антиген или антигенный препарат, по меньшей мере, из трех сезонных штаммов вируса гриппа (межпандемических). Наиболее предпочтительно, когда такой иммуногенный препарат содержит вирусный антиген или антигенный препарат, по меньшей мере, из одного пандемического штамма вируса гриппа.

Предпочтительно в вышеуказанных воплощениях вирус гриппа выбран из группы, состоящей из (1) двух штаммов А, выбранных из Η1Ν1 и Η3Ν2, и двух штаммов В, выбранных из В/уашада!а и Β/νίοΙοΓία; (2) трех штаммов А, выбранных из Η1Ν1 и Η3Ν2, и одного штамма В, выбранного из В/уашада!а или В/АсШпа; (3) двух штаммов А, выбранных из Η1Ν1 и Η3Ν2, одного штамма А Η5Ν1 и одного штамма В, выбранного из В/уашада!а и ВАюЮпа.

Пандемический штамм вируса гриппа предпочтительно выбран из группы, состоящей из Η5Ν1, Η9Ν2, Η5Ν8, Η5Ν9, Η7Ν4, Η7Ν7, Η2Ν2, Η10Ν7, Η5Ν2, Η7Ν2, Η7Ν1 и Η7Ν3.

В предпочтительном воплощении дозированной формы по настоящему изобретению антиген вируса гриппа или его антигенный препарат получен из вируса гриппа, выращенного на яйцах или на клеточной культуре.

Также предпочтительной является дозированная форма по изобретению, в которой антиген вируса гриппа или его антигенный препарат представлен цельным вирусом, расщепленным вирусом, виросомой или одним или более чем одним очищенным антигеном, выбранным из НА, ΝΑ, М1, М2. Более предпочтительно, когда указанный(е) очищенный(е) антиген(ы) получен(ы) из вируса гриппа, выращенного в

- 5 024250 клетках млекопитающего, птицы или насекомого.

Конкретными предпочтительными воплощениями дозированной формы согласно изобретению являются следующие:

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза составляет от 0,5 до 1,5 мл;

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза для человека составляет от 0,2 до 1,2 мл;

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза для человека составляет от от 0,2 до 0,7 мл;

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 0,25 мл;

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 0,5 мл;

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 0,7 мл;

дозированная форма, как она определена выше, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 1 мл.

Согласно изобретению также предложен способ приготовления дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа, как она определена выше, включающий стадию смешивания, по существу, равных объемов эмульсии типа масло в воде и водной суспензии, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат.

Согласно изобретению также предложен способ приготовления дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа, как она определена выше, включающий стадию смешивания эмульсии типа масло в воде и водной суспензии, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат, где объем водной суспензии больше, чем объем эмульсии.

В одном из воплощений предложенные способы включают стадию разведения эмульсии типа масло в воде водным носителем и затем смешивание полученной разведенной эмульсии с указанной водной суспензией антигена вируса гриппа.

Также в настоящем изобретении предложена вакцина, содержащая дозированную форму иммуногенного препарата по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Соответственно предложен также способ изготовления вакцины по изобретению, включающий стадию смешивания дозированной формы иммуногенного препарата, как она определена выше, с фармацевтически приемлемым эксципиентом.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение дозированной формы иммуногенного препарата, как она определена выше, для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа у людей.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение дозированной формы иммуногенного препарата, как она определена выше, для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа у людей, который представляет собой вариант вируса, из которого получен антиген, входящий в состав данного иммуногенного препарата.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа, как она определена выше, для ревакцинации индивидуумов, ранее вакцинированных указанным иммуногенным препаратом или вакциной по настоящему изобретению.

В конкретных воплощениях вышеуказанных аспектов индивидуумы выбраны из группы, состоящей из пожилых людей в возрасте 65 лет или старше, взрослых людей в возрасте 18-65 лет, детей в возрасте до 18 лет.

Более предпочтительно, когда индивидуумы представляют собой взрослых людей в возрасте 18-50 лет.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение вакцины по изобретению для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение вакцины по изобретению для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа, который представляет собой вариант вируса гриппа, из которого получен антиген, входящий в состав данной вакцины.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Клиническое испытание - средние геометрические титров (ОМТ) для антитела против НА в разные моменты времени (АТР когорта в отношении иммуногенности).

Фиг. 2. Клиническое испытание - уровень серозащиты (8РР) для титра ΗΙ антител с 95%-ным доверительным интервалом в день 0 и день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности).

Фиг. 3. Клиническое исследование - уровень сероконверсии (8СР) для титра ΗΙ антител с 95%-ным доверительным интервалом в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности).

Фиг. 4. Клиническое испытание - фактор сероконверсии (8СР) для титра ΗΙ антител с 95% доверительным интервалом в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности).

- 6 024250

Фиг. 5. Исследование на мышах - тест на ингибирование гемагглютинина (ОМТ +/-1С95) у мышей ВАЬВ/с, примированных гетеросубтипическими штаммами (диапазон доз А§03).

Фиг. 5А - титры ΗΙ антител против А/Иете Са1ейоша/20/99.

Фиг. 5В - титры ΗΙ антител против А/Рапата/2007/99 ΗΙ.

Фиг. 5С - титры ΗΙ антител против В/§Ьапбопд/7/97.

Фиг. 6. Исследование на мышах - тест на ингибирование гемагглютинина (ОМТ +/-1С95) у мышей С57В1/6, примированных гетеросубтипическими штаммами (диапазон доз А§03).

Фиг. 7. Исследование на мышах - клеточный иммунный ответ (СИ4+ Т-клетки) в РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) мышей С57В1/6, примированных гетеросубтипическими штаммами (диапазон доз А§03).

Фиг. 8. Исследование на мышах - клеточный иммунный ответ (СИ4+ Т-клетки) в РВМС мышей С57В1/6, примированных гетеросубтипическими штаммами и подвергнутых иммунизации низкой дозой антигена (0,5 мкг) с адъювантом в диапазоне доз А§03.

Фиг. 9. Исследование на мышах - титры ШИНспецифических сывороточных Ι§ в ЕЫ§А (твердофазный иммуноферментный анализ) (А и В) и !дО1 (С и И) и Ι§026 (Е и Р) изотипичекие ответы против Η5Ν1 в день 14 после иммунизации (ОМТ +/-ЙС95) для двух разных доз антигена: 1,5 мкг (А, С и Е) или 0,38 мкг (В, И и Р).

Фиг. 10. Исследование на мышах - тест на ингибирование гемагглютинации (ОМТ +/-ЙС95) в день 21 после иммунизации (ОМТ +/-ЙС95) для двух разных доз антигена: 1,5 мкг (А) или 0,38 мкг (В).

Фиг. 11. Исследование на мышах - клеточный иммунный ответ (СИ4+ Т-клетки) у наивных мышей С57ВЕ6, подвергнутых иммунизации разными дозами Η5Ν1 вакцины (1,5 или 0,38 мкг) с адъювантом в диапазоне доз А§03: (А) 1,5 мкг НА Ад (антиген) или (В) 0,38 мкг НА Ад (антиген).

Фиг. 12. Исследование на свиньях - тест на ингибирование гемагглютинина (ОМТ +/-ΙΟ95) у свиней, примированных гомологичными штаммами (диапазон доз А§03).

Фиг. 13. - тест на ингибирование гемагглютинина (ОМТ +/-ΙΟ95) у наивных мышей С57ВЕ6, подвергнутых иммунизации ТГУ или ΟΙν. простыми или с адъювантом А§03 или А803/2.

Фиг. 14 - тест на ингибирование гемагглютинина (ОМТ +/-ΙΟ95) у мышей С57ВЕ6, примированных В/ЩсШпа-подобным вирусом и подвергнутых иммунизации Ήν или ΟΙν, простыми или с адъювантом А803 или А803/2.

Фиг. 15. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта): ОМТ для титра ΗΙ антител в день 0 и день 21.

Фиг. 16. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у взрослых) - уровень серозащиты (8РК) для титра ΗΙ антител в день 0 и день 21.

Фиг. 17. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у взрослых): фиг. 17А - уровень сероконверсии (8СК) для титра ΗΙ антител в день 21 после иммунизации (ΡΙ(ΌΛΥ21)): фиг. 17В для возрастной категории.

Фиг. 18. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у взрослых): фиг. 18А - фактор сероконверсии (8СР) для титра ΗΙ антител в день 21 после иммунизации (РI(^АΥ21)): фиг. 18В - для возрастной категории.

Фиг. 19. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у пожилых): ОМТ для титра ΗΙ антител в день 0 и день 21.

Фиг. 20. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у пожилых) - уровень серозащиты (8РК) для титра ΗΙ антител с 95% доверительным интервалом день 0 и день 21.

Фиг. 21. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у пожилых) - уровень сероконверсии (8СК) для титра ΗΙ антител в день 21 после иммунизации (РI(^АΥ21)).

Фиг. 22. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у пожилых) - 8СР для титра ΗΙ антител с 95%-ным доверительным интервалом (С^ в день 21 (АТР когорта в отношении ΗΙ иммуногенности).

Фиг. 23. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у пожилых) - цитокинпозитивные СИ4 Т-клетки для объединенных штаммов в день 0 и день 21 (АТР когорта для СМI (клеточноопосредованный иммунитет)).

Фиг. 24. Клиническое испытание на людях (диапазон доз адъюванта у пожилых) - процент субъектов, сообщивших о связанных обычных и необычных симптомах (все степени/степень 3) в течение 7дневного (дни 0-6) периода после вакцинации (вся вакцинированная когорта).

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что адъювантная композиция, содержащая метаболизируемое масло, такое как сквален, эмульгатор и токол, где каждый компонент присутствует на более низком уровне на дозу вакцины для человека, чем использовали ранее, может улучшать иммунные ответы на противогриппозный препарат и в то же время иметь меньшую реактогенность по сравнению с некоторыми препаратами предшествующего уровня техники, в которых адъювантные компоненты присутствовали на более высоких уровнях (предпочтительно в 2 раза выше или более чем в 2 раза выше) на дозу для человека.

- 7 024250

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что противогриппозный препарат, содержащий вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом, как определено здесь, и возможно дополнительно с иммуностимуляторами, такими как производное липида А, например 3Б-МРЬ (3-Одеацилированный монофосфориллипид А), способен 1) улучшать СБ4-Т-клеточный иммунный ответ и/или гуморальный иммунный ответ на указанный антиген или антигенную композицию по сравнению с указанными ответами, достигаемыми с использованием вируса или его антигенного препарата без адъюванта, и/или 2) формировать СБ4-Т-клеточный иммунный ответ и/или гуморальный иммунный ответ на указанный антиген или антигенную композицию, сравнимый с указанными ответами, достигаемыми с использованием композиции с адъювантом, в которой каждый компонент присутствует на более высоком (предпочтительно в 2 раза выше или более чем в 2 раза выше) уровне. Препараты с адъювантом преимущественно применяют для индуцирования СБ4-Т-клеточных ответов на вирус гриппа, способных обнаруживать эпитопы вируса гриппа, презентируемые молекулами МНС класса II (молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II). Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что для того чтобы увеличить реактивность против гомологичных и дрейфующих штаммов вируса гриппа (после вакцинации и инфицирования), эффективным является направленное воздействие на клеточноопосредованную иммунную систему.

Дозированные формы иммуногенного препарата против гриппа для применения по настоящему изобретению способны обеспечивать у людей любое одно или оба из: (1) лучшая серозащита против вируса гриппа после ревакцинации по сравнению с композицией без адъюванта и (2) сравнимая серозащита против вируса гриппа после ревакцинации по сравнению с адъювантной композицией, где каждый компонент присутствует на более высоком уровне, оцениваемом по количеству субъектов-людей, удовлетворяющих любому, нескольким или всем коррелятам защиты от вируса гриппа (т.е. уровню сероконверсии, фактору конверсии, уровню защиты). Кроме того, в еще одном конкретном воплощении композиция для применения по настоящему изобретению также способна индуцировать любое одно или оба из: (1) более высокий ответ В-клеток памяти после первой вакцинации субъекта-человека и более высокий гуморальный ответ после ревакцинации по сравнению с композицией без адъюванта и (2) сравнимый ответ В-клеток памяти после первой вакцинации субъекта-человека и сравнимый гуморальный ответ после ревакцинации по сравнению с адъювантной композицией, где каждый компонент присутствует на более высоком (предпочтительно в 2 раза выше или более чем в 2 раза выше) уровне.

Адъювантные композиции против гриппа по изобретению имеют несколько преимуществ. Эти преимущества можно оценить путем сравнения с эквивалентными композициями без адъюванта или путем сравнения с адъювантной композицией, в которой каждый компонент адъюванта присутствует на более высоком уровне:

1) улучшенная иммуногенность по сравнению с композицией без адъюванта, обеспечивающая любое или все из следующих: 1) усиление слабого иммунного ответа на менее иммуногенные штаммы вируса гриппа до уровня, который выше, чем уровень, достигаемый с использованием препаратов без адъюванта; 2) восстановление слабого иммунного ответа у специфического населения, например у пожилых людей (в возрасте старше 50 лет, типично в возрасте старше 65 лет), до уровней, наблюдаемых у молодых людей (антительные и/или Т-клеточные ответы);

2) использование адъювантов может победить потенциально слабую иммуногенность антигена у наивного населения или у маленьких детей (от 6 месяцев до 4 лет, особенно у детей в возрасте до 1 года) и индуцировать примирование и защиту;

3) в дополнение, по меньшей мере, к эквивалентной защите от вакцинных штаммов по сравнению с классической вакциной (например коммерчески доступной расщепленной вакциной) они могут придавать дополнительный уровень защиты против дрейфующих штаммов, приводя к улучшенному профилю перекрестной защиты: повышенная перекрестная реактивность, перекрестная защита против варианта (дрейфующего) штаммов вируса гриппа, что дает возможность выстраивать стратегию перекрестного примирования; и особый интерес представляет их применение в качестве препандемических вакцин дополнительно, что позволяет использовать только одну дозу пандемической вакцины для усиления защиты от (циркулирующего) пандемического штамма; и это также представляет интерес, поскольку может решить проблему дрейфов Η3Ν2, которые имеют тенденцию появляться чаще, чем при другом межпандемическом штамме А Η1Ν1;

4) пониженный профиль реактогенности адъювантной композиции по сравнению с профилем, получаемым с использованием композиции, где каждый компонент присутствует на более высоком (предпочтительно в 2 раза выше или более чем в 2 раза выше) уровне с сохранением удовлетворительного иммуногенного потенциала.

Благодаря также достижению любого или всех этих преимуществ при уменьшенной дозировке антигена (обычно ниже 15 мкг/штамм/дозу) и уменьшенной дозировке адъюванта они обеспечивают увеличение способности в случае внезапной пандемической ситуации или пандемической ситуации, к которой готовы (экономия антигена при пандемии), и дает возможность обеспечить население в сезон межпандемической вакцинации большим количеством доз вакцины.

Комбинация уменьшенной дозы антигена и/или уменьшенной дозы адъюванта делает возможной

- 8 024250 разработку более сложных противогриппозных композиций, таких как квадривалентная вакцина, содержащая четвертый штамм, который может представлять собой второй штамм вируса гриппа В или штамм пандемического вируса гриппа, добавленный в стандартную тривалентную вакцину.

В еще одном аспекте изобретения адъювантная иммуногенная композиция, как она определена здесь, демонстрирует результаты иммуногенности в отношении продуцирования антител и частоты встречаемости после вакцинации специфических по отношению к вирусу гриппа (возможно перекрестно реактивных) СЭ4. которые больше чем или эквивалентны достигаемым с использованием вакцины без адъюванта или с использованием вакцины с адъювантом, в которой компоненты адъюванта присутствуют предпочтительно на более высоком уровне. Этот эффект особенно ценен у детского населения или пожилых людей, поскольку обеспечивает более высокую эффективность по сравнению с современными коммерческими вакцинами и одновременно показывают меньшие или более редкие симптомы реактогенности по сравнению с группой, получающей адъювантную вакцину, в которой компоненты адъюванта присутствуют в более высоком (предпочтительно в 2 раза более высоком) количестве.

Адъювант в виде эмульсии типа масло в воде.

Адъювант по настоящему изобретению представляет собой эмульсию, в частности эмульсию типа масло в воде, и возможно может содержать другие иммуностимуляторы. В частности, масляная фаза эмульсионной системы содержит метаболизируемое масло, такое как сквален. Значение термина метаболизируемое масло известно в данной области техники. Метаболизируемое может быть определено как способное трансформироваться в результате метаболизма (Лог1апй'5 Ши81га1ей Мейюа1 Оюйоиагу, А.В. §аийег8 Сотрапу, 251Н ейПюп (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или синтетическое масло, не токсичное для реципиента и способное трансформироваться в результате метаболизма. Обычно источниками растительных масел являются орехи, семена и зерно. Синтетические масла могут включать коммерчески доступные масла, такие как ΝΕΟВЕЕ® и другие. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое в больших количествах обнаружено в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом масле, масле зародышей пшеницы, масле рисовых отрубей и в дрожжах и является маслом для использования в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло, так как является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Мегск шйех, 101Н ЕЙ1йои, еШгу ио. 8619).

Эмульсии типа масло в воде сами по себе общеизвестны в данной области и были предложены для использования в адъювантных композициях (ЕР 399843 В). Комбинации эмульсий типа масло в воде и другие активные агенты также были описаны как адъюванты для вакцин в АО 95/17210, АО 98/56414, АО 99/12565, АО 99/11241, АО 2006/100109, АО 2006/100110, АО 2006/100111, в которых раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и ΤАЕЕN 80, возможно в составе с иммуностимуляторами 0821 и/или ЗО-МРЬ). Были описаны и другие адъюванты в виде эмульсии типа масло в воде, например адъюванты, раскрытые в АО 90/14837, АО 00/50006, АО 2007/080308, АО 2007/006939, которые все образуют масляные эмульсионные системы (в частности на основе сквалена) для образования альтернативных адъювантов и композиций по настоящему изобретению.

Эмульсия типа масло в воде по изобретению содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквален, и токол, например токоферол, в частности α-токоферол, и эмульгатор (или поверхностно-активное вещество, например неионное поверхностно-активное вещество ΤАЕЕN 80™ или Ро1у§огЬа1е 80).

Токолы (например витамин Е) также часто используются в адъювантах в виде масляных эмульсий (ЕР 0382271 В1, И8 5667784, АО 95/17210). Токолы, используемые в масляных эмульсиях (возможно эмульсиях типа масло в воде), по изобретению могут быть приготовлены как описано в ЕР 0382271 В1, причем токолы могут представлять собой дисперсии капель токола, возможно содержащие эмульгатор, возможно диаметром менее 1 мкм. Альтернативно, токолы можно использовать в комбинации с другим маслом для образования масляной фазы масляной эмульсии. Здесь описаны примеры масляных эмульсий, которые могут быть использованы в комбинации с токолом, например метаболизируемые масла, указанные выше.

Способ получения эмульсий типа масло в воде известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание масляной фазы с поверхностно-активным веществом, таким как раствор РВ8/ТАЕЕЖ0™, и последующую гомогенизацию с использованием гомогенизатора, и специалисту в данной области техники ясно, что для гомогенизации небольших объемов жидкости может быть подходящим способ, включающий двукратное пропускание смеси через иглу шприца. Равным образом, способ эмульгирования в микрофлюидизаторе (аппарат М1108 Мюгойшйюк, максимум 50 пропусканий, в течение периода времени 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (600 кПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85000 кПа)) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть достигнута рутинным экспериментированием, включающим проведение измерений образующейся эмульсии до тех пор, пока капли масла в препарате не достигнут требуемого диаметра.

- 9 024250

В эмульсии типа масло в воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, забуференный фосфатом физиологический раствор (ΡΒδ).

Размер капель масла, находящихся в стабильной эмульсии типа масло в воде, возможно составляет менее 1 мкм, может составлять, по существу, 30-600 нм, возможно, по существу, приблизительно 30500 нм в диаметре и возможно, по существу, 150-500 нм в диаметре, и в частности приблизительно 150 нм в диаметре, измеренном методом фотонкорреляционной спектроскопии. В этом отношении 80% капель масла по количеству должны иметь размер в пределах определенного диапазона возможно более 90% и возможно более 95% капель масла по количеству имеют размер в определенном диапазоне.

Предпочтительно указанная эмульсия имеет капли масла по меньшей мере 70% которых, предпочтительно по меньшей мере 80% по интенсивности имеют диаметр менее 1 мкм.

Изобретение характеризуется тем, что каждый или все индивидуальные компоненты адъюванта в дозированной форме иммуногенного препарата против гриппа присутствует(ют) на меньшем уровне по сравнению с уровнем, который ранее считался полезным, и типично является таким, как указано выше.

Конкретные подходящие дозированные формы содержат указанные ниже компоненты адъюванта в виде эмульсии м/в (масло в воде) в указанных количествах в конечном объеме дозы для человека (предпочтительно приблизительно 0,5 мл или приблизительно 0,7 мл) (табл. 1):

Таблица 1А

Конкретные адъюванты в виде эмульсии типа масло в воде по изобретению

	Адъювант А	Адъювант В	Адъювант Е	Адъювант Р	Адъювант С	Адъювант Н	Адъювант С	Адъювант 0
Эмульсия м/в *	125 мкл	100 мкл	83,33 мкл	62,5 мкл	50 Мкл	41,67 мкл	31,25 мкл	25 мкл
Компоненты:
Токоферол (мг)	5,94 (5,6-6,2)	4,75 (4,5-5,0)	3,96 (3,8-4,2)	2,97 (2,8-3,1)	2,38 (2,3-2,5)	1,98 (1,9-2.1)	1,49 (1,4-1,6)	1,19 (1,1- 1,25)
Сквален (МГ)	5,35 (5,1-5,6)	4,28 (4,1-4,5)	3,57 (3,4- 3,75)	2,68 (2,5-2,8)	2,14 (2,0- 2,25)	1,78 (1,7-1,9)	1,34 (1.3-1,4)	1,07 (1,0-1,1)
Ро1у$огЬа180 или Τννββη 80 (мг)	2,43 (2,3-2,6)	1,94 (1,8-2,0)	1,62 (1,5-1,7)	1,21 (1,1-1,3)	0,97 (0,9-1,0)	0,81 (0,8-0,9)	0,61 (0,58- 0,64)	0,49 (0,47- 0,51)

* подходящие объемы эмульсии м/в приведены для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения,

() в скобках указаны подходящие диапазоны (+/- 5%) около вышеуказанного значения.

Таблица 1В

Конкретные адъюванты на основе эмульсии типа масло в воде по изобретению

	Адъю- вант 1	Адъю- вант ϋ	Адъю- вант К	Адъю- вант I.	Адъю- вант М	Адъю- вант N	Адъю- вант О	Адъю- вант Р
Компоненты:
Зрап 85	0,59	0,47	0,39	0,29	0,24	0,2	0,15	0,12
(МГ)	(0,56-	(0,45-	(0,37-	(0,28-	(0,23-	(0,19-	(0,14-	(0,11-
	0,62)	0,49)	0,41)	0,3)	0,25)	0,21)	0,16)	0,13)
Сквален	4,88	3,9	3,25	2,44	1,95	1,63	1,22	0,98
(МГ)	(4,6-5,1)	(3,7-4,1)	(3,1-3,4)	(2,3-2,6)	(1,85- 2,05)	(1,55- 1,7)	(1,2-1,3)	(0,9-1,1)
Ро1у5ог0а180	0,59	0,47	0,39	0,29	0,24	0,2	0,15	0,12
или Т\уееп 80	(0,56-	(0,45-	(0,37-	(0,28-	(0,23-	(0,19-	(0,14-	(0,11-
(МГ)	0,62)	0,49)	0,41)	0,3)	0,25)	0,21)	0,16)	0,13)

	Адъю- вант О	Адъю- вант Р	Адъю- вант 3	Адъю- вант Т	Адъю- вант и	Адъю- вант V	Адъю- вант νν	Адъю- вант X
Компоненты:
Зрап 85	0,84	0,67	0,56	0,42	0,34	0,28	0,21	0,17
(мг)	(0,8-0,9)	(0,64- 0,7)	(0,53- 0,6)	(0,4- 0,44)	(0,32- 0,36)	(0,27- 0,3)	(0,2- 0,22)	(0,16- 0,18)
Сквален	4,88	3,9	3,25	2,44	1,95	1,63	1,22	0,98
(мг)	(4,6-5,1)	(3,7-4,1)	(3,1-3,4)	(2,3-2,6)	(1,85- 2,05)	(1,55- 1,7)	(1,2-1,3)	(0,9-1,1)
Ро1у$огЬа180	0,84	0,67	0,56	0,42	0,34	0,28	0,21	0,17
или Τννββη 80	(0,8-0,9)	(0,64-	(0,53-	(0,4-	(0,32-	(0,27-	(0,2-	(0,16-
(МГ)		0,7)	0,6)	0,44)	0,36)	0,3)	0,22)	0,18)

Следует иметь в виду, что все приведенные (например в % или в мг) численные значения, включая значения, приведенные в табл. 1, допускают вариацию 5%, т.е. 4,88 мг сквалена означает 4,64-5,12 мг.

Для получения адъювантной вакцины, которая доставляет требуемое количество НА и требуемое

- 10 024250 количество компонента, представляющего собой адъювант, может быть выполнено предварительное разведение каждого компонента (эмульсия м/в и антиген).

В одном из аспектов по изобретению эмульсия м/в адъювантной вакцины по изобретению (независимо от того, разведена она предварительно или нет) может быть добавлена в объеме, не превышающем или предпочтительно менее половины от общего объема дозы. Для иллюстрации подходящие объемы (например в пределах от 125 мкл до 25 мкл) приведены для эмульсионного компонента препаратов А-Н, проиллюстрированных в табл. 1А.

Дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа согласно изобретению может быть получена способом, включающим стадию смешивания эмульсии типа масло в воде и водной суспензии, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, где объем водной суспензии больше, чем объем эмульсии. Предпочтительно объем эмульсии м/в получают после разведения концентрированной эмульсии.

Альтернативно, для получения дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа по изобретению смешивают, по существу, равные объемы (после предварительного разведения или без предварительного разведения) эмульсии м/в и суспензии антигена. Соответственный объем каждого компонента в типичном случае тогда будет в максимальном избытке 10% по сравнению с другим компонентом (т.е. соотношение адъювант в виде эмульсии:суспензия антигена составляет от 1:1,1 до 1,1:1), предпочтительно в максимальном избытке 5% (т.е. соотношение эмульсия м/в:суспензия антигена составляет от 1:1,05 до 1,05:1), предпочтительно в максимальном избытке 2,5% (т.е. соотношение адъювант в виде эмульсии:суспензия антигена составляет от 1:1,025 до 1,025:1). Предпочтительно объем эмульсии м/в получают после разведения концентрированной эмульсии.

Во всех способах количества компонентов эмульсии и возможно НА в конечном объеме дозы для человека меньше, чем количества, которые ранее считались полезными, и представляют собой заявленные здесь количества. Предпочтительно они находятся в пределах заявленных здесь конкретных количеств.

Количество каждого индивидуального компонента в вакцине может быть выражено в процентах от общей вакцинной композиции, т.е. в % (об./об.) или в % (мас./об.). Следующие переводные численные значения известны специалисту в данной области и могут быть применены: сквален 0,855 г/мл, αтокоферол 0,949 г/мл, Ро1у8ОгЬа1 80 1,080 г/мл и 8рап 85 0,94 г/мл.

В некоторых случаях может быть предпочтительным, чтобы иммуногенные препараты и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества, включая каприловую кислоту (Мегск 1пбех 10¹¹' Εάίίίοη, епбу по. 1739), например ТпсаргуПп.

При объединении адъюванта в жидкой форме с жидкой формой антигенного препарата адъювантная композиция находится в подходящем объеме дозы для человека, который представляет собой долю предполагаемого конечного объема дозированной формы для применения у человека, например приблизительно половину предполагаемого конечного объема дозированной формы для человека, например объема 360 мкл для предполагаемой дозированной формы для человека 0,7 мл или объема 250 мкл для предполагаемой дозированной формы для человека 0,5 мл. Если доза вакцины для человека увеличивается, то предполагается, что количество (в мг) компонентов адъюванта остается неизменным в результате этого увеличения объема дозы, просто становится более разбавленным. Адъювантная композиция разбавляется, если необходимо, при объединении с антигенной композицией с получением конечной дозы вакцины для людей. Разумеется, конечный объем такой дозы будет варьировать в зависимости от исходного объема адъювантной композиции и объема антигенного препарата, добавляемого к адъювантной композиции.

В альтернативном воплощении жидкий адъювант используют для разведения лиофилизированного антигенного препарата. В этом воплощении подходящий объем дозы для человека адъювантной композиции приблизительно равен конечному объему дозированной формы для человека. Жидкую адъювантную композицию добавляют во флакон, содержащий лиофилизированный антигенный препарат. Конечная дозированная форма для человека может варьировать в пределах от 0,5 до 1,5 мл. В конкретном воплощении дозированная форма для человека приблизительно составляет 0,5 мл или приблизительно 0,7 мл.

Возможно, соотношение масло (например, сквален):токол (например, α-токоферол) равно или меньше 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию.

В некоторых случаях может быть предпочтительным, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.

Доза компонентов, в которой адъювант функционирует в дозированной форме иммуногенного препарата, предпочтительно способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящим количеством сквалена, токола и полиоксиэтиленсорбитана моноолеата является такое количество, которое повышает иммунологический потенциал препарата по сравнению с препаратом без адъюванта, или такое количество, которое дает иммунологический потенциал, сходный с потенциалом, дости- 11 024250 гаемым при использовании препарата с адъювантом, содержащим иное, более высокое количество указанных компонентов, в целевой популяции людей, и в то же время является приемлемым исходя из профиля реактогенности.

Возможные иммуностимуляторы.

В конкретном воплощении изобретения адъювант представляет собой адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, содержащий метаболизируемое масло, такое как сквален, токол, такой как αтокоферол, и поверхностно-активное вещество, такое как Ро1у8ОгЬа! 80, в указанных выше количествах, но не содержащий никакого(их) дополнительного(ых) иммуностимулятора(ов), в частности не содержащий нетоксичное производное липида А (такое как 3Ό-ΜΡΕ) или сапонин (такой как 0821).

В еще одном воплощении изобретения предложена дозированная форма иммуногенного препарата, содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, представляющую собой эмульсию типа масло в воде и возможно содержащую один или более дополнительных иммуностимуляторов.

В конкретном воплощении адъювант в виде эмульсии типа масло в воде возможно содержит один или более чем один дополнительный адъювант или иммуностимулятор, отличающийся от 0821 и/или МРЬ.

В еще одном конкретном воплощении адъювант в виде эмульсии типа масло в воде и иммуногенный препарат дополнительно содержат дополнительный иммуностимулятор, который представляет собой липополисахарид, предпочтительно нетоксичное производное липида А, в частности монофосфориллипид А или, еще более конкретно, 3-деацилированный монофосфориллипид Α (3Ό-ΜΡΕ). 3Ό-ΜΡΕ продается под названием МРЬ компанией С1ахо8тДЬК1ше ВюкщеаЬ Ν.Α. и упоминается в этом документе как МРЬ или 3Ό-ΜΡΕ (см., например, патенты США №№ 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094). 3Ό-ΜΡΕ прежде всего промотирует СЭ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΡΝ-γ (интерферон гамма) (ТЫ). 3Ό-ΜΡΕ может быть получен способами, раскрытыми в СВ 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В композициях по настоящему изобретению может быть использован 3Ό-ΜΡΕ с небольшим размером частиц. 3Ό-ΜΡΕ с небольшим размером частиц имеет такой размер частиц, что он может быть подвергнут стерильной фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Такие препараты описаны в νθ 94/21292.

Указанный липополисахарид, такой как 3Ό-ΜΡΕ, может быть использован в количествах от 1 до 50 мкг на дозированную форму иммуногенного препарата для человека. Такой 3Ό-ΜΡΕ может быть использован в количестве приблизительно 25 мкг, например 20-30 мкг, предпочтительно 21-29 мкг, или от 22 до 28 мкг, или от 23 до 27 мкг, или от 24 до 26 мкг, или 25 мкг. В еще одном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека содержит 3Ό-ΜΡΕ в количестве приблизительно 10 мкг, например от 5 до 15 мкг, предпочтительно от 6 до 14 мкг, например от 7 до 13 мкг, или от 8 до 12 мкг, или от 9 до 11 мкг, или 10 мкг. В еще одном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека содержит 3Ό-ΜΡΕ в количестве приблизительно 5 мкг, например от 1 до 9 мкг, или от 2 до 8 мкг, или предпочтительно от 3 до 7 мкг, или 4 и 6 мкг, или 5 мкг.

В еще одном воплощении в качестве возможного дополнительного иммуностимулятора используют синтетические производные липида А, некоторые из которых известны как агонисты ТЬК-4 (То11подобного рецептора), и они включают

ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетра-деканоиламино]-4-о-фосфоно-(вП-глюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-П-глюкопиранозилдигидрофосфат) (νθ 95/14026),

ОМ 294 ΌΡ (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис(дигидрофосфат) (νθ 99/64301 и νθ 00/0462),

ОМ 197 МР-Ас ΌΡ (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1 -дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (νθ 01/46127), но ими не ограничиваются.

Другие лиганды ТЬК4, которые могут быть использованы, представляют собой алкилглюкозаминидфосфаты (АСР), например раскрытые в νθ 9850399 или И8 6303347 (также раскрыты способы получения АСР), предпочтительно КС527 или КС529 или фармацевтически приемлемые соли АСР, раскрытые в и8 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК4, а некоторые являются антагонистами ТЬК4. Полагают, что оба полезны в качестве адъювантов.

Другими подходящими лигандами ТЬК-4, способными вызывать сигнальный ответ через ТЬК-4 (8аЬгое е! а1, Л 2003, р. 1630-5), являются, например, липополисахарид грамотрицательных бактерий и его производные или его фрагменты, в частности нетоксичное производное липополисахарида (ЬР8) (такое как 3Ό-ΜΡΕ). Другими подходящими агонистами ТЬК являются: белок теплового шока (Н8Р) 10, 60, 65, 70, 75 или 90, поверхностно-активный белок А, гиалуронановые олигосахариды, фрагменты гепарансульфата, фрагменты фибронектина, фибриногеновые пептиды и Ь-дефенсин-2, мурамилдипептид (ΜΌΡ) или белок Ρ респираторно-синцитиального вируса. В одном из воплощений агонист ТЬК представляет собой Н8Р 60, 70 или 90. Другие подходящие лиганды ТЬК-4 описаны в νθ 2003/011223 и в νθ

- 12 024250

2003/099195, такие как соединения I, II и III, раскрытые на страницах 4 и 5 \УО 2003/011223 или на страницах 3 и 4 \УО 2003/099195, и в частности те соединения, которые раскрыты в \УО 2003/011223 как ЕК 803022, ЕК 803058, ЕК 803732, ЕК 804053, ЕК 804057, ЕК 804058, ЕК 804059, ЕК 804442, ЕК 804680 и ЕК 804764. Предпочтительно указанный лиганд ТЬК-4 представляет собой ЕК 804057.

То11-подобные рецепторы (ТЕК) представляют собой трансмембранные рецепторы типа I, эволюционно консервативные между насекомыми и людьми. До настоящего времени установлены десять ТЬК (ТЬК 1-10) (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). Члены семейства ТЬК обладают схожими внеклеточными и внутриклеточными доменами. Было показано, что их внеклеточные домены имеют богатые лейцином повторяющиеся последовательности, а их внутриклеточные домены подобны внутриклеточной области интерлейкинового рецептора 1 (ГЪ-БК). ТЬК-клетки экспрессируются дифференциально среди иммунных клеток и других клеток (включая клетки сосудистого эпителия, адипоциты, сердечные миоциты и клетки кишечного эпителия). Внутриклеточный домен ТЬК может взаимодействовать с адаптерным белком Муб88, который также имеет домен [Л-1К в своей цитоплазматической области, приводя к ΝΡ- кВ активации цитокинов. Этот Муб88-путь представляет собой один из путей, по которому на высвобождение цитокинов влияет активация ТЬК. Основная экспрессия ТЬК осуществляется в типах клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки (например, дендритные клетки, макрофаги и т.д.).

Активация дендритных клеток путем стимуляции через ТЬК приводит к созреванию дендритных клеток и продуцированию воспалительных цитокинов, таких как [Л-12. Проведенные до настоящего времени исследования выявили, что ТЬК распознает разные типы агонистов, хотя некоторые агонисты являются общими для нескольких ТЬК. Агонисты ТЬК преимущественно имеют происхождение из бактерий или вирусов и включают молекулы, такие как флагеллин или бактериальный липополисахарид (ЬР8). Под агонистом ТЬК подразумевается компонент, который способен вызывать сигнальный ответ через ТЬК сигнальный путь либо как прямой лиганд, либо опосредованно через образование эндогенного или экзогенного лиганда (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5).

В еще одном воплощении другие природные или синтетические агонисты молекул ТЬК используются в качестве возможных дополнительных иммуностимуляторов. Они могут включать агонисты ТЬК2, ТЬК3, ТЬК7, ТЬК8 и ТЬК9, но не ограничиваются ими.

Соответственно в одном из воплощений адъювант и иммуногенный препарат дополнительно содержат дополнительный иммуностимулятор, который выбран из группы, состоящей из агониста ТЬК-1, агониста ТЬК-2, агониста ТЬК-3, агониста ТЬК-4, агониста ТЬК-5, агониста ТЬК-6, агониста ТЬК-7, агониста ТЬК-8, агониста ТЬК-9 или их комбинации.

В одном из воплощений настоящего изобретения используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-1 (ЗаЬтое е! а1., Л 2003 р1630-5). Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-1, выбран из три-ацилированных липопептидов (ЬР), растворимого в феноле модулина, МусоЬас!етшт 1иЬегси1о515 ЬР, 8-(2,3-бис(пальмитоилокси)-(2-К8)-пропил)^пальмитоил-(К)-Су5-(8)-8ег-(§)-Ьу8(4)-ОН, тригидрохлорида (Рат₃Сук) ЬР, который имитирует ацетилированный аминоконец бактериального липопротеина и ОкрА ЬР из Воттейа ЬигдбогГек

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-2 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-2, представляет собой один или более чем один из следующих: липопротеин, петидогликан, бактериальный липопептид М !иЬегси1о818, В ЬигдбогГегк Т раШбит; пептидогликаны видов, включающих 8!арйу1ососсик аитеик; липотейхоевые кислоты, маннуроновые кислоты, порины №ίκкепа, бактериальные пилусы, факторы вирулентности иерсинии, вирионы СМУ (цитомегаловируса), коревой гемагглютинин и зимозан из дрожжей.

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-3 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-3, представляет собой двухцепочечную РНК (б8КNА) или полиинозиновуюполицитидиловую кислоту (Ро1у Ю), молекулярный паттерн нуклеиновой кислоты, ассоциирующийся с вирусной инфекцией.

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-5 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-5, представляет собой бактериальный флагеллин.

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-6 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5).

Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-6, представляет собой микобактериальный липопротеин, ди-ацилированный ЬР и растворимый в феноле модулин. Агонисты ТЬК6 описаны также в \УО 2003043572.

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-7 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-7, представляет собой одноцепочечную КNА (88КNА), локсорибин, гуанозиновый аналог в позициях Ν7 и С8, или имидазохинолиновое соединение, или его производное. В одном из воплощений агонист ТЬК представляет собой имиквимод. Агонисты ТЬК7 описаны также в \УО

- 13 024250

02085905.

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЙК-8 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). Предпочтительно агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЙК-8, представляет собой одноцепочечную ΚΝΑ (δδΚΝΑ), имидазохинолиновую молекулу, обладающую противовирусной активностью, например резиквимод (К848); резиквимод также способен распознаваться ТЬК-7. Другие агонисты ТЙК-8, которые могут быть использованы, описаны в АО 2004071459.

В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЙК-9 (8аЬгое е! а1., Л 2003, р. 1630-5). В одном из воплощений агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-9, представляет собой Н8Р90. Альтернативно, агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ через ТЬК-9, представляет собой бактериальную или вирусную ДНК, ДНК, содержащую неметилированные СрО нуклеотиды, в частности контексты последовательности, известные как мотивы СрО. СрО-содержащие олигонуклеотиды вызывают преимущественно ТЬ1 ответ. Такие олигонуклеотиды общеизвестны и описаны, например, в АО 96/02555, АО 99/33488 и в патентах США №№ 6008200 и 5856462. Предпочтительно СрО нуклеотиды представляют собой СрО олигонуклеотиды. Подходящие олигонуклеотиды для использования в иммуногенных композициях по настоящему изобретению представляют собой СрО-содержащие олигонуклеотиды, возможно содержащие два или более динуклеотидных мотивов СрО, разделенных по меньшей мере тремя, предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрО представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. СрО олигонуклеотиды по настоящему изобретению типично представляют собой дезоксинуклеотиды. В конкретном воплощении промежуточный нуклеотид в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоат или предпочтительно фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфирные и другие межнуклеотидные связи входят в объем изобретения. Также в объем изобретения входят олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы продуцирования фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоата описаны в И8 5666153, И8 5278302 и АО 95/26204. Примеры предпочтительных олигонуклеотидов имеют приведенные ниже последовательности, и эти последовательности могут содержать фосфоротиоатные модифицированные межнуклеотидные связи

ОЛИГО 1 (ЗЕО ГО N0:1): ТСС АТО АСО ТТС СТО АСО ΤΤ (СрС 1826)

ОЛИГО 2 (ЗЕО ГО N0:2): ТОТ ССС АСС СТО СОС САТ (СрС 1758)

ОЛИГО 3 (ЗЕО ГО N0:3): АСС 6АТ САС СТС ССС СОТ САС ССС АСС АСС ОЛИГО 4 (ЗЕО ГО N0:4): ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ СТС ОТТ (СрС 2006 или 7909)

ОЛИГО 5 (ЗЕО ГО N0:5): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668)

ОЛИГО 6 (ЗЕО ГО N0:6): ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрО 5456).

Предпочтительно используют фосфоротиоатный скелет СрО7909 (8Е0 ГО NО:4). Альтернативные СрО олигонуклеотиды могут содержать последовательности, указанные выше, при том, что они имеют несущественные делеции или добавления. СрО Олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области (см., например, ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды удобно синтезировать с использованием автоматического синтезатора.

В изобретении раскрыты также адъювант и иммуногенный препарат, которые дополнительно содержат адъювант сапонин. Особенно подходящим сапонином для использования в настоящем изобретении является 0ιιί1 Α, а также его производные. 0ш1 А представляет собой препарат сапонина, выделенного из южно-американского дерева ОиШща заропапа шойпа, и впервые он был описан Эайдаагй е! а1. в 1974 г. (8аропш айщуапЦ;. ΑτοΗίν. 1ит й1е §езат!е УццзРотзсЬипд, Уо1. 44, 8рппдет Ует1а§, Ветйп, р. 243254) как обладающий адъювантной активностью. Очищенные фрагменты 0ш1 А были выделены методом НРЙС (высокоэффективная жидкостная хроматография), позволяющим сохранять адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с 0ш1 А (ЕР 0362278), например Р87 и Р821 (также известные как 0Α7 и 0Α21). 08-21 является природным сапонином, получаемым из коры 0ш11а|а заропапа тойпа, который индуцирует СГО8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), Тй1-клетки и преобладающий 1§О2а-антительный ответ, и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения. В подходящей форме настоящего изобретения сапониновый адъювант в иммуногенном препарате представляет собой производное 8аропапа тойпа ций А, такое как иммунологически активная фракция Οιιίΐ А, например Р8-17 или 08-21, предпочтительно 08-21. В одном из воплощений дозированная форма по изобретению содержат иммунологически активную фракцию сапонина, по существу, в чистой форме. В одном из воплощений композиции по изобретению содержат 0821, по существу, в чистой форме, то есть Р821 с чистотой по меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%.

Другие полезные сапонины получают из растений Аезси1из Ырросаз!апцт или ОуорйШа з!ти!йшт. Другие сапонины, которые описаны в литературе, включают эсцин, который описан в Мегск 1пйех (12^!Ьей: еп!гу 3737), в виде смеси сапонинов, присутствующей в семени конского каштана, йа!: Аезси1из Ырросаз!апит. Описано его выделение хроматографией и очисткой (Р1ей1ет, Аг/пеипШеЕЕогзсЬ. 4, 213 (1953)) и с использованием ионообменных смол (ЕтЬппд е! а1., И8 3238190). Фракции эсцина были очищены, и было показано, что они являются биологически активными (УозЫкатеа М, е! а1. (СЬет РЬатт Ви11 (Токуо) 1996 Ац§;44(8): 1454-1464)). Сапоальбин из ОурзорЬШа з!ти!Ьшт (К. УосЬ!еп е! а1., 1968, 1.

- 14 024250

Ркагт.Ве1д., 42, 213-226) также представляет собой один из вариантов.

Указанный иммунологически активный сапонин, такой как 0821. может быть использован в количествах от 1 до 50 мкг на дозированную форму иммуногенного препарата для человека. Предпочтительно 0821 используют в количестве приблизительно 25 мкг, например 20-30 мкг, предпочтительно 21-29 мкг, или 22-28 мкг, или 23-27 мкг, или 24-26 мкг, или 25 мкг. В еще одном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека содержит 0821 в количестве приблизительно 10 мкг, например от 5 до 15 мкг, предпочтительно 6-14 мкг, например 7-13 мкг, или 8-12 мкг, или 9-11 мкг, или 10 мкг. В дополнительном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека содержит 0821 в количестве приблизительно 5 мкг, например 1 -9 мкг, или 2-8 мкг, или предпочтительно 3-7 мкг, или 4-6 мкг, или 5 мкг.

Доза 3Ό-ΜΡΕ и/или 0821 предпочтительно способна усиливать иммунный ответ у человека на антиген. В частности, подходящее количество 3Ό-ΜΡΕ и/или 0821 представляет собой такое количество, которое повышает иммунологический потенциал препарата по сравнению с препаратом без адъюванта или по сравнению с препаратом, адъювантированным другим количеством 3Ό-ΜΡΕ или 0821, и в то же время остается приемлемым исходя из профиля реактогенности. Обычно для введения человеку сапонин (например 0821) и/или производное ЬР8 (например 3Ό-ΜΡΕ) присутствует в дозированной форме иммуногенного препарата человека в пределах от 1 до 200 мкг, например от 10 до 50 мкг или от 1 до 25 мкг на дозу.

В изобретении раскрыт адъювант и иммуногенные препараты, которые содержат сапонин (например, 0821) и/или производное ЬР8 (например, 3Ό-ΜΡΕ) в описанной выше масляной эмульсии вместе со стеролом (например, холестерином). Эти стеролы общеизвестны в данной области. Например, холестерин раскрыт в Уегск 1пбех, 111Ь Ебп., раде 341 как природный стерол, содержащийся в животном жире. Дополнительно, масляная эмульсия (в частности эмульсия типа масло в воде) может содержать 8рап 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию типа масло в воде, стерол и сапонин, описаны в \УО 99/12565. Примеры дополнительных иммуностимуляторов описаны здесь и в Уассше Эеыдп - ТЬе 8иЪиш1 апб ЛбщуаШ АрргоасЬ 1995, ΡЬа^тасеиΐ^са1 Вю1есЬпо1оду, Уо1ите 6, Εάδ. Но^еП, Μ.Ρ., апб Ые^тап, Μ.Ε, Ρ1еηит ΡΐΌ5Ε Ыете Уогк апб Ьопбоп, Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х.

Если в состав препарата включены сквален и сапонин (возможно Ц821), то лучше также включать в состав препарата стерол (возможно холестерин), поскольку это дает возможность снизить общий уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости производства, улучшению общего комфорта вакцинации, а также к качественному и количественному улучшению результирующих иммунных ответов, таких как повышенное продуцирование ΙΡΝ-γ. Соответственно адъювантная система по настоящему изобретению обычно содержит метаболизируемое масло и сапонин в соотношении метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, и настоящее изобретение также можно использовать в форме с низким содержанием масла, возможный диапазон в которой составляет от 1:1 до 200:1, возможно от 20:1 до 100:1 или, по существу, 48:1, и эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов при значительно уменьшенном профиле реактогенности. Соответственно некоторые воплощения имеют соотношение сквален:Ц821 (мас./мас.) в диапазоне от 1:1 до 250:1, или от 20:1 до 200:1, или от 20:1 до 100:1, или, по существу, 48:1. Возможно, стерол (например, холестерин) также присутствует в соотношении сапонин:стерол, как описано здесь.

Адъюванты, в которые возможно включен дополнительный иммуностимулятор, являются особенно подходящими для вакцинных препаратов, предназначенных для детей и/или пожилых людей.

Таким образом, в настоящем изобретении раскрыт адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, который возможно может дополнительно содержать 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Ό-ΜΡΕ). Адъювант в виде эмульсии типа масло в воде возможно может содержать 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерола (например, холестерина), 1-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 1-10, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Ό-ΜΡΕ или любого синтетического производного липида А) и 1-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 1-10, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, Ц821).

Штаммы вируса гриппа и антигены вируса гриппа, режимы вакцинации, введение доз и критерии эффективности.

Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат может быть продуцирован на яйце или на культуре клеток. Например, антиген вируса гриппа или антигенные препараты по изобретению могут быть получены стандартным способом с использованием оплодотворенных яиц путем выращивания вируса гриппа в яйцах и очистки собранной аллантоисной жидкости. Яйца могут быть аккумулированы в больших количествах за короткий срок. Альтернативно, они могут быть получены любым из способов нового поколения с использованием клетки или клеточной культуры для выращивания вируса или для экспрессии рекомбинантных поверхностных антигенов вируса гриппа. Подходящие клеточные субстраты для выращивания данного вируса включают, например, клетки почки собаки, такие как ΜΟΤΊΕ или клетки из клона ΜΟΤΊΕ ΜΗΟΚ-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как клетки ΑΟΜΚ, включая клетки Уего, подходящие клеточные линии свиньи или любой другой тип клеток млекопитаю- 15 024250 щих, подходящий для продуцирования вируса гриппа с целью получения вакцины. Подходящие клеточные субстраты также включают человеческие клетки, например клетки МРС-5, или клеточную линию Рег.Сб. Подходящие клеточные субстраты не ограничиваются линиями клеток. Например, они также включают первичные клетки, такие как фибробласты куриного эмбриона, или линии клеток птиц, такие как линии клеток цыпленка или утки (например, линию клеток ЕВх, такую как ЕВ14 или ЕВ24, из эмбриональных стволовых клеток цыпленка или утки соответственно). Подходящими клетками насекомых являются клетки 8Г9 или Ηί5.

В одном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат для применения по настоящему изобретению может представлять собой расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат расщепленного вируса. В альтернативном воплощении противогриппозный препарат может содержать антиген инактивированного вируса гриппа другого типа, например инактивированный цельный вирус или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина) или виросому гриппа. В еще одном дополнительном воплощении вирус гриппа может представлять собой живой аттенуированный противогриппозный препарат.

Расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат расщепленного вируса для применения по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой препарат инактивированного вируса, где вирусные частицы расщеплены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки. Расщепленный вирус или антигенные препараты расщепленного вируса предпочтительно получают путем фрагментации цельного вируса гриппа, либо инфекционного, либо инактивированного, органическими растворителями или детергентами в солюбилизирующих концентрациях и последующим удалением всего или большей части солюбилизирующего агента и некоторой или большей части вирусного липидного вещества. Под антигенным препаратом расщепленного вируса подразумевается препарат расщепленного вируса, который возможно был подвергнут очистке до некоторой степени по сравнению с расщепленным вирусом с сохранением большей части антигенных свойств компонентов расщепленного вируса. Например, при продуцировании в яйцах расщепленный вирус может быть очищен от загрязняющих белков яйца или при продуцировании в культуре клеток расщепленный вирус может быть очищен от загрязняющих веществ клеток-хозяев. Антигенный препарат расщепленного вируса может содержать антигенные компоненты расщепленного вируса из более чем одного вирусного штамма. Вакцины, содержащие расщепленный вирус (называемые сплит-вакциной против гриппа), или антигенные препараты расщепленного вируса обычно содержат остаточный матриксный белок и нуклеопротеин и иногда липид, а также мембранные оболочечные белки. Такие сплит-вирусные вакцины обычно будут содержать большую часть или все структурные белки вируса, хотя не обязательно в таких же соотношениях, в которых они присутствуют в цельном вирусе. Примерами коммерчески доступных расщепленных вакцин являются, например, РЬиАР1Х™, ΡΙυδΗΙΕΕΌ™ или ΡΕυΖΘΝΕ™.

Альтернативно, вирус гриппа может быть в форме цельновирусной вакцины. Эта вакцина может иметь преимущество по сравнению со сплит-вирусной вакциной в пандемической ситуации, так как это исключает неопределенность относительно того, можно ли успешно получить сплит-вирусую вакцину для нового штамма вируса гриппа. Для некоторых штаммов традиционные детергенты, используемые для продуцирования расщепленного вируса, могут повреждать вирус и делать его непригодным для применения. Несмотря на то что всегда существует возможность использования других детергентов и/или разработки другого способа получения сплит-вакцины, это потребовало бы времени, которого может не быть в пандемической ситуации. Помимо большей степени определенности при цельновирусном подходе имеет место также более высокая мощность производства вакцины, чем для расщепленного вируса, поскольку во время дополнительных стадий очистки, необходимых для получения подходящей сплитвакцины, теряются значительные количества антигена.

В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме очищенной субъединичной вакцины против гриппа. Субъединичные вакцины против гриппа обычно содержат два главных оболочечных белка, НА и ΝΑ, и могут иметь дополнительное преимущество над цельновирионными вакцинами, так как они обычно являются менее реактогенными, особенно у молодых вакцинируемых субъектов. Субъединичные вакцины могут быть получены либо рекомбинантно, либо могут быть очищены из расщепленных вирусных частиц. Примерами коммерчески доступных субъединичных вакцин являются, например, АОРГРРАЬ™ или ΡΕυνίΡΙΝ™. В конкретном воплощении субъединичные вакцины получают по меньшей мере из одного основного оболочечного компонента, например из гемагглютинина (НА), нейраминидазы (ΝΑ) или М2, предпочтительно из НА. Предпочтительно они содержат комбинации двух или более антигенов, например комбинацию по меньшей мере двух структурных белков вируса гриппа НА, ΝΑ, Мабтх 1 (М1) и М2, предпочтительно комбинацию НА и ΝΑ, возможно содержащую М1. Предпочтительно компоненты вакцины против гриппа получают методом рекомбинантных ДНК, т.е. в результате манипуляций с рекомбинантной ДНК, или экспрессируются из нуклеиновой кислоты, являющейся результатом манипуляций с рекомбинантной ДНК, включая живой рекомбинантный вектор (коровья оспа) или рекомбинантный субъединичный белок (бакуловирус/клетки насекомых, клетки млекопитающих, клетки птиц, дрожжи, растения или бактерии). Подходящими клетками насекомых являются клетки 8ро6ор1ега Ггидрегба (§Г9) или клетки насекомых Ηί§1ι РАе (Ηί5), созданные из ТпсНорРМа ηί

- 16 024250 (1пуПгодеп), и подходящим бакуловирусом является вирус ядерного полиэдроза ЛиЮдгарка саПГогшса (Ас№^ (Васи1одо16, Всс1оп ОюкПъоп, РйагМшдеп) или так называемая система ВастШ.

В одном из воплощений препарат вируса гриппа находится в форме виросомы. Виросомы представляют собой сферические однослойные везикулы, которые сохраняют функциональные гликопротеины НА и ΝΑ вирусной оболочки в аутентичной конформации, включенные в двухслойную фосфолипидную мембрану виросом. Примерами коммерчески доступных виросомальных вакцин являются, например, ШЕкЕХЛкУ™ или ΙΝνΑνΑΟ™

В еще одном воплощении субъединичные компоненты вируса гриппа экспрессируются в форме вирусоподобных частиц (\ЪР) или капсомеров, предпочтительно УЙР, получаемых из растений или клеток насекомых. АЪР презентируют антигены в их нативной форме. Технология субъединичных АЪР может быть полностью основана на белках вируса гриппа или может быть основана на другом вирусе, таком как вирус мышиной лейкемии (МЬУ), и поэтому может содержать антиген, не являющийся антигеном вируса гриппа, такой как белок ΜΣν дад. Подходящий νΕ-Р содержит по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два белка вируса гриппа возможно с другими белками вируса гриппа или белками, не являющимися белками вируса гриппа, например М1 и НА, НА и ΝΑ, НА, ΝΑ и М1 или НА, ΝΑ и ΜΣν дад. Он может продуцироваться либо в клетках растений, либо в клетках насекомых. УЪР также могут нести антигены из более чем одного штамма вируса гриппа, например УЙР, полученные к примеру из двух сезонных штаммов (например Η1Ν1 и Η3Ν2) или из одного сезонного и одного пандемического штамма (например Η3Ν2 и Η5Ν1).

Соответственно в одном из воплощений иммуногенный препарат по изобретению содержит антиген вируса гриппа или его антигенный препарат из вируса гриппа, выращенного на яйцах или на клеточной культуре. В еще одном воплощении указанный антиген вируса гриппа или его антигенный препарат содержит цельный вирус, расщепленный вирус, виросому или один или более чем один очищенный антиген, выбранный из НА, ΝΑ, М1, М2. В еще одном воплощении указанный(е) очищенный(е) антиген(ы) получают из вируса гриппа, выращенного в клетках млекопитающих, птиц или насекомых. Конкретно, указанный(е) очищенный(е) антиген(ы) продуцируют рекомбинантно. Они могут находиться в форме вирусоподобной частицы.

Антиген вируса гриппа или его антигенный препарат могут быть получены любым из множества промышленных способов, например способом с использованием расщепленного вируса гриппа, описанного в патентах ΌΌ 300833 и ΌΌ 211444, которые включены в данное описание посредством ссылки. Традиционно расщепленный вирус гриппа получают, используя обработку растворителем/детергентом, таким как три-н-бутилфосфат или диэтиловый эфир в комбинации с Т\уееп™ (известную как Т\уеепэфирное расщепление), и этот способ до сих пор используется на некоторых промышленных предприятиях. Другие используемые в настоящее время расщепляющие агенты включают детергенты, или протеолитические ферменты, или соли желчной кислоты, например дезоксихолат натрия, как описано в патенте ΌΌ 155875, который включен в данное описание посредством ссылки. Детергенты, которые могут быть использованы в качестве расщепляющих агентов, включают катионные детергенты, например цетилтриметиламмония бромид (СТАВ), другие ионные детергенты, например лаурилсульфат, тауродезоксихолат, или неионные детергенты, такие как детергенты, описанные выше, включая Тгйоп X100 (например, в способе, описанном в Ипа е! а!., 2000, ВЫодюай 28, 95-103) и Тгйоп Ν-101, или комбинации любых двух или более детергентов.

Способ изготовления сплит-вакцины может включать целый ряд различных стадий фильтрации и/или других стадий разделения, например стадии ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, зонального центрифугирования и хроматографии (например, ионообменной) в различных комбинациях и возможно стадию инактивирования, например, нагреванием, формальдегидом или р-пропиолактоном или УФ (ультрафиолетом), которые можно проводить до или после расщепления. Способ расщепления может быть осуществлен как периодический, непрерывный или полунепрерывный процесс. Подходящий способ расщепления и очистки для сплит-иммуногенной композиции описан в АО 02/097072.

Подходящие антигенные препараты сплит-вакцины против гриппа по изобретению содержат остаточное количество Т\уееп 80 и/или ТгПоп Х-100, оставшихся после осуществления процесса получения, хотя их можно добавлять, или их концентрации можно довести до нужного значения после получения расщепленного антигена. В одном воплощении присутствуют и Т\уееп 80, и Тгйоп Х-100. Предпочтительными диапазонами конечных концентраций этих неионных поверхностно-активных веществ в дозе вакцины, обусловленной антигенным препаратом, являются:

Т\уееп 80 от 0,01 до 1% или приблизительно 0,1% (об./об.),

Тгйоп Х-100 от 0,001 до 0,1% (мас./об.) или от 0,005 до 0,02% (мас./об.).

В конкретном воплощении конечная концентрация Тетееп 80, обусловленная антигенным препаратом, варьирует в пределах от 0,025 до 0,09% (мас./об.). В другом конкретном воплощении предусмотрен антиген в виде 2-кратной концентрированной смеси, в которой концентрация Т\уееп 80 составляет от 0,025 до 0,2% (мас./об.), и которая нужно разбавлять в два раза при окончательном приготовлении препарата с адъювантом (или буфером в контрольном препарате).

- 17 024250

В другом конкретном воплощении конечная концентрация Τήΐοη Х-100 варьирует в пределах от 0,005 до 0,017% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген присутствует в виде 2-кратной концентрированной смеси, которая имеет концентрацию Τήΐοη Х-100, варьирующую в пределах от 0,005 до 0,034% (мас./об.), и которая должна быть разбавлена в два раза при приготовлении конечного препарата с адъювантом (или с буфером в контрольном препарате).

В одном из воплощений получают препарат вируса гриппа, в котором тиомерсал присутствует на низком уровне или в котором тиомерсал отсутствует. В другом воплощении полученный препарат вируса гриппа является стабильным в отсутствие ртутьорганических консервантов. В частности, данный препарат не содержит остаточный тиомерсал. В частности, препарат вируса гриппа содержит антиген гемагглютинин, стабилизированный в отсутствие тиомерсала или при низких уровнях тиомерсала (обычно 5 мкг/мл или менее). Конкретно, стабилизацию штамма гриппа В осуществляют производным αтокоферола, таким как сукцинат α-токоферола (также известный как сукцинат витамина Е, т.е. УЕ§). Такие препараты и способы их получения раскрыты в νΟ 02/097072.

Предпочтительный препарат содержит три инактивированных антигена расщепленного вириона, полученных из штаммов гриппа соответствующего сезона, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения (νΗΟ).

В одном из воплощений вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант по изобретению содержатся в одном и том же контейнере. Это называется в одном флаконе. В еще одном воплощении флакон представляет собой предварительно заполненный шприц. В альтернативном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант по изобретению содержатся в отдельных контейнерах или флаконах и смешиваются непосредственно перед или при введении субъекту. Это называется в двух флаконах. Предпочтительно 2-компонентная вакцина состоит из 0,5 мл концентрированных антигенов инактивированного расщепленного вириона, находящегося в стеклянном флаконе типа I (контейнер с антигеном), и предварительно заполненного стеклянного шприца типа I, содержащего 0,5 мл адъюванта (контейнер с адъювантом). Альтернативно, вакцина представляет собой двухкомпонентную вакцину, находящуюся в 2 флаконах (один для антигена, один для адъюванта, по 10 доз в каждом) для смешивания перед введением первому пациенту в течение 24 ч при комнатной температуре и последующего хранения при 4°С в течение короткого периода времени (например до одной недели) для последующего введения. В момент инъекции содержимое многодозового флакона или шприца, содержащего адъювант, впрыскивают во флакон, содержащий концентрированный антиген расщепленного вириона. После смешивания содержимое отбирают в шприц и иглу меняют на внутримышечную иглу. Одна доза разведенной адъювантной вакцины-кандидата против гриппа соответствует 0,5 мл.

В одном из воплощений каждая доза иммуногенного препарата для человека содержит 15 мкг НА на штамм вируса гриппа на дозу, как определено методом δΚΙΌ (одномерная радиальная иммунодиффузия). Это особенно подходит для пожилого населения.

Важным аспектом настоящего изобретения является то, что антиген(ы) вируса гриппа может(гут) быть использован(ы) в меньших количествах по сравнению с количествами, которые ранее считались полезными, предпочтительно на уровне менее 15 мкг НА на штамм вируса, например от 1 до 10 мкг НА на штамм на дозу иммуногенного препарата для человека.

Соответственно в одном из воплощений каждая доза иммуногенного препарата для человека содержит небольшую дозу гемагглютинина (НА), определяемую как количество менее 15 мкг НА на дозу, предпочтительно менее 10 мкг по результатам измерения методом одномерной радиальной иммунодиффузии (δΚϋ) (ЕМ. νοοά е1 а1.: 1. ΒίοΙ. δίαηά. 5 (1977) 237-247; 1. М. νοοά е1 а1., 1. ΒίοΙ. δίαηά. 9 (1981) 317-330). В конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека содержит дозу гемагглютинина (НА) на штамм на уровне приблизительно 10 мкг, например от 5 до 15 мкг, предпочтительно от 6 до 14 мкг, например от 7 до 13 мкг ,или от 8 до 12 мкг, или от 9 до 11 мкг, или 10 мкг. В дополнительном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека содержит дозу гемагглютинина (НА) на штамм на уровне приблизительно 5 мкг, например от 1 до 9 мкг, или от 2 до 8 мкг, или предпочтительно от 3 до 7 мкг, или 4 и 6 мкг, или 5 мкг. Подходящие количества составляют 1,9, 2,5, 3,8, 5,0, 7,5, или 10 мкг НА, или любое подходящее количество НА, менее 15 мкг, которое определяется исходя из условия, что вакцинная композиция удовлетворяет критериям эффективности, которые сформулированы здесь. Предпочтительно может быть использована доза НА 1 мкг или еще меньшая, такая как 0,5 мкг НА, которая соответствует нормативным критериям, указанным в табл. 2. Подходящим количеством НА являются, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 мкг (мас./об.) на штамм вируса гриппа на дозу иммуногенной композиции для человека. Указанное небольшое количество НА может быть настолько малым, насколько оно может быть практически осуществимым при условии, что дает возможность изготавливать вакцину, которая удовлетворяет международным критериям эффективности, например критериям эффективности Европейского союза (ЕЙ) или Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (ΡΌΆ), которые подробно изложены ниже (см. табл. 2 и указанные конкретные параметры).

Предпочтительно использовать дозу вакцины 0,5 мл. Подходящей также является доза вакцины 1

- 18 024250 мл (препарат, содержащий 0,5 мл адъюванта плюс 0,5 мл антигена). Предпочтительно доза вакцины по изобретению, в частности вакцина с низким содержанием НА, может быть предоставлена в меньшем объеме по сравнению с традиционными инъецируемыми вакцинами на основе расщепленного вируса гриппа, которые, как правило, составляют приблизительно 0,5, 0,7 или 1 мл на дозу. Малообъемные дозы согласно изобретению соответственно составляют менее 500 мкл, типично меньше 300 мкл и предпочтительно не более чем приблизительно 200 мкл или менее на дозу. Небольшую корректировку объема дозы на практике осуществляют в зависимости от концентрации НА в исходном образце или в зависимости от пути доставки, причем меньшие дозы вводят интраназальным или интрадермальным путем, или в зависимости от целевого населения (например дети могут получать половину дозы для взрослого человека).

Предпочтительно штамм или штаммы вируса гриппа, включаемые иммуногенную композицию или вакцинную композицию, представляет(ют) собой межпандемический(ие) (сезонный(ые)) штамм(ы) или штамм(ы), ассоцированный(ые) с вспышкой пандемии или ассоциированный со вспышкой пандемии или предрасположенный(ые) к тому, чтобы ассоциироваться со вспышкой пандемии, или предпочтительно в поливалентной композиции смесь этих штаммов.

Межпандемические штаммы представляют собой, например, штаммы, которые глобально циркулируют на протяжении межпандемических периодов, такие как Η1Ν1, Η1Ν2, Η3Ν2 или В, но не ограничиваются ими. Коммерчески доступные вакцины против гриппа представляют собой тривалентную комбинацию, включающую один штамм вируса гриппа В и два штамма вируса гриппа А (Η1Ν1, Η3Ν2).

Особенностями штамма вируса гриппа, которые дают ему возможность вызывать пандемию или вспышку заболеваемости вирусом гриппа, связанную с пандемическими штаммами вируса гриппа, являются следующие: штамм содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином в циркулирующих на данный момент штаммах, и поэтому почти все люди являются иммунологически наивными; он способен передаваться в популяции людей от человека к человеку; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин представляет собой гемагглютинин, который не проявлялся в популяции людей в течение длительного периода времени, вероятно в течение нескольких десятилетий, такой как Н2. Или он может представлять собой гемагглютинин, который ранее не циркулировал в популяции людей, например Н5, Н9, Н7 или Н6, которые обнаружены у птичьих видов (у птиц). В любом случае, большинство, или, по меньшей мере, значительная доля, или даже вся популяция ранее не сталкивалась с данным антигеном и является иммунологически наивной в отношении его. В настоящее время вирус гриппа А, который идентифицирован νΗΟ как вирус, который потенциально может вызвать у людей пандемию, представляет собой высокопатогенный вирус птичьего гриппа Η5Ν1. Таким образом, пандемическая вакцина по изобретению предпочтительно должна содержать вирус Η5Ν1. Два других штамма, подходящих для включения в заявленную композицию, представляют собой Η9Ν2 или Η7Ν1.

Некоторые группы людей обычно имеют повышенный риск инфицирования вирусом гриппа в случае пандемии. Особенно восприимчивы пожилые люди, люди, страдающие хроническими болезнями, и маленькие дети, но риск также имеют многие молодые и явно здоровые люди. Для вируса гриппа Н2 часть населения, родившаяся после 1968 года, имеет повышенный риск. Важно, чтобы эти группы были эффективно защищены по возможности быстро и простым путем.

Другая группа людей, которая имеет повышенный риск, это путешественники. В настоящее время люди путешествуют больше, чем раньше, и области, где возникают самые новые вирусы, а именно Китай и юго-восточная Азия в течение последних лет превратились в популярные места для путешествий. Это изменение картины путешествий дает новым вирусам возможность распространяться по всему миру за недели, а не за месяцы или года.

Таким образом, для этих групп людей существует особая необходимость в вакцинации для защиты от вируса гриппа в случае пандемии или потенциальной пандемии. Подходящими штаммами, без ограничений, являются Η5Ν1, Η5Ν8, Η5Ν9, Η7Ν4, Η9Ν2, Η7Ν7, Η7Ν3, Η2Ν2 и Η7Ν1. Другие пандемические штаммы у людей: Η7Ν3 (2 случая в Канаде), Η10Ν7 (2 случая в Египте) и Η5Ν2 (1 случай в Японии) и Η7Ν2. Штамм вируса гриппа, который представляет собой пандемический штамм или штамм, ассоциированный с пандемией, для краткости в этом документе называется пандемическим штаммом.

Соответственно лекарственное средство против гриппа по изобретению удовлетворяет определенным международным критериям для вакцин. Для измерения эффективности вакцин против гриппа применяются международные стандарты. Серологические переменные оценивают согласно критериям Европейского агентства по оценке медицинских продуктов для людей (СΗМР/ВVР/214/96, Комитет по патентованным медицинским продуктам (СРМР). №1е Гог Ьагтош/аРоп оГ гесцйгетеШк Гог тЛиеп/а уассшек, 1997, СΗМР/ВVР/214/96 с1гси1аг №96-0666:1-22) для клинических испытаний, относящихся к ежегодным процедурам лицензирования вакцин против гриппа (табл. 2). Эти требования разные для взрослого населения (18-60 лет) и пожилого населения (старше 60 лет) (табл. 2). Для межпандемических вакцин против гриппа по меньшей мере одна из оценок (фактор сероконверсии, уровень сероконверсии, уровень серозащиты) должна удовлетворять европейским требованиям для всех штаммов гриппа, включенных в вакцину. Доля титров, равных или больше 1:40, рассматривается как наиболее релевантная, поскольку ожидается, что эти титры представляют собой наилучший коррелят защиты [Веуег Vе! а1. 1998, С1ш Игид Тиуек!., 15:1-12].

- 19 024250

Согласно ОшбеНпе оп бо881ег 81гис1иге апб соШеп! Гог рапбепнс тЛиеп/а уассзпе тагкеНпд аи1йоп8аНоп аррНсаЛоп (СНМР/УЕО/4717/03, 5 апреля 2004) или более позднему

ЕМЕЛ/СНМР/УШР/263499/2006 от 24 января 2007 года под названием Ошбе1те8 оп Г1и уассте8 ргерагеб Ггот У1ги8е8 У11й а ро1епНа1 1о саи8е а рапбетю, доступному на сайте \с\с\с.етеа.еи.т1), в отсутствие конкретных критериев для вакцин против гриппа, получаемых из не циркулирующих штаммов, предполагается, что пандемическая вакцина-кандидат (по меньшей мере) должна быть способна вызывать иммунологические ответы, достаточные для удовлетворения всем трем действующим стандартам, установленным для существующих вакцин, у непримированных взрослых или пожилых субъектов после двух доз вакцины. В ЕМЕА ОшбеНпе описана ситуация, когда в случае пандемии население является иммунологически наивным, и поэтому предполагается, что пандемические вакцины-кандидаты должны удовлетворять всем трем критериям СНМР для сезонных вакцин. Никакого определенного требования доказывать это у превакцинированных серонегативных субъектов нет.

Вакцины по настоящему изобретению предпочтительно удовлетворяют по меньшей мере одному такому критерию для пандемического штамма, включенного в данную композицию (одного критерия достаточно, чтобы получить разрешение), предпочтительно по меньшей мере двум или типично по меньшей мере всем трем критериям защиты, которые указаны в табл. 2А.

Таблица 2А

Критерии СНМР

	18-60 лет	старше 60 лет
Уровень сероконверсии*	>40%	>30%
Фактор конверсии**	>2,5	>2,0
Уровень защиты***	>70%	>60%

* - уровень сероконверсии определяют как долю субъектов в каждой группе, имеющих защитный титр после вакцинации не менее 1:40. Уровень сероконверсии просто выражают в % субъектов, которые имеют титр Н1 менее 1:10 до вакцинации и не менее 1:40 после вакцинации. Однако, если исходный титр больше или равен 1:10, то должно быть по меньшей мере четырехкратное увеличение количества антитела после вакцинации.

** - фактор конверсии определяют как кратное увеличение средних геометрических значений титров (ОМТ) сывороточных Н1 антител после вакцинации для каждого вакцинного штамма.

*** - уровень защиты определяют как долю субъектов, которые были либо серонегативными до вакцинации и имеющими (защитный) титр Н1 после вакцинации не менее 1:40, либо серопозитивными до вакцинации и имеющими значимое 4-кратное увеличение титра после вакцинации; это общепризнанный показатель защиты.

Уровень серозащиты 70% определяется Европейским регулирующим органом здравоохранения (СНМР - СоттШее Гог Мебюта1 Ргобис-18 Гог Нитап И8е (Комитет по медицинским продуктам для применения у человека) как один из трех критериев, которым обычно удовлетворяет ежегодная сезонная вакцина против гриппа и которым, как ожидает СНМР, также удовлетворяет пандемическая вакцинакандидат. Однако, математическое моделирование показало, что вакцина, которая на уровне популяции является только на 30% эффективной против некоторых дрейф-вариантов штаммов, также может быть полезной для снижения масштаба пандемии, и что кампания по вакцинации в ситуации пандемии с использованием (препандемической) вакцины с 30% эффективностью против пандемического штамма (перекрестная защита на 30%) может эффективно снижать уровень клинической атаки на 75% и, следовательно, заболеваемость/смертность среди населения (Регдц8оп е1 а1., №1иге 2006).

ΡΌΑ опубликовало проект руководства (проектные критерии СВЕК (Центр биологической оценки и исследований)) (доступен из ОГйсе оГ Соттцшсайоп, Тгаттд апб МапиГас1игег8 Α88^8ίапсе (НРМ-40), 1401 КоскуШе Р|ке, 5ийе 200Ν, КоскуШе, МО 20852-1448, или при звонке на номер 1-800-835-4709 или 301-827-1800, или в Интернете на сайте Н11р.7/\с\\лс.Гба.с]оу/сЪег/с]шбеПпе8.Н1т) по клиническим данным, необходимым для подтверждения лицензирования пандемических вакцин против гриппа, и предлагаемые критерии также основаны на критериях СНМР. ΡΌΑ использует несколько иные возрастные точки отсечки. Соответствующие конечные показатели аналогичным образом включают 1) процент субъектов, у которых достигается титр Н1 антител не менее 1:40 и 2) уровни сероконверсии, определяемые как четырехкратное увеличение титра Н1 антител после вакцинации. Среднее геометрическое титра (ОМТ) должно быть включено в результаты, но данные должны включать не только точечную оценку, но и нижнюю границу 95%-ного доверительного интервала инцидентного уровня сероконверсии, и в день 42 уровень инцидентности титров Н1 не менее 1:40 должен превышать целевое значение. Таким образом, должны быть приведены эти данные и 95%-ные доверительные интервалы (С1) точечных оценок. Проект руководства, опубликованный ΡΌΑ, требует того, чтобы достигались обе цели. Это суммировано в табл.

2В.

Таблица 2В

Проектные критерии СВЕК

	18-64 года	старше 64 лет
Уровень сероконверсии *	>40%	>30%
Уровень титров ΗΙ не менее 1:40	>70%	>60%

- уровень сероконверсии определяется а) для субъектов с исходным

- 20 024250 титром не менее 1:10 как 4-кратное или более увеличение или б) для субъектов с исходным титром менее 1:10 как увеличение до 1:40 или более.

Эти критерии должны соблюдаться на нижней границе 95% С1 для истинного значения.

Соответственно в одном аспекте данного изобретения предложена вакцина, способ или применение, как они здесь заявлены, где указанный иммунный ответ или защита, индуцированные введением рассматриваемой композиции против гриппа, удовлетворяют всем трем регулирующим критериям Ευ по эффективности вакцины против гриппа. Предпочтительно штамм или каждый штамм вакцины удовлетворяет по меньшей мере одному, предпочтительно двум или трем из следующих критериев:

уровень сероконверсии более 50%, более 60%, более 70%, предпочтительно более 80% или более 90% у взрослого населения (в возрасте 18-60 лет) и/или предпочтительно также у пожилого населения (в возрасте старше 60 лет);

уровень защиты более 75%, более 80%, более 85%, предпочтительно более 90% у взрослого населения (в возрасте 18-60 лет) и/или предпочтительно также у пожилого населения (в возрасте старше 60 лет);

фактор конверсии более 4,0; более 5,0; более 6,0; более 7,0; более 8,0; более 9,0; или 10 или более 10 у взрослого населения (в возрасте 18-60 лет) и/или предпочтительно также у пожилого населения (в возрасте старше 60 лет).

В конкретном воплощении вакцина по изобретению удовлетворяет как требованию по уровню сероконверсии более 60%, или более 70%, или предпочтительно более 80%, так и требованию по уровню защиты более 75%, предпочтительно более 80% у взрослого населения. В другом конкретном воплощении композиция по данному изобретению удовлетворяет как требованию фактора конверсии более 5,0, или более 7,0, или предпочтительно более 10,0, так и требованию уровня сероконверсии более 60%, или более 70%, или предпочтительно более 80% у взрослого населения. В другом конкретном воплощении композиция по изобретению удовлетворяет требованиям и фактора конверсии 10,0 или более, и уровня сероконверсии 80% или более, и уровня защиты 80% или более.

В другом воплощении заявленная вакцина, предпочтительно препандемическая вакцина, содержащая пандемический штамм или штамм, ассоциированный с пандемией, имеет 30%-ную эффективность против циркулирующего пандемического штамма (перекрестная защита на 30%). В частности, заявленная вакцина будет удовлетворять требованию уровня серозащиты по меньшей мере 30% против дрейфвариантов штаммов, предпочтительно по меньшей мере 40%, или более 50%, или более 60% против дрейф-вариантов штаммов. Предпочтительно уровень серозащиты будет составлять более 70% или предпочтительно более 80% против дрейф-вариантов штаммов. Указанная препандемическая вакцина, способная обеспечивать перекрестную защиту, способна значительно снижать общий уровень атаки инфекции по меньшей мере на 50% или предпочтительно по меньшей мере на 75% и, следовательно, заболеваемость/смертность среди населения.

В еще одном воплощении заявленная адъювантная вакцина способна индуцировать выработку нейтрализующих антител по меньшей мере у 50% субъектов, по меньшей мере у 60%, предпочтительно по меньшей мере у 70% или предпочтительно у более чем 75% субъектов против дрейфующего штамма или штамма из другой монофилетической группы. Предпочтительно этот эффект достигается с использованием низкой дозы антигена, например 7,5 мкг НА, или еще меньшей дозы антигена, такой как 3,8 мкг или 1,9 мкг НА.

Предпочтительно любой или все такие критерии также удовлетворяются в других группах населения, таких как дети, и в любых группах населения с ослабленным иммунитетом.

В одном из аспектов изобретения доза иммуногенной композиции для человека содержит гемагглютинин (НА) единственного штамма вируса гриппа и упоминается как моновалентная композиция против гриппа. В еще одном аспекте изобретения доза иммуногенной композиции для человека содержит гемагглютинин (НА) из более чем одного штамма вируса гриппа и упоминается как поливалентная композиция против гриппа. Подходящая поливалентная композиция по изобретению представляет собой бивалентную композицию (содержащую гемагглютинин (НА) из двух штаммов вируса гриппа, таких как, но не исключительно, два штамма, ассоциированных с пандемиями или предрасположенных к тому, чтобы ассоциироваться с пандемией, например Н5=Н2), тривалентную композицию (содержащую гемагглютинин (НА) из трех штаммов вируса гриппа, возможно двух штаммов А и одного штамма В, например, без ограничений, В/уатада!а или В/У1с!опа), квадривалентную композицию (содержащую гемагглютинин (НА) из четырех штаммов вируса гриппа) или пентавалентную композицию (содержащую гемагглютинин (НА) из пяти штаммов вируса гриппа). Подходящая квадривалентная композиция содержит гемагглютинин из двух штаммов А и двух штаммов В из различных линий (таких как В/уатада!а или В/У1с!опа). Альтернативно, квадривалентная композиция содержит гемагглютинин из трех штаммов А (возможно Η1Ν1, Η3Ν2 и один штамм А, ассоциированных с пандемий или предрасположенный к тому, чтобы ассоциироваться с пандемией) и одного штамма В (такого как В/уатада!а или В/У1с!опа). Еще одна альтернативная квадривалентная композиция содержит гемагглютинин из четырех штаммов А, ассоциированных с пандемией или предрасположенных к тому, чтобы ассоциироваться с пандемией, таких

- 21 024250 как штаммы птичьего гриппа, например Н5+Н2+Н7+Н9. Конкретно, поливалентная адъювантная пандемическая композиция, например пандемическая бивалентная (например, Н5+Н2), или тривалентная, или квадривалентная (например, Н5+Н2+Н7+Н9) обеспечивает преимущество превентивной иммунизации против опасных подтипов пандемического вируса гриппа А и длительного примирования против опасных подтипов. Обычно две дозы вводят с возраста 6 недель с использованием обычной схемы (например, с интервалом 6-12 месяцев) и возможно предусмотренную периодическую ревакцинирующую дозу (например 10 лет). Возможно, такая пандемическая вакцина может быть объединена с сезонной вакциной.

Поливалентная композиция также может содержать более 5 штаммов вируса гриппа, например 6, 7, 8, 9 или 10 штаммов вируса гриппа.

Когда в поливалентной сезонной композиции используются два штамма В, это могут быть штаммы из двух разных линий (возможно, из В/Щсйогйа и В^атадайа). По меньшей мере один из указанных штаммов В, предпочтительно оба штамма В являются штаммами из циркулирующей линии. Такая композиция особенно подходит для детей. Предпочтительно, когда поливалентная композиция для применения у детей включает в себя два штамма В, тогда количество антигена, обычно приходящееся на штамм В, распределяется между двумя штаммами В. Конкретно, квадривалентная (Н1+Н3+обе линии В) вакцина против гриппа с адъювантом дает преимущество, заключающееся в улучшении профилактики наивных детей, благодаря ее превосходной эффективности по сравнению с вакцинами без адъюванта (с точки зрения защиты от гомологичного и дрейфующего штамма и ее эффективности против двух циркулирующих линий В) и возможной круглогодичной иммунизации с учетом возраста. Одну дозу или две дозы предпочтительно вводят в возрасте 6 недель или в возрасте от 6 до 35 месяцев.

В конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека представляет собой тривалентный иммуногенный или вакцинный препарат, содержащий гемагглютинин (НА) из двух штаммов А (возможно Η1Ν1, Η3Ν2) и один штамм В. Предпочтительно количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно 10 мкг НА на штамм или меньше) и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Адъювант является таким, как определено в данном описании и, в частности, как определено в табл. 1. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1узогЬай 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1узогЬай 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно. Эти адъювантные иммуногенные препараты или вакцины особенно подходят для взрослого населения (18-60 лет) или старших детей (3-17 лет) и могут обеспечивать перекрестную защиту от дрейфующих вариантов Η3Ν2 и от штамма В из другой линии.

В еще одном конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека представляет собой квадривалентную иммуногенную или вакцинную композицию, содержащую гемагглютинин (НА) из двух штаммов А (возможно Η1Ν1, Η3Ν2) и двух штаммов В (возможно из разных линий, например В/Щсйогйа и В^атадайа). Предпочтительно количество НА на штамм на дозу составляет приблизительно 15 мкг. Предпочтительно количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно приблизительно 10 мкг НА на штамм на дозу или меньше, чтобы достигалось максимум 40-45 мкг НА на дозу) и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Адъювант является таким, как определено в данном описании и, в частности, как определено в табл. 1. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1узогЬай 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1узогЬай 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно. Такая композиция, содержащая второй штамм В, особенно подходит для совсем маленьких детей, особенно когда важно заблаговременное воздействие или примирование. Адъювант обеспечивает преимущество повышенной защиты для этой группы населения. Доза иммуногенной композиции для детей предпочтительно составляет половину дозы для взрослых людей и предпочтительно составляет 2,5 мкг НА на штамм, при этом эмульсия типа масло в воде содержит сквален, α-токоферол и Ро1узогЬай 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно.

Альтернативно, указанный дополнительный штамм В предпочтительно с характеристиками и в количестве, которые определены выше в отношении квадривалентного препарата, может быть добавлен в форме моновалентного препарата в тривалентный препарат, как описано выше. Использование небольшого количества НА, такого как 10 мкг или меньше или 5 мкг или меньше, или, возможно, для младших детей 2,5 мкг или меньше, может обеспечить преимущество ограниченного влияния добавленного штамма вируса гриппа на глобальные поставки вакцины. Предпочтительно, когда два штамма В включены в вакцинную композицию, тогда количество антигена, обычно предусмотренное для штамма В, распределяется между двумя штаммами В.

В еще одном конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека

- 22 024250 представляет собой квадривалентную иммуногенную или вакцинную композицию, содержащую гемагглютинин (НА) из двух межпандемических штаммов А (возможно Η1Ν1, Η3Ν2), одного штамма В и одного штамма А, ассоциированного с пандемий или предрасположенного к тому, чтобы ассоциироваться с пандемией (возможно Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7, Η5Ν8, Η5Ν9, Η7Ν4, Η7Ν3, Η2Ν2, Η10Ν7, Η5Ν2, Η7Ν2 и Η7Ν1). Предпочтительно количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно 10 мкг НА на штамм или меньше) и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Адъювант является таким, как определено в данном описании и, в частности, как определено в табл. 1. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8ОгЬа1: 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8ОгЬа1: 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно.

В еще одном конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека представляет собой квадривалентную иммуногенную или вакцинную композицию, содержащую гемагглютинин (НА) из трех межпандемических штаммов А (возможно Η1Ν1 и два штамма Η3Ν2) и одного штамма В. Предпочтительно количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно 10 мкг НА на штамм или меньше) и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Адъювант является таким, как определено в данном описании и, в частности, как определено в табл. 1. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8ОгЬа1: 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8ОгЬа1 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно. Такая композиция, содержащая третий сезонный штамм А, особенно подходит для самых маленьких детей. Предпочтительно два из трех межпандемических штаммов представляют собой штамм Η3Ν2, причем второй штамм Η3Ν2 является штаммом ближайшей или отдаленной монофилетической группы относительно первого штамма Η3Ν2. Преимущество этого адъюванта заключается в обеспечении этой группы населения повышенной защитой. Подходящая доза иммуногенного препарата для детей составляет половину дозы для взрослых и предпочтительно содержит 2,5 мкг НА на штамм, при этом эмульсия типа масло в воде содержит сквален, α-токоферол и Ро1у8ОгЬа1 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно.

В еще одном конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека представляет собой пентавалентную иммуногенную или вакцинную композицию, содержащую гемагглютинин (НА) из двух межпандемических штаммов А (возможно Η1Ν1, Η3Ν2), двух штаммов В (возможно из разных линий, таких как В/УШопа и В/Уатада1а) и одного штамма А, ассоциирующегося с пандемией или предрасположенного к тому, чтобы ассоциироваться с пандемией (возможно Η5Ν1, Η9Ν2, Η5Ν8, Η5Ν9, Η7Ν4, Η7Ν7, Η7Ν3, Η2Ν2, Η10Ν7, Η5Ν2 и Η7Ν1). Предпочтительно количество НА на штамм на дозу составляет приблизительно 15 мкг. Предпочтительно количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно приблизительно 10 мкг НА на штамм на дозу или меньше, чтобы достигался максимум 40-45 мкг НА на дозу), и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Адъювант является таким, как определено в данном описании и, в частности, как определено в табл. 1. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, альфа-токоферол и Ро1у8огЬа1 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8огЬа1 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно.

В еще одном конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека представляет собой пентавалентную иммуногенную или вакцинную композицию, содержащую гемагглютинин (НА) из трех межпандемических штаммов А (возможно Η1Ν1 и два штамма Η3Ν2) и двух штаммов В (возможно из разных линий, таких как В/УШопа и В/Уашада1а). Предпочтительно количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно 10 мкг НА на штамм или меньше) и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Адъювант является таким, как определено в данном описании и, в частности, как определено в табл. 1. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8огЬа1 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и Ро1у8огЬа1 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно.

Соответственно в изобретении предложен иммуногенный препарат против гриппа, содержащий сквален и НА, где массовое соотношение сквален:общее количество НА (с учетом всех штаммов вируса

- 23 024250 гриппа) находится в диапазоне приблизительно 50-150 или приблизительно 150-400 (например, приблизительно 200-300). Такие препараты подходят, но не исключительно, для применения у пожилого населения и обеспечивают наилучший баланс реактогенности и иммуногенности. В изобретении также предложен иммуногенный препарат против вируса гриппа, содержащий сквален и НА, где массовое соотношение сквален:общее количество НА (с учетом всех штаммов вируса гриппа) составляет приблизительно 50-400, например приблизительно 50-100, 75-150, 75-200, 75-400, 100-200, 100-250 или 200-400. Предпочтительно это соотношение является таким, что по меньшей мере два, предпочтительно все три критерия (табл. 2) защиты удовлетворяются для конкретной группы населения. Может быть включен агонист ТШ. предпочтительно ТЬК-4 (например, выбранный из следующих: 3Ό-ΜΡΕ, МРЬ; молекула ЛОР, такая как КС527 или КС529, или ЕК804057) или ТЬК-9 (предпочтительно СрО олигонуклеотид, например СрО7909). Подходящие массовые соотношения сквален:ТЬК-4 составляют приблизительно 100-450, например 50-250, 50-150, 100-250, 200-250, 350-450. Подходящие массовые соотношения сквален:ТЬК-9 составляют приблизительно 50-1000, например 50-500, 100-1000, 100-400, 400-600. НА может быть получен из сезонного штамма вируса гриппа. Такие препараты подходят, но не исключительно, для применения у взрослого или детского населения и обеспечивают наилучший баланс реактогенности и иммуногенности. Предпочтительно НА представляет собой НА из по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех штаммов вируса гриппа. Предпочтительно присутствуют три сезонных штамма (например, Η1Ν1, Η3Ν2, В). Предпочтительно, когда присутствуют четыре штамма, тогда они представляют собой группу штаммов из четырех сезонных штаммов (например, Η1Ν1, Η3Ν2, два штамма В; или Η1Ν1, В, два штамма Η3Ν2) или группу штаммов из одного пандемического (например, птичьего) штамма плюс три сезонных штамма (например, Η1Ν1, Η3Ν2, В).

Все заявленные иммуногенные препараты или вакцина с адъювантом преимущественно могут быть основаны на адъюванте для обеспечения устойчивого иммунного ответа в течение периода времени, превышающего 6 месяцев, предпочтительно 12 месяцев после вакцинации.

Предпочтительно вышеуказанный(ые) ответ(ы) достигается(ются) после одной дозы или, как правило, после двух доз, введенных во время одного и того же текущего первичного иммунного ответа. Особое преимущество заявленной дозированной формы иммуногенного препарата заключается в том, что иммунный ответ вызывается всего лишь после одной дозы препарата или вакцины. Подходящим также является ведение двух доз во время одного и того же текущего первичного иммунного ответа, предпочтительно для наивных групп населения или индивидуумов или для групп населения или индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Предпочтительно для детей, которых прежде не вакцинировали, в частности детей в возрасте до 6 лет или 9-10 лет, могут потребоваться две дозы.

Соответственно в одном из аспектов изобретения предложено применение антигенного препарата инактивированного пандемического вируса гриппа, в частности расщепленного вируса гриппа или его антигенного препарата, в изготовлении вакцинной композиции для однодозовой или двухдозовой вакцинации против вируса гриппа, где однодозовая или двухдозовая вакцинация формирует иммунный ответ, который удовлетворяет по меньшей мере одному, предпочтительно двум или трем международным регулирующим требованиям для вакцин против гриппа. В еще одном конкретном воплощении указанная однодозовая вакцинация также или дополнительно формирует иммунный СЭ4 Т-клеточный ответ и/или ответ В-клеток памяти, который сильнее, чем ответ, вызываемый вакциной без адъюванта. В конкретном воплощении указанный иммунный ответ представляет собой перекрестно-реактивный антительный ответ или перекрестно-реактивный СЭ4 Т-клеточный ответ, или их оба. В конкретном воплощении пациентчеловек является иммунологически наивным (т.е. без ранее существовавшего иммунитета) по отношению к вакцинирующему штамму. В частности, вакцинная композиция содержит небольшое количество антигена НА и адъюванта в виде эмульсии типа масло в воде с компонентами, присутствующими в меньших количествах по сравнению с количествами, которые ранее считались полезными, и где количества являются такими, как определено в данном описании. В частности, вакцинная композиция является такой, как определено в данном описании. В частности, иммуногенные свойства вакцинной композиции являются такими, как определено в данном описании. Предпочтительно данную вакцину вводят внутримышечно.

Иммуногенные свойства иммуногенного препарата, используемого для вакцинации (возможно первой вакцинации) по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении адъювантный иммуногенный препарат способен вызывать улучшенный СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ по меньшей мере на компонент-антиген(ы) или антигенную композицию по сравнению с СЭ4+ Т-клеточным иммунным ответом, достигаемым при использовании соответствующей композиции без адъюванта, т.е. композиции, которая не содержит никакого экзогенного адъюванта (называемой здесь также простой композицией). В конкретном воплощении, когда иммуногенный препарат против гриппа состоит из нескольких штаммов вируса гриппа, один из которых представляет собой второй штамм В, или третий межпандемический штамм А, или пандемический штамм, тогда указанный улучшенный СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ направлен против по меньшей мере одного из этих штаммов. В другом воплощении адъювантный иммуногенный препарат, в котором адъювантный(ые) компонент(ы) присутствует(ют) в меньшем количестве по сравнению с количеством, кото- 24 024250 рое ранее считалось полезным, и обычно является(ются) таким(и), как определено выше, соответственно способен вызывать СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ по меньшей мере на один из компонентовантигенов или антигенную композицию, по меньшей мере сравнимый с ответом, который получают с адъювантными композициями, содержащими некоторые из адъювантов предшествующего уровня техники. Эта характеристика ниже по тексту упоминается как сравнимый СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ.

Термин улучшенный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ означает, что более высокий СЭ4+ ответ достигается у пациента-человека после введения адъювантного иммуногенного препарата, как он определен здесь, по сравнению с ответом, достигаемым после введения этого же препарата без адъюванта. Например, более сильный СЭ4+ Т-клеточный ответ достигается у пациента-человека при введении иммуногенного препарата, содержащего вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде, содержащим метаболизируемое масло, такое как сквален, токол (возможно α-токоферол) и эмульгатор (возможно полиоксиэтиленсорбитана моноолеат, такой как Тгееи 80™ или Ро1у8огЬа! 80™), по сравнению с ответом, формирующимся после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат без адъюванта. Такой адъювантный препарат преимущественно будет применяться для индуцирования противогриппозного СЭ4+ Тклеточного ответа, способного обнаруживать эпитопы вируса гриппа, презентируемые молекулами МНС II класса.

Предпочтительно указанный иммунологический ответ, индуцированный адъювантным препаратом на основе расщепленного вируса гриппа для применения в настоящем изобретении, более сильный, чем иммунологический ответ, индуцированный любой другой неадъювантной традиционной вакциной против гриппа, такой как субъединичная вакцина против гриппа или вакцина против гриппа на основе целого вируса.

В частности, но не исключительно, указанный улучшенный СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ или сравнимый СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ получают у иммунологически непримированного пациента, т.е. у пациента, который является серонегативным по отношению к указанному вирусу гриппа или антигену. Эта серонегативность может быть результатом того, что указанный пациент никогда не сталкивался с таким вирусом или антигеном (так называемый наивный пациент) или, альтернативно, не реагировал на указанный антиген при столкновении с ним. Предпочтительно указанный улучшенный СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ получают у субъекта с ослабленным иммунитетом, такого как пожилой человек, обычно в возрасте по меньшей мере 50 лет, типично 65 лет или старше, или у взрослого субъекта младше 65 лет с высоким риском медицинского состояния (взрослый субъект, подверженный высокому риску), или у ребенка младше двух лет.

(Улучшенный) СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ можно оценить путем измерения количества клеток, продуцирующих любой из следующих цитокинов:

клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (СП40Ь, 1Ь-2, ΙΡΝ-7, ΤΝΡ-α); клетки, продуцирующие по меньшей мере СО40Ь и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΡ-α, ΙΡΝ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере 1Ь-2 и другой цитокин (СП40Ь, ΤΝΡ-α, ΙΡΝ-γ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΡΝ-γ и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΡ-α, СО40Ь); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΤΝΡ-α и другой цитокин (1Ь-2, СП40Ь, ΙΡΝ-γ). Улучшенный СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ будет иметь место, когда клетки, продуцирующие любой из цитокинов, упомянутых выше, будут присутствовать в большем количестве после введения адъювантного препарата по сравнению с введением композиции без адъюванта. В типичном случае должно соблюдаться по меньшей мере одно, предпочтительно два из пяти условий, упомянутых здесь выше. В конкретном воплощении клетки, продуцирующие все четыре цитокина, присутствуют в большем количестве в адъювантной группе по сравнению с неадъювантной группой. Сравнимый СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ будет иметь место, когда отсутствует значимое, возможно статистически значимое снижение ответа при использовании адъювантного иммуногенного препарата, где адъювантный(ые) компонент(ы) присутствует(ют) в меньшем количестве по сравнению с количеством, которое ранее рассматривали как полезное, и которое типично является таким, как определено здесь, по сравнению с ответом при использовании композиций с некоторыми адъювантами предшествующего уровня техники (т.е. с тем же компонентом(ами) в большем количестве).

В конкретном воплощении улучшенный СЭ4+ Т-клеточный иммунный ответ может давать адъювантный препарат против гриппа по настоящему изобретению, и в идеале он может быть получен после одного введения. Однодозовый подход будет крайне уместным, например, в ситуации быстро развивающейся эпидемии. В некоторых обстоятельствах особенно для пожилого населения, или в случае маленьких детей (младше 9 лет), которые впервые вакцинируются против гриппа, или в случае пандемии может быть полезным введение двух доз одного и того же препарата для этого сезона. Вторая доза указанного этого же препарата (все еще рассматриваемого как препарат для первой вакцинации) может быть введена во время текущего первичного иммунного ответа и через адекватный промежуток времени. Обычно вторую дозу данного препарата вводят через несколько недель или примерно через один месяц, напри- 25 024250 мер через 2, 3, 4, 5 или 6 недель после введения первой дозы, чтобы способствовать примированию иммунной системы у не реагирующих или слабо реагирующих индивидуумов. В конкретном аспекте после примо-вакцинации следует курс последующей вакцинации адъювантным вакцинным продуктом, содержащим гетерологичный штамм вируса гриппа.

В конкретном воплощении введение указанного иммуногенного препарата альтернативно или дополнительно индуцирует улучшенный ответ В-клеток памяти у пациентов, которым введен адъювантный иммуногенный препарат, по сравнению с ответом В-клеток памяти, вызванным у индивидуумов, иммунизированных композицией без адъюванта. Имеется в виду, что улучшенный ответ В-клеток памяти означает повышенную концентрацию В-лимфоцитов периферической крови, способных, столкнувшись с антигеном, дифференцироваться в плазматические клетки, секретирующие антитела, измеренную посредством стимуляции дифференцировки ш уйго (смотри раздел Примеры, например, способы ЕПкро! с В-клетками памяти). В еще одном воплощении адъювантный иммуногенный препарат, в котором компонент(ы)-адъювант присутствует(ют) в меньшем количестве по сравнению с количеством, которое ранее считалось полезным, и типично является таким, как определено здесь, способен вызывать ответ В-клеток памяти по меньшей мере на один из антигенов антигенного компонента или антигенную композицию, сравнимый (т.е. незначительно ниже или возможно статистически незначимо ниже) с ответом, который вызывают адъювантные композиции с адъювантами предшествующего уровня техники. Эта характеристика в данном описании называется сравнимый ответ В-клеток памяти.

В еще одном конкретном воплощении вакцинация адъювантным препаратом для первой вакцинации не оказывает измеримого влияния на СО8-ответ.

Предпочтительно заявленная дозированная форма, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат, приготовленный с использованием адъюванта в виде эмульсии типа масло в воде, в частности с использованием адъюванта в виде эмульсии масло в воде, содержащего метаболизируемое масло, такое как сквален, токол (возможно α-токоферол) и эмульгатор (возможно полиоксиэтиленсорбитана моноолеат, такой как Т\уссп 80™ или Ро1укотЪа1 80™) в небольших количествах, таких, как определено здесь, эффективна в стимуляции Т-клеточных ответов у человеческой популяции с ослабленным иммунитетом или иммунологически наивной человеческой популяции. Соответственно введение разовой дозы адъювантного иммуногенного препарата для первой вакцинации, как описано в данном изобретении, обеспечивает улучшенную серозащиту, оцениваемую по кореллятам защиты для вакцин против гриппа, с последующей ревакцинацией против вируса гриппа, чем вакцинация неадъювантной вакциной против гриппа. Заявленный адъювантный препарат также преимущественно вызывает улучшенный СЭ4 Тклеточный иммунный ответ против вируса гриппа по сравнению с ответом, достигаемым с использованием неадъювантного препарата. Это свойство может быть связано с повышенной реактивностью после вакцинации или инфицирования по отношению к антигенному воздействию вируса гриппа. Кроме того, это также может быть связано с перекрестной реактивностью, т.е. с более высокой способностью реагировать на вариантные штаммы вируса гриппа. Этот качественно и/или количественно улучшенный ответ может быть благоприятным во всех популяциях в случае пандемии и особенно в человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, такой как популяция пожилых людей (в возрасте 65 лет и старше) и, в частности, у пожилого населения, подверженного высокому риску. Он также может быть благоприятным для большей части наивной популяции маленьких детей (младше 5 лет, предпочтительно младше 2 лет). Когда препарат содержит по меньшей мере один пандемический штамм, этот улучшенный ответ будет благоприятным для применения для примирования, например, вакциной из стратегического запаса, содержащей дрейф-вариант, до или в начале пандемической вспышки. Результатом может быть снижение общего показателя заболеваемости и смертности и предотвращение экстренных госпитализаций по поводу пневмонии или другого гриппоподобного заболевания. Кроме того, это обеспечивает формирование СЭ4 Т-клеточного ответа, который более устойчив во времени, например все еще присутствует через год после первой вакцинации, по сравнению с ответом, сформированным неадъювантным препаратом. Все эти преимущества могут быть достигнуты с использованием заявленного адъювантного препарата с одновременным снижением общей реактогенности по сравнению с адъювантом, имеющим большее(ие) количество(а) компонента(ов).

Предпочтительно в СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, такой как улучшенный или сравнимый СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, получаемый у непримированного субъекта, вовлечено индуцирование перекрестно-реактивного СЭ4 Т-хелперного ответа. В частности, увеличивается количество перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток. Под перекрестно-реактивным СЭ4 ответом подразумевается, что СЭ4 Т-клетка направленно воздействует на общие эпитопы штаммов вируса гриппа, возможно из разных монофилетических групп или линий.

Обычно доступные вакцины против гриппа эффективны только против инфицирующих штаммов вируса гриппа, которые имеют гемагглютинин со сходными антигенными характеристиками. В том случае, когда инфицирующий (циркулирующий) вирус гриппа претерпел незначительные изменения, такие как точечная мутация или аккумулирование точечных мутаций, приводящие к аминокислотным заменам в поверхностных гликопротеинах, в частности в гемагглютинине (вариантный штамм вируса, подверг- 26 024250 шийся антигенному дрейфу), вакцина все еще может обеспечивать защиту, хотя она может обеспечивать только ограниченную защиту, так как новые образовавшиеся варианты могут ускользать от иммунитета, сформированного предыдущей гриппозной инфекцией или вакцинацией. За ежегодные эпидемии ответственен антигенный дрейф, который происходит в межпандемические периоды времени (\УПеу & 8кеЬе1, 1987, Αηη. Реу. ВюсЬет. 56, 365-394). Индуцирование перекрестно-реактивных СИ4 Т-клеток дает дополнительное преимущество композиции по изобретению, заключающееся в том, что она может обеспечивать также перекрестную защиту, другими словами защиту от гетерологичных инфекций, т.е. инфекций, вызываемых циркулирующим штаммом вируса гриппа, который является вариантом (например дрейф-вариантом) штамма вируса гриппа, содержащегося в данной иммуногенной композиции. Это может быть полезным, когда размножение в яйцах или продуцирование в культуре клеток циркулирующего штамма затруднено, и в этом случае использование дрейф-варианта штамма становится рабочей альтернативой. Это также может быть полезным, когда субъекту была сделана первая и вторая вакцинации с интервалом в несколько месяцев или в один год, и штамм вируса гриппа в иммуногенной композиции, использованной для второй иммунизации, представляет собой дрейф-вариант штамма, использованного в композиции для первой вакцинации.

Таким образом, адъювантный иммуногенный препарат против гриппа, как он определен здесь, обладает более высокой способностью индуцировать серозащиту и перекрестно-реактивные СИ4 Т-клетки у вакцинированных пожилых субъектов или маленьких детей. Эта характеристика может быть связана с более высокой способностью реагировать на вариантный штамм, присутствующий в данной иммуногенной композиции. Это может оказаться важным преимуществом в пандемической ситуации. Например, иммуногенный препарат против гриппа, содержащий по меньшей мере один пандемический штамм, возможно любой из Н5, Н2, Н9, Н7 или Н6, может обеспечить более высокую способность реагировать против пандемического варианта, т.е. дрейф-варианта указанного пандемического штамма(ов), либо после следующей вакцинации, либо после инфицирования указанным дрейф-вариантом штамма. Например, адъювантный вакцинный препарат содержит штамм Α/Ιηάο^δίαη и способен вызывать перекрестный защитный и/или перекрестно-реактивный иммунный ответ против одного, предпочтительно более чем одного из дрейфующих штаммов, таких как штамм(ы) Α/Ηοη§ Копд, Α/Тшкеу, Α/V^еίηат и/или Α/Αηΐιιιί.

Обнаружение перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток после вакцинации вакциной против гриппа.

После введения классической тривалентной вакцины против гриппа (через 3 недели) наблюдается существенное увеличение концентрации СЭ4 Т-клеток периферической крови, реагирующих на антигенный препарат штамма (цельный вирусный или расщепленный антиген), который гомологичен одному из антигенов, присутствующих в вакцине (Η3Ν2: Α/Раηата/2007/99, Η1Ν1: Α/Νον Са1е6ота/20/99, В: В/§Ьап6оп§/7/97) (см. пример ΙΙΙ). Сравнимое увеличение концентрации можно наблюдать, если СИ4 Тклетки периферической крови повторно стимулируются штаммами гриппа, классифицируемыми как дрейф-варианты штаммов (Η3Ν2: Α/§уάηеу/5/97, Η1Ν1: Α/Ве^^^η§/262/95, В: В/Уатапа5Ь1/166/98). Напротив, если СЭ4 Т-клетки периферической крови повторно стимулируются штаммами вируса гриппа, классифицируемыми экспертом в данной области как шифт-варианты штаммов (Η2Ν2: Α/§^η§арο^е/1/57, Η9Ν2: Α/Ηοη§кοη§/1073/99), то после вакцинации заметного увеличения не наблюдается.

СЭ4 Т-клетки, которые способны распознавать как гомологичные штаммы, так и дрейф-варианты штаммов гриппа, в настоящем документе называются перекрестно-реактивными. Адъювантные препараты против гриппа, как они описаны здесь, способны демонстрировать гетеросубтипическую перекрестную реактивность, поскольку имеет место заметная перекрестная реактивность против дрейфвариантов штаммов вируса гриппа. Как указано выше, способность вакцинного препарата, содержащего по меньшей мере один пандемический штамм, быть эффективным против дрейф-вариантов пандемического(их) штамма(ов) может оказаться важной характеристикой в случае пандемии.

Согласно вышеуказанным данным у человека были идентифицированы СЭ4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вирусов гриппа (Ое16ег С е1 а1. 1998, Ιηί Iттиηο1. 10(2):211-22; Ое16ег СМ е1 а1. 1996 1 νίΐΌΐ. 70(7):4787-90; ОеШег СМ е1 а1. 1995 1 νίιυΐ. 1995 69(12):7497-506).

Заявленная дозированная форма иммуногенного препарата благодаря ее иммуногенным свойствам может обеспечить создание упреждающей стратегии вакцинации против угрозы пандемии гриппа у человека, включая накопление запаса предпандемической вакцины, чтобы лучше подготовиться к началу пандемии. Она также может быть способна обеспечить упреждающую стратегию вакцинации против циркулирующих штаммов, которые могут не точно соответствовать штамму(ам), присутствующим в вакцинной композиции. В конкретном воплощении адъювантный препарат может принести дополнительную пользу, обеспечив лучшую защиту против циркулирующих штаммов, которые подверглись значительному изменению (такому как, например, рекомбинация генов между двумя разными видами) в гемагглютинине (антигенный сдвиг), против которого имеющиеся в данный момент вакцины не эффективны.

В частности, предпандемическая вакцина представляет собой вакцину, которая содержит по меньшей мере один пандемический штамм (возможно Η5Ν1 (птичий грипп)), сходный со штаммами, циркулирующими в данный момент в популяции птиц, и которая изготовлена, например, путем применения обратной генетики. Иммунитет, развившийся в ответ на предпандемическую вакцину, позволит иммун- 27 024250 ной системе примироваться или обучиться и находиться в готовности и, тем самым, обеспечить более быстрое развитие защитных иммунных ответов после контакта с реальным пандемическим штаммом вируса, приводя к снижению восприимчивости к родственному пандемическому штамму вируса гриппа. Сразу после объявления νΗΟ пандемии и идентификации конечного пандемического штамма (который может представлять собой или не представлять собой дрейф-вариант штамма) предпандемическая вакцина также обеспечит более быстрый иммунный ответ на пандемическую вакцину, когда она станет доступной.

Ревакцинация и композиция, используемая для ревакцинации (композиция для ревакцинации).

В одном из аспектов настоящего изобретения предложено применение (а) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и (б) адъюванта в виде эмульсии масло в воде, как определено здесь, в изготовлении иммуногенного препарата, как он определена здесь, для защиты от гриппозных инфекций, вызываемых штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа.

Предложено также применение дозированной формы иммуногенного препарата, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, из первого штамма вируса гриппа, и адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, как определено здесь, для для защиты человека или человеческой популяции от гриппозных инфекций, вызываемых штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение антигена вируса гриппа в изготовлении дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа для ревакцинации людей, ранее вакцинированных (одной или двумя дозами) адъювантного препарата против гриппа, как он определен здесь. Также предложено применение дозированной формы иммуногенного препарата, содержащего вирус гриппа или его антигенный препарат, вместе с адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде, как определено здесь, для применения для ревакцинации людей, ранее вакцинированных (одной или двумя дозами) адъювантного препарата против гриппа, как он определен здесь.

В одном из воплощений иммуногенный препарат для ревакцинации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СЭ4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Термин общий СЭ4 Т-клеточный эпитоп обозначает пептиды/последовательности/эпитопы из разных антигенов, которые может распознавать одинаковая ί'.Ό4 клетка (см. примеры описанных эпитопов в: СеИет С. е! а1., 1998, Ιηΐ. 1ттипо1. 10(2):211-22; СеШег С-Μ. е! а1., 1996, ΐ. Уио1. 70(7):4787-90; СеМет С-Μ. е! а1., 1995, ΐ. Упо1. 1995 69(12):7497-506).

В одном из аспектов настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа (возможно пандемического) в изготовлении адъювантного иммуногенного препарата, как он определен здесь, для защиты от гриппозных инфекций, вызываемых штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа (возможно пандемического). Также предложена адъювантная иммуногенная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа (возможно пандемического) и адъювант, как он определен здесь, для применения для защиты от гриппозных инфекций, вызываемых штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа (возможно пандемического).

В еще одном аспекте изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении иммуногенного препарата против гриппа для ревакцинации людей, ранее вакцинированных заявленным здесь адъювантным препаратом против гриппа или адъювантным препаратом против гриппа, содержащим вариант штамма вируса гриппа, где адъювант является таким, как определено здесь. Также предложена дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат вместе адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде, как определено здесь, для применения для ревакцинации людей, ранее вакцинированных заявленным здесь адъювантным препаратом против гриппа или адъювантным препаратом против гриппа, содержащим вариант штамма вируса гриппа, где адъювант является таким, как здесь определено.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ вакцинации человеческого населения или индивидуумов против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или населения против варианта штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку (1) первого препарата, содержащего вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа и адъювант, как он определен здесь, и (2) второго иммуногенного препарата, содержащего вариант штамма вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа. В конкретном воплощении указанный первый штамм ассоциируется с пандемией или имеет потенциал ассоциироваться со вспышкой пандемии. В еще одном конкретном воплощении указанный вариантный штамм ассоциируется с пандемией или имеет потенциал ассоциироваться с пандемией. В частности, ревакцинацию выполняют препаратом против гриппа, содержащим по меньшей мере один штамм, который представляет собой циркулирующий пандемический штамм. В еще одном воплощении указанный вариантный штамм представляет собой дрейф-вариант штамма, возможно из ближайшей или отдаленной монофиле- 28 024250 тической группы Η3Ν2, используемого в качестве первого штамма. В еще одном воплощении указанный вариантный штамм представляет собой штамм В другой линии относительно линии первого штамма В (например В/уатада1а или В/УюЮпа, относящиеся к разным линиям). Примирующий препарат и препарат для ревакцинации оба могут быть моновалентными или предпочтительно поливалентными, т.е. могут содержать по меньшей мере два штамма вируса гриппа, например бивалентная, тривалентная, квадривалентная или пентавалентная вакцина. Когда препарат(ы) является(ются) поливалентной(ыми), тогда по меньшей мере один штамм предпочтительно выбран из группы, состоящей из пандемического штамма, штамма В (такого как В/уатада1а или В/УюЮпа), штамма Η3Ν2 и возможно дрейф-варианта штамма, присутствующего в вакцине, используемой для первой вакцинации.

Первая вакцинация предпочтительно может представлять собой две дозы, вводимые в пределах нескольких недель во время одного и того же текущего иммунного ответа, как определено выше. Типично, ревакцинацию выполняют через нескольких месяцев после первой вакцинации, предпочтительно по меньшей мере через 3 или 4 месяца после первой вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев или более после первой вакцинации. Предпочтительно ревакцинацию выполняют по меньшей мере через 6 месяцев после первой(ых) вакцинации(ий). Предпочтительно ревакцинацию выполняют ближе к или в следующий сезон гриппа, например приблизительно через год после введения первого иммуногенного препарата. Препарат для ревакцинации также можно вводить каждый последующий год (третья, четвертая, пятая вакцинация и т.д.).

Соответственно в одном из воплощений изобретения предложена схема вакцинации (или препарат для применения по указанной схеме), включающая (1) первичную вакцинацию, которую выполняют адъювантным препаратом по изобретению, вводимым одной или двумя дозами (предпочтительно с разнесением по времени, например с интервалом 3-6 недель или 3-4 недели), в любое время в течение года (т.е. не в сезон гриппа), и последующую (2) ревакцинацию, которую выполняют по меньшей мере через промежуток времени от 6 недель до одного года после первой вакцинации. Когда при первичной вакцинации вводят две дозы, тогда первой дозой вводят адъювантную тривалентную или квадривалентную сезонную вакцину, а затем второй дозой вводят пандемическую (например моновалентную) адъювантную вакцину. Предпочтительно ревакцинирующую дозу вводят по меньшей мере через 6 недель после первой вакцинации и в любое время в пределах обычного календаря иммунизации (например для детей) или на следующий сезон гриппа. Ревакцинация может быть выполнена любой коммерчески одобренной вакциной против гриппа (например классической тривалентной вакциной без адъюванта или адъювантной вакциной, такой как Р1иАб™) или адъювантной композицией по изобретению (например адъювантной тривалентной или квадривалентной композицией). Предпочтительно препарат для ревакцинации содержит циркулирующие сезонные штаммы для данного сезона, которые могут представлять собой дрейф-вариант из штаммов, присутствующих в первичной вакцине. Эта схема вакцинации подходит для педиатрической группы населения, которая могла быть примирована в жизни раньше (например в возрасте до 6 или до 2 месяцев) имеющейся тогда вакциной и ревакцинирована препаратом, содержащим циркулирующие штаммы, которые могут представлять собой дрейф-варианты штаммов, присутствующих в первичном препарате.

Иммуногенный препарат для ревакцинации (препарат для ревакцинации) может содержать антигенный препарат любого типа, либо инактивированный, либо живой аттенуированный. Он может содержать антигенный препарат такого же типа, например расщепленный вирус гриппа или его антигенный препарат, цельный вирион или очищенную НА и ΝΑ (субъединичную) вакцину, как и иммуногенный препарат, используемый для первой вакцинации. Препарат для ревакцинации может содержать антиген(ы) вируса гриппа такого же подтипа, как и используемый для первой вакцинации. Например, когда первую вакцинацию проводят после объявления пандемии, и ревакцинацию проводят позже, тогда ревакцинацию выполняют вакциной, содержащей штамм вируса гриппа (например Η5Ν1 У1е1пат) такого же подтипа, как в используемой для первой вакцинации (например Η5Ν1 У1е1пат). Альтернативно, препарат для ревакцинации может содержать дрейф-штамм антигена(ов) такого же подтипа, как и используемый для первой вакцинации, например Η5Ν1 1пбопе81а. В еще одном воплощении указанный штамм вируса гриппа, используемый для ревакцинации, представляет собой шифт-штамм, т.е. отличается от штамма, используемого для первой вакцинации, например имеет НА или ΝΑ другого подтипа, такой как Η5Ν2 (такой же подтип НА, как и Η5Ν1, но другой подтип ΝΑ) или Η7Ν1 (отличающийся от Η5Ν1 подтип НА, но такой же подтип ΝΑ). Например, вакцинная композиция для первой иммунизации содержит штамм А/1пбопе81ап, а композиция для ревакцинации содержит штамм(ы) А/Иопд Копд, А/Тигкеу, А/У1е1пат и/или А/АпЬш.

В одном из воплощений используют расщепленный вирус. Композиция для ревакцинации может быть адъювантной или неадъювантной. Неадъювантная композиция для ревакцинации может представлять собой Р1иапх™/а-К1х®/1пЯи8рШ®, которую вводят внутримышечно и которая содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена, приготовленных из рекомендованных \УИО штаммов вируса гриппа соответствующего сезона гриппа. В частности, штаммы вируса гриппа или их антигенные препараты выбраны в соответствии с материалами, распространяемыми Всемирной организацией здра- 29 024250 воохранения, с условием, что они адаптированы к штамму вируса гриппа, который циркулирует в год ревакцинации. Адъювантная композиция для ревакцинации предпочтительно может содержать адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, как определено здесь, возможно с дополнительным иммуностимулятором, таким как лиганд ТЬК-4, такой как 3Б-МРЬ или сапонин.

Предпочтительно ревакцинация препаратом, содержащим адъювант, как он определен здесь, вызывает любые, предпочтительно два или все из следующих ответов: (1) улучшенный СБ4+ Т-клеточный иммунный ответ на вирус гриппа или его антигенный препарат, или (2) улучшенный ответ в виде Вклеток памяти, или (3) улучшенный гуморальный ответ по сравнению с эквивалентным ответом, вызываемым после первой вакцинации вирусом гриппа без адъюванта или его антигенным препаратом. Предпочтительно ревакцинация препаратом, содержащим адъювант, как он определен здесь, вызывает любые, предпочтительно, два или все из следующих ответов: (1) сравнимый СБ4+ Т-клеточный иммунный ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или (2) сравнимый ответ в виде В-клеток памяти, или (3) сравнимый гуморальный ответ относительно эквивалентного ответа, вызываемого после первой вакцинации вирусом гриппа или его антигенным препаратом с адъювантом, где компонент(ы) присутствует(ют) в большем количестве.

В одном из аспектов изобретения ревакцинация субъектов ревакцинирующим препаратом, содержащим вирус гриппа и адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, как он определен здесь, содержащий метаболизируемое масло, такое как сквален, токол (возможно α-токоферол) и эмульгатор (возможно полиоксиэиленсорбитана моноолеат) в указанных выше количествах, демонстрирует более высокие титры антител по сравнению с соответствующими значениями в группе людей, первый раз вакцинированных неадъювантной композицией и ревакцинированных неадъювантной композицией. Влияние адъюванта на усиление ответа на ревакцинацию в виде антител особенно важно для пожилого населения или маленьких детей, которые, как известно, имеют низкую ответную реакцию на вакцинацию или инфицирование вирусом гриппа. В частности, успех, связанный с адъювантными композициями, также будет заметным в отношении улучшения СБ4 Т-клеточного ответа после ревакцинации.

Адъювантный препарат для ревакцинации способен индуцировать лучшую перекрестную реактивность против дрейф-варианта штамма (штамм гриппа следующего сезона гриппа) по сравнению с защитой, которую обеспечивает контрольная вакцина. Указанная перекрестная реактивность показала более высокую устойчивость по сравнению с устойчивостью, полученной с препаратом без адъюванта. Эффект адъюванта в усилении перекрестной реактивности против дрейф-варианта штамма является важным в случае пандемии.

В еще одном воплощении изобретение относится к схеме вакцинации, по которой первую вакцинацию проводят препаратом против гриппа, предпочтительно препаратом на основе расщепленного вируса гриппа, содержащим штамм вируса гриппа, который потенциально может вызвать пандемию, а ревакцинацию проводят препаратом, либо моновалентным, либо поливалентным, содержащим по меньшей мере один циркулирующий штамм, либо пандемический штамм, либо классический штамм.

В конкретном воплощении дозированная форма иммуногенного препарата для человека для ревакцинации содержит адъювант в виде эмульсии типа масло в воде. Предпочтительно количество НА на штамм на дозу составляет приблизительно 15 мкг. В конкретном воплощении количество НА на штамм представляет собой небольшое количество НА (возможно приблизительно 10 мкг НА на штамм на дозу или меньше, так чтобы достигался максимум 40-45 мкг НА на дозу) и является таким, как определено выше. Предпочтительно количество НА на штамм составляет приблизительно 5 мкг или меньше, приблизительно 2,5 мкг или меньше. Предпочтительно адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и ΡοΙνδοιΉαΙ 80 в количестве 5-6, 5-6 и 2-3 мг на дозу соответственно. Альтернативно, адъювантная композиция представляет собой эмульсию типа масло в воде, содержащую сквален, α-токоферол и ΡοΙνδοιΉαΙ 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно. Дозированная форма иммуногенного препарата для человека для ревакцинации предпочтительно содержит адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, который содержит половину компонентов, присутствующих в препарате, используемом для первичной вакцинации, и предпочтительно содержит адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, содержащий сквален, α-токоферол и Ρο1νδοιΉαΙ 80 в количестве 2,5-3,5, 2-3 и 1-2 мг на дозу соответственно. В конкретном воплощении указанную дозу для ревакцинации вводят примерно через год или примерно через два года после первичной иммунизации.

СБ4 эпитоп в НА.

Этот антигенный дрейф главным образом присущ эпитопным участкам вирусных поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (ΝΑ). Известно, что любое различие в СБ4 и Вклеточных эпитопах между разными штаммами гриппа, используемое вирусом, чтобы ускользнуть от адаптивного ответа иммунной системы хозяина, играет главную роль в вакцинации против вируса гриппа.

У человека были идентифицированы СБ4 Т-клеточные эпитопы, общие для различных штаммов гриппа (см., например, ОеМет С е! а1., 1998, ΤηΙ. Тштипск 10(2):211-22; ОеИет СМ е! а1., 1996, 1. Υίτοί.

- 30 024250

70(7):4787-90 и Ое1йег СМ е! а1., 1995, 1. Уио1. 1995 69(12)7497-506).

В конкретном воплощении ревакцинацию проводят препаратом для ревакцинации, который содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СЭ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Таким образом, в данном изобретении раскрыто применение иммуногенного препарата, содержащего пандемический вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант в виде эмульсии типа масло в воде, как он определен выше, в изготовлении компонента первой вакцинации многодозовой вакцины, причем данная многодозовая вакцина дополнительно содержит в качестве ревакцинирующей дозы вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СЭ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном пандемического вируса гриппа или его антигенным вирусным препаратом в дозе, вводимой при первой вакцинации.

Способы вакцинации.

Дозированную форму препарата по изобретению можно вводить любым подходящим путем доставки, таким как интрадермальный, мукозальный, например интраназальный, пероральный, внутримышечный или подкожный. Другие пути доставки общеизвестны в данной области.

Внутримышечный путь доставки является особенно подходящим для адъювантной композиции против гриппа. Дозированная форма по изобретению может быть предоставлена в однодозовом контейнере или, альтернативно, в многодозовом контейнере, особенно подходящем для пандемической вакцины. В этом случае для предотвращения загрязнения в процессе использования обычно присутствует противомикробный консервант, такой как тиомерсал. Концентрация тиомерсала может составлять 25 мкг/дозу 0,5 мл (т.е. 50 мкг/мл). Предпочтительной является концентрация тиомерсала 5 мкг/дозу 0,5 мл (т.е. 10 мкг/мл) или 10 мкг/дозу 0,5 мл (т.е. 20 мкг/мл). Для внутримышечной (в.м.) доставки можно использовать такое подходящее устройство, как безыгольное устройство для инъекций, например Вю)ес!от 2000 (Вю_)ес!, Ротйаий, ОК). Альтернативно, для самостоятельного введения вакцины можно использовать устройство в виде шприц-ручки, подобное тому, которое обычно используется для доставки эпинефрина в домашних условиях. Использование таких устройств для доставки может быть особенно подходящим для широкомасштабных кампаний по иммунизации, таких, которые требуются во время пандемии.

Интрадермальная доставка является другим подходящим путем. Можно использовать любое подходящее устройство для интрадермальной доставки, например короткоигольное устройство. Интрадермальные вакцины также можно вводить с помощью устройств, которые ограничивают эффективную длину проникновения иглы в кожу, таких как устройства, описанные в АО 99/34850 и ЕР 1092444, которые включены в данное описание изобретения посредством ссылки, и их функциональных эквивалентов. Также подходят безыгольные инъекционные устройства, которые доставляют жидкие вакцины в дерму через безыгольный инъектор или через иглу, которая прокалывает роговой слой и выпускает струю, которая достигает дермы. Также подходят баллистические устройства для доставки порошка/частиц, в которых используется сжатый газ для форсирования проникновения вакцины в форме порошка через наружные слои кожи в дерму. Кроме того, можно использовать традиционные шприцы для интрадермального введения классическим способом Манту.

Другим подходящим путем введения является подкожный путь. Для подкожной доставки можно использовать любое подходящее устройство, например классическую иглу. Предпочтительно используют безыгольный инъектор. Предпочтительно указанное устройство предварительно заполнено жидким вакцинным препаратом.

Альтернативно, вакцину вводят интраназально. Типично, вакцину вводят местно в носоглоточную область предпочтительно без вдыхания в легкие. Желательно использовать устройство для интраназальной доставки, которое доставляет вакцинный препарат в носоглоточную область без или, по существу, без ее поступления в легкие.

Подходящими устройствами для интраназального введения вакцин согласно данному изобретению являются распылители. Подходящие коммерчески доступные назальные распылители включают Ассизртау™ (Вес!оп Июкшзоп). Небулайзеры продуцируют очень тонкий спрей, который может легко вдыхаться в легкие и, следовательно, не действует эффективно на слизистую оболочку носа. Следовательно, небулайзеры не являются предпочтительными.

Подходящими распылителями для интраназального применения являются устройства, эффективность которых не зависит от давления, прилагаемого пользователем. Эти устройства известны как устройства с пороговым давлением. Жидкость высвобождается из сопла только тогда, когда прилагается пороговое давление. Эти устройства облегчают продуцирование спрея с регулярным размером капель. Устройства с пороговым давлением, подходящие для применения по настоящему изобретению, известны в данной области и описаны, например, в АО 91/13281, ЕР 311863 В и ЕР 516636, которые включены в данное описание изобретения посредством ссылки. Такие устройства имеются в продаже от РГсНТсг ОтЬН, а также описаны в Воттег, К. РЬаттасеи!юа1 ТесЬио1оду Еигоре, 8ер! 1999.

Подходящие интраназальные устройства продуцируют капли (измеренные с использованием воды в качестве жидкости) размером в пределах от 1 до 200 мкм, предпочтительно от 10 до 120 мкм. При размере менее 10 мкм существует риск вдыхания, поэтому желательно иметь не более примерно 5% капель

- 31 024250 размером менее 10 мкм. Капли размером более 120 мкм не распределяются так же хорошо, как капли меньшего размера, поэтому желательно иметь не более примерно 5% капель, размер которых превышает 120 мкм.

Двухдозовая доставка является еще одной предпочтительной особенностью интраназальной системы доставки для использования с вакцинами по изобретению. Двухдозовые устройства содержат две субдозы одной дозы вакцины - по одной субдозе для введения в каждую ноздрю. Обычно эти две субдозы находятся в одной камере, и конструкция устройства обеспечивает эффективную доставку одной субдозы за один раз. В качестве альтернативы, для введения вакцин по данному изобретению можно использовать однодозовое устройство.

Альтернативно, в настоящем изобретении также предусматривается эпидермальный или трансдермальный путь вакцинации.

В одном аспекте настоящего изобретения адъювантный иммуногенный препарат для первого введения можно вводить внутримышечно, а композицию для ревакцинации, либо с адъювантом, либо без адъюванта, можно вводить другим путем, например интрадермальным, подкожным или интраназальным. В конкретном воплощении препарат для первого введения содержит НА в количестве менее 15 мкг для пандемического штамма гриппа, а препарат для ревакцинации может содержать стандартное количество 15 мкг или предпочтительно меньшее количество НА, т.е. меньше 15 мкг, которое в зависимости от пути введения может быть введено в меньшем объеме.

Хотя вакцина по изобретению может быть введена в виде разовой дозы, ее компоненты также можно совместно вводить одновременно или в разные моменты времени (например, антигены вируса гриппа можно вводить раздельно, предпочтительно в одно и тоже время с введением адъюванта). В дополнение к одному единственному пути введения 2 разных пути введения могут быть использованы, когда делают две инъекции. Например, первое введение (например, примирующая доза) антигенов вируса гриппа с адъювантом может быть проведено в.м. или интрадермально (и.д.), а второе введение (например, ревакцинирующая доза) может быть проведено интраназально (и.н.) (или и.д.). Дополнительно, вакцины по изобретению можно вводить в.м. для примирующих доз и и.н. для ревакцинирующих доз.

Содержание антигенов вируса гриппа в вакцине обычно находится в диапазоне 0,1-15 мкг НА на штамм вируса гриппа, предпочтительно 1-10 мкг, наиболее типично в диапазоне 1-8 мкг. Подходящее содержание антигенов вируса гриппа составляет 5 мкг НА или меньше на штамм вируса гриппа, включенный в вакцину. После начальной вакцинации субъектам может быть проведена одна или несколько повторных иммунизации через соответствующие промежутки времени.

Популяции, подлежащие вакцинации.

Целевой популяцией для вакцинации является все население, например здоровые молодые взрослые люди (в возрасте, например, 18-60 лет), пожилые люди (типично старше 60 лет) или маленькие дети/дети. Целевой популяцией, в частности, может быть группа населения с ослабленным иммунитетом. Люди с ослабленным иммунитетом обычно хуже реагируют на антиген, в частности на антиген гриппа, по сравнению со здоровыми взрослыми людьми.

В одном аспекте изобретения целевой популяцией является население, которое не подвергалось первичной иммунизации против гриппа, являющееся либо наивным (например по отношению к пандемическому штамму), либо не реагировавшее ранее на гриппозную инфекцию или вакцинацию. Предпочтительно целевой популяцией являются пожилые лица, предпочтительно в возрасте по меньшей мере 60 лет или по меньшей мере 65 лет или старше, более молодые взрослые люди, подверженные высокому риску (т.е. в возрасте от 18 до 60 лет), такие как люди, работающие в учреждениях здравоохранения, или такие молодые взрослые люди с фактором повышенного риска, таким как сердечно-сосудистое и легочное заболевание, или диабет. Другой целевой популяцией являются все дети с рождения или в возрасте 2 месяца или старше, в возрасте от 6 месяцев и старше, особенно дети в возрасте 6-23 месяцев, которые имеют относительно высокий показатель госпитализации, связанной с гриппом. Еще одной целевой популяцией являются младшие дети с рождения до 6 месяцев.

Полное содержание всех источников информации, ссылки на которые приведены в описании настоящего изобретения, включая патентные заявки и выданные патенты, включено в данное описание посредством ссылки. Любая патентная заявка, по которой испрашивается приоритет данной заявки, во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки таким же образом, как описано для публикаций и источников информации.

Во избежание неясности здесь авторами изобретения предусматривается, что термины содержащий, содержат и содержит могут быть взаимозаменяемыми в каждом случае терминами состоящий из, состоят из и состоит из соответственно. Изложенные здесь воплощения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным препаратам по изобретению, и наоборот. Термин приблизительно (или около) во всех числовых значениях допускает 5%-ную вариацию, т.е. значение приблизительно 1,25% может означать 1,19%-1,31%.

Ниже изобретение дополнительно описано со ссылками на следующие не ограничивающие объем изобретения примеры.

Пример I, в котором описаны иммунологические методы считывания, используемые в исследовани- 32 024250 ях на мышах, хорьках, свиньях и людях.

Пример II, в котором описано приготовление эмульсии масло в воде и адъювантных препаратов, использованных в исследованиях, приведенных в примерах.

Пример III демонстрирует клинические испытания в популяции взрослых людей в возрасте 18-59 лет с использованием вакцины, содержащей препарат на основе расщепленного антигена вируса гриппа и две дозы адъюванта А§03.

Пример IV демонстрирует предклиническую оценку адъювантных и неадъювантных расщепленных вакцин против гриппа (содержащих различные дозы адъюванта А§03) у примированных мышей ВАЬВ/с.

Пример V демонстрирует предклиническую оценку адъювантных и неадъювантных расщепленных вакцин против гриппа (содержащих различные дозы адъюванта А§03) у примированных мышей С57ВЕ6.

Пример VI демонстрирует предклиническую оценку адъювантных и неадъювантных расщепленных вакцин против гриппа (содержащих различные дозы адъюванта А§03 и низкую дозу антигена) у примированных мышей С57ВЕ6.

Пример VII демонстрирует предклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин на основе расщепленных Η5Ν1 (содержащих различные дозы адъюванта А§03 и антиген) у наивных мышей С57ВЕ6.

Пример VIII демонстрирует предклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин против гриппа у примированных крупных белых свиней.

Пример IX демонстрирует предклиническую оценку адъювантных и неадъювантных расщепленных ТГО и ОГО сезонных вакцин (содержащих различные дозы адъюванта А§03 и антиген) у наивных и примированных мышей С57ВЕ6.

Пример X демонстрирует клинические испытания в популяции взрослых людей в возрасте 18-64 лет с использованием вакцины, содержащей препарат расщепленного вируса гриппа и различные дозы адъюванта А§03.

Пример XI демонстрирует клинические испытания в популяции пожилых людей в возрасте 65 лет и старше с использованием вакцины, содержащей препарат расщепленного вируса гриппа и различные адъюванты.

Пример I. Методы иммунологического считывания.

Σ.1, Методы на мышах.

Σ.1.1. Тест на ингибирование гемагглютинации.

Принцип теста (классическая процедура).

Титры антител против гемагглютинина для трех (сезонных) штаммов вируса гриппа определяют с использованием теста на ингибирование гемагглютинации (Η^. Принцип ΗΣ теста основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Инактивированные теплом сыворотки крови обрабатывают каолином и КВС для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двухкратные разведения сывороток крови инкубируют с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляют эритроциты и оценивают ингибирование агглютинации. Титры выражают как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляет 1:20, не обнаруживаемый уровень оценивают как титр, равный 10.

Адаптация для Η5Ν1 (конкретное описание ΗΣ с использованием лошадиных эритроцитов):

Поскольку было документально подтверждено, что классический анализ ΗΣ для определения антител против НА не достаточно хорошо работает в отношении штамма Η5Ν1, был использован адаптированный протокол с использованием лошадиных КВС. Лошадиные эритроциты используют для пандемических штаммов Η5Ν1. 0,5%-ная (конечная концентрация) суспензия лошадиных эритроцитов в фосфатном буфере, содержащем 0,5% В8А (бычий сывороточный альбумин, конечная концентрация). Эту суспензию получают ежедневно путем промывки эритроцитов тем же фосфатным буфером и последующим центрифугированием (10 мин, 2000 об/мин). Эту стадию промывки следует повторить еще раз. После добавления лошадиных эритроцитов в реакционную смесь сыворотки и вирусной суспензии планшеты инкубируют при комнатной температуре (КТ, 20+/-2°С) в течение двух часов из-за низкой скорости осаждения лошадиных эритроцитов.

Статистический анализ.

Статистический анализ выполняли по титрам ΗΣ антител после вакцинации с использованием ИМ§ТАТ. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, кратко может быть описан следующим образом:

Логарифмическое преобразование данных.

Тест Шапиро-Вилка для каждой популяции (группы) для проверки нормальности распределения групп.

Тест Кокрана для проверки гомогенности дисперсии между разными популяциями (группами).

Дисперсионный анализ по выбранным данным.

Критерий взаимодействия для двухфакторного дисперсионного анализа (АNΟVА).

- 33 024250

Тест Тикеу-ΗδΌ для множественных сравнений.

1.1.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов.

Эта методика дает возможность количественно определять антигенспецифические Т-лимфоциты на основе продукции цитокинов: эффекторные Т-клетки и/или эффекторные Т-клетки памяти продуцируют ΙΡΝ-γ (гамма-интерферон) и/или центральные Т-клетки памяти продуцируют 1Ь-2. РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) собирают в день 7 после иммунизации.

Лимфоидные клетки рестимулируют ίη уйго в присутствии ингибитора секреции (Вге£е16ше). Эти клетки затем обрабатывают общепринятым иммунофлуоресцентным методом с использованием флуоресцентных антител (СЭ4. СЭ8. ΙΡΝ-γ и ΙΌ-2). Результаты выражают в виде частоты встречаемости цитокин-позитивных клеток среди СЭ4/СЭ8 Т-клеток. Окрашивание внутриклеточных цитокинов в Т-клетах осуществляли на РВМС через 7 дней после второй иммунизации. Кровь собирали у мышей и объединяли в гепаринизированной среде КРМ1+А66. Для крови КРМ1+А66-разбавленные суспензии РВЬ (лимфоцитов периферической крови) наносили на градиент Ьутрйо1у!е-Матта1 в соответствии с рекомендуемым протоколом (центрифугирование в течение 20 мин при 2500 об/мин и комнатной температуре). Мононуклеарные клетки на границе раздела удаляли, дважды промывали КРМ1+А66, и суспензии РВМС доводили до 2х 10⁶ клеток/мл в КРМ1 5% фетальной телячьей сыворотке.

Антигенную стимуляцию РВМС ίη уйго осуществляли при конечной концентрации 1 χ 10⁷ клеток/мл (пробирка РАС8) с \Уйо1е ΡΙ (1 мкг НА/штамм) и затем инкубировали в течение 2 ч при 37°С с добавлением антител против ί'.'Ό28 и антител против СЭ496 (1 мкг/мл для обоих).

После стадии антигенной рестимуляции РВМС инкубируют в течение ночи при 37°С в присутствии Вге£е16ш (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования секреции цитокинов. Окрашивание ΙΡΝ-γ/ΙΡ-2/ί’Ό4/ί’Ό8 выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкг РВ§ 1% фетальной телячьей сыворотки (РС8), содержащей 2% Рс блокирующего реагента (1/50; 2.402). После инкубации в течение 10 мин при 4°С 50 мкл смеси антител против СЭ4-РЕ (2/50) и антител против СЭ8 добавляли регСр (3/50) и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После промывки в РВ§ 1% РС8 клетки делали проницаемыми ресуспендированием в 200 мкл Су!ойх-Су!орегт (набор ВО) и инкубировали в течение 20 мин при 4°С. Клетки затем промывали Регт ХУазй (набор ВО) и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси антигенпрезентирующих клеток (АРС) для антител против ΙΡΝ-γ (1/50)+антитела против 1Ь-2 флуоресцеин-изотиоцианат (Р1ТС) (1/50), разведенных в Регт ХУазй После инкубации минимум 2 ч максимум в течение ночи при 4°С клетки промывали Регт \Уа5Й и ресуспендировали в РВ§ 1% РС8+1% параформальдегида. Анализ образцов проводили при помощи РАС8. Собирали живые клетки (Р§С/88С), и сбор данных выполняли по приблизительно 20000 событиям (лимфоциты) или 35000 событиям на СЭ4+ Т-клетках. Процент ΙΡΝ-γ+ или 1Ь2+ рассчитывали по СЭ4+ и СЭ8+ гейтированным популяциям.

Ι.1.3, ЕЫ8А антител против Η5Ν1.

Количественную оценку Ι§ против Η5Ν1, титры антител Ιβ01 и Ц02Ь осуществляли методом ЕЫ§А с использованием расщепленных Η5Ν1 в качестве покрытия. Использовали растворы вируса и антитела по 100 мкл на лунку. Расщепленный вирус Η5Ν1 разводили до конечной концентрации 1 мкг/мл в РВ§ и адсорбировали в течение ночи при 4°С в лунках 96-луночных микротитровальных планшетов (Мах18огЬ ^типор^е №тс 439454). Планшеты затем инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 200 мкл на лунку РВ§, содержащего 1% В8А и 0,1% Т\\ееп 20 (буфер насыщения). Двадцатидвухкратные разведения сыворотки крови в буфере насыщения добавляли в планшеты, покрытые Η5Ν1, и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты четыре раза промывали РВ§ 0,1% Т\\ееп 20. В каждую лунку добавляли конъюгированный с биотином Ι§ против мышиного антитела (Рго/ап-Е0413), разведенный 1/500, или конъюгированный с биотином Ιβ01 против мышиного антитела (ПШесй 1070-08), или конъюгированный с биотином Ц02Ь против мышиного антитела (ПШесй 1090-08), разведенный 1/4000 в РВ§ 1% В8А 0,1% Т\\ееп 20, и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. После промывки планшеты инкубировали в течение 30 мин со стрептавидин-биотин-пероксидазным конъюгатом (Рго/ап Р0397), разведенным 1/10000 в РВ§ 1%В§А Т\\ееп 20.

Для колориметрического обнаружения планшеты инкубировали в течение 20 мин при 22°С с раствором 0,04% ортофенилдиамина (81дта Р4664), 0,03% Н₂О₂ в 0,1М цитратном буфере, рН 4,2. Реакцию останавливали добавлением 2 н. раствора Η₂δΟ₄, и микропланшеты считывали при 490-630 нм.

Ι.2. Методы на хорьках.

Ι.2.1. Тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ).

Процедура теста.

Титры антител против гемагглютинина для трех штаммов вируса гриппа определяли с использованием теста на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ). Принцип теста ΗΙ основан на способности специфических антител против вируса гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Сыворотки крови сначала обрабатывали 25%-ным раствором нейраминидазы (КОЕ) и инактивировали теплом для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двухкратные разведения сывороток крови инкубировали с 4 единицами ге- 34 024250 магглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:20, не обнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 5.

Статистический анализ.

Статистический анализ осуществляли по титрам Ш (день 41, перед провокацией) с использованием И№8ТАТ. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, кратко может быть описан следующим образом:

Логарифмическое преобразование данных.

Дисперсионный анализ по выбранным данным.

Критерий взаимодействия для двухфакторного дисперсионного анализа (АNОVА).

Тест Тикеу-Н8О для множественных сравнений.

12.2. Контроль температуры организма.

Индивидуальные температуры контролировали во время провокации датчиками и телеметрической регистрацией. Все имплантаты проверяли и подновляли, осуществляли новую калибровку с помощью Ο8Σ (Иа!а 8с1еисек йПегпабопак СеШаигик^ед 123, 5015 ТС ТПЬигд, Тйе №!йег1аибк) и после этого размещали в брюшной полости. Во время этих измерений все животные находились индивидуально в отдельных клетках.

Температуры регистрировали каждые 15 мин, начиная со дня 4 до провокации и до дня 7 после провокации.

Е2.3. Назальные смывы.

Назальные смывы выполняли путем введения 5 мл РВ8 в обе ноздри находящихся в сознании животных. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнер для образцов на сухом льду.

Титрование вируса в назальных смывах.

Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры 8рш X (Сок!аг) для удаления каких-либо бактериальных примесей. 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных смывов переносили в микротитрационные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл клеток МИСК (2,4х10⁵ клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 5-7 суток.

После 5-7 дней инкубации культуральную среду осторожно удаляли, добавляли 100 мкл среды, содержащей 1/20 \У8Т-1, и инкубировали в течение еще 18 ч.

Интенсивность окрашивания желтым формазановым красителем, полученного после восстановления ХУ8Т-1 живыми клетками, пропорциональна количеству живых клеток, находящихся в лунке в конце анализа вирусного титрования, и ее количественно оценивали путем измерения поглощения в каждой лунке при подходящей длине волны (450 нм). Отсечку определяют как среднюю оптическую плотность (ОИ) неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ОИ (0,3 ОИ соответствует +/-3 стандартное отклонение ОИ для неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда ОИ меньше отсечки и, наоборот, отрицательную оценку определяют, когда ОИ больше отсечки. Титры высвобожденных вирусов определяли методом Кееб апб Миепсй и выражали как Ьод ТСГО50/мл.

Σ.3. Методы на свиньях.

Σ.3.1. Тест на ингибирование гемагглютинации (Н^.

Процедура теста.

Титры антител против гемагглютинина для трех штаммов вируса гриппа определяли с использованием теста на ингибирование гемагглютинации (Н^. Принцип теста Ш основан на способности специфических антител против вируса гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Сыворотки крови сначала обрабатывали 25%-ным раствором нейраминидазы (КИЕ) и инактивировали теплом для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двухкратные разведения сывороток крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1: 10, не обнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 5.

Статистический анализ.

Статистический анализ осуществляли на титрах Ш (день 41, до провокации) с использованием Ц№8ТАТ. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, кратко может быть описан следующим образом:

Логарифмическое преобразование данных.

- 35 024250

Дисперсионный анализ по выбранным данным.

Ι.4. Анализы для оценки иммунного ответа у людей.

Ι.4.1. Анализ на ингибирование гемагглютинации.

Иммунный ответ определяли путем измерения ΗΙ антител с использованием метода, описанного \νΗΘ Со11аЬогайтд Сейге для вируса гриппа, Сепйгез йог Эйзеазе Сопйго1, 25 Ай1апйа, И8А (1991).

Измерения титров антител проводили на размороженных образцах сыворотки крови с использованием стандартизированного и общепризнанного микрометода с использованием 4 единиц ингибирования гемагглютинации (4 ΗΙυ) соответствующих антигенов и 0,5%-ной суспензией птичьих эритроцитов. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли путем тепловой обработки и обработки ферментом, разрушающим рецепторы.

Полученные сыворотки крови оценивали в отношении уровней ΗΙ антител. Начиная с исходного разведения 1:10, готовили серии разведений (сокращая в 2 раза) до конечного разведения 1:20480. Конечная точка титрования была принята как наивысшая стадия разведения, демонстрирующая полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы проводили в двух повторах.

Ι.4.2. Анализ ингибирования нейраминидазы.

Анализ проводили в микротитрационных планшетах, покрытых фетуином. Готовили 2-кратные серии разведений антисывороток и смешивали их со стандартизированным количеством вируса гриппа А Η3Ν2, Η1Ν1 или вируса гриппа В. Тест основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления концевой нейраминовой кислоты в-Э-галактоза-Н-ацетилгалактозамин демаскировался. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (ИКР) арахисовый агглютинин из АгасЫз Ьуродаеа, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связавшегося агглютинина может быть обнаружено и количественно определено в реакции субстрата с тетраметилбензидином (ТМВ). Наивысшее разведение антител, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, указывали как титр ΝΙ.

1.4.3. Анализ нейтрализующих антител.

Измерения нейтрализующих антител проводили на размороженных образцах сыворотки крови. Нейтрализацию вируса антителами, содержащимися в сыворотке крови, определяли в анализе микронейтрализации. В этом анализе использовали сыворотки крови без дополнительной обработки. Каждый образец сыворотки крови тестировали в трех повторах. Стандартизированное количество вируса смешивали с серийными разведениями сыворотки крови и инкубировали, давая возможность антителам связаться с вирусом. Затем к смеси вируса и антисыворотки добавляли клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток МОСК, и инкубировали при 33°С. После инкубации репликацию вируса визуализировали гемагглютинацией эритроцитов цыплят. 50%-ный титр нейтрализации сыворотки крови рассчитывали методом Кеей апй МиепсЬ.

1.4.4. Клеточно-опосредованный иммунитет оценивали методом цитокиновой проточной цитометрии (СРС).

Антигенспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клетки периферической крови можно рестимулировать ίπ νίйго для продуцирования ΙΕ-2, СЭ40Ь, ТХР-альфа и ΙΡΝ, если инкубировать с их соответствующим антигеном. Затем антигенспецифические СЭ4 и СЭ8 Т-клетки могут быть подсчитаны методом проточной цитометрии после обычного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также внутриклеточного продуцирования цитокинов. В настоящем исследовании антиген вакцины против гриппа, а также пептиды из специфического белка вируса гриппа использовали в качестве антигена для рестимуляции специфических к вирусу гриппа Т-клеток. Результаты выражали в виде частоты встречаемости цитокинположительных СЭ4 или СЭ8 Т-клеток в СЭ4 или СЭ8 Т-клеточной субпопуляции.

Ι.4.5. Статистические методы.

Ι.4.5.1. Первичные конечные результаты.

Процент, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией обычных локальных и общих показателей и симптомов в течение 7-дневного последующего периода (т.е. день вакцинации и 6 последующих дней) после вакцинации и в сумме.

Процент, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией необычных локальных и общих показателей и симптомов в течение 21-дневного последующего периода (т.е. день вакцинации и 20 последующих дней) после вакцинации и в сумме.

Возникновение серьезных нежелательных побочных событий в течение всего исследования.

Ι.4.5.2. Вторичные конечные результаты Для гуморального иммунного ответа: Наблюдаемые переменные:

В день 0 и день 21: сывороточные титры ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ) и ΝΙ антител тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антитела против Η1Ν1, антитела против Η3Ν2 и антитела против В).

- 36 024250

В день 0 и день 21: титры нейтрализующих антител тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине.

Производные переменные (с 95%-ными доверительными интервалами):

средние геометрические значения титров (СМТ) сывороточных ΗΙ антител с 95%-ными доверительными интервалами (95% С1) до и после вакцинации;

уровни сероконверсии* с 95% С1 в день 21; факторы конверсии** с 95% С1 в день 21; уровни серозащиты*** с 95% С1 в день 21;

СМТ сывороточных ΝΙ антител (с 95%-ными доверительными интервалами) во всех точках времени;

* - уровень сероконверсии, определенный как процент вакцин, которые вызывали по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров ΗΙ в день 21 по сравнению с титрами в день 0 для каждого вакцинного штамма;

** - фактор конверсии, определенный как кратное увеличение СМТ сывороточных ΗΙ в день 21 по сравнению с увеличением в день 0 для каждого вакцинного штамма;

*** - уровень защиты, определенный как процент вакцин с сывороточным титром ΗΙ=40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принимается за показатель защиты.

Понятно, что для некоторых клинических исследований реактогенность/безопасность могут представлять собой вторичные конечные результаты, а иммуногенность может представлять собой первичный конечный результат.

Для клеточно-опосредованного иммунного (СМ1) ответа.

Наблюдаемая переменная.

В день 0 и день 21: частота встречаемости цитокин-положительных СЭ4/СЭ8 клеток на 10⁶ в разных тестах.

Каждый тест количественно оценивает ответ СЭ4/СЭ8 Т-клеток на:

антиген пептид вируса гриппа (рГ) (точную природу и происхождение этих антигенов необходимо указать/объяснить);

антиген расщепленный вирус гриппа (8ί); антиген цельный вирус гриппа (теГ).

Производные переменные:

клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (СЭ40Ь, 1Ь-2, ΙΡΝγ, ΤΝΡα); клетки, продуцирующие по меньшей мере СЭ40Ь и другой цитокин (ГО-2, ΤΝΡα, ΙΡΝγ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΡ-2 и другой цитокин (СО40Ь, ΤΝΡα, ΙΡΝγ); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΡΝγ и другой цитокин (ГО-2, ΤΝΡα, СО40Ь); клетки, продуцирующие по меньшей мере ΤΝΡα и другой цитокин (ГО-2, СО40Ь, ΙΡΝγ).

Ι.4.5.3. Анализ иммуногенности.

Анализ иммуногенности основан на общей вакцинированной когорте. Для каждой обрабатываемой группы рассчитывали следующие параметры (с 95%-ными доверительными интервалами):

средние геометрические значения титров (СМГ) ΗΙ антител и титров Ν1 антител в день 0 и в день

21;

средние геометрические значения титров (СМГ) нейтрализующих антител в день 0 и в день 21; факторы конверсии в день 21;

уровни сероконверсии (СК) в день 21, определенные как процент вакцин, вызывающих по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров ΗΙ антител в день 21 по сравнению с увеличением в день 0;

уровни защиты в день 21, определенные как процент вакцин с сывороточным титром ΗΙ 1:40; частоту встречаемости ί'Ό4/ί'Ό8 Т-лимфоцитов, секретирующихся в ответ, суммировали (описательная статистика) для каждой группы вакцинации в каждую точку времени (день 0, день 21) и для каждого антигена (пептид вируса гриппа (рГ), расщепленный вирус гриппа (8Г) и цельный вирус гриппа (те));

описательная статистика индивидуальных различий между ответами в моменты времени (после-до) для каждой группы вакцинации и каждого антигена (рГ, 8Г и \\Т) в каждом из 5 разных тестов.

непараметрический тест (тест Крушкалла-Валлиса) использовали для сравнения локационных различий между 3 группами, и статистическое р-значение рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 разных тестов. Все критерии значимости были двусторонними. р-Значения ниже или равно 0,05 рассматривали как статистически значимые.

Пример ΙΙ. Приготовление эмульсии типа масло в воде и адъювантных препаратов.

Если не указано иное, эмульсия масло/вода, используемая в последующих примерах, состоит из органической фазы, состоящей из 2 масел (α-токоферол и сквален) и водной фазы РВ8, содержащего ГОуееп 80™ или Ро1у8огЬа1 80™ в качестве эмульгатора. Если не указано иное, готовили используемые в последующих примерах препараты адюъюванта в виде эмульсии типа масло в воде, содержащие следующий

- 37 024250 компонент эмульсии масло в воде (указаны конечные концентрации): 2,5% сквалена (об./об.), 2,5% атокоферола (об./об.), 0,9% полиоксиэтиленсорбитана моноолеата (об./об.) (Туееп 80) (см. \УО 95/17210). Эту эмульсию, называемую Αδ03 в последующих примерах, готовили в виде двукратного концентрата.

ΙΙ.1. Приготовление эмульсии δΒ62.

Этот способ использовали в исследованиях, о которых сообщается в разделах, относящихся к клиническим и предклиническим примерам. Приготовление эмульсии δΒ62 осуществляют путем смешивания при интенсивном перемешивании масляной фазы, состоящей из гидрофобных компонентов (ЭЬ-атокоферол и сквален), и водной фазы, содержащей водорастворимые компоненты (анионный детергент Туееп 80 и ΡΒδ модифицированный, рН 6,8). При перемешивании масляную фазу (1/10 общего объема) переносят в водную фазу (9/10 общего объема), и эту смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученную смесь затем подвергают действию сил сдвига, удара и кавитации в камере взаимодействия микрофлюидизатора (15000 фунт/кв.дюйм (103,5х 10³ кПа) - 8 циклов или 3 цикла в адъюванте, используемом в клинических испытаниях, описанных в примере ΙΙΙ) с получением субмикронных капель (распределение от 100 до 200 нм). Результирующий рН составляет 6,8±0,1. Эмульсию δΒ62 затем стерилизуют фильтрованием через мембрану 0,22 мкм, и стерильную эмульсию хранят охлажденной в контейнерах Сирас при 2-8°С. Стерильный инертный газ (азот или аргон) нагнетают в мертвый объем контейнера с конечной эмульсией δΒ62 в течение по меньшей мере 15 с.

Конечная композиция эмульсии δΒ62 следующая: Туееп 80: 1,8% (об./об.) 19,4 мг/мл; сквален: 5% (об./об.) 42,8 мг/мл; а-токоферол: 5% (об./об.) 47,5 мг/мл; ΡΒδ модифицированный: №С1 121 мМ, КС1 2,38 мМ, №₂ΗΡΟ₄ 7,14 мМ, ΚΗ₂ΡΟ₄ 1,3 мМ; рН 6,8±0,1.

Пример ΙΙΙ. Клиническое испытание у взрослого населения в возрасте 18-59 лет с использованием вакцины, содержащей препарат расщепленного гриппозного антигена и две дозы адъюванта Αδ03 (Р1иЬЭ-004).

ΙΙΙ.1. Введение.

В 2006 году было проведено контролируемое рандомизированное одностороннее слепое исследование, фаза ΙΙ, у взрослого населения в возрасте 18-59 лет для оценки иммуногенности безопасности и реактогенности низкодозовой противогриппозной вакцины-кандидата ΟΙαχοδιηίΙΙιΚΙίηο БЫощсаРс (т.е. содержащей 5 мкг НА на штамм) с двумя дозами адъюванта Αδ03. Гуморальный иммунный ответ (т.е. титры антител против гемагглютинина) измеряли через 21 день после внутримышечного введения одной дозы вакцины с адъювантом Αδ03. Для сравнения использовали Ииапх™.

ΙΙΙ.2. Схема исследования.

Три группы субъектов параллельно внутримышечно получали следующую вакцину:

одна группа из 100 субъектов, получающая одну инъекцию низкодозовой расщепленной вакцины против гриппа, содержащей 5 мкг НА и адъювант Αδ03 (ПиЬЭ1/1);

одна группа из 100 субъектов, получающая одну инъекцию низкодозовой расщепленной вакцины против гриппа, содержащей 5 мкг НА и половинную дозу Αδ03 (Αδ03 1/2) (Р1иЬП1/2);

одна группа из 100 субъектов, получающих одну дозу Ииапх™ (Ииапх). Схема: одна в.м. инъекция вакцины против гриппа в день 0, посещение места исследования в день 0 и день 21 с отбором образца крови (определение антител ΗΙ) и дополнительный контакт по телефону в день 30 (заключение по результатам исследования).

Стандартная тривалентная расщепленная вакцина против гриппа Ииапх™, использованная в этом исследовании, представляет собой продаваемую с 2006/2007 года вакцину, разработанную ΝογΙΙκγπ Ηет1крйеге и производимую С1аxοδт^ΐЬΚ1^ηе БЫощсаП

ΙΙΙ.3. Задачи исследования.

ΙΙΙ.3.1. Первоочередная задача:

оценить гуморальный иммунный ответ, вызываемый исследуемыми вакцинами, в показателях титров антител против гемагглютинина.

Наблюдаемые в день 0 и день 21 переменные: титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию.

Производные переменные (с 95%-ными доверительными интервалами): средние геометрические титров (ОМТ) сывороточных антител в день 0 и день 21; уровни сероконверсии* в день 21;

факторы сероконверсии** в день 21; уровни серозащиты*** в день 0 и день 21.

* - уровень сероконверсии для ответа в виде антител против гемагглютинина определяют как процент вакцинируемых, которые имеют либо титр менее 1:10 до вакцинации и титр не менее 1:40 после вакцинации, либо титр не менее 1:10 до вакцинации и по меньшей мере четырехкратное увеличение титра после вакцинации.

** - фактор конверсии определяют как кратное увеличение ОМТ сывороточных ΗΙ после вакцинации по сравнению с днем 0;

*** - уровень серозащиты определяют как процент вакцинируемых с сывороточным титром ΗΙ не

- 38 024250 менее 1:40 после вакцинации, который обычно принимается за показатель защиты.

ΙΙΙ.3.2. Вторичная задача:

оценить безопасность и реактогенность исследуемых вакцин с точки зрения обычных локальных и общих неблагоприятных событиях, необычных неблагоприятных событиях и серьезных неблагоприятных событиях:

1. Возникновение, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией обычных местных и общих признаков и симптомов на протяжении 7-дневного периода наблюдения (т.е. день вакцинации и 6 последующих дней) после каждой вакцинации в каждой группе.

2. Возникновение, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией необычных местных и общих признаков и симптомов на протяжении 30-дневного периода наблюдения (т.е. день вакцинации и 29 последующих дней) после вакцинации в каждой группе.

3. Возникновение и взаимосвязь с вакцинацией серьезных неблагоприятных событий на протяжении всего периода исследования в каждой группе.

ΙΙΙ.4. Композиция и введение вакцины.

ΙΙΙ.4.1. Препарат вакцины.

Вакцина против гриппа без адъюванта представляет собой тривалентную инактивированную противогриппозную вакцину на основе расщепленного вириона, состоящую из трех партий моновалентного вирусного антигена (приготовленных из штаммов вируса гриппа соответственно Л/Н1N1, Α/^ΝΙ и В). Антигены, присутствующие в этой вакцине, те же, что в лицензированной вакцине Р1иапх™, которая продается как Р1иаг1х™ (а-К1х®) с 1992 года и содержит 15 мкг НА/штамм на дозу. Штаммы вируса гриппа, включенные в клинические партии Р1иЬО, представляют собой штаммы, которые были выбраны для 2006/2007 ШпНегп Нет18рйеге:

Α/№\ Са1ебоша/20/99 (НШ1)-подобный штамм: Α/№\ Са1ебоша/20/99 (НШ1)1УК-116,

Л/Αι8соη8ιη/67/2004 (Н3Ш)-подобный штамм: ЛЖ^8Соп8ш/67/2005 (Н3Ю) КУМСХ-161,

В/Ма1ау81а/2506/2004.

Антигены получают из выращенных на яйцах вирусов. Расщепление осуществляют с использованием дезоксихолата натрия перед стадией инактивации, которую проводят путем последовательного действия дезоксихолата натрия и формальдегида.

Низкодозовая вакцина против гриппа с адъювантом Α803 (Р1иЬО) (клинические партии) основана на коммерчески доступной вакцине Р1иаг1х™ (приготовленной из штаммов вируса гриппа соответственно Л/Н1N1, Α^3Ν2 и В), но с меньшим содержанием антигена и с адъювантной системой Αδ03 О8К. Α803 состоит из эмульсии типа масло в воде (8В62), которая содержит два биоразлагаемых масла, сквален и α-токоферол (витамин Е), и поверхностно-активное вещество Ро1у8отЪа1 80 (Т\ееп 80). Антигены вируса гриппа введены в водную фазу адъювантной системы простым смешиванием с эмульсией. Были протестированы два препарата, отличающиеся количеством адъюванта, введенного с антигенами Р1и в партию вакцины. Вакцины с адъювантом содержат 5 мкг гемагглютинина (НА) каждого штамма вируса гриппа на дозу, объединенного с полной дозой (Α803) или половинной дозой (Α803 1/2) адъювантной системы Α803. Эксципиенты следующие: Ро1у8отЪа1 80 (Т\ееп 80), октоксинол 10 (Ттйоп Х-100), альфатокоферилгидросукцинат, хлорид натрия, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид калия, вода для инъекций. Низкодозовые вакцины против гриппа с адъювантом Α803 (Р1иЬО, полная или половинная доза Α803) представляют собой вакцины, не содержащие консервант. Однако, они содержат следовые количества тиомерсала (менее 1,25 мкг Нд на дозу) с ранних стадий производственного процесса.

Обе они представлены в виде однодозовых вакцин в стеклянных (типа Ι) предварительно заполненных шприцах в объеме 0,5 мл/дозу.

ΙΙΙ.4.1.1. Композиция вакцины против гриппа с адъювантом Α803.

Одна доза Р1иБЭ (полная или половинная доза Α803) соответствует 0,5 мл. Композиция приведена в табл. 3. Содержание НА на дозу составляет 5 мкг для обоих препаратов, единственное различие заключается в количестве Α803, присутствующего в конечных контейнерах.

- 39 024250

Таблица 3

Композиция низкодозовой вакцины против гриппа с адъювантом А803 (полная и половинная доза А803)

Компонент	Количество на дозу (0,5 мл)
Инактивированные расщепленные вирионы - ΑΖΝθα Са1е0оп!а/20/99 (Η1Ν1) ΐνΚ-116 - АЛА/13СОП51П/67/2005 (Η3Ν2) ΝΥΜ0Χ-161 - В/Ма1ауз!а/2506/2004	5 мкг НА 5 мкг НА 5 мкг НА
Адъювант (полная доза/половинная доза)	0,250 мл 10,70 мг/5,35 мг 11,88 мг/5,94 мг 4,85 мг/2,425 мг
- эмульсия ЗВ62 (общий объем) • сквален • йк-а-токоферол • Ро1у5ОгЬа180 (Т^ееп 80)
Ро1у5ОгЬа180 (ТАееп 80)	0,122 мг
Октоксинол 10 (ΤτίΙοη Х-100)	0,0283 мг
а-Токоферилгидросукцинат	0,01665 мг
Хлорид натрия	4 мг
Г идрофосфат натрия	0,575 мг
Г идрофосфат калия	0,100 мг
Хлорид калия	0,101 мг
Вода для инъекций	до 0,50 мл

НА - гемагглютинин.

Общее содержание Ро1узогЬа1 80 соответствует 4,972 мг на дозу при использовании полной дозы А803 и 2,547 мг на дозу при использовании половинной дозы А803.

Ш.4.1.2. Изготовление препарата расщепленного инактивированного антигена вируса гриппа.

Антигены вируса гриппа идентичны антигенам, входящим в Ииапх™ (вакцина против гриппа). Моновалентные партии состоят из очищенных инактивированных расщепленных вирусов, которые получают из рабочих посевных материалов трех штаммов вируса гриппа, типа А (Η1Ν1 и Η3Ν2) и типа В, которые индивидуально выращивают в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. Эти рабочие посевные материалы происходят из штаммов, которые получены из центра сотрудничества АНО в соответствии с ежегодными рекомендациями АНО. Способ получения антигенов описан в АО 02/097072. Объемы трех моновалентных партий основаны на содержании НА, измеренном в каждой моновалентной партии перед изготовлением, и на целевом объеме производства.

10-Кратный концентрированный физиологический раствор, забуференный фосфатом (рН 7,4, когда он однократный концентрированный), и предварительную смесь Τтеееη 80 и α-токоферилгидросукцината разводят в воде для инъекций, после чего перемешивают в течение 5-30 мин при комнатной температуре. Затем три концентрированные моновалентные партии последовательно разводят в полученном физиологическом растворе, забуференном фосфатом/растворе Иуееп 80-α-токоферилгидросукцината до концентрации 20 мкг НА каждой моновалентной партии А (НДО1, Η3Ν2), 23,32 мкг НА моновалентной партии В на мл промежуточной тривалентной партии (5 мкг НА каждой моновалентной партии А и 5,83 мкг НА В/500 мкл тривалентной конечной партии).

Между добавлениями каждой моновалентной партии смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре и в течение 15-30 мин после добавления последней моновалентной партии. Эту промежуточную тривалентную партию, также называемую как до объединения, можно хранить при температуре от 2 до 8°С или дополнительно обработать на конечной стадии приготовления препарата в этот же день. Конечный объем партии до объединения составляет 250 мкл на дозу.

ΙΙΙ.4.1.3. Изготовление вакцинных композиций с адъювантом А803.

Адъювантная вакцина: ИО А803 1 /1 (табл. 4).

Модифицированный РВ8, 10-кратный концентрированный (рН 7,4, когда он однократный концентрированный; 137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ №₂НРО₄, 1,47 мМ КН₂РО₄, рН 7,4), а также смесь, содержащую Τтеееη80, ΤΓΐΙθη Х-100 и УЕ8 (количества с учетом детергента, присутствующего в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После перемешивания в течение 5-30 мин добавляют 20 мкг НА на мл каждого из штаммов Η1Ν1 и Η3Ν2 и 23,32 мкг НА на мл штамма В при перемешивании в течение 10-30 мин между каждым добавлением. После перемешивания в течение 15-30 мин небольшой объем так называемой промежуточной партии отбирают для анализа и хранят при температуре от 2 до 8°С. Промежуточная партия находится в однократном концентрированном модифицированном РВ8. Целевые концентрации детергентов составляют 488 мкг Τтеееη 80 на мл, 73,6 мкг ΤΓΐΙθη Х-100 на мл и 66,6 мкг УЕ8 на мл.

Затем готовят конечный препарат: равный объем 8В62 (см. приготовление в примере ΙΙ) добавляют к каждой 250 мкл промежуточной партии до объединения и перемешивают в течение 30-60 мин при комнатной температуре. рН доводят до значения в пределах от 6,8 до 7,5. Перед заполнением препарат продувают азотом и затем хранят при температуре от 2 до 8°С.

- 40 024250

Таблица 4

Низкодозовая вакцина с адъювантом А803

Компонент	Концентрация	Объем (мл)
Стадия 1: До объединения
Α/Νβνν СаЫогйа моновалентная партия	104 мкг/мл	302,88
ΑΛΛ/ϊδοοηδίη моновалентная партия	85 мкг/мл	370,59
В/Ма1ау51а моновалентная партия	110 мкг/мл	333,90
РВ8 модифицированный (1)	Смотри примечание	56,76
Тт/ееп 80	48000 мкг/мл	5,24
Тгйоп Х-100		Остаточный из штамма Η3Ν2
а-токоферилгидросукцинат	26480 мкг/мл	1,2
Фильтрованная вода		504,43
Общий объем = 1575 (мл) 75 мл образцов до объединения отбирают для тестирования Оставшийся объем до объединения = 1500(мл)
Стадия 2: добавление к партии до объединения
Эмульсия	\| 1500

| Общий объем конечной партии = 3000(мл)| (1) - композиция буфера конечной партии следующая:

137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ \а_;1 ΙΡΟ,, 1,47 мМ ΚΗ2ΡΟ4, рН 7,4

Адъювантная вашина: ЬБ А803 1/2 (табл. 5).

Модифицированный РВ8, 10-кратный концентрированный (рН 7,4, когда он однократный концентрированный; см. композицию, приведенную выше), а также смесь, содержащую Т^ееп80, Тгйоп Х-100 и УЕ8 (количества с учетом детергента, присутствующего в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После перемешивания в течение 5-30 мин добавляют 20 мкг НА на мл каждого из штаммов Η1Ν1 и Η3Ν2 и 23,32 мкг НА на мл штамма В при перемешивании в течение 10-30 мин между каждым добавлением. После перемешивания в течение 15-30 мин небольшой объем так называемой промежуточной партии отбирают для анализа и хранят при температуре от 2 до 8°С. Промежуточная партия находится в однократном концентрированном модифицированном РВ8. Целевые концентрации детергентов составляют 488 мкг Т\уееп 80 на мл, 73,6 мкг Тгйоп Х-100 на мл и 66,6 мкг УЕ8 на мл.

Затем готовят конечный препарат: 8В62 сначала разводят в буфере РВ8 модифицированный и перемешивают в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Равный объем этого разведенного 8В62 затем добавляют к каждой 250 мкл промежуточной партии до объединения. После перемешивания в течение 30-60 мин при комнатной температуре рН доводят до значения в пределах от 6,8 до 7,5. Перед заполнением препарат продувают азотом и затем хранят при температуре от 2 до 8°С.

Конечный объем обоих препаратов составляет 500 мкл на дозу, и конечная концентрация НА составляет 10 мкг каждой моновалентной партии А и 11,66 мкг моновалентной партии В на мл тривалентной конечной партии. Конечные целевые концентрации Т\уееп 80, Тгйоп Х-100 (остаточный от изготовления монопартии Η3Ν2) и α-токоферилгидросукцината (α-токоферилгидросукцинат представляет собой эфирную форму ККК (Б-изомер)-а-токоферол) составляют соответственно 244, 58,6 и 33,3 мкг/мл.

Таблица 5

Низкодозовая вакцина с адъювантом А803 (половинная доза адъюванта)

Компонент	Концентрация	Объем(мл)
Стадия 1: До объединения
Стадия 1: До объединения
Α/Νθ\ν Са1ес!оп1а моновалентная партия	104 мкг/мл	300,96
ΑΛΛ/ϊδοοηδϊη моновалентная партия	85 мкг/мл	368,24
В/Ма1ау51а моновалентная партия	110 мкг/мл	331,78
РВЗ модифицированный (1)	Смотри легенду	56,4
Тжееп 80	48000 мкг/мл	5,2
Τπΐοη Х-100		Остаточный из штамма Η3Ν2
а-токоферилгидросукцинат	26480 мкг/мл	1,2
Фильтрованная вода		501,22
Общий объем = 1565(мл) 65 мл образцов до объединения отбирают для тестирования Оставшийся объем до объединения = 1500(мл1
Стадия 2: добавление к партии до объединения
Эмульсия ЗВ62		750
РВЗ модифицированный (1)	Смотри легенду	75
Фильтрованная вода		675
Общий объем конечной партии = 3000( мл)

(1): Композиция буфера конечной партии следующая:

137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ ЖОТО^ 1,47 мМ КИзРО^ рН 7,4

ΙΙΙ.4.2. Введение вакцины.

- 41 024250

Вакциной заполняли стерильные стеклянные шприцы 1,25 мл типа I (РЬ. Еиг.). Каждый шприц заполняли до целевых 0,57 мл (диапазон 0,54-0,60 мл). Вакцины внутримышечно вводили в дельтовидную область не основной руки. Все вакцины были представлены в виде предварительно заполненных шприцев (0,5 мл). Для обеспечения надлежащей в.м. инъекции вакцины использовали иглу по меньшей мере 25С и длиной по меньшей мере 2,5 см.

ΙΙΙ.5. Результаты исследования у населения.

В сумме 300 субъектов были охвачены этим исследованием: по 100 субъектов в каждой из 3 групп. Средний возраст всей вакцинируемой группы в момент вакцинации составлял 36,7 лет со стандартным отклонением 13,67 лет. Средний возраст и распределение по полу субъектов в 3 вакцинируемых группах были близкими.

ΙΙΙ.6. Результаты анализа иммуногенности.

Анализ иммуногенности осуществляли в АТР когорте в отношении иммуногенности (297 субъектов).

Гуморальный иммунный ответ.

Для оценки гуморального иммунного ответа, вызываемого низкодозовой противогриппозной вакциной-кандидатом с адъювантом А803, для каждой обрабатываемой группы рассчитывали следующие параметры (с 95%-ными доверительными интервалами):

средние геометрические титров (ΟΜ^ ΗΙ антител в день 0 и день 21; уровни сероконверсии (8С) на 21 сутки; факторы конверсии в день 21; уровни защиты в день 0 и день 21.

ΙΙΙ.6.1. Средние геометрические титров ^Μ^ ΗΙ.

СΜТ для ΗΙ антител с 95% С1 представлены в табл. 6 и на фиг. 1. Скорректированные соотношения СΜТ между группами представлены в табл. 7.

СΜТ ΗΙ антител до вакцинации для всех 3 штаммов вакцин находились в пределах одного и того же диапазона в 3 обрабатываемых группах. СΜТ, обнаруженные в день 21 для групп с адъювантом, выше, чем у группы Г1иапх, для всех 3 штаммов со статистическим различием (отсутствие перекрывания 95% С1 и скорректированное соотношение СΜТ не имеет значение, равное 1) между Г1иЬ01/1 и Г1иапх в отношении штамма вакцины А^18соп8ш. Статистическое различие (скорректированное соотношение СΜТ не имеет значение, равное 1) обнаружено также для Г1иЬ01/2 и Г1иапх в отношении штамма вакцины В^акузха.

Таблица 6

Уровни серопозитивности и средние геометрические титров ^ΜΓ для антитела против НА в день 0 сутки и день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности)

Антитело	Группа	Момент времени	N	η	21 %	91/01и 951- и_	С1 ии	1/ΟΙ.	омт 951* ίί	С1 ии	Μϊη	Мах
ΑίΝ«» Са1е<1опк1	Р1иЮ1/1	РКЕ РК021)	99	80 99	80,8 100	71,7 96,3	68,0 100	31,9 475,4	23,5 352,2	43,4 641,6	<10,0 20,0	2560,0 7240,0
Р1иЬ01/2	РКЕ Р1(О21)	99 99	80 98	80,8 99,0	71,7 94,5	88,0 100	36,1 399,0	26,9 294,7	48,5 540,2	<10,0 <10,0	3620,0 7240,0
ЯиаПх	РКЕ Р1(021)	98 98	85 98	86,7 100	78,4 96,3	92,7 100	26,1 380,6	20,5 274,2	33,2 528,4	<10,0 10,0	1280,0 7240,0
АМПесоП81п	ЯиЮ1/1	РКЕ Р1(О21)	99 99	61 99	61,6 100	51.3 96.3	71,2 100	16,8 276,2	13,1 223,5	21,5 341,3	<10,0 28,0	453,0 5120,0
ЯиЮ1/2	РКЕ Р1(О21)	99 99	66	66,7 100	56,5 96,3	75,8 100	19.9 241.9	15,2 192,9	25,9 303,4	<10,0 20,0	640,0 5120,0
ПиагЬс	РКЕ ΡΙ(ϋ21)	98	58 97	59.2 99,0	46.8 94,4	69,0 100	14,7 172,3	11,6 136,4	18,6 217,6	<10,0 <10,0	320,0 5120,0
В/Ма1ауз1а	ПиШ1/1	РКЕ Р1<О21)	99 99	/2 99	/2,/ 100	62,9 96,3	81,2 100	20,4 268,6	15,9 221,3	26,1 326,0	<10,0 28,0	453,0 2560,0
Яи Ι.Ο1/2	РКЕ Р1(О21)	99 99	76 99	76,8 100	67.2 96.3	84,7 100	22,2 301,5	17,6 246,1	27,9 369,4	<10,0 28,0	320,0 3620,0
Яиапх	РКЕ Р1(О21)	98 98	76 97	77,6 99,0	68,0 94,4	85,4 100	26,5 219,2	20,9 171,4	33,6 280,2	<10,0 <10,0	320,0 5120,0

Г1и1,1)1 1 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта А803,

Г1иРП1/2 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с половинной дозой адъюванта А803,

Г1иапх - вакцина Ииапх,

СΜТ - среднее геометрическое титра антител,

N - количество субъектов с имеющимися результатами, п/% - количество/процент серопозитивных субъектов (титр ΗΙ>1:10),

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, 1,1, - нижний предел, иЬ - верхний предел, Μιη Иах - минимум/ максимум,

РКЕ - до вакцинации в день 0,

ΡΙ (021) - после вакцинации в день 21.

- 42 024250

Таблица 7

Скорректированные соотношения ОМТ между группами для каждого штамма вакцины в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности)

Антитело	Описание группы	N	Скоррект. ОМТ	Описание группы	N	Скоррект. ОМТ	Скорректированное соотношение ОМТ
							Порядок соотношения	Значе ние	9С кк	%С1 ик
АЛЧеж	Р1икО1/1	99	472,4	Р1и1Л1/2	99	385,0	ΗυίϋΙ/1 /Р1икО1/2	1,23	0,80	1,88
Са1е<1опй	Р1иШ1/1	99	472,3	Р)иапх	98	398,9	Р1иЮ1/1 /РШапх	1,19	0,78	1,82
<1/Мк»	Р1и1Х>1/2	99	385,0	Р!иапх	98	397,0	Р1иЮ1/2 /РШапх	0,97	0,63	1,49
АМПасопыл	РЮЦЭ1/1	99	277,3	ΡΙυίΟ1/2	99	230,0	Р1икО1/1 Л=1иЮ1/2	1,21	0,90	1,62
(1/ΟΙ1.)	Р1иШ1/1	99	277,5	ΡΙιιβιΙχ	98	180,8	Р1иШ1/1 /Р1иаг1х	1,54	1,14	2,06
	РЮкО1/2	99	230,0	Р1иапх	98	180,8	Р1икО1/2/Р1иапх	1,27	0,95	1,71
Б/Ма1ауз1а	ρκιίΌΐ/ι	99	275,1	Рк1Ш1/2	99	303,4	Р1иЬ01/1 /Р1икО1/2	0,91	0,68	1,22
(1/ΟΙΙ.)	Р1икО1/1	99	275,2	Р!иапх	98	212,7	Р1икО1/1 /Р1иапх	1,29	0,96	1,74
	Р1иШ1/2	99	303,4	Ρΐιιβιΐχ	98	212,6	Р1иШ1/2/Ииапх	1,43	1,06	1,92

ΓΊιιΙ,Ι)! I - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта Α803,

ΓΊιιΙ,1)1 2 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с половинной дозой адъюванта Α803,

Ииапх - вакцина Ииапх, скоррект. ОМТ - среднее геометрическое титров антител, скорректированное по исходному титру, Ν - количество субъектов с имеющимися результатами до и после вакцинации,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал для скорректированного соотношения,

ОМТ (модель Αηсονа: корректировка по исходному титру - пул дисперсий с более чем 2 группами); 1,1, - нижний предел, иЬ - верхний предел.

ΙΙΙ.6.2 Факторы сероконверсии титров антител против ΗΙ, уровни серозащиты и уровни сероконверсии (корреляты для защиты, которые установлены для вакцины против гриппа для людей).

Результаты представлены в табл. 8 и на фиг. 2 для уровней серозащиты, в табл. 9 и на фиг. 3 для уровней сероконверсии и в табл. 10 и на фиг. 4 для факторов конверсии.

Пороговое значение, требуемое Европейскими официальными органами по уровням серозащиты (70%), достигалось во всех группах (по меньшей мере 94,9%). Для каждого штамма вакцины уровни серозащиты в день 21 для 3 групп находились в пределах одного и того же диапазона.

Пороговое значение, требуемое Европейскими официальными органами по уровням сероконверсии (40%), достигалось во всех группах (по меньшей мере 65%).

В отношении штамма вакцины Α/Νον Са1е6оша, 8СК в день 21 для 3 групп находились в пределах одного и того же диапазона.

В отношении штамма вакцины Α/Α^5сοη5^η. §СК в день 21 для группы ИцЬП1/1 были выше по сравнению с группой Ииапх. §СК в день 21 для группы ИиЬП1/2 находились в пределах одного и того же диапазона по сравнению с группой Ииапх.

В отношении штамма вакцины В/Ма1ау81а, 8СК в день 21 для группы ИцЬП1/2 были выше по сравнению с группой Ииапх. §СК в день 21 для группы ИиЬП1/1 находились в пределах одного и того же диапазона по сравнению с группой Ииапх.

Пороговое значение, требуемое Европейскими официальными органами по факторам сероконверсии (2,5), достигалось во всех группах (по меньшей мере 6,2).

В отношении штамма Α/№ν Са1е6оша представляется, что 8СР в день 21 для 3 групп находятся в пределах одного и того же диапазона. Наблюдаемое значение для группы ИцЬП1/2 было ниже, чем наблюдаемое значение для группы Ииапх, но это можно объяснить более высоким уровнем серозащиты до вакцинации в группе ИцЬП1/2.

В отношении штамма вакцины Α^/Αίδ^^ω, §СИ в день 21 для группы ИцЬП1/1 были выше, чем в группе Ииапх. §СИ в день 21 для группы ИиЬП1/2 находились в пределах одного и того же диапазона по сравнению с группой Ииапх.

В отношении штамма В/Ма1ау81а 8СИ в день 21 для двух групп с адъювантом были выше, чем в группе Ииапх.

- 43 024250

Таблица 8

Уровни серозащиты (8РК) для титра ΗΣ антител в день 0 и в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности)

Штамм вакцины	Г руппа	Момент времени	N	5РК
п	%	95% С!
и_	υί
Α/Νβνν Са1ес1ота	НиЮ1/1	РКЕ	99	41	41,4	31,6	51,8
		ΡΙ(ϋ21)	99	95	96,0	90,0	98,9
	Е1иЕО1/2	РКЕ	99	55	55,6	45,2	65,5
		Р1(021)	99	97	98,0	92,9	99,8
	Ииапх	РКЕ	98	35	35,7	26,3	46,0
		ΡΙ(ϋ21)	98	93	94,9	88,5	98,3
ΑΛνΐδοοηδίη	НиЮ1/1	РКЕ	99	32	32,3	23,3	42,5
		ΡΙ(ϋ21)	99	97	98,0	92,9	99,8
	НиЮ1/2	РКЕ	99	37	37,4	27,9	47,7
		ΡΙ(ϋ21)	99	97	98,0	92,9	99,8
	Ииапх	РКЕ	98	25	25,5	17,2	35,3
		Р1(021)	98	93	94,9	88,5
В/Ма1ау$>а	НиЮ1/1	РКЕ	99	31	31,3	22,4	41,4
		ΡΙ(ϋ21)	99	97	98,0	92,9	99,8
	НиЮ1/2	РКЕ	99	39	39,4	29,7	49,7
		Р1(021)	99	98	99,0	94,5	100
	Ииапх	РКЕ	98	44	44,9	34,8	55,3
		Р1(Э21)	98	94	95,9	89,9	98,9

ΓΊιιΙ,Ι)|·| - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта А803,

ΓΊιιΙ,Ι)1'2 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с половинной дозой адъюванта А803,

Ииапх - вакцина Ииапх,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами, п/% - количество/процент субъектов с серозащитой (титр Ш>40 1/ΌΓΚ),

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, И. - нижний предел, ИЬ - верхний предел, РКЕ - до вакцинации в день 0,

II (Ό1) - после вакцинации в день 21,

Источник данных - прилагаемая таблица ША

Таблица 9

Уровень сероконверсии (8СК) для титра ΗΣ антител в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности)

Штамм вакцины	Группа	N	5СК
η	%	95% С!
ίί	υί
А/Νβν/ Са1ебоП1а	НиЮ1/1	99	69	69,7	59,6	78,5
	НиШ1/2	99	64	64,6	54,4	74,0
	Ииапх	98	66	67,3	57,1	76,5
Α/Μΐδοοπδίη	НиЮ1/1	99	88	88,9	81,0	94,3
	НиЮ1/2	99	79	79,8	70,5	87,2
	Ииапх	98	73	74,5	64,7	82,8
В/Ма!ау$1а	НиЮ1/1	99	76	76,8	67,2	84,7
	НиЮ1/2	99	82	82,8	73,9	89,7
	Ииапх	98	65	66,3	56,1	75,6

ИиЬИ1/1 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта А803,

ИиЬИ1/2 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с половинной дозой адъюванта А803,

Ииапх - вакцина Ииапх, сероконверсия определена как:

для изначально серонегативных субъектов титр антител>40 1/МЬ после вакцинации, для изначально серопозитивных субъектов титр антител после вакцинации >4-кратному титру антител до вакцинации,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами до и после вакцинации, п/% - количество/процент субъектов с сероконверсией,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, И. - нижний предел, ИЬ - верхний предел

Таблица 10

Фактор сероконверсии (8СР) для титра ΗΊ антител в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности)

Штамм вакцины	Г руппа	N	5СР
Значе- ние	95% С!
ίί	υί
Α/Νθ\ν Са!ес!оп1а	Ηυίϋ1/1	99	14,9	10,4	21,3
	Ηυίϋ1/2	99	11,0	7,7	15,9
	Ииапх	98	14,6	9,9	21,6

- 44 024250

Штамм вакцины	Г руппа	N	ЗСР
Значе- ние	95% С1
ьь	иь
ΑΛΛ/ΐδθοηδίη	Р1иЮ1/1	99	16,5	13,0	20,9
	Р1иЮ1/2	99	12,2	9,2	16,1
	Ниалх	98	11,7	8,8
В/Ма1ау51а	НиШ1/1	99	13,2	10,0	17,4
	НиШ1/2	99	13,6	10,2	18,0
	Ниалх	98	8,3	6,2	11,0

ΓΊιιΙ,Ι)1 2 - низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с половинной дозой адъюванта Α803,

Р1иапх - вакцина Пиапх,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами до и после вакцинации,

8СР - фактор сероконверсии или соотношение средних геометрических (среднее[1о§ 10(ΡΙ(Ό21 )/РРЕ)]),

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, РЬ - нижний предел, иЬ - верхний предел.

ΙΙΙ.7. Выводы по безопасности.

Более высокая реактогенность с точки зрения обычных (локальных/общих) и необычных симптомов в группах с адъювантной вакциной по сравнению с группой Р1иапх наблюдалась в этом исследовании. Уменьшение содержания Α803 в адъювантной вакцине оказывает значительное влияние на все общие симптомы и на локальные симптомы 3 степени. Возникновение необычных симптомов выше в группе с адъювантной вакциной (55% и 47% субъектов) по сравнению с группой Р1иапх (35%). Из этих результатов можно сделать вывод, что профиль реактогенности и безопасности для вакцин-кандидатов является удовлетворительным и клинически приемлемым.

ΙΙΙ.8. Общие выводы.

ΙΙΙ.8.1. Результаты в отношении иммуногенности.

Основная задача этого исследования заключалась в том, чтобы оценить гуморальный иммунный ответ (титры антител против ΗΙ), вызываемый низкодозовой вакциной против гриппа с двумя разными концентрациями адъюванта Α803 и вызываемый вакциной Р1иапх.

В день 21 три вакцины превышали требования Европейских официальных органов, касающиеся ежегодной регистрации противогриппозных вакцин на основе расщепленного вириона (№1е Гог Ошбапсе оп ИагтотхаНоп оГ тсдштстсШз Гог тЛисп/а Уасстс8 Гог 1Ьс 1ттипо1одюа1 а88С88тсп! оГ аппиа1 81гат сЬапдсз - СРМР/В^Р/214/96). ОМТ обнаруживают тенденцию к повышению в группах с адъювантом по сравнению с группой Р1иапх, со статистически значимым различием, наблюдаемым для штаммов Α/’νί8^ιΐ8ίιι (Р1иЬП1/1 по сравнению с Р1иапх) и В/Ма1ау81а (Р1иЬП1/2 по сравнению с Р1иапх). Аналогичные уровни серозащиты имели место во всех трех группах вакцин, и эти уровни находятся в диапазоне от 94,9 до 99%. Обнаружено, что уровни сероконверсии и факторы сероконверсии выше в группе с адъювантом по сравнению с группой Р1иапх. Данные этого исследования также выявили, что иммуногенность, индуцируемая вакциной с половинной дозой адъюванта Α803, сопоставима с иммуногенностью, индуцируемой вакциной с полной дозой адъюванта.

ΙΙΙ.8.2. Результаты в отношении реактогенности и безопасности.

Введение низкодозовой противогриппозной вакцины-кандидата с адъювантом Α803 было безопасным и клинически хорошо переносилось в исследуемой группе населения, т.е. взрослыми людьми в возрасте от 18 до 59 лет. Вакцина с половинной дозой адъюванта продемонстрировала значительное снижение случаев обычных локальных и общих симптомов по сравнению с вакциной, содержащей полную дозу адъюванта.

Пример Ιν. Предклиническая оценка расщепленных вакцин против гриппа с адъювантом и без адъюванта (содержащих различные дозы адъюванта Α803) у примированных мышей βΑβ-βΑ;.

Ιν. 1. Схема и задача эксперимента.

Для оценки увеличения гуморальных ответов благодаря Α803, вызываемых вакцинами против гриппа в виде эмульсии масло в воде, были проведены эксперименты на примированных вакциной против гриппа мышах. Для того чтобы быть ближе к ситуации человека (люди являются серопозитивными вследствие повторяющейся инфекции дрейфующими штаммами приблизительно каждые два года), этот эксперимент проводили с использованием животных, которых примировали гетеросубтипическими штаммами. Гетеросубтипическое примирование также представляет собой более строгую модель по сравнению с примированием гомотипическими штаммами и является более хорошей моделью, чтобы выявить различие между разными адъювантами.

Ιν.1.1. Обработка/группа (табл. 11).

Группу из 27 взрослых самок мышей ВΑ^В/с примировали интраназально (объем 20 мкл) в день 0 тривалентным цельным формалин-инактивированным вирусом гриппа (5 мкг НА для каждого штамма). Примирующие штаммы состояли из более ранних дрейф-вариантов (5 мкг НА цельный инактивированный Η1Ν1 Α/^οЬаηηс8Ьи^§/82/96, Η3Ν2 Α/8у<^ηсу/5/97, В/ИагЬ1п/7/94) по отношению к включенным в

- 45 024250 вакцину. Через 28 суток мышей внутримышечно вакцинировали разовой дозой вакцины-кандидата общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали препаратами, содержащими только расщепленные антигены (тривалентная расщепленная простая), или препаратами, содержащими расщепленные антигены с двумя дозами адъюванта А803 (полная или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены Η1Ν1 Λ/№\ν Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 А/Раиата/2007/99, В/8йаидбоид/7/97 (1,5 мкг/штамм, 1/10 дозы для человека).

Таблица 11

Гр.	Ангиген/Препарат	Другая обработка
1	Т ривалентный расщепленный/простой (без адъюванта)	Гетерологичное примирование 00 (день 0)
2	Тривалентный расщепленный/А503	Гетерологичное примирование 00
3	Тривалентный расщепленный/А803 1/5	Гетерологичное примирование 00

^.1.2. Приготовление вакцинных препаратов.

Предварительную смесь Ттеееи 80, Тгбои Х100 и сукцината витамина Е (УЕ8) готовят так, чтобы достигалась конечная концентрация в вакцине 750 мкг/мл Ттеееи 80, 110 мкг/мл Тп1ои Х100 и 100 мкг/мл УЕ8. Количества, используемые в предварительной смеси, рассчитывают с учетом количеств детергента и УЕ8, уже присутствующих в штаммах. Приготовление одного литра 10-кратного концентрированного физиологического раствора (РВ8 рН 7,4): к 0,800 л воды для инъекций добавляют №С1 80 г, КС1 2 г, Nа₂ΗРО4 11,44 г, КН₂РО₄ 2 г. После солюбилизации и доведения водой для инъекций до объема 1,0 л рН после 10-кратного разведения составляет 7,4.

Тривалентный расщепленный/простой.

Препарат одной дозы 50 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекции+физиологический раствор (10-кратный концентрированный РВ8, рН 7,4)+предварительная смесь, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин при комнатной температуре, +1,5 мкг штамма НА НШ1, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +1,5 мкг штамма НА ^N2, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +1,5 мкг НА штамма В, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре. Препараты инъецируют в пределах одного часа после окончания их приготовления.

Тривалентный расщепленный/А803.

Предварительную смесь Ттеееи 80, Тп1ои Х100 и сукцината витамина Е (УЕ8) готовят так, чтобы достигалась конечная концентрация в вакцине 750 мкг/мл Ттеееи 80, 110 мкг/мл Тп1ои Х100 и 100 мкг/мл УЕ8. Количества, используемые в предварительной смеси, рассчитывают с учетом количеств детергента и УЕ8, уже присутствующих в штаммах.

Препарат одной дозы 50 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекции+физиологический раствор (10-кратный концентрированный РВ8 рН 7,4)+предварительная смесь, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин при комнатной температуре, +1,5 мкг штамма НА НШ1, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +1,5 мкг штамма НА ^N2, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +1,5 мкг НА штамма В, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре, +25 мкл эмульсии 8В62 для полной дозы А803 или 5 мкл эмульсии 8В62 для 1/5 дозы А803, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре. Препараты инъецируют в пределах одного часа после окончания их приготовления.

£ν.1.3. Считывание данных (табл. 12).

Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию измеряли перед иммунизацией (день 28) и через 14 дней после иммунизации (27 мышей/группу). Образцы сыворотки крови тестировали на ингибирование гемагглютинации (Н^.

Таблица 12

Считывание	Момент времени	Тип образца	Метод анализа
Гуморальный ответ	День 28, день 42	Сыворотка крови	ΙΗΑ (реакция непрямой гемагглютинации)

!У.2. Результаты.

Σν.2.1. Гуморальный иммунитет.

Результаты представлены на фиг. 5. В этой мышиной модели гетеросубтипического примирования с последующей разовой вакцинацией было продемонстрировано, что А803 и его разведения индуцируют более высокие титры Н по сравнению с простой вакциной. Для всех штаммов вируса гриппа А выявлено статистически значимое увеличение титров Н (р<0,05). Для штамма НШ1 также наблюдалось значи- 46 024250 тельное увеличение титров ΗΙ между А803 и А803 1/5 (р<0,05). Уменьшенная доза А803 не увеличивала титры ΗΙ для штамма В по сравнению с простой вакциной. Очень низкие ответы наблюдались против штамма В (В/8Ьапдбопд); это, вероятно, является следствием значительного антигенного дрейфа между штаммами В, использованными для примирования и для вакцины.

IV. 3. Обобщение результатов и выводы.

В заключение, увеличение титров ΗΙ выявлено у животных, примированных гетеросубтипическими штаммами с использованием вакцины с адъювантом А803 по сравнению с простой вакциной. Полная доза А803 оптимальна для достижения устойчивых титров ΗΙ против всех трех штаммов вакцины против гриппа.

Пример У. Предклиническая оценка расщепленных вакцин против гриппа с адъювантом и без адъюванта (содержащих различные дозы адъюванта А803) у примированных мышей С57ВЕ6.

V. 1. Схема и задача эксперимента.

Эксперименты на примированных антигеном вируса гриппа мышах были проведены для оценки увеличения гуморального и клеточного ответов благодаря А803, вызываемых вакцинами против гриппа, приготовленными с этим адъювантом в виде эмульсии масло в воде. Чтобы быть ближе к ситуации человека, эксперимент проводили с использованием мышей, примированных гетеросубтипическими штаммами.

У.1.1. Обработка/группа (табл. 13).

Группу из 25 взрослых самок мышей С57ВЕ6 примировали интраназально (объем 20 мкл) в день 0 тривалентным цельным формалин-инактивированным вирусом гриппа (5 мкг НА для каждого штамма). Примирующие штаммы состояли из более ранних дрейф-вариантов (5 мкг НА полная инактивированная Η1Ν1 А/Веут§/262/95, Η3Ν2 АЖапата/2007/99, В/8Ьапдбопд/7/97) по отношению к включенным в вакцину. Через 28 дней мышей внутримышечно вакцинировали разовой дозой вакцины-кандидата общим объемом 100 мкл. Мышей иммунизировали препаратами, содержащими только расщепленные антигены (тривалентная расщепленная простая), или препаратами, содержащими расщепленные антигены с тремя дозами адъюванта А803 (полная, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены Η1Ν1 А/№\у Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 А/Νθλν Уогк/55/2004, В/Лап§8и/10/2003 (1,5 мкг/штамм, 1/10 дозы для человека).

Таблица 13

Группа	Антиген/Препарат	Другая обработка
1	Тривалентный расщепленный/простой (без адъюванта)	Гетерологичное примирование день 0
2	Тривалентный расщепленный/А$03	Гетерологичное примирование день 0
3	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ 1/2	Гетерологичное примирование день 0
4	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ1/5	Гетерологичное примирование день 0

5

РВЗ

Гетерологичное примирование день 0

У.1.2. Приготовление вакцинных препаратов.

Тривалентный расщепленный/простой.

Препараты для дозы 100 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекций+физиологический раствор (10-кратный концентрированный ΡΒ8, рН 7,4, приготовленный как описано в примере Ι^^Ρ^^ Ьо1 ПРЬиА014 (1,5 мкг на штамм в конечной дозе).

Тривалентный расщепленный/А803.

Препараты для дозы 100 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекций+физиологический раствор (10-кратный концентрированный ΡΒ8 рН 7,4, приготовленный как описано в примере !У)+Р1иаг1х Ьо1 ПРЬиА014 (1,5 мкг на штамм в конечной дозе)+25 мкл эмульсии 8В62 для полной дозы или 12,5 мкл эмульсии 8В62 для 1/2 дозы или 5 мкл эмульсии 8В62 для 1/5 дозы. Препараты инъецируют в течение часа после окончания их изготовления.

У.1.3. Считывание данных (табл. 14).

Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию измеряли через 21 день после иммунизации (10 мышей/группу), и образцы сыворотки крови тестировали на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ). Клеточный иммунный ответ (15 мышей на группу) тестировали через 7 дней после иммунизации методом окрашивания внутриклеточных цитокинов ^С8).

Таблица 14

Считывание данных	Момент времени	Тип образца	Метод анализа
Гуморальный ответ	День 49	Сыворотка крови	ΙΗΑ
Клеточный ответ	День 35	РВМС	1СЗ

- 47 024250

ν.2. Результаты.

ν.2.1. Гуморальный иммунитет (10 мышей/группу).

Результаты представлены на фиг. 6. В этой мышиной модели гетеросубтипического примирования с последующей единственной вакцинацией было продемонстрировано, что Α803 и его разведения (1/2 и 1/5) вызывают более высокие титры Ш по сравнению с простой вакциной. Для всех трех штаммов не выявлено статистически значимого различия титров Ш между мышами, получившими вакцину с полной дозой адъюванта Α803 или с уменьшенными дозами Α803.

ν.2.2. Клеточный иммунитет (15 мышей/группу).

Результаты представлены в фиг. 7. Независимо от разведения Α803 более высокие СБ4+Тклеточные ответы обнаружены у мышей, иммунизированных тривалентной расщепленной вакциной с адъювантом Α803, по сравнению с мышами, иммунизированными тривалентной расщепленной простой вакциной. По сравнению с ответом, вызываемым у мышей, иммунизированных тривалентной расщепленной вакциной с полной дозой адъюванта Α803, наблюдалась тенденция к снижению клеточного ответа при иммунизации мышей тривалентной расщепленной вакциной с меньшими дозами адъюванта Α803.

ν.3. Обобщение результатов и выводы.

В заключение, увеличение гуморального и клеточного ответов обнаружено у животных, примированных гетеросубтипическими штаммами с использованием вакцины с адъювантом Α803, по сравнению с простой вакциной. Близкий порядок гуморального ответа обнаружен у мышей, иммунизированных полной дозой или долями полной дозы адъюванта Α803. Тем не менее, уменьшение дозы адъюванта ассоциировалось с тенденцией к снижению величины СБ4+Т-клеточного ответа.

Пример VI. Предклиническая оценка клеточного иммунного ответа, вызываемого расщепленными вакцинами против гриппа с адъювантом и без адъюванта (содержащими различные дозы адъюванта Α803 и низкую дозу антигена) у примированных мышей С57ВГ6.

VI. 1. Схема и задача эксперимента.

Эксперименты на примированных антигеном вируса гриппа мышах были проведены с целью оценки увеличения клеточного иммунного ответа благодаря Α803, вызываемого вакцинами против гриппа, содержащими низкую дозу антигена (0,5 мкг/штамм, 1/30 дозы для человека) и приготовленными с этим адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде. Чтобы быть ближе к ситуации человека, эксперимент проводили с использованием мышей, примированных гетеросубтипическими штаммами.

νΣ.1.1. Обработка/группа (табл. 15).

Группу из 15 взрослых самок мышей С57ВГ6 примировали интраназально (объем 20 мкл) в день 0 тривалентным цельным формалин-инактивированным вирусом гриппа (5 мкг НА для каждого штамма). Примирующие штаммы состояли из более ранних дрейф-вариантов (5 мкг НА цельный инактивированный Η1Ν1 Α/Βοίρη§/262/95. Η3Ν2 Α/Раηата/2007/99, Β/δΗπηβάοηβ/7/97) по отношению к включенным в вакцину. Через 28 дней мышей внутримышечно вакцинировали разовой дозой вакцины-кандидата общего объема 50 мкл. Мышей иммунизировали препаратами, содержащими только расщепленные антигены (тривалентная расщепленная простая), или препаратами, содержащими расщепленные антигены с тремя дозами адъюванта Α803 (полная, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизаций, включали вирусные антигены Η1Ν1 Α/Νο\ν Са1сάοη^а/20/99. Η3Ν2 Α/Νο\ν ΥογΚ/55/2004, Β/^^аη§8и/10/2003 (1,5мкг/штамм, 1/10 дозы для человека).

Таблица 15

Гр.	Антиген/Препарат	Другая обработка
1	Тривалентный расщепленный/простой (без адъюванта)	Гетерологичное примирование день 0
2	Тривалентный расщепленный/А503	Гетерологичное примирование день 0
3	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ 1/2	Гетерологичное примирование день 0
4	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ 1/5	Гетерологичное примирование день 0
5	РВЗ	Гетерологичное примирование день 0

νΣ.1.2. Приготовление вакцинных препаратов.

Тривалентный расщепленный/простой.

Препараты для дозы 50 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекций+физиологический раствор (10-кратный концентрированный РВ8, рН 7,4, приготовленный как описано в примере Ш)+Р1иап\ Γοΐ ΌΡΓυΑ014 (0,5 мкг на штамм в конечной дозе).

Тривалентный расщепленныйМ^Э.

Препараты для дозы 50 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекции+физиологический раствор (10-кратный концентрированный РВ8 рН 7,4, приготовленный как описано в примере Ш)+Р1иап\ Γοΐ ΌΡΓυΑ014 (0,5 мкг на штамм в конечной дозе)+25 мкл эмульсии 8В62 для полной дозы или 12,5 мкл эмульсии 8В62 для 1/2 дозы, или 5 мкл эмульсии 8В62 для 1/5 дозы. Препараты инъецируют в пределах одного после окончания их приготовления.

- 48 024250

У1.1.3. Считывание данных (табл. 16).

Клеточный иммунный ответ тестировали через 7 дней после иммунизации методом окрашивания внутриклеточных цитокинов.

Таблица 16

Считывание	Момент времени	Тип образца	Метод анализа
Клеточный ответ	День 35	РВМС	1СЗ

У1.2. Результаты.

У1.2.1. Клеточный иммунитет.

Результаты представлены на фиг. 8. Минимально повышенные СИ4+ Т-клеточные ответы выявлены у мышей, иммунизированных тривалентной расщепленной вакциной с адъювантом А803 (полная доза или 1/2 дозы), по сравнению с мышами, иммунизированными тривалентной расщепленной простой вакциной. По сравнению с ответом, вызываемым у мышей, иммунизированных тривалентной расщепленной простой вакциной или вакциной с полной дозой или половинной дозой адъюванта А803, более высокие клеточный ответы наблюдались при иммунизации мышей тривалентной расщепленной вакциной с 1/5 дозы адъюванта А803.

VI. 3. Обобщение результатов и выводы.

В заключение, минимальное увеличение СИ4+ Т-клеточных ответов выявлено у животных, примированных гетеросубтипическими штаммами с использованием вакцин с адъювантом А803 по сравнению с простой вакциной. В этом эксперименте не обнаружен ответ на дозу адъюванта, и, действительно, 1/5 дозы А803 индуцировала более высокую частоту встречаемости антигенспецифических СИ4+ Т-клеток, чем при более высоких дозах адъюванта. В общем, эти данные, полученные с использованием 0,5 мкг НА на штамм, не сходятся с данными, полученными в других предклинических экспериментах с использованием 1,5 мкг НА на штамм.

Пример VII. Предклиническая оценка расщепленной вакцины Η5Ν1 с адъювантом и без адъюванта (содержащей различные дозы адъюванта А803 и антигена) у наивных мышей С57В1/6.

VII. 1. Схема и задача эксперимента.

Эксперименты на Н5Ш-наивными мышах были проведены с целью оценки увеличения гуморального и клеточного иммунного ответов благодаря А803, вызываемых расщепленными вакцинами Η5Ν1, приготовленными с этим адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде. В случае пандемии ожидается, что все население в мире будет иммунологически наивным по отношению к новому циркулирующему пандемическому штамму вируса гриппа. Ввиду этого наивного иммунного статуса пандемическая вакцина вероятно потребует две дозы вакцины для защиты индивидуумов от инфекции и тяжелого заболевания, вызываемого новым штаммом вируса гриппа. Чтобы воспроизвести это отсутствие предыдущего воздействия, была разработана модель наивных мышей для оценки иммуногенности вакцины.

УП.1.1. Обработка/группа (табл. 17).

Группу из 15 взрослых самок наивных мышей С57ВЧ6 внутримышечно иммунизировали в день 0 и день 21 пандемической вакциной-кандидатом Η5Ν1 в общем объеме 50 мкл. Мышей иммунизировали препаратами, содержащими только расщепленные антигены Η5Ν1 (Η5Ν1 расщепленный простой), или препаратами, содержащими расщепленные антигены с различными дозами адъюванта А803 (двойная, полная, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусный антиген Η5Ν1 А/У1е!пат/1194/04 (1,5 или 0,38 мкг/штамм, соответствующие 1/10 дозы для человека). Препарат с двойной дозой А803 не готовили, а делали одновременную инъекцию одна 50 мкл доза расщепленного Н5Ш/полная доза А803+одна 50 мкл доза А803.

Таблица 17

Группа	Антиген / Препарат	Доза антигена
1	Η5Ν1 расщепленный/простой (без адъюванта)	1,5 мкг
2	Η5Ν1 расщепленный/двойная доза АЗОЗ	1,5 мкг
3	Η5Ν1 расщепленный/АЗОЗ	1,5 мкг
4	Η5Ν1 расщепленный/АЗОЗ ΛΙ2	1,5 мкг
5	Η5Ν1 расщепленный/АЗОЗ 1/5	1,5 мкг
6	Η5Ν1 расщепленный/простой (без адъюванта)	0,38 мкг
7	Η5Ν1 расщепленный/двойная доза АЗОЗ	0,38 мкг
8	Η5Ν1 расщепленный/АЗОЗ	0,38 мкг
9	Η5Ν1 расщепленный/АЗОЗ 1/2	0,38 мкг
10	Η5Ν1 расщепленный/АЗОЗ 1/5	0,38 мкг
11	РВЗ

УП.1.2. Приготовление вакцинных препаратов.

Приготовление одного литра буфера конечной партии (РВ8 рН 7,2±0,2): к 0,800 л воды для инъекций добавляют №С1 7,699 г, КС1 0,200 г, М§С1₂х6Н₂О 0,100 г, №₂ОТО₄х12 Н₂О 2,600 г, К^РО₄ 0,373 г. После солюбилизации доводят до 1,0 л водой для инъекций.

- 49 024250

Η5Ν1 расщепленный/простой.

Приготовление дозы 50 мкл.

Тиомерсал (количества с учетом его концентрации в штамме) и Тпйоп Х100 добавляют к буферу конечной партии. Ттеееп 80 не добавляют, так как целевое содержание в препарате достигается за счет концентрации Ттеееп в штамме. Конечные концентрации составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 368 мкг/мл для Ттеееп 80 и 35 мкг/мл для Тпйоп Х100 в дозе препарата 1,5 мкг. Они составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 93 мкг/мл для Ттеееп 80 и 8,9 мкг/мл для Тпйоп Х100 в дозе препарата 0,38 мкг. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 5-30 мин добавляли 1,5 или 0,38 мкг НА (штамм Η5Ν1). Препараты перемешивают в течение 30-60 мин. Проверяют рН. Инъекции делают в пределах одного часа после завершения приготовления препарата.

Η5Ν1 расщепленный/А803.

Приготовление дозы 50 мкл.

Тиомерсал (количества с учетом его концентрации в штамме) и Тпйоп Х100 добавляют к буферу конечной партии. Ттеееп 80 не добавляют, так как целевое содержание в препарате достигается за счет концентрации Ттеееп в штамме. Конечные концентрации составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 368 мкг/мл для Т\\'ееп 80 и 35 мкг/мл для Тпйоп Х100 в дозе препарата 1,5 мкг. Они составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 93 мкг/мл для Ттеееп 80 и 8,9 мкг/мл для Тпйоп Х100 в дозе препарата 0,38 мкг. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 5-30 мин добавляют 1,5 или 0,38 мкг НА (штамм Η5Ν1). Препараты перемешивают в течение 30-60 мин, а затем добавляют 25, или 12,5, или 5 мкл эмульсии 8В62. Проверяют рН. Инъекции делают в пределах одного часа после завершения приготовления препарата.

νΠ.1.3. Считывание данных (табл. 18А).

Гуморальный иммунный ответ измеряли через 14 дней после иммунизации (10 мышей/группу) титрами антител против Щ, ^О! и ^О2Ь (фиг. 9, А-Р). Гуморальный иммунный ответ также измеряли в день 21 после иммунизации (10 мышей/группу) в анализе на ингибирование гемагглютинации антителами против Η5Ν1 (фиг. 10, А-В).

Клеточный иммунный ответ тестировали через 6 дней после иммунизации (5 пулов из 3 мышей на группу) методом окрашивания внутриклеточных цитокинов ЦС8) антиген-специфических ΟΩ4+ Тклеток, подсчитанных методом проточной цитометрии (фиг. 11, А-В).

Таблица 18А

Считывание данных	Момент времени	Тип образца	Метод анализа
Гуморальный ответ	День 42	Сыворотка крови	ЕЫЗА, изотипы и титры ΗΙ
Клеточный ответ	День 47	РВМС	1СЗ

νΊΓ2. Результаты.

νΊΓ2.1. Гуморальный иммунный ответ: ЕЫ8А и изотипы Результаты представлены в фиг. 9 и в табл. 18В.

Таблица 18В

	Η5Ν1 расщеп- ленная ПРОСТАЯ	Η5Ν1 расщеп- ленная 2ХА503	Η5Ν1 расщеп- ленная АЗОЗ	Η5Ν1 расщеп- ленная А303/2	Η5Ν1 расщеп- ленная АЗОЗ/5	РВЗ
1д Ответ (ΕΙ.Ι8Α медианные титры)
1,5 мкг/Мышь	177	81680	59734	67772	57697	50
0,38 мкг/мышь	120	91319	76144	49162	54566
1дО1 Ответ (ЕЫЗА медианные титры)
1,5 мкг/мышь	124	54683	44965	40558	39854	50
0,38 мкг/мышь	144	62445	44381	31855	39269
1дО2Ь Ответ (ЕЫ8А титры для средней точки)
1,5 мкг/мышь	190	10928	10625	11215	7903	79
0,38 мкг/мышь	60	20993	12617	9352	9565
Соотношение 1дО1/1дО2Ь
1,5 мкг/мышь	0,7	5	4,2	3,6	5	0,6
0,38 мкг/мышь	2,4	3	3,5	3,4	4,1

При каждой дозе расщепленной вакцины Η5Ν1 во всех группах с адъювантом были индуцированы более высокие титры антител Щ, ЩОй и ЩО2Ь против Η5Ν1 по сравнению с расщепленной вакциной Η5Ν1 без адъюванта (фиг. 9 А-Р). При каждой дозе расщепленной вакцины Η5Ν1 ответ в виде антитела ^Ой против Η5Ν1 был в 4-5 раз выше, чем ответ в виде антитела ^О2Ь против Η5Ν1 (фиг. 9 С-Р). При использовании дозы 1,5 мкг НА расщепленной вакцины Η5Ν1 и объединенной с каждой дозой адъюванта не выявлено никакого различия в ответах в виде антител Щ, ЩО и ЩО2Ь против Η5Ν1 (фиг. 9-А, С и

- 50 024250

Е). При использовании расщепленной вакцины Η5Ν1 с дозой 0,38 мкг НА наблюдалась тенденция к повышению титров Ι§ против Η5Ν1 после иммунизации расщепленной вакциной Η5Ν1 с двойной полной дозой адъюванта по сравнению с ответом, вызванным расщепленной вакциной Η5Ν1 с адъювантом Л803/2 (р=0,7315) и Л803 1/5 (р=0,9744) (фиг. 9-В). Эта тенденция также наблюдалась для ответа в виде антитела ЦС1 против Η5Ν1 (фиг. 9-Ό). Однако сила увеличения была недостаточной, для того чтобы обнаружить статистически значимое различие (сила увеличения 25% для 1,7-кратного различия или 47% для 2-кратного различия).

νΙΙ.2.2. Гуморальный иммунный ответ: титры ΗΙ.

С дозой 1,5 мкг НА/мышь.

При каждой дозе адъюванта у всех мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 с адъювантом Л803, были индуцированы более высокие титры ΗΙ по сравнению с ответом, полученным у мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 без адъюванта (фиг. 10-А). Статистически значимого различия титров ΗΙ не наблюдалось, когда расщепленная вакцина Η5Ν1 содержала адъювант в дозовом диапазоне Л803 (фиг. 10-А).

С дозой 0,38 мкг НА/мышь.

При каждой дозе адъюванта у всех мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 с адъювантом Л803, были индуцированы более высокие титры ΗΙ по сравнению с ответом, полученным у мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 без адъюванта (фиг. 10В). Значительно более высокие титры ΗΙ наблюдались для расщепленной вакцины Η5Ν1 с адъювантом с двойной полной дозой Л803 по сравнению с ответом, полученным для расщепленной вакцины Η5Ν1 с адъювантом Л803/2 (р=0,032 для 4-кратного различия) (фиг. 10В). Никакого статистически значимого различия титров ΗΙ не обнаружено у мышей, иммунизированных расщепленной вакциной с адъювантом Η5Ν1 с двойной полной дозой Л803 или полной дозой Л803, или для мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 с адъювантом Л803/2 или А803/5 (фиг. 10В).

Сравнение доз антигена (1,5 или 0,38 мкг):

Никакого статистически значимого различия титров ΗΙ антител не обнаружено у мышей, иммунизированных каждой дозой НА в расщепленной вакцине Η5Ν1 с адъювантом Л803, Л803/2 или Л803/5, за исключением различия между мышами, иммунизированными 1,5 мкг НА в расщепленной Η5Ν1 с адъювантом Л803/5, которая продемонстрировала значительно меньший титр ΗΙ (р=0,01) по сравнению с мышами, иммунизированными 0,38 мкг НА в расщепленной Η5Ν1 с двойной дозой адъюванта Л803 (фиг. 10).

νΙΙ.2.3. Клеточный иммунный ответ.

Для оценки клеточных иммунных ответов, вызываемых тривалентной сезонной вакциной против гриппа, 1 мкг НА расщепленного антигена на штамм использовали для рестимуляции СЭ4 Т-клеток. Для поддержания одинаковых условий рестимуляции для моновалентной Η5Ν1 вакцины против гриппа в этом эксперименте использовали 3 мкг НА моновалентного расщепленного антигена. Также было продемонстрировано, что эта концентрация является оптимальной для различия между разными адъювантами. Результаты представлены на фиг. 11.

При каждой дозе расщепленной вакцины Η5Ν1 (1,5 или 0,38 мкг) более высокие СЭ4+ Т-клеточные ответы выявлены у мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 с разными дозами адъюванта Л803, по сравнению с мышами, иммунизированными расщепленной вакциной Η5Ν1 без адъюванта.

При дозе 1,5 мкг расщепленной вакцины Η5Ν1 уменьшение доз Л803 соответствовало уменьшению частоты встречаемости СЭ4+ Т-клеток (фиг. 11А). Однако, при дозе 0,38 мкг расщепленной вакцины Η5Ν1 не обнаружены различия СЭ4+ Т -клеточных ответов между разными дозами адъюванта у мышей, иммунизированных расщепленной вакциной Η5Ν1 с адъювантом Л803 (фиг. 11В).

νΙΙ.3. Обобщение результатов и выводы.

Исследования иммуногенности у мышей продемонстрировали, что расщепленная вакцина Η5Ν1 с адъювантом вызывала значительно более высокий гуморальный (ЕЫ8А и титры ΗΙ против Η5Ν1) и клеточный (СЭ4+ Т-клетки) ответы по сравнению с ответами, вызываемыми расщепленной вакциной Η5Ν1 без адъюванта.

Никакого влияния дозы антигена на ответ не наблюдалось для гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных 1,5 мкг и 0,38 мкг расщепленной вакцины Η5Ν1 с адъювантом, за исключением двух групп, упомянутых в разделе νΙΙ.2.2, что позволяет предположить, что в присутствии адъюванта еще более низкие дозы НА могут потребоваться для обнаружения влияния дозы на ответ в этой модели.

Значительное увеличение СЭ4+ Т-клеточных ответов наблюдалось у наивных мышей при использовании пандемических вакцин Η5Ν1 с адъювантом Л803 по сравнению с простой вакциной Η5Ν1. Никакого влияния разведения Л803 не выявлено при использовании дозы 0,38 мкг расщепленной вакцины Η5Ν1 в качестве вакцины-кандидата, тогда как снижение СЭ4 Т-клеточных ответов обнаружено для 1,5 мкг расщепленной вакцины Η5Ν1 с уменьшенной дозой адъюванта Л803.

Как и ранее, никакого различия гуморальных и клеточных иммунных ответов не обнаружено у мы- 51 024250 шей, иммунизированных расщепленной вакциной ΉΝ1 (при любой дозе антигена) с адъювантом с полной дозой Αδ03 или Αδ03/2. Некоторое усиление иммунного ответа обнаружено при использовании двойной полной дозы Αδ03 в препарате вакцины, и соответственно снижение иммунного ответа было обнаружено при использовании Αδ03/5 в препарате вакцины.

В общем, приведенные здесь данные подтверждают силу действия этой новой адъювантной системы в этом препарате вакцины.

Пример VIII. Предклиническая оценка вакцин против гриппа с адъювантом и без адъюванта у примированных крупных белых свиней.

νΐΙΙ.1. Схема и задача эксперимента.

Эксперимент на примированных вирусом гриппа свиньях был проведен для оценки увеличения гуморальных ответов благодаря Αδ03, вызываемых вакцинами против гриппа, приготовленными с этим адъювантом в виде эмульсии типа масло в воде.

Свиней использовали, чтобы оценить диапазон доз Αδ03 в животной модели, близкой людям. Свинья демонстрирует длинный перечень биологических аналогий, которые делают это животное за очень немногими исключениями физиологически наиболее близким человеку (Эои§1а8 К., 1972). Более того, у свиней обычно наблюдается проявление гриппозной инфекции.

νΙΙΙ.1.1. Обработка/группа (табл. 19).

Группу из 10 взрослых самок крупных белых свиней примировали интраназально в день 0 тривалентным цельным формалин-инактивированным вирусом гриппа (25 мкг НА для каждого штамма) в общем объеме 200 мкл. Примирующие штаммы состояли из штаммов, гомологичных штаммам вакцины (25 мкг НА цельный инактивированный НШ1 Α/Ν^\ Са1ебоша/20/99, Н3№ Α/Раηата/2007/99 и В/8Ьапдбопд/7/97). Через 28 дней свиней внутримышечно вакцинировали разовой дозой вакциныкандидата в общем объеме 500 мкл. Свиней иммунизировали препаратами, содержащими только расщепленные антигены (тривалентная расщепленная простая), или препаратами, содержащими расщепленные антигены с адъювантом Αδ03 в диапазоне доз (полная, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены НШ1 Α/Ν^\ Са1ебоша/20/99, Н3№ Α/Раηата/2007/99 и В/8йапдбопд/7/97 (15 мкг НА для штаммов НШ1 Α/№\ Са1ебоша/20/99, Н3№ Л/Рапата/2007/99 и 17,5 мкг для штамма В/8йапдбопд/7/97 штамм в виде разовой дозы для человека).

Таблица 19

Г руппа	Антиген/Препарат	Другая обработка
1	Тривалентный расщепленный/простой (без адъюванта)	Гомологическое примирование в день 0
2	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ	Гомологическое примирование в день 0
3	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ 1/2	Гомологическое примирование в день 0
4	Тривалентный расщепленный/АЗОЗ 1/5	Гомологическое примирование в день 0

νΙΙΙ.1.2. Изготовление вакцинных препаратов.

Тривалентный расщепленный/простой.

Предварительную смесь Т\ееп 80, Тгйоп Х100 и сукцината витамина Е (νΈδ) готовят для достижения конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Т\ееп 80, 110 мкг/мл Тгйоп Х100 и 100 мкг/мл νΈδ. Количества, используемые в предварительной смеси, рассчитывают с учетом количеств детергента и νΈδ, уже присутствующих в штаммах.

Препарат одной дозы 500 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекций+физиологический раствор (10-кратный концентрированный РВδ, рН 7,4, приготовленный как описано в примере ^^предварительная смесь, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин при комнатной температуре, +15 мкг штамма НА НДО1, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +15 мкг штамма НА Н3Х2, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +17,5 мкг НА штамма В, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре. Препараты инъецируют в пределах одного часа после окончания их приготовления.

Тривалентный расщепленныйМ503.

Препарат одной дозы 500 мкл готовят непосредственно перед применением следующим образом: вода для инъекций+физиологический раствор (10-кратный концентрированный РВδ, рН 7,4, приготовленный как описано в примере ^^предварительная смесь, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин при комнатной температуре, +15 мкг штамма НА НДО1, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +15 мкг штамма НА

- 52 024250

Η3Ν2, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин при комнатной температуре, +17,5 мкг НА штамма В, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре, +250 мкл эмульсии δΒ62 для полной дозы Αδ03, или 125 мкл эмульсии δΒ62 для 1/2 дозы Αδ03, или 50 мкл эмульсии δΒ62 для 1/5 дозы Αδ03, перемешивание с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре. Препараты инъецируют в пределах одного часа после окончания их приготовления.

УШ.1.3. Считывание данных (табл. 20).

Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию измеряли до интраназального примирования (день 0), перед иммунизацией (день 28) и день 14 после иммунизации (10 свиней/группу). Образцы сыворотки крови тестировали на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ).

Таблица 20

Считывание данных	Момент времени	Тип образца	Метод анализа
Гуморальный ответ	день 0, день 28, день 42	Сыворотка крови	ΙΗΑ

УШ.2. Результаты и выводы.

УШ.2.1. Гуморальный иммунитет.

Результаты представлены на фиг. 12. Независимо от разведения адъюванта тривалентные расщепленные препараты с адъювантом Αδ03 вызывали более сильный ответ ΗΙ на все штаммы по сравнению с простым тривалентным препаратом в этой модели гомологичного примирования, хотя статистическая значимость не всегда достигалась для всех трех штаммов. Выявлено влияние дозы адъюванта с небольшими различиями от штамма к штамму. Для менее иммуногенных штаммов, таких как Β/δ^ηβόοηβ, только тривалентная расщепленная вакцина с полной дозой адъюванта Αδ03 значительно отличалась от простой вакцины. В противоположность тривалентной расщепленной вакцине, содержащей полную дозу адъюванта Αδ03, уменьшенная доза Αδ03 не увеличивала титры ΗΙ для всех трех штаммов выше, чем простая вакцина.

Пример ΙΧ. Предклиническая оценка расщепленной тривалентной или квадривалентной (содержащей второй штамм В) вакцины с адъювантом и без адъюванта у наивных и примированных мышей С57ΒI/6.

ΙΧ. 1. Схема и задача эксперимента.

Эксперименты на наивных и примированных мышах были проведены для оценки увеличения гуморального иммунного ответа, вызываемого расщепленной противогриппозной тривалентной или квадривалентной (содержащей второй штамм В) вакциной, которые приготовлены с этим адъювантом в виде эмульсии масло в воде (Αδ03 или половинная доза Αδ03). Филогенетический анализ генов НА недавно выделенных изолятов вируса гриппа В продемонстрировал, что с середины 1980-х годов этот ген эволюционировал в две отличающиеся антигенами линии, представленными Β/V^сΐο^^а/2/87-подобными и Β/Υатаβаΐа/16/88-подобными вирусами. Эти эксперименты оценивали влияние присутствия второго штамма В в квадривалентной вакцине против гриппа (ΡΙν) на гуморальный иммунный ответ по сравнению с ответом, вызываемым тривалентной вакциной против гриппа (ТТУ).

ΙΧ.1.1. Обработка/группа (табл. 21).

Эти эксперименты проводили с использованием групп из 10 взрослых самок С57ΒI/6 наивных мышей или мышей, примированных гетерологичными штаммами по сравнению со штаммами вакцины.

Наивных мышей внутримышечно иммунизировали в день 0 и день 28 тривалентной или квадривалентной противогриппозной вакциной-кандидатом в общем объеме 1000 мкл.

Примированным мышам сначала интраназально вводили (объем 20 мкл) в день 0 тривалентного цельного формалин-инактивированного вируса гриппа (5 мкг НА для каждого штамма). Примирующие штаммы состояли из дрейф-вариантов (5 мкг НА цельный инактивированный Η1Ν1 Α/Βе^^^ηβ/262/95, Η3Ν2 Л/^еШп§1оп/1/04 и Β/Β^^8Ьаηе/32/02) по отношению к включенным в вакцину. Через двадцать восемь дней мышей внутримышечно вакцинировали разовой дозой вакцины-кандидата в общем объеме 100 мкл.

Мышей иммунизировали препаратами, содержащими только Ήν или ΡΙν (простая вакцина), или препаратами, содержащими Ήν или ΡΙν с разными дозами адъюванта Αδ03 (полная или половинная (1/2)). Штаммы, использованные для иммунизации, включали Η1Ν1 .Υ^λν Са1ейоша/20/99, Η3Ν2 Α/Μ^ο^ίη^^ и Β/δ1κιηβί1οηβ/7/97 (линия Б/МсЮпа, включенная как в Ήν, так и в ΟΙ\^Ζ), и для вакцины ΡΙν также Б/11апд8и/10/03 (линия Β/Υатаβаΐа, включенная только в ΡΙν) (1,5 мкг/штамм соответствуют 1/10 дозы для человека).

- 53 024250

Таблица 21

Группа	Антиген/Препарат	Доза антигена
1	Τίν Простой (без адъюванта)	1,5 мкг
2	Τίν АЗОЗ	1,5 мкг
3	Τίν А503/2	1,5 мкг
4	Οίν Простой (без адъюванта)	1,5 мкг
5	Θΐν АЗОЗ	1,5 мкг
6	Οίν А503/2	1,5 мкг
7	РВЗ

ΙΧ.1.2. Приготовление вакцинных препаратов ТГУ простая (без адъюванта).

Приготовление дозы 100 мкл.

10-кратный концентрированный РВ8 и предварительную смесь Т^ееп 80, Тгйоп Χ-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляли в воду для инъекций. Конечные концентрации составляли 354 мкг/мл для Т^ееп 80, 52 мкг/мл для Тгйоп Χ-100, 47,37 мкг/мл для УЕ8 в этом препарате. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин добавляли 1,5 мкг каждого штамма (штаммы Η1Ν1, Η3Ν2, В) при перемешивании с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин между каждыми добавлениями. Препарат затем перемешивали в течение 15 мин. Проверяли рН. Инъекции делали в пределах одного часа после окончания приготовления препарата.

Т!УА803 или А803 %.

Приготовление дозы 100 мкл.

10-кратный концентрированный РВ8 и предварительную смесь Т^ееп 80, Тгйоп Χ-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляли в воду для инъекций. Конечные концентрации составляли 354 мкг/мл для Т^ееп 80, 52 мкг/мл для Тгйоп Χ-100, 47,37 мкг/мл для УЕ8 в этом препарате. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин добавляли 1,5 мкг каждого штамма (штаммы Η1Ν1, Η3Ν2, В) при перемешивании с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин между каждыми добавлениями. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин добавляли 25 или 12,5 мкл эмульсии 8В62. Препарат затем перемешивали в течение 15 мин. Проверяли рН. Инъекции делали в пределах одного часа после окончания приготовления препарата.

()Ι\' простая (без адъюванта).

Приготовление дозы 100 мкл.

10-Кратный концентрированный РВ8 и предварительную смесь Т^ееп 80, Тгйоп Χ-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляли в воду для инъекций. Конечные концентрации составляли 472 мкг/мл для Т^ееп 80, 69,44 мкг/мл для Тгйоп Χ-100, 63,16 мкг/мл для УЕ8 в этом препарате. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин добавляли 1,5 мкг каждого штамма (штаммы Η1Ν1, Η3Ν2, 2В) при перемешивании с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин между каждыми добавлениями. Препарат затем перемешивали в течение 15 мин. Проверяли рН. Инъекции делали в пределах одного часа после окончания приготовления препарата.

(ΙΙΑ А803 или А803 %.

Приготовление дозы 100 мкл.

10-кратный концентрированный РВ8 и предварительную смесь Т^ееп 80, Тгйоп Χ-100 и УЕ8 (количества с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляли в воду для инъекций. Конечные концентрации составляли 472 мкг/мл для Тэдееп 80, 69,44 мкг/мл для Тгйоп Χ-100, 63,16 мкг/мл для УЕ8 в препарате. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 5 мин добавляли 1,5 мкг каждого штамма (штаммы Η1Ν1, Η3Ν2, 2В) при перемешивании с использованием магнитной мешалки в течение 10 мин между каждыми добавлениями. После перемешивания с использованием магнитной мешалки в течение 15 мин добавляли 25 или 12,5 мкл эмульсии 8В62. Препарат затем перемешивали в течение 15 мин. Проверяли рН. Инъекции делали в пределах одного часа после окончания приготовления препарата.

ΙΧ.1.3. Считывание данных (табл. 22).

У наивных мышей гуморальный иммунный ответ измеряли через 28 дней после первой иммунизации (Ώ28 после-Ι) и день 21 после второй иммунизации (Ώ21 после-ΙΙ) для 10 мышей на группу в анализе на ингибирование гемагглютинации (фиг. 13).

У примированных мышей гуморальный иммунный ответ измеряли через 28 дней после примирования (Ώ28 после прим.) и день 21 после разовой иммунизации (Ώ21 после имм.) для 10 мышей на группу в анализе на ингибирование гемагглютинации (фиг. 14).

Для того чтобы упростить и сфокусироваться на задаче этого эксперимента, описаны только гуморальные иммунные ответы, индуцированные против штаммов В.

Таблица 22

Считывание данных	Момент времени	Тип образца	метод анализа
Гуморальный ответ	День 28 и день 49	Сыворотки крови	Титры ΗΙ

- 54 024250

ΙΧ.2. Результаты.

ΙΧ.2.1. Гуморальный иммунный ответ у наивных мышей: титры ΗΙ.

У наивных мышей, которых иммунизировали адъювантными расщепленными вакцинами против гриппа, были индуцированы более высокие титры ΗΙ по сравнению с ответом, полученным у мышей, иммунизированных расщепленными вакцинами против гриппа без адъюванта (фиг. 13 А и В).

Независимо от адъюванта (А803 или А803/2) у наивных мышей, иммунизированных адъювантной ТГУ или адъювантной ОШ, были индуцированы сходные титры ΗΙ против В/81апдбопд/7/97 (В/У1с1ог1аподобный вирус включен как в ПУ, так и в ОШ) (фиг. 13 А).

Независимо от адъюванта (А803 или А803/2) у наивных мышей, иммунизированных адъювантной ΡΙν, были индуцированы более высокие титры ΗΙ против В/Лапдки/10/03 (В/Уатада1а-подобный вирус включен только в ОШ) по сравнению с отсутствием титров ΗΙ у наивных мышей, иммунизированных адъювантной ПУ (фиг. 13 В).

ΙΧ.2.2. Гуморальный иммунный ответ у примированных мышей: титры ΗΙ.

У мышей, примированных В/УюЮпа-подобным вирусом и иммунизированных адъювантными расщепленными вакцинами против гриппа, были индуцированы более высокие титры ΗΙ по сравнению с ответом у мышей, иммунизированных расщепленными вакцинами против гриппа без адъюванта (фиг. 14 А и В).

Независимо от адъюванта (А803 или А803/2) у мышей, примированных Уюйопа-подобным вирусом и иммунизированных адъювантной ПУ или адъювантной ОШ, были индуцированы сходные титры ΗΙ против вируса В/81апдбопд/7/97 (В/УюЮпа-подобный вирус включен как в ТШ, так и в ОШ) (фиг. 14 В).

Независимо от адъюванта (А803 или А803/2) у мышей, примированных Уюйопа-подобным вирусом и иммунизированных адъювантной ОШ, были индуцированы более высокие титры ΗΙ против В/Лапдки/10/03 (В/Уатада1а-подобный вирус включен только в ОШ) по сравнению с отсутствием титров ΗΙ у наивных мышей, иммунизированных адъювантной ПУ (фиг. 14 В).

ΙΧ.3. Обобщение результатов и выводы.

Наивные мыши или мыши, примированные В/УюЮпа-подобным вирусом, иммунизированные вакциной ПУ или ОШ с адъювантом (А803 или А803/2), продемонстрировали перекрестную реактивность против гомотипического В/УюЮпа-подобного вируса, включенного в вакцину, или гетеросубтипического вируса, относящегося к той же линии В/Ую1опа. Наивные мыши или мыши, примированные В/УюЮпа-подобным вирусом, иммунизированные вакциной ПУ с адъювантом (А803 или А803/2), не продемонстрировали какой-либо перекрестной реактивности против гетеросубтипического вируса, относящегося к другой линии (В/Уатада1а-подобный вирус в этом примере) по сравнению с вирусом В, включенным в вакцину.

Эти эксперименты продемонстрировали, что второй штамм В и адъювант (А803 или А803/2) необходимы для того, чтобы вызывать перекрестную реакцию против вируса В, относящегося к линиям В/Ую1опа и В/Υатада!а.

Пример X. Клинические испытания в группе населения в возрасте 18-64 лет с использованием вакцины, содержащей препарат расщепленного антигена вируса гриппа и разные дозы адъюванта А803 (Р1иΕΌ-012).

Х.1. Введение.

В 2007 году было проведено контролируемое рандомизированное одностороннее слепое исследование, фаза ΙΙ, у взрослого населения в возрасте 18-64 лет для оценки иммуногенности, безопасности и реактогенности низкодозовых противогриппозных вакцин-кандидатов (т.е. содержащих 5 мкг НА на штамм) (С1ахо8тйЛКЛпс Вю1одюа1к) с разными дозами адъюванта А803, вводимых внутримышечно, по сравнению с вакциной ИиаЛх™ (С1ахо8тйЛК1шс Вю1одюа1к), используемой для сравнения.

Х.2. Схема исследования.

Пять групп субъектов (по 200 на группу) параллельно внутримышечно получали следующие вакцины:

Р1иЬП1/1: 5 мкг НА/штамм вакцины против гриппа с дозой 1/1 адъюванта А803,

Р1иЬП1/2: 5 мкг НА/штамм вакцины против гриппа с 1/2 дозой адъюванта А803,

Р1иЬП1/4: 5 мкг НА/штамм вакцины против гриппа с 1/4 дозой адъюванта А803,

Р1иЬП1/8: 5 мкг НА/штамм вакцины против гриппа с 1/8 дозой адъюванта А803, одна группа из 200 субъектов, получающая одну полную дозу ИиаЛх™ 15 мкг НА/штамм.

Схема: одна в.м. инъекция вакцины против гриппа в день 0, отбор образцов крови в день 0, день 21 и день 180 после вакцинации.

Стандартная тривалентная расщепленная вакцина против гриппа -ИиаЛх™, использованная в этом исследовании, представляет собой коммерчески доступную от ШПйсгп НстщрЬсгс с 2007/2008 г. вакцину, разработанную и производимую С1ахо8тЛЛКЛпс Вю1одюа1к.

Х.2. Задачи исследования.

Х.2.1. Первоочередная задача: иммуногенность.

Продемонстрировать, что иммунологическая эффективность (СМТ) низкодозовой вакцины против

- 55 024250 гриппа с адъювантом А803 (1/1, 1/2, 1/4, 1/8 доза А803) не хуже по сравнению с Ρ1ιι;·ιπχ в день 21 после вакцинации всем субъектам.

Определяемые переменные:

в день 0 и день 21: титр антитела в сыворотке крови, ингибирующего гемагглютинацию (ΗΙ), против каждого из трех штаммов вакцины у всех субъектов.

Производные переменные:

средние геометрические титров (ОМИ ΗΙ антител в день 0 и день 21.

Х.2.2. Вторичные задачи:

оценить гуморальный иммунный ответ с точки зрения титров антител против гемагглютинина (ΗΙ), индуцированных низкодозовой вакциной против гриппа с адъювантом А803 (1/1, 1/2, 1/4, 1/8 доза А803) и вакциной Ρ1ικ·ιπχ в день 21 после вакцинации у всех субъектов;

оценить устойчивость антител ΗΙ в результате введения низкодозовой вакцины против гриппа с адъювантом А803 (1/1, 1/2, 1/4, 1/8 доза А803) и вакцины Ρ1ικ·ιπχ в день 180 после вакцинации у всех субъектов;

оценить клеточно-опосредованный иммунный ответ, вызываемый низкодозовой вакциной против гриппа с адъювантом А803 (1/1, 1/2, 1/4, 1/8 доза А803) и вакциной ΡΕπ-κίχ, с точки зрения частоты встречаемости специфических для вируса гриппа ί'.Ό4/ί'.Ό8 Т-лимфоцитов в день 0, 21 и 180 в подгруппе субъектов;

оценить гуморальный иммунный ответ с точки зрения титров нейтрализующего антитела, вызываемый введением низкодозовой вакцины против гриппа с адъювантом А803 (1/1, 1/2, 1/4, 1/8 доза А803) и вакциной Ρ^ύχ, в день 0, 21 и 180 в подгруппе субъектов;

оценить безопасность и реактогенность низкодозовой вакцины против гриппа с адъювантом А803 (1/1, 1/2, 1/4, 1/8 доза А803) и вакциной Ρ1υηΓίχ в течение всего периода исследования у всех субъектов (отслеживание обычных симптомов в течение 7 дней, отслеживание необычных симптомов в течение 21 дней, отслеживание тяжелых неблагоприятных проявлений и значимых с медицинской точки зрения состояний в течение 6 месяцев).

Определяемые переменные в отношении гуморального ответа:

в дни 0, 21 и 180: титр антитела в сыворотке крови, ингибирующего гемагглютинацию (ΗΙ), против каждого из трех штаммов вакцины у всех субъектов;

в дни 0, 21 и 180: титры нейтрализующего антитела, тестируемые отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленного в вакцине, в подгруппе субъектов.

Производные переменные:

средние геометрические титров (ОМИ ΗΙ антител в дни 0, 21 и 180; уровни сероконверсии* в день 21; факторы сероконверсии** в день 21; уровни серозащиты*** в день 0 и день 21;

уровень сероконверсии определяется как процент вакцинируемых, у которых либо титр менее 1:10 до вакцинации и титр не менее 1:40 после вакцинации, либо титр не менее 1:10 до вакцинации и по меньшей мере четырехкратное увеличение титра после вакцинации;

** - фактор конверсии определяется как кратное увеличение ОМΤ сывороточных ΗΙ после вакцинации по сравнению показателем в день 0;

*** - уровень серозащиты определяется как процент вакцинируемых с сывороточным титром ΗΙ не менее 1:40 после вакцинации, который обычно принимается за показатель защиты.

Определяемые переменные для СМI ответа (клеточно-опосредованного иммунного ответа) (в подгруппе субъектов):

в дни 0, 21 и 180:

частота встречаемости цитокинпозитивных СЭ4/СЭ8 клеток на 10⁶ в тестах, продуцирующих по меньшей мере две разные сигнальные молекулы (ΙΗ-2, ΙΡΝ-γ, ΤΡΝ-α и СО40Ь);

частота встречаемости цитокинпозитивных ί'.Ό4/ί'.Ό8 клеток на 10⁶ в тестах, продуцирующих по меньшей мере СО40Ь и другую сигнальную молекулу (Ш-2, ΙΡΝ-γ, ΤΡΝ-α);

частота встречаемости цитокинпозитивных ί'.Ό4/ί'.Ό8 клеток на 10⁶ в тестах, продуцирующих по меньшей мере Ш-2 и другую сигнальную молекулу (СО40Ь, ΙΡΝ-γ, ΤΡΝ-α);

частота встречаемости цитокинпозитивных ί'.Ό4/ί'.Ό8 клеток на 10⁶ в тестах, продуцирующих по меньшей мере ΤΡΝ-α и другую сигнальную молекулу (ГБ-2, ΙΡΝ-γ, СО40Ь);

частота встречаемости цитокинпозитивных ί'.Ό4/ί'.Ό8 клеток на 10⁶ в тестах, продуцирующих по меньшей мере ΙΡΝ-γ и другую сигнальную молекулу (СО40Ь, Ш-2, ΤΡΝ-α).

Производные переменные.

Для каждого теста среднее геометрическое (ОМ) специфических противогриппозных ί'.Ό4/ί'.Ό8 Тлимфоцитов в дни 0, 21, 180.

Х.2.3. Дополнительные задачи:

оценить гуморальный иммунный ответ с точки зрения титров гетерологичных для вакцины ΗΙ (титр

- 56 024250 антитела в сыворотке крови, ингибирующего гемагглютинацию (ΗΙ), против дрейфующих штаммов) в дни 0, 21 и 180 в подгруппе субъектов;

оценить гуморальный иммунный ответ с точки зрения титров гетерологичных для вакцины нейтрализующих антител (перекрестно-реактивные специфические в отношении вируса гриппа штаммы (дрейфующие штаммы)) в дни 0, 21 и 180 в подгруппе субъектов;

оценить СΜI ответ с точки зрения частоты встречаемости перекрестно-реактивных специфических в отношении вируса гриппа С.П4/С.П8 Т-лимфоцитов (гетерологичные штаммы) (дрейфующие штаммы или консервативные эпитопы вируса гриппа) в дни 0, 21 и 180 в подгруппе субъектов.

Производные переменные и критерии (серозащита, уровни сероконверсии и факторы сероконверсии) такие, как описано выше.

Х.3. Композиция и введение вакцины.

Х.3.1. Препарат вакцины.

Низкодозовая вакцина против гриппа с адъювантом А803, используемая в этом исследовании, представляет собой жидкую смесь равных количеств (т.е. 3x5 мкг НА) трех разных антигенов расщепленного инактивированного вируса гриппа, содержащую адъювант А803. Она представлена в виде однодозовой вакцины в стеклянных (тип Ι) предварительно заполненных шприцах в объеме 0,5 мл/дозу. Низкодозовые противогриппозные препараты-кандидаты с адъювантом А803 содержат следующие штаммы:

А/8о1отоп П1апб8/3/2006 (ИШ1)-подобный штамм: А/8о1отоп П1апб8/03/2006 (ГУК.-145),

АЛУ18соп8т/67/2005 (Н3Ш)-подобный штамм: А/\У18соп8т/67/2005 (NΥΜСX)-161Β,

Β/Μа1ау8^а/2506/2004-πодобный штамм: Β/Μа1ау8^а/2506/2004.

Вакцины содержат 5 мкг гемагглютинина (НА) каждого штамма вируса гриппа на дозу, объединенного с полной дозой, половинной дозой, 1/4 дозы или 1/8 дозы адъювантной системы А803. Антигены вируса гриппа введены в водную фазу адъювантной системы путем простого смешивания с эмульсией.

Вакцина содержит остаточные количества следующих веществ из процесса изготовления данного лекарственного средства: тиомерсал, овальбумин, сахароза, формальдегид и дезоксихолат натрия и остаточные уровни тиомерсала (меньше 1 мкг на дозу) с более ранних стадий процесса изготовления. Изготовление трех моновалентных партий антигенов инактивированного расщепленного вириона осуществляют способом изготовления коммерческой вакцины Р1иапх™. Его осуществляют, как изложено в разделе ΙΙΙ.4.1.2. Расщепление проводят дезоксихолатом натрия, затем проводят стадию инактивации, которую осуществляют с использованием формальдегида.

Х.3.2. Композиция вакцины.

Одна доза Р1иЬП (полная, половинная доза, 1/4 дозы или 1/8 дозы А803) соответствует 0,5 мл.

Композиция приведена в табл. 23. Содержание НА на дозу составляет приблизительно 5 мкг для всех препаратов, и единственным отличием является количество А803, присутствующее в конечных контейнерах.

Таблица 23

Композиция низкодозовой вакцины против гриппа с адъювантом А803

Компонент	Количество на дозу (0,5 мл)
Инактивированные
расщепленные вирионы
- А/5о1отоп 151ап0е/03/2006 (1УК-	5,0 мкг НА
145)
- АЛМзсоп51П/67/2005 (Η3Ν2)	5,0 мкг НА
ΝΥΜ0Χ-161Β
- В/Ма1ауз1а/2506/2004	5,0 мкг НА
Адъювант	Полная Половин- 1/4 дозы 1/8 дозы
	доза ная дозы
- ЗВ62 эмульсия (общий объем)	0,250 мл 0,125 мл 0,0625 мл 0,031мл
• сквален	10,70 мг 5,35 мг 2,675 мг 1,337 мг
• 01_-а-токоферол	11,88 мг 5,94 мг 2,97 мг 1,5 мг
• Ро1у$огЬа180 (Τννββη 80)	4,85 мг 2,425 мг 1,21мг 0,6 мг
РВЗ модифицированный	до 0,250 мл
Эксципиенты (целевое значение)
Ро1у$огЬа180 (Τννββη-80)	0,40 мг
окгоксинол 10 (Τηίοη® Х-100)	0,05 мг
альфа-Токоферил гидросукцинат	0,05 мг
Хлорид натрия	4 мг
Хлорид магния	0,03 мг
Гидрофосфат натрия	1,30 мг
Гидрофосфат калия	0,19 мг

Хлорид калия	0,10 мг
Вода для инъекций	до 0,50 мл

НА - гемагглютинин; общее содержание Ρо1у8о^Ъаί 80 соответствует 4,972 мг на дозу при использовании полной дозы А803 и 2,547 мг на дозу при использовании половинной дозы А803.

- 57 024250

Х.3.3. Изготовление вакцинной композиции с адъювантом А803.

Антигенный препарат (промежуточная партия): Т\уееи 80, ТгПои Х-100 и УЕ8 добавляют к РВ8, модифицированному Nа/К (132,7 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 1,1 мМ МдС1₂, 7,26 мМ №₂НРО₄, 2,72 мМ КН₂РО₄, рН 7,2) в таких количествах, чтобы конечные концентрации в промежуточной партии составляли соответственно 952,5, 130,9 и 119,1 мкг/мл. После перемешивания в течение 15-45 мин добавляют 35,71 мкг НА на мл каждого штамма НДО1, 36,90 мкг/мл штамма Κ3Ν2 и 39,29 мкг НА на мл штамма В.

Адъювантная вакцина: РВ8, модифицированный Νη/К (132,7 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 1,1 мМ МдС1₂, 7,26 мМ №₂НРО₄, 2,72 мМ КН₂РО₄, рН 7,2) добавляют в воду для инъекций до достижения конечного объема 0,5 мл на дозу для человека. После перемешивания в течение 15-45 мин добавляют объем так называемой промежуточной партии и перемешивают в течение 15-45 мин. Затем добавляют 20кратный концентрированный РВ8 модифицированью (2,74 мМ №С1, 54 мМ КС1, 142,8 мМ №₂НРО₄, 26 мМ КН2РО4, рН 6,8) и смешивают в течение 15-45 мин. Этот 20-кратный концентрированный модифицированного РВ8 имеет такую же композицию, как эмульсия А803, и добавляемое количество зависит от дозы А803 и рассчитывается таким образом, чтобы сохранялась постоянная ионная композиция вакцины при уменьшении содержания эмульсии. В конце добавляют требуемое количество эмульсии (31,25, или 62,5, или 125, или 250 мкл/доза) и перемешивают в течение 15-45 мин до достижения конечных целевых значений, проиллюстрированных в табл. 23.

Х.4. Результаты по иммуногенности - гуморальный иммунный ответ.

Х.4.1 Средние геометрические титров (СМТ) Ш.

СМТ для антител Ш с 95% О представлены в табл. 24 и на фиг. 15. СМТ для антител Ш с 95% на возрастную группу (18-49 лет и 50-64 года) представлены в табл. 25.

Таблица 24

Уровни серопозитивности и СМТ для титра антител Ш в день 0 и день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности)

	>= 10 1/01к	6МТ
		95% С1		95% С1
Антитело	Группа	Момент времени	N	N	%	ίί	ш.	знамени е	ίί	Ш.	Μίη	Мах
А/Зо1отоп	Р1Ш.О11	РКЕ	187	94	50,3	42,9	57,6	13.0	10,9	15,5	<10,0	905,0
Р1(О21)	187	187	100	98,0	100	203,2	171,7	240,3	10,0	5120,0
Р1иШ12	РКЕ	189	83	43,9	36,7	61,3	12,3	10,2	14,8	<10,0	1280,0
РКЭ21)	189	185	97,9	94,7	99,4	155,8	128,2	189,4	<10,0	2560,0
Р1иЮ14	РКЕ	190	84	44,2	37,0	51,6	12,9	10.6	15,8	<10,0	1280,0
Р1(О21>	190	186	97,9	94,7	99,4	184,9	137,6	197,8	<10,0	2560,0
Ε1υΙ_ϋ18	РКЕ	192	100	52,1	44,8	59,3	14,9	12,3	18,2	<10,0	640,0
Р1(О21>	192	187	97,4	94,0	99,1	151,1	124,7	183,1	<10,0	3620,0
Яиапх	РКЕ	185	106	57,3	49,8	84,5	15,1	12.5	18,2	<10,0	640,0
Р1(О21)	185	183	98,9	96,1	99,9	191,0	158,5	230,2	<10,0	3620,0
ΑΛΛΛδοοπϊΙπ	РШЭ11	РКЕ	187	142	75,9	69,2	81,9	29,4	23,8	36,4	<10,0	1280,0
Р1(О21)	187	187	100	98,0	100	340,1	321,3	449,8	14,0	5120,0
ЯиЮ12	РКЕ	189	141	74,6	67,8	60,6	30,0	24,3	37,2	<10,0	1260,0
Р1(О21)	189	188	99,5	97,1	100	325,4	275,6	386,7	<10,0	5120,0
ЯиЬО14	РКЕ	190	141	74,2	67,4	80,3	29.9	24,5	36,5	<10,0	640,0
Р1<021>	190	188	98,9	96,2	99,9	319,9	270,0	379,1	<10,0	20480,0
ЯиПЛв	РКЕ	192	149	77,6	71,0	83,3	27,2	22.6	32,8	<10,0	905,0
Р1(О21)	192	191	99,5	97,1	100	273,9	232,0	323,3	<10,0	5120,0
Аиайх	РКЕ	185	155	83,8	77,7	88,8	37,4	30.2	46,4	<10,0	1280,0
Р1(О21)	185	185	100	98,0	100	335,3	286,2	392,7	20,0	5120,0
В/Ма1ау5ьа	ПиЮ11	РКЕ	187	142	75,9	69,2	81,9	25,8	21.3	31,3	<10,0	2560,0
р\|(й21>	187	187	100	98,0	100	225,8	195,3	261,1	20,0	2560,0
ЯиЮ12	РКЕ	189	145	76,7	70,0	82,5	27,3	22.6	32,9	<10,0	3620,0
ΡΙΡ21)	189	188	99,5	97,1	100	246,1	210,9	287,2	<10,0	3620,0
Р1ииЭ14	РКЕ	190	133	72,6	65,7	78,8	22,6	18,8	27,1	<10,0	1280,0
РИО21)	190	188	98,9	96,2	99,9	195,5	165,1	231,4	<10,0	2560,0
Ηυίϋ18	РКЕ	192	142	74,0	67,1	80,0	23,2	19,5	27,8	<10,0	1280,0
Р1Ц521)	192	188	97,9	94,8	99,4	171,2	144,2	203,2	<10,0	5120,0
Яиайх	РКЕ	185	139	75,1	68,3	81,2	27,0	22,2	32,7	<10,0	1280,0
Р1(О21)	185	183	98.9	96,1	99,9	217,8	184,3	257,4	<10,0	3620,0

ΓΊιιΙ ,1)11 - 5 мкг НА/штамм с 1/1 дозой А803;

Г'1и1,1)12 - 5 мкг НА/штамм с 1/2 дозы А803;

Г'1и1,1)14 - 5 мкг НА/штамм с 1/4 дозы А803;

Г'1и1,1)18 - 5 мкг НА/штамм с 1/8 дозы А803;

Ииапх - Ииапх (15 мкг НА/штамм),

N - количество субъектов с имеющимися результатами, и/% - количество/процент серопозитивных субъектов (титр Н не менее 1:10),

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, 1,1. - нижний предел, ЦЬ- верхний предел, СМТ - среднее геометрическое титра антител; РКЕ - до вакцинации в день 0; Мт/Мах - минимум/максимум, И(П21) - после вакцинации в день 21.

- 58 024250

Таблица 25

Уровни серопозитивности и ОМТ для титра антител Ш в день 0 и день 21 по возрастной категории

	>=10-1/011.	ОМТ
		96% С!		95% С1
Антитело	Подгруп па	Группа	Момент времени	N	^п	%	ίί	υί	значени	ίί	υί	Μϊη	Мах
А/5о1отоп	18-49 лет	АиЮ11	РКЕ	129	68	52,7	43,7	61,6	14,7	11,7	18,5	<10,0	905,0
РЦ021)	129	12»	100	97,2	100	271,6	224,5	328,5	10,0	5120,0
АиЮ12	РКЕ	128	58	45,3	36,5	54,3	14,1	11,о	18,0	<10,0	1280,0
Р10Э21)	128	125	97,7	93,3	99,5	195,4	153,3	249,0	<10,0	2560.0
Р1иЮ14	РКЕ	130	62	47,7	38,9	56,6	15,3	11,7	20,0	<10,0	1280,0
РЦ021)	130	128	98,5	94,6	99,8	205,5	167,0	252,8	<10,0	2560,0
РШЭ18	РКЕ	132	73	55,3	46,4	64,0	17,2	13,4	22,0	<10,0	640,0
РЦ021)	132	130	98,5	94,6	99,8	195,7	156,2	245,1	<10,0	3620,0
РквагТх	РКЕ	130	70	53,8	44,9	62,6	15,1	12,0	19,2	<10,0	640,0
Р1(021)	130	126	98,5	94,6	99,8	247,6	197,7	310,0	<10,0	3620,0
ААМа сопат	50-64 года	ΡΙυίϋΙΙ	РКЕ	58	26	44,8	31,7	58,5	9,9	7,8	12,5	<10,0	113,0
РЦ021)	58	58	100	93,8	100	108,5	80,5	141,0	10,0	905,0
ΡΚιΙ_012	РКЕ	61	25	41,0	28,6	54,3	9.3	7,4	11,8	<10,0	80,0
РК1Й1)	61	60	98,4	91,2	100	96,9	71,9	130,8	<10,0	1810,0
ΡΙυίΟ14	РКЕ	60	22	36,7	24,6	50,1	9,0	7,1	11,4	<10,0	160,0
Р1(О21)	60	58	96,7	88,5	99,6	102,5	73,2	143,4	<10,0	1280,0
Р1иЮ18	РКЕ	80	2/	45,0	32,1	58,4	11,0	8,1	14,8	<10,0	453,0
РЦ021)	60	5/	95,0	88,1	99,0	85,6	61,7	118,8	<10,0	1280,0
Р1иапх	РКЕ	55	36	65,5	51,4	77,8	14,9	11,2	19,9	<10,0	226,0
Р1(О21)	55	55	100	93,5	190	103,5	77,9	137,3	20,0	2560,0
18-49 лет	Ρΐυίϋΐΐ	РКЕ	129	98	76,0	67,7	83,1	28,7	22,2	37,1	<10,0	1280,0
Р1(О21>	129	129	100	97,2	100	360,1	294,7	440,1	14,0	5120,0
РЮ1ХИ2	РКЕ	128	95	74,2	65,7	81,5	31,2	23,9	40,6	<10,0	1280,0
РЦ021)	128	127	99,2	95,7	100	335,0	271,4	413,4	<10,0	5120,0
ΡΙυίΟ14	РКЕ	130	99	76,2	67,9	83,2	32,1	25,2	41,0	<10,0	640.0
РЦ021)	130	130	100	97,2	100	334,8	278,0	406,1	10,0	20480,0
ΡΙυίΟ18	РКЕ	132	105	79,5	/1,7	86,1	27,7	22,2	34.5	<10,0	905,0
ΡΙ(ϋ21)	132	131	99,2	95,9	100	273,2	223,8	333,6	<10,0	3620,0
	РКЕ	130	106	81,5	73,8	87,8	34,0	26,6	4-3,4	<10,0	1280,0
РЦ021)	130	130	100	97,2	100	360,7	299,2	434,8	20,0	5120,0
	50-64 года	Р1иЮ11	РКЕ	58	44	75,9	62,8	86,1	31,1	20,9	46,4	<10,0	1280,0
Р1(021)	58	58	100	93,8	100	426,8	312,7	587,9	20,0	2560,0
ΡΜΌ12	РКЕ	61	46	75,4	62,7	85,5	27,8	19,2	40,2	<10,0	640,0
ΡΚΟΑΥ2 1)	61	61	100	94,1	100	309,2	231,0	413,9	20,0	5120,0
ΡΙυίΟ14	РКЕ	60	42	70,0	56,8	81,2	25,6	17,9	36,6	<10,0	640,0
ΡΙ(ϋ21)	60	58	96,7	88,5	99,6	290,0	205,5	409,1	<10,0	2560,0
Р1и1Х>18	РКЕ	60	44	73,3	60,3	83,9	26,2	18,3	37,6	<10,0	640,0

	>= 101/ΟΙί	ОМТ
		95% С!		95% С1
Антитело	Подгруп па	Группа	Момент времени	N	^П	%	ίί	υί	значени е	ίί	υί	Μϊη	Мах
В/Ма1ауз1а			Р1(О21)	60	60	100	94,0	100	275,3	202,4	374,4	10,0	5120,0
Пиайх	РКЕ	55	49	89,1	/7,8	95,9	47,1	30,4	72,9	<10,0	1280,0
Р1(О21)	55	56	100	93,5	100	282,0	208,9	380,8	40,0	2560,0
18-49 лет	ΡΙυίΟ11	РКЕ	129	101	78,3	70,2	85,1	26,3	20,8	33,4	<10,0	2560,0
Р1(О21)	129	129	100	97,2	100	281,2	237,9	332,4	40,0	2560,0
Ρ1υΙ_ϋ12	РКЕ	128	98	76,6	68,3	83,6	27,2	21,5	34,4	<10,0	3620,0
Р1(О21)	128	128	100	9/,2	100	335,9	283,3	398,3	28,0	3620,0
Р1иЮ14	РКЕ	130	94	72,3	63,8	79,8	22,7	18,2	28,2	<10,0	640,0
Р1(О21)	130	128	98,5	94,6	99,8	219,1	179,8	266,9	<10,0	2560,0
ΡΙυίΟ18	РКЕ	132	95	72,0	63,5	79,4	23,9	19,1	30,0	<10,0	1280,0
Р1(021)	132	130	98,5	94,6	99,8	203,5	166,7	246,5	<10,0	5120,0
Ииапх	РКЕ	130	98	75,4	6/,1	82,5	27,4	21,7	34,4	<10,0	453,0
Р1(О21)	130	129	99,2	95,8	100	250,9	206,9	304,3	<10,0	2560,0
	50-64 года	ИиЮ11	РКЕ	58	41	70,7	6/,3	81,9	24,8	17,7	34,7	<10,0	320,0
Р1(О21)	58	58	100	93,8	100	138,6	108,1	177,6	20,0	1280,0
ИиЮ12	РКЕ	61	4/	77,0	64,5	86,8	27,5	19,9	37,8	<10,0	640,0
Р1(О21)	61	60	98,4	91,2	100	128,1	99,3	165,1	<10,0	1280,0
АиЮ14	РКЕ	60	44	73,3	60,3	83,9	22,4	15,9	31,6	<10,0	1280,0
Р1(О21)	60	60	100	94,0	100	152,7	110,9	210,3	10,0	2560,0
Ии 1.018	РКЕ	60	47	78,3	65,8	87,9	21,8	16,2	29,2	<10,0	453,0
Р1(О21)	60	58	96,7	88,5	99,6	117,0	85,4	160,3	<10,0	1810,0
Ииапх	РКЕ	55	41	74,5	61,0	85,3	26,0	18,0	37,6	<10,0	1280,0
Р1(О21)	55	54	98,2	90,3	100	155,9	113,0	215,0	<10,0	3620,0

Промежуточное заключение.

Для А/8о1отоп Ыапй (Η1Ν1) ОМТ находились в одном и том же диапазоне для всех исследуемых групп. Все группы с адъювантами не уступали группе Р1иапх для всех штаммов и всех возрастных категорий. Для А/А1зсопзт (Η3Ν2) продемонстрирована тенденция к уменьшению иммунного ответа с уменьшением концентрации А803, но без статистически значимого различия. Для В/Ма1ауз1а также продемонстрирована тенденция к уменьшению иммунного ответа с уменьшением концентрации А803, но единственное статистически значимое различие продемонстрировано между ОМТ, индуцированными Р1иЬИ1/2 и Р1иЬИ1/8 для этого штамма (см. фиг. 15).

Аналогичные результаты получены при анализе данных по возрастной группе. Тем не менее, для В/Ма1ауз1а ОМТ, индуцированные Р1иРИ1/2, были статистически значимо выше, чем индуцированные Р1иРИ1/4 в более молодой возрастной группе (18-49 лет).

Х.4.2 Факторы сероконверсии для титров антител против Ш, уровни серозащиты и уровни сероконверсии (коррелирует с защитой, установленной для вакцин против гриппа у людей).

Результаты представлены в табл. 26 и 27 - фиг. 16 для уровней серозащиты, в табл. 28 и 29 - фиг. 17А и 17В для уровней сероконверсии и в табл. 30 и 31 - фиг. 17 для факторов конверсии.

Таблица 26

Уровни серозащиты (8РЕ) для титра антител Ш в день 0 и в день 21

	ЗРВ
		95% С!
Штамм вакцины	Группа	Момент времени	N	η	%	Ι_Ι_	υι_
А/Зо1отоп	Р1иЮ11	РВЕ	187	45	24,1	18,1	30,8
ΡΙ(ϋΑΥ21>	187	177	94,7	90,4	97,4
Р1цЦ012	РВЕ	189	46	24,3	18,4	31,1
ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	170	89,9	84,7	93,8
Р1иШ14	РНЕ	190	43	22,6	16,9	29,2
ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	169	88,9	83,6	93,0
Р1иЦЭ18	РВЕ	192	52	27,1	20,9	34,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	166	86,5	80,8	91,0
Пиапх	РВЕ	185	50	27,0	20,8	34,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	172	93,0	88,3	96,2
АЛМ5СОП51П	Р1иЮ11	РВЕ	187	90	48,1	40,8	55,5
Ρί(ϋΑΥ21)	187	183	97,9	94,6	99,4
ΡΙιιΙ_ϋ12	РВЕ	189	90	47,6	40,3	55,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	186	98,4	95,4	99,7
Р1иЮ14	РВЕ	190	96	50,5	43,2	57,8
ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	185	97,4	94,0	99,1
Р1и1_О18	РВЕ	192	91	47,4	40,2	54,7
ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	184	95,8	92,0	98,2
Р!иалх	РВЕ	185	95	51,4	43,9	58,8

	ЗРК
		95% С!
Штамм вакцины	Группа	Момент времени	N	η	%	ίί	иь
		ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	183	98,9	96,1	99,9
В/Ма1ау$1а	Р1иЮ11	РВЕ	187	80	42,8	35,6	50,2
ΡΙ(ϋΑΥ21)	187	183	97,9	94,6	99,4
Р1иШ12	РВЕ	189	88	46,6	39,3	53,9
ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	186	98,4	95,4	99,7
Р1иЮ14	РВЕ	190	81	42,6	35,5	50,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	180	94,7	90,5	97,4
Р1иЮ18	РВЕ	192	86	44,8	37,6	52,1
ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	180	93,8	89,3	96,7
Пиалх	РВЕ	185	88	47,6	40,2	55,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	178	96,2	92,4	98,5

ΓΊιιΙ,Ι)11- 5 мкг НА/штамм с 1/1 дозой Α803,

ΓΊιιΙ,Ι)12 - 5 мкг НА/штамм с 1/2 дозы Α803,

ΓΊιιΙ,Ι)14 - 5 мкг НА/штамм с 1/4 дозы Α803,

ΓΊιιΙ,Ι)1Χ - 5 мкг НА/штамм с 1/8 дозы Α803,

Ииапх - Ииапх (15 мкг НА/штамм), уровень серозащиты определен как процент вакцинируемых субъектов, имеющих титр Ш в сыворотке крови не менее 1:40,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами до и после вакцинации η/% - количество/процент серозащищенных субъектов,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, 1,1, - нижний предел, иЬ - верхний предел, РЕЕ - до вакцинации в день 0; ΡΣ(ΠΑΥ21) - после вакцинации в день 21

- 60 024250

Таблица 27

Уровни серозащиты (8РК) для титра антител ΗΙ в день 0 и в день 21 по возрастной категории

	8РК
		95% С1
Штамм вакцины	Подгруппа	Группа	Момент времени	N	η	%	IX	υί
А/Зо1отоп	18-49 лет	ПиЮ11	РКЕ	129	36	27,9	20,4	36,5
ΡΙ(ϋΑΥ21)	129	127	98,4	94,5	99,8
ПиЮ12	РКЕ	128	35	27,3	19,8	35,9

	8РК
		95% С1
Штамм вакцины	Подгруппа	Группа	Момент времени	N	η	%	IX	υί
			ΡΙΡΑΥ21)	128	117	91,4	85,1	95,6
Р1иЮ14	РКЕ	130	35	26,9	19,5	35,4
ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	119	91,5	85,4	95,7
ΡΙιιίϋ18	РКЕ	132	43	32,6	24,7	41,3
ΡΙ(ΟΑΥ21)	132	119	90,2	83,7	94,7
РЮапх	РКЕ	130	34	26,2	18,8	34,6
ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	124	95,4	90,2	98,3
ΑΛΛΓίδΟοηδίη	50-64 года	Р1иЮ11	РКЕ	58	9	15,5	7,3	27,4
ΡΙ(ΟΑΥ21)	58	50	86,2	74,6	93,9
РЮЮ12	РКЕ	61	11	18,0	9,4	30,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	61	53	86,9	75,8	94,2
Р1иЮ14	РКЕ	60	8	13,3	5,9	24,6
ΡΙ(ΟΑΥ21)	60	50	83,3	71,5	91.7
Р1иШ18	РКЕ	60	9	15,0	7,1	26,6
ΡΙ(ΟΑΥ21)	60	47	78,3	65,8	87,9
Р1иапх	РКЕ	55	16	29,1	17,6	42,9
ΡΙ(ϋΑΥ21)	55	48	87,3	75,5	94,7
18-49 лет	Р1иЮ11	РКЕ	129	62	48,1	39,2	57,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	129	127	98,4	94,5	99,8
Р1иЮ12	РКЕ	128	62	48,4	39,5	57,4
ΡΙ(ϋΑΥ21)	128	126	98,4	94,5	99,8
РЮЮ14	РКЕ	130	68	52,3	43,4	61,1
ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	128	98,5	94,6	99,8
Р1иШ18	РКЕ	132	62	47,0	38,2	55,8
ΡΙ(ϋΑΥ21)	132	127	96,2	91,4	98,8
Р1иапх	РКЕ	130	66	50,8	41,9	59,6
ΡΙ(ΟΑΥ21)	130	128	98,5	94,6	99,8
	50-64 года	Р1иЮ11	РКЕ	58	28	48,3	35,0	61,8
ΡΙ(ϋΑΥ21)	58	56	96,6	88,1	99,6
Р1и1Х>12	РКЕ	61	28	45,9	33,1	59,2
ΡΙ(ΟΑΥ21)	61	60	98,4	91,2	100
Р1и1Х>14	РКЕ	60	28	46,7	33,7	60,0
ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	57	95,0	86,1	99,0
Р1иЮ18	РКЕ	60	29	48,3	35,2	61,6
ΡΙ(ΟΑΥ21)	60	57	95,0	86,1	99,0
Р1иаг1Х	РКЕ	55	29	52,7	38,8	66,3

	8РК
		95% С1
Штамм вакцины	Подгруппа	Группа	Момент времени	N	η	%	ίί	υί
В/Ма1ау51а			ΡΙ(ϋΑΥ21)	55	55	100	93,5	100
18-49 лет	Р1и1_011	РКЕ	129	53	41,1	32,5	50,1
ΡΙ(ΟΑΥ21)	129	129	100	97,2	100
Р1иЮ12	РКЕ	128	59	46,1	37,2	55,1
ΡΙ(ϋΑΥ21)	128	127	99,2	95,7	100
Р1иЮ14	РКЕ	130	57	43,8	35,2	52,8
ΡΙ(ΟΑΥ21)	130	125	96,2	91,3	98,7
РШЭ18	РКЕ	132	61	46,2	37,5	55,1
ΡΚΟΑΥ21)	132	128	97,0	92,4	99,2
РЮапх	РКЕ	130	61	46,9	38,1	55,9
ΡΙ(ΟΑΥ21)	130	126	96,9	92,3	99,2
	50-64 года	ΡΙυίϋ11	РКЕ	58	27	46,6	33,3	60,1
ΡΙ(ΟΑΥ21)	58	54	93,1	83,3	98,1
Р1иЮ12	РКЕ	61	29	47,5	34,6	60,7
ΡΙ(ΟΑΥ21)	61	59	96,7	88,7	99,6
Р1и1Х>14	РКЕ	60	24	40,0	27,6	53,5
ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	55	91,7	81,6	97,2
Р1иЮ18	РКЕ	60	25	41,7	29,1	55,1
ΡΙ(ΟΑΥ21)	60	52	86,7	75,4	94,1
р\|иапх	РКЕ	55	27	49,1	35,4	62,9
ΡΙ(ΰΑΥ21)	55	52	94,5	84,9	98.9

Легенда такая же, как в табл. 24.

Промежуточное заключение.

8РК удовлетворяет критериям СНМР (Комитет по медицинским продуктам, предназначенным для человека) (среднее значение >70) и ГЭА (ЬЬ 95% С1>70) для всех групп и всех трех штаммов. Продемонстрировано, что 8РК находится в пределах одинакового диапазона для всех групп.

Таблица 28

Уровень сероконверсии (8СК) для титра антител ΗΙ РI(^АΥ21)

	8СК
		95% С!
Штамм вакцины	Группа	Момент времени	Ν	η	%	ίί	υί
А/Зо1отоп	НиШ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	187	154	82,4	76,1	87,5
НиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	141	74,6	67,8	80,6
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	133	70,0	62,9	76,4
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	119	62,0	54,7	68,9
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	131	70,8	63,7	77,2
АЛМ$СОП51П	НиШ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	187	150	80,2	73,8	85,7
НиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	147	77,8	71,2	83,5
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	142	74,7	67,9	80,7
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	142	74,0	67,1	80,0
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	118	63,8	56,4	70,7
В/Ма1ау51а	Р1ииЭ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	187	136	72,7	65,7	79,0
НиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	127	67,2	60,0	73,8
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	128	67,4	60,2	74,0
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	127	66,1	59,0	72,8
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	125	67,6	60,3	74,3

ΓΊιιΙ ,1)11 - 5 мкг НА/штамм с 1/1 дозой А803,

ΓΊιιΙ,Ι)12 - 5 мкг НА/штамм с 1/2 дозы А803;

Ι'ΊιιΙ,Ι)14 - 5 мкг НА/штамм с 1/4 дозы А803;

Ι'ΊιιΙ,Ι)1Χ - 5 мкг НА/штамм с 1/8 дозы А803; Ииапх - Ииапх (15 мкг НА/штамм), сероконверсия определена как:

для изначально серонегативных субъектов титр антитела не менее 401 1)П, после вакцинации, для изначально серопозитивных субъектов титр антитела после вакцинации не менее 4-кратного титра антитела до вакцинации,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами до и после вакцинации, п/% - количество/процент серозащищенных субъектов,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, 1,1, - нижний предел, иЬ - верхний предел,

14(1 ХА\'21) - после вакцинации в день 21.

Таблица 29

Уровень сероконверсии (8СК) для титра ΗΙ антител на РI(^АΥ21) по возрастной категории

	8СК
		95% С!
Штамм вакцины	Под- группа	Г руппа	Момент времени	Ν	η	%	ίί	υί
А/8о1отоп	18-49 лет	НиШ11	ΡΙ(ΟΑΥ21)	129	113	87,6	80,6	92,7
ИиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	128	96	75,0	66,6	82,2
ПиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	91	70,0	61,3	77,7
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	132	84	63,6	54,8	71,8
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	101	77,7	69,6	84,5
50-64 лет	НиШ11	ΡΙ(ΟΑΥ21)	58	41	70,7	57,3	81,9
НиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	61	45	73,8	60,9	84,2
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	42	70,0	56,8	81,2
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	35	58,3	44,9	70,9
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	55	30	54,5	40,6	68,0
Α/ννΐδοοηδϊη	18-49 лет	НиШИ	ΡΙ(ϋΑΥ21)	129	104	80,6	72,7	87,0
НиШ12	ΡΙ(ΟΑΥ21)	128	101	78,9	70,8	85,6
ИиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	97	74,6	66,2	81,8
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	132	96	72,7	64,3	80,1
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	89	68,5	59,7	76,3
50-64 лет	НиШ11	Ρ1(ϋΑΥ21)	58	46	79,3	66,6	88,8
НиШ12	ΡΙ(ΟΑΥ21)	61	46	75,4	62,7	85,5
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	45	75,0	62,1	85,3
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	46	76,7	64,0	86,6
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	55	29	52,7	38,8	66,3
В/Ма1ауЗ!а	18-49 лет	НиШ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	129	102	79,1	71,0	85,7
НиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	128	96	75,0	66,6	82,2
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	93	71,5	63,0	79,1
НиШ18	Ρ1(ϋΑΥ21)	132	96	72,7	64,3	80,1
Пиапх	Ρί(ϋΑΥ21)	130	94	72,3	63,8	79,8
50-64 лет	НиШ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	58	34	58,6	44,9	71,4
НиШ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	61	31	50,8	37,7	63,9
НиШ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	35	58,3	44,9	70,9
НиШ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	31	51,7	38,4	64,8
Пиапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	55	31	56,4	42,3	69,7

Легенда такая же, как в табл. 26.

- 62 024250

Промежуточное заключение.

8СР удовлетворяет критериям СНМР (среднее >е 40) и критериям ΡΌΑ (ЬЬ 95% С1 >40) для всех исследуемых вакцин и для всех 3 штаммов. Продемонстрирована тенденция к уменьшению 8СР при уменьшении содержания Α803, за исключением В/Ма1ау81а (где показано, что все результаты находятся в пределах одинакового диапазона). Для Α/8ο1οтοη ЫапТ Р1иЬЭ1/1 индуцировала статистически значимый более высокий 8СР по сравнению с Р1иЬЭ1/8. Для всех групп, 8СР, индуцированные Р1иЬВ1/2 и Р1иЬВ1/4, находились в пределах одинакового диапазона.

Таблица 30

Фактор сероконверсии (8СР) для титра ΗΙ антител в день 21

	ЗСР
		95% С!
Штамм вакцины	Г руппа	Момент времени	Ν	Знамени е	ίί	υί
А/5о1отоп (1/ϋΙί)	НиЮ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	187	15,6	12,7	19,2
ПиЮ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	12,7	10,2	15,8
НиЮ14	ΡΙ(ΟΑΥ21)	190	12,8	10,1	16,1
Р1иЮ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	192	10,1	8,0	12,8
Ниалх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	12,7	9,9	16,2
Α/ννίδθοηδΐη (1/ϋΙί)	НиЮ11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	187	12,9	10,5	16,0
НиЮ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	10,9	8,9	13,3
НиЮ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	10,7	8,6	13,2
ΡΙυίϋ18	ΡΙ(ΟΑΥ21)	192	10,1	8,2	12,3
Ниалх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	9,0	7,2	11,2
В/Ма1ауаа (1/011.)	НиЮ11	Ρ1(ϋΑΥ21)	187	8,7	7,2	10,6
НиЮ12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	189	9,0	7,3	11,2
НиЬ014	ΡΙ(ϋΑΥ21)	190	8,7	7,0	10,8
НиЮ18	ΡΙ(ΟΑΥ21)	192	7,4	6,1	8,9
Ниалх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	185	8,1	6,6	9,9

Ρ1ιτΤΌ11 - 5 мкг НА/штамм с 1/1 дозой Α803,

Ρ1ιτΤΌ12 - 5 мкг НА/штамм с 1/2 дозы Α803,

Ρ1ιτΤΌ14 - 5 мкг НА/штамм с 1/4 дозы Α803,

Ρ1ιτΤΌ18 - 5 мкг НА/штамм с 1/8 дозы Α803;

Р1иапх - Р1иапх (15 мкг НА/штамм),

8СР - фактор сероконверсии или среднее геометрическое соотношение (среднее[1о§10(после/до]),

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, 1,1, - нижний предел, 1Л, - верхний предел, ΡΙ(ΌΑΥ21) - после вакцинации в день 21.

Таблица 31

Фактор сероконверсии (8СР) для титра ΗΙ антител в день 21 по возрастной категории

	5СР
		95% С!
Штамм вакцины	Подгруппа	Группа	Момент времени	Ν	Значе- ние	ίί	υί
А/5о1отоп (1/ΟΙΙ.)	18-49 лет	НикО11	ΡΙ(ΟΑΥ21)	129	18,5	14,3	23,8
Р1икО12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	128	13,9	10,5	18,4
Р1икО14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	13,4	10,1	17,8
РШЭ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	132	11,4	8,4	15,4
Ниапх	ΡΙ(0ΑΥ21)	130	16,3	12,1	22,1
50-64 лет	Ηυί011	ΡΚ0ΑΥ21)	58	10,8	7,7	15,1
Ник012	ΡΙ(ϋΑΥ21)	61	10,4	7,4	14,6
НиЮ14	ΡΙ(ΟΑΥ21)	60	11.4	7,7	17,1
Р1икО18	ΡΙ(0ΑΥ21)	60	7,8	5,5	11.2
Ниалх	ΡΙ(ΟΑΥ21)	55	6,9	4,6	10,4
ΑΜϊδΟοηδίη (1/ϋΙί)	18-49 лет	Н1икО11	Ρ1(ΟΑΥ21)	129	12,5	9.6	16,0
НиЦ012	ΡΚΟΑΥ21)	128	10,7	8.5	13,7
Ηυίϋ14	ΡΙ(ΟΑΥ21)	130	10,4	8,0	13,5
Иик018	ΡΙ(ϋΑΥ21)	132	9,9	7.8	12,5
Ниапх	ΡΙ(ϋΑΥ21)	130	10,6	8,2	13,8
50-64 лет	ΗυίΟ11	ΡΙ(0ΑΥ21)	58	13,8	9,0	21,2
НиЬО12	ΡΙ(0ΑΥ21)	61	11,1	7.5	16,4
НиЮ14	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	11,3	7,7	16,7
Р1икО18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	10,5	7.0	15,7
Р1иалх	ΡΚ0ΑΥ21)	55	6,0	4.0	8,9
В/Ма!ауз1а (1ЛМ)	18-49 лет	НикО11	ΡΙ(ϋΑΥ21)	129	10,7	8,4	13,5
ИиЬО12	ΡΙ(ϋΑΥ21)	128	12,4	9.5	16,1
ИикО14	ΡΙ(ΟΑΥ21)	130	9,7	7,4	12,6
ΡΙυίΟ18	ΡΙ(0ΑΥ21)	132	8,5	6,8	10,7
Ниапх	ΡΙ(0ΑΥ21)	130	9.2	7,2	11.7
50-64 лет	ИиЬОН	ΡΙ(0ΑΥ21)	58	5,6	4,0	7,7
Ηυί012	ΡΚΟΑΥ21)	61	4.7	3,4	6,5
Ηυίϋ14	ΡΙ(ΟΑΥ21)	60	6,8	4,6	10,0
ΡΚιίΟ18	ΡΙ(ϋΑΥ21)	60	5,4	3,8	7,5
Ниапх	ΡΙ(0ΑΥ21)	55	6,0	4,1	8,8

Легенда такая же, как в табл. 28

Промежуточное заключение.

- 63 024250

Для всех исследуемых вакцин 8СР значительно превосходили критерии СНМР (>2) для всех 3 штаммов. 8СР находились в пределах одного и того же диапазона для всех исследуемых вакцин.

Х.4.3 Адъювантные низкодозовые вакцины не хуже, чем Р1иапх (СМТ).

То, что адъювантные низкодозовые вакцины не хуже, чем Р1иапх с точки зрения соотношений СМТ в день 21 для 3 вирусных штаммов, показано в табл. 32.

Таблица 32

Адъювантные низкодозовые вакцины не хуже, чем Р1иапх с точки зрения соотношений СМТ в день 21 для 3 вирусных штаммов

	Низкая N СМТ	доза Ни 95% С!	ΡΙ N СМТ	иапх 95% С1
Доза А803 (мкл)	Доля дозы	Анти- тело	ίί Οί	ίί υί
250	1/1	Α/Η1Ν1	187	202,3	168,3	243,2	18 5	191,0	158,7	229,9
Α/Η3Ν2	187	378,6	320,0	447,8	18 5	335,3	286,5	392,3
В	187	236,0	206,1	270,4	18 5	217,8	184,5	257,2
125	1/2	Α/Η1Ν1	189	160,5	135,7	189,9	18 5	191,0	158,7	229,9
Α/Η3Ν2	189	336,0	288,2	391,8	18 5	335,3	286,5	392,3
В	189	226,2	204,8	249,7	18 5	217,8	184,5	257,2
62,5	1/4	Α/Η1Ν1	190	155,5	139,2	173,7	18 5	191,0	158,7	229,9
Α/Η3Ν2	190	302,0	272,9	334,1	18 5	335,3	286,5	392,3
В	190	205,7	181,9	232,6	18 5	217,8	184,5	257,2

31,2	1/8	Α/Η1Ν1	192	156,3	132,8	183,8	18 5	191,0	158,7	229,9
Α/Η3Ν2	192	282,9	244,0	328,1	18 5	335,3	286,5	392,3
В	192	169,4	145,1	197,7	18 5	217,8	184,5	257,2

	ЬО/Пиалх	90% С1
Доза А803 (мкл)	Доля дозы	Антитело	Соотношение	ίί	υί
250	1/1	Α/Η1Ν1	1,06	0,85	1,32
Α/Η3Ν2	1,13	0,93	1,37
В	1,08	0,91	1,30
125	1/2	Α/Η1Ν1	0,84	0,68	1,04
Α/Η3Ν2	1,00	0,83	1,20
В	1,04	0,88	1,22
62,5	1/4	Α/Η1Ν1	0,81	0,68	0,98
Α/Η3Ν2	0,90	0,77	1,05
В	0,94	0,79	1,12
31,2	1/8	Α/Η1Ν1	0,82	0,67	1,01
Α/Η3Ν2	0,84	0,70	1,01
В	0,78	0,64	0,94

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал,

90% С1 - 90%-ный доверительный интервал,

ЬЬ - нижний предел, ИЬ - верхний предел,

СМТ - среднее геометрическое титра антитела.

Промежуточное заключение.

Продемонстрировано, что Р1иЬП1/1, 1/2, 1/4 не хуже, чем Р1иапх с точки зрения соотношений СМТ для всех трех штаммов. Показано, что Р1цРП 1/8 не хуже, чем Р1иапх в отношении штаммов Η1Ν1 и Η3Ν2, но не в отношении В.

Х.5. Общие выводы.

Х.5.1 Выводы по безопасности.

Более высокая реактогенность продемонстрирована для адъювантных вакцин по сравнению с реактогенностью, продемонстрированной с использованием коммерчески доступной вакцины Р1иапх. Для адъювантных вакцин продемонстрирована тенденция к уменьшению реактогенности с уменьшением количества А803. В общем, сходный профиль реактогенности получен для Р1цПЫ/4 и Р1цПЫ/8.

Необычные симптомы были одинаковыми для всех групп вакцин.

Х.5.2. Заключения об иммуногенности.

- 64 024250

Основная задача этого исследования заключалась в оценке того, что препараты ЬЭ (низкодозовых) вакцин не хуже (ОМТ), чем Р1иапх на Ό21.

Продемонстрировано, что в день 21 после вакцинации одной дозой адъювантной вакцины Р1иОЬ1/1, Р1нОЬ1/2 и Р1нОЬ1/4 соотношения ОМТ для всех трех штаммов не хуже, чем соотношения, полученные с использованием Р1иайх. В этом исследовании соотношение ОМТ, полученное с использованием вакцины Р1нОЬ1/8, не хуже, чем с использованием Р1иайх в отношении штаммов НШ1 и Н3№, но не в отношении штамма В.

Несмотря на тенденцию к снижению иммунного ответа, продемонстрированную для уменьшающихся количеств адъюванта, показано, что все вакцины удовлетворяют всем 3 критериям СНМР для официального разрешения для всех штаммов.

Пример ХЕ Клинические испытания в группе населения в возрасте 65 лет и старше с использованием вакцины, содержащей препарат расщепленного антигена вируса гриппа и различные адъюванты.

ХЫ. Введение.

Эффективность классической расщепленной вакцины против гриппа, такой как Р1иапх™, у пожилых людей значительно ниже, чем в у взрослого или молодого населения. Предполагается, что старение иммунной системы (т.е. иммуностарение) лежит в основе относительной утраты эффективности, наблюдаемой у пожилых людей, и это оставляет место для улучшения вакцины путем стимулирования более сильных иммунных ответов. Поэтому в 2007 году было проведено контролируемое рандомизированное одностороннее слепое исследование, фаза ΙΙ, у пожилого населения в возрасте 65 лет и старше для оценки иммуногенности, безопасности и реактогенности противогриппозной вакцины-кандидата с восемью различными адъювантными препаратами, вводимыми внутримышечно, по сравнению с Р1иайх™ (О1ахоδт^ΐЬК1^ηе Вю1одюа18), используемым для сравнения.

Адъювантную противогриппозную вакцину, содержащую эмульсию типа масло в воде, и 25 мкг 30-МРЬ на дозу уже тестировали и выявили, что она является эффективной (\УО 2006/100111). В этом исследовании количества каждого компонента фиксировали до 250 мкл эмульсии масло в воде и 25 мкг МРЬ. Задача настоящего исследования заключалась в определении оптимального вакцинного препарата с приемлемым балансом профиля реактогенности/безопасности с профилем иммуногенности.

ХЕ2. Схема и задачи исследования.

Десять групп субъектов (200 на группу в возрасте 65 лет и старше, за исключением группы Р1иайх ΥΝΌ в возрасте 18-40 лет) параллельно внутримышечно (в.м.) получали следующие вакцины против гриппа:

Ρ1иΑδ03 1/1 - вакцина с адъювантом с полной дозой эмульсии м/в (масло вводе)(Αδ03 1/1),

Ρ1иΑδ03 'Л - вакцина с адъювантом с 1/2 дозы эмульсии м/в (Αδ03 1/2),

Ρ1иΑδ03 % - вакцина с адъювантом с 1/4 дозы эмульсии м/в (Αδ03 1/4),

Ρ1иΑδ25 1/1 - вакцина с адъювантом с 25 мкг МРЬ+полная доза эмульсии м/в (Αδ25Α),

Ρ1иΑδ25 'Л - вакцина с адъювантом с 25 мкг МРЬ+1/2 дозы эмульсии м/в (Αδ25В),

Ρ1иΑδ25 % - вакцина с адъювантом с 25 мкг МРЬ+1/4 дозы эмульсии м/в (Αδ25Ο),

Ρ1иΑδ50 'Л - вакцина с адъювантом с 50 мкг МРЬ+1/2 дозы эмульсии м/в (Αδ25Έ),

Ρ1иΑδ50 % - вакцина с адъювантом с 50 мкг МРЬ+1/4 дозы эмульсии м/в (Αδ25Ρ),

Р1иайх ΈΕΌ (>65 лет): Р1иайх™,

Р1иайх ΥΝ6 (18-40 лет): Р1иайх™.

Схема: одна в.м. инъекция вакцины против гриппа в день 0, отбор образцов крови в день 0,21 сутки и 180 после вакцинации. Стандартная тривалентная расщепленная вакцина против гриппа - Р1иайх™, используемая в этом исследовании такая же, как в примере Х.

Вакцинные препараты описаны в табл. 31 и 32.

ХТ2.1. Первоочередная задача: иммуногенность.

Идентифицировать оптимальный препарат (комбинация одной дозы эмульсии м/в и одной дозы МРЬ) адъювантной вакцины против гриппа по сравнению с Р1иайх, вводимые внутримышечно субъектам в возрасте 65 лет и старше, на основе иммуногенности (ОМТ) для трех штаммов вакцины в день 21 после вакцинации. Переменные являются такими же, как в примере Х.2.1, и для субъектов в возрасте 65 лет и старше (титр Ш антител и ОМТ титров антител Ш в день 21).

Х.2.2. Вторичные задачи - оценить:

безопасность и реактогенность у всех субъектов, вакцинированных вакцинами против гриппа, иммуногенность (ОМТ, δСΡ, δί',Έ и δРК) вакцин против гриппа у всех субъектов через 21 день после вакцинации, персистенция Н антител через 180 дней после первой вакцинации у всех субъектов, клеточно-опосредованный иммунный ответ (СМЦ, вызываемый противогриппозными вакцинами с точки зрения частоты встречаемости специфических в отношении вируса гриппа ί'.Ό4/ί'.Ό8 Тлимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два разных цитокина (ГРК-у, ΙΕ-2, СО40Ь или ТМР-а), в день 0, 21 и 180 (только для подгруппы субъектов).

Наблюдаемые и производные переменные (и определения) такие же, как описано в примере Х.

- 65 024250

ΧΙ.3. Композиция и введение вакцины.

Адъювантная вакцина против гриппа основана на коммерчески доступной вакцине Ииапх, продающейся на рынке с 1992 года компанией С8К Вю. Препараты-кандидаты состоят из тривалентного расщепленного вириона, инактивированных антигенов вируса гриппа, состоящих из 3 моновалентных партий вирусного антигена (полученных из соответственно штаммов вируса гриппа Α/Η1Ν1, Α/Η3Ν2 и В, рекомендованных для северного полушария в 2007/2008 г., см. пример X), объединенных с адъювантными системами на основе МРЬ и/или эмульсии масло в воде (м/в).

В этом испытании были протестированы два семейства патентованных адъювантных систем С8К

Вю:

семейство Αδ03, дифференцированное (1/1 - 1/2 - ...) по количеству эмульсии на дозу адъювантной вакцины для человека;

семейство Αδ25 эмульсий масло в воде, дополненных МРЬ и дифференцированных (А, В, ...) по количеству каждого компонента на дозу адъювантной вакцины для человека.

ΧΙ.3.1. Вакцинная композиция.

Продуцирование трех монопартий антигенов расщепленного инактивированного вириона, приготовленных из рабочего посевного материала трех штаммов вируса гриппа типа Α (Η1Ν1 и Η3Ν2) и типа В, выращенных индивидуально в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом, уже было описано (см. пример X). Клинические партии содержат 15 мкг гемагглютинина (НА) каждого штамма вируса гриппа на дозу. Антигены вируса гриппа адъювантированы 3-О-дезацил-4'-монофосфориллипидом Α (МРЬ) и/или Αδ03 в виде эмульсии масло в воде (м/в). Для объединения с антигенами расщепленного гриппозного вириона использованы восемь разных препаратов Αδ. Способ приготовления адъювантов представляет собой адаптированный способ из примера ΙΙ, приведенного в ШО 2006/100111, где количество индивидуальных компонентов адаптированы в соответствии с информацией, приведенной в табл. 31 и 32. Эксципиенты следующие: Ро1у8огЬа1 80 (Τтеееη-80), октоксинол 10 (Ггйоп® Χ-100), αтокоферилгидросукцинат, хлорид натрия, хлорид магния, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид калия и вода для инъекций. Разные препараты адъювантной вакцины против гриппа не содержат консервантов. Однако, они содержат следовые количества тиомерсала (менее 1,25 мкг Ид на дозу) с ранних стадий процесса изготовления лекарственного вещества, где его добавляют для снижения биологической нагрузки.

Адъювантная вакцина против гриппа представляет собой стерильную беловатую эмульсию расщепленного очищенного вируса гриппа с адъювантом, предназначенную для инъекций. Она представлена в виде двухкомпонентной вакцины, состоящей из стеклянного флакона типа Ι, содержащего антиген (суспензию), и предварительно заполненного стеклянного шприца типа Ι (РГ8), содержащего адъювант (эмульсию). Вакцину хранят при температуре 2-8°С. В момент инъекции содержимое шприца, предварительно заполненного антигеном, инъецируют во флакон, содержащий концентрированные антигены тривалентного инактивированного расщепленного вириона. После смешивания содержимое отбирают в шприц и иглу заменяют внутримышечной иглой. Одна доза разведенной адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 0,7 мл (табл. 33 и 34).

Таблица 33

Вакцинные препараты

Адъювантная система	Объем эмульсии м/в	Количество МРЬ	Антигены Р1и ΝΗ 2007/2008
А525А (А325_1__1)	250 мкл	25 мкг	А/Зо1отоп 1$1ап<15/3/2006
А525В (А325_1_2)	125 мкл	25 мкг	(Η1Ν1) ΐνΡ-145
А325С (А325_1_4)	62,5 мкл	25 мкг	АЛМ8СОП51П/67/2005
АЗОЗ 1/1 (А303_1_1)	250 мкл	0 мкг	(Η3Ν2) ΝΥΜΟΧ-161Β
АЗОЗ 1/2 (А503_1_2)	125 мкл	0 мкг
АЗОЗ 1/4 (А303_1_4)	62,5 мкл	0 мкг
А525Е - А350 1/2 (А350_1_2)	125 мкл	50 мкг	В/Ма!ау$1а/2506/2004
А525Р - А350 1/4 (А350_1_4)	62,5 мкл	50 мкг

- 66 024250

Таблица 34

Композиция вакцин против гриппа с адъювантом

Компонент 1			Количество на дозу (0,7 мл)
Активные ингредиенты
Инактивиро-
ванные
расщепленные
вирионы
-Η1Ν1				15 мкг НА
- Η3Ν2				15 мкг НА
- В				15 мкг НА
Адъювант	А32	А325	А325С	АЗОЗ	АЗОЗ	АЗОЗ	А325Е	А325Р
	5А	В		1/1	1/2	1/4
- эмульсия (мкл)	250	125	62,5	250	125	62,5	125	62,5
* сквален (мг)	10,69	5,34	2,67	10,69	5,34	2,67	5,34	2,67
• ϋί-α-	11,86	5,93	2,97	11,86	5,93	2,97	5,93	2,97
токоферол (мг) ♦ Ро1у5ОгЪа180 (Τννββη-80) (мг)	4,86	2,43	1,22	4,86	2,43	1,22	2,43	1,22
- МР1_	25 мкг	25 мкг	25 мкг	/	/	/	50 мкг	50 мкг

Эксципиенты (целевые значения)
Ро1узогЬа180 (Τννβθη-δΟ)	0,40 мг
Окгоксинол 10 (Тгйоп® Х-100)	0,05 мг
α-Т окоферилгидросукцинат	0,05 мг
Хлорид натрия	3,92 мг
Хлорид магния	0,03 мг
Гидрофосфат натрия	0,54 мг
Дигидрофосфат калия	0,16 мг
Хлорид калия	0,10 мг
Вода для инъекции	до 0,70 мл

ΧΙ.3.2. Изготовление вакцины.

Препараты Αδ03 готовят путем разведения фосфатного буфера (Ν/Κ 191,4 мМ ΡΟ₄ ^3- 2,74 мМ №С1, 54 мМ КС1, рН 6,8, до 9,57 мМ РО₄ ³) в воде для инъекций (перемешивание в течение 15-45 мин при к.т. до гомогенного состояния). Затем добавляют соответствующее количество партии эмульсии масло в воде. Смесь перемешивают в течение 15-45 мин при комнатной температуре, и измеряют рН. Смесь затем стерилизуют фильтрованием через 0,2 мкм мембрану. Осуществляют продувку стерильным инертным газом (азотом) для создания инертного пространства сверху в заполненных контейнерах в течение минимум 1 мин. Стерильный адъювант Αδ03 хранят при температуре 2-8°С до асептического заполнения в 1,25 мл стерильные стеклянные шприцы типа Ι (Ρ1. Еиг). Каждый шприц содержит избыточный объем 60 мкл (280 мкл+избыток 60 мкл).

Препараты Αδ25 готовят путем разведения фосфатного буфера в воде для инъекций (перемешивание в течение 15-45 мин при к.т. до гомогенного состояния). Затем добавляют подходящие количества партии δΒ62 и жидкой партии ΜΡΗ В остальном процедура такая же, как описано выше.

Одна доза разведенной адъювантной вакцины против гриппа соответствует 0,7 мл. Конечная концентрация НА составляет 21,4 мкг каждой моновалентной партии на мл тривалентной конечной партии. Конечную партию антигенов (Α§8) заполняют в стеклянные флаконы на 3 мл, где одна доза тривалентных антигенов вируса гриппа соответствует объему 0,42 мл. Конечную партию адъюванта заполняют в 1,25 мл стеклянные ΡΡδ, где одна доза соответствует объему 0,28 мл. Конечная доза вакцины после разведения составляет 0,7 мл.

Для обеспечения инъецирования номинального объема (0,7 мл) после разведения каждый флакон с Α§ заполняют целевым объемом 0,51 мл, и каждый шприц с Αδ заполняют целевым объемом 0,34 мл.

ΧΙ.4. Результаты по иммуногенности - гуморальный иммунный ответ.

ΧΙ.4.1. Средние геометрические титров (ОМТ) ΗΙ антител.

ОМТ для ΗΙ антител с 95% С1 представлены в табл. 35 и на фиг. 19.

- 67 024250

Таблица 35

Уровни серопозитивности и 0МТ для титра ΗΙ антител в день 0 и день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности ΗΙ)

	>= 10 1/ΟΙΙ-	©мт
		95% С1		95% С1
Антитело	Группа	Момент времени	N	п	%	ίί	υί	Значение	IX	υί	ΜίΠ	Мах
А/Зо1отоп ΙδΙβηΰδ	А303_1_4	РКЕ	191	97	50,8	43,5	58,1	10,6	9.3	12,2	<10,0	453,0
Р1<021)	191	184	96,3	92,6	98,5	82,3	69,7	97,1	<10,0	2560,0
А303_1_2	РКЕ	191	91	47,6	40,4	55,0	10,8	9,4	12,4	<10,0	226,0
Р1(О21)	192	188	97,9	94,8	99.4	102,2	87,0	119,9	<10,0	1280,0
А303_1_1	РКЕ	189	86	45,5	38,3	52,9	10,1	8,8	11,5	<10,0	320,0
Р1(О21)	189	185	97,9	94,7	99,4	98,2	84,3	114,3	<10,0	3620,0
А325_1_4	РКЕ	194	97	50,0	42,8	57,2	10,6	9,3	12,1	<10,0	226,0
Р1<021)	194	189	97,4	94,1	99,2	91,7	76,9	109,3	<10,0	1810,0
А325_1_2	РКЕ	192	97	50,5	43,2	57,8	12,0	10,3	14,0	<10,0	320,0
Р1(О21)	192	190	99,0	96,3	99,9	113,2	96,0	133,6	<10,0	2560,0
А325_1_1	РКЕ	193	88	45,6	38,4	52,9	9,9	8,6	11,3	<10,0	320,0
Р1(О21)	193	188	97,4	94,1	99,2	114,4	97,1	134,8	<10,0	1810,0
А350_1_4	РКЕ	192	87	45,3	38,1	52,6	10,2	8,9	11,7	<10,0	160,0
Р1(О21)	192	183	95,3	91,3	97,8	78,5	65,9	93,5	<10,0	1280,0
А550_1_2	РКЕ	189	91	48,1	40,8	55,5	10,3	9,0	11,9	<10,0	640,0
Р1(О21)	189	183	96,8	93,2	98,8	111,8	93,3	134,0	<10,0	1280,0
Ни_ЕиЭ	РКЕ	187	88	47,1	39,7	54,5	10,7	9,2	12,4	<10,0	2560,0
Р1(О21)	188	177	94,1	89,8	97,0	59,6	49,6	71,7	<10,0	3620,0
ΡΙυ_ΥΝ©	РКЕ	197	122	61,9	54,8	68,7	21,3	17,1	26,5	<10,0	1810,0

	>= 10 1/ϋΙί	©МТ
		95% С1		95% С1
Антитело	Группа	Момент времени	N	η	%	ίί	υί	Значение	ίί	υί	ΜίΠ	Мах
		ΡΙ(ϋ21)	197	195	99,0	96,4	99,9	271,6	224,6	328,4	<10,0	5120,0
АЛМ5С0П51П	А303_1_4	РКЕ	191	176	92,1	87,4	95,5	59,9	49,5	72,4	<10,0	1280,0
Р1(О21)	191	190	99,5	97,1	100	276,2	238,8	319,6	<10,0	5120,0
А303_1_2	РКЕ	191	168	88,0	82,5	92,2	51,2	41,9	62,4	<10,0	905,0
Р1(О21)	192	192	100	98,1	100	350,2	298,0	411,4	14,0	14480,0
А303_1_1	РКЕ	169	168	88,9	83,5	93,0	44,4	36,5	54,0	<10,0	2560,0
Р1(О21)	189	189	100	98,1	100	351,3	304,8	404,8	28,0	5120,0
А325_1_4	РКЕ	194	175	90,2	85,1	94,0	65,7	53,7	80,4	<10,0	2560,0
Р1(О21)	194	194	100	98,1	100	309,2	264,9	361,0	10,0	5120,0
А325_1_2	РКЕ	192	174	90,6	85,6	94,3	61,1	50,6	73,8	<10,0	1280,0
Р1(О21)	192	192	100	98,1	100	331,1	289,6	378,6	40,0	5120,0
А325_1_1	РКЕ	193	173	89,6	84,4	93,6	55,8	46,2	67,4	<10,0	1280,0
Ρ1(ϋ21)	193	192	99,5	97,1	100	438,1	379,7	505,4	<10,0	3620,0
А350_1_4	РКЕ	192	168	87,5	82,0	91,8	54,6	44,5	67,0	<10,0	2560,0
Р1(О21)	192	191	99,5	97,1	100	263,3	225,3	307,7	<10,0	5120,0
А350_1_2	РКЕ	189	166	87,8	82,3	92,1	57,8	47.1	70,9	<10,0	2560,0
Р1(О21)	189	188	99,5	97,1	100	347,5	296,4	407,3	<10,0	2560,0
ΡΙυ_Είϋ	РКЕ	187	169	90,4	85,2	94,2	61,0	49,8	74,7	<10,0	1810,0
Р1(О21)	188	188	100	98,1	100	186,7	158,0	220,7	10,0	2560,0
ΡΙυ.ΥΝ©	РКЕ	197	166	84,3	78,4	89,1	47,8	39,2	58,4	<10,0	1280,0
Р1(О21)	197	197	100	98,1	100	380,2	331,6	435,9	40,0	5120,0
В/Ма1ау$1а	А303_1_4	РКЕ	191	178	93,2	88,6	96,3	58,6	49,8	68,9	<10,0	2560,0
Р1(О21)	191	190	99,5	97,1	100	147,1	129,1	167,6	<10,0	2560,0
А303_1_2	РКЕ	191	180	94,2	89,9	97,1	53,7	45,7	63,2	<10,0	640,0
Р1(О21)	192	192	100	98,1	100	163,1	142,5	186,6	14,0	2560,0
А303_1_1	РКЕ	189	177	93,7	89,2	96,7	57,0	48,2	67,5	<10,0	2560,0
Р1(О21)	189	189	100	98,1	100	172,1	149,9	197,6	14,0	2560,0
А325_1_4	РКЕ	194	183	94,3	90,1	97,1	62,6	53,3	73,4	<10,0	1810,0
Р1(О21)	194	194	100	98,1	100	152,4	134,4	172,7	20,0	2560,0
А325_1_2	РКЕ	192	184	95,8	92,0	98,2	77,8	66,0	91,7	<10,0	1280,0
Р1(О21)	192	192	100	98,1	100	181,4	158,9	207,1	10,0	2560,0
А325_1_1	РКЕ	193	186	96,4	92,7	98,5	62,9	53,9	73,4	<10,0	2560,0
Р1(О21)	193	193	100	98,1	100	202,0	179,7	227,1	20,0	3620,0
А350_1__4	РКЕ	192	179	93,2	88,7	96,3	58,2	49,0	69,1	<10,0	1280,0
Р1(О21)	192	192	100	98,1	100	155,7	134,8	179,8	20,0	5120,0
А350_1_2	РКЕ	189	176	93,1	88,5	96,3	62,6	53,0	74,0	<10,0	1280,0

	>= 10 1/ΟΙί	©МТ
		95% С!		95% С!
Антитело	Группа	Момент времени	N	π	%	ίί	υί	Значение	IX	υί	Μίη	Мах
		Р1(О21)	189	189	100	98,1	100	174,6	152,0	200,7	10,0	2560,0
ΡΙιι.ΕίΟ	РКЕ	187	179	95,7	91,7	98,1	66,5	56,5	78,3	<10,0	905,0
ΡΙ(ϋ21)	188	188	100	98,1	100	153,0	135,2	173,1	20,0	1280,0
ΡΙυ.ΥΝ©	РКЕ	197	135	68,5	61,5	74,9	23,4	19,1	28,7	<10,0	1280,0
ΡΙ(ϋ21)	197	197	100	98,1	100	281,9	241,7	328,7	20,0	5120,0

Р1и_ЕЬВ - Р1иапх пожилые люди (возраст>65 лет); Ρ1υ_ΥΝΟ - Р1иапх молодые люди (возраст 18-40 лет),

ОМТ - среднее геометрическое титра антитела, рассчитанное на всех субъектов,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами, п/% - количество/процент субъектов с титром в пределах указанного диапазона,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал; ЬЬ - нижний предел, 1Л, - верхний предел; Мт/Мах - минимум/максимум,

РКЕ - до вакцинации дозы 1 (день 0); И(В21) - после вакцинации дозы 1 (день 21).

Промежуточное заключение.

Вакцина против гриппа, содержащая одну полную дозу адъюванта А803 и 25 мкг МРЬ (А825_1_1), вызывает статистически значимый лучший ответ ΗΙ для штамма В/Ма1ау81а по сравнению с Пиайх у субъектов в возрасте 65 лет и старше. Для других двух штаммов все адъювантные вакцины, за исключением вакцин, содержащих четверть дозы А803, успешны по сравнению с Пиайх у субъектов в возрасте 65 лет и старше в этом исследовании.

ΧΙ.4.2. Факторы сероконверсии титров антител против ΗΙ, уровни серозащиты и уровни сероконверсии (кареллируют с защитой, установленной для вакцины против гриппа для людей).

Результаты представлены в табл. 36 - фиг. 20 (один на штамм) для уровней серозащиты, в табл. 37 фиг. 21 для уровней сероконверсии и в табл. 38 - фиг. 22 для факторов сероконверсии.

Таблица 36

8РК для титра ΗΙ антител в день 0 и день 21 (АТР когорта в отношении ΗΙ)

	ЗРР
		95% С!
Штамм вакцины	Группа	Момент времени	N	η	%	ίί	иь
А/5о1отоп ΙδΙβηάδ	А303_1_4	РРЕ	191	27	14,1	9,5	19,9
ΡΙ(ϋ21)	191	160	83,8	77,8	88,7
А303_1_2	РРЕ	191	31	16,2	11,3	22,2
ΡΙ(ϋ21)	192	168	87,5	82,0	91,8
А503_1_1	РРЕ	189	25	13,2	8,7	18,9
ΡΙ(ϋ21)	189	171	90,5	85,4	94,3
А325_1_4	РРЕ	194	33	17,0	12,0	23,1
ΡΙ(ϋ2Τ)	194	158	81,4	75,2	86,7
А525_1_2	РРЕ	192	44	22,9	17,2	29,5
ΡΙ(ϋ21)	192	169	88,0	82,6	92,3
А825_1_1	РРЕ	193	23	11,9	7,7	17,3
ΡΙ(ϋ21)	193	172	89,1	83,8	93,1
А550_1_4	РРЕ	192	22	11,5	7,3	16,8
Р1<021)	192	153	79,7	73,3	85,1
А550_1_2	РРЕ	189	26	13,8	9,2	19,5
Р1Щ21)	189	163	86,2	80,5	90,8
Р1и_Е1_О	РРЕ	187	31	16,6	11,6	22,7
ΡΙ(ϋ21)	188	132	70,2	63,1	76,6
ΡΙιι_ΥΝΘ	РРЕ	197	69	35,0	28,4	42,1
ΡΙ(ϋ21)	197	182	92,4	87,8	95,7
ΑΛΜδοοηδΐη	А303_1_4	РРЕ	191	133	69,6	62,6	76,1
ΡΙ(ϋ21)	191	188	98,4	95,5	99,7
А503_1_2	РРЕ	191	124	64,9	57,7	71,7
ΡΙ(ϋ21)	192	189	98,4	95,5	99,7
А303_1_1	РРЕ	189	113	59,8	52,4	66,8
Р1Щ21)	189	188	99,5	97,1	100
А325_1_4	РРЕ	194	139	71,6	64,8	77,9
Р1Щ21)	194	190	97,9	94,8	99,4
А325_1_2	РРЕ	192	131	68,2	61,1	74,7
Р1(О21>	192	192	100	98,1	100

	ЗРР
		95% С1
Штамм вакцины	Группа	Момент времени	N	η	%	ίί	υί
	А325_1_1	РРЕ	193	139	72,0	65,1	78,2
ΡΙ(ϋ21)	193	191	99,0	96,3	99,9
А350_1_4	РРЕ	192	130	67,7	60,6	74,3
ΡΙ(ϋ21)	192	187	97,4	94,0	99,1
А350_1_2	РРЕ	189	134	70,9	63,9	77,3
ΡΙ(ϋ21)	189	185	97,9	94,7	99,4
ΡΙυ_ΕΙ_Ο	РРЕ	187	132	70,6	63,5	77,0
ΡΙ(ϋ21)	188	179	95,2	91,1	97,8
Е1и_УЫС	РРЕ	197	122	61,9	54,8	68,7
ΡΙ(ϋ21)	197	197	100	98,1	100
В/Ма!ауб1а	А503_1_4	РРЕ	191	138	72,3	65,3	78,5
Р1Щ21)	191	183	95,8	91,9	98,2
А303_1_2	РРЕ	191	140	73,3	66,4	79,4
ΡΙ(ϋ21)	192	183	95,3	91,3	97,8
А303_1_1	РРЕ	189	138	73,0	66,1	79,2
ΡΙ(ϋ21)	189	184	97,4	93,9	99,1
А325_1_4	РРЕ	194	148	76,3	69,7	82,1
ΡΙ(ϋ21)	194	187	96,4	92,7	98,5
А325_1_2	РРЕ	192	156	81,3	75,0	86,5
ΡΙ(ϋ21)	192	186	96,9	93,3	98,8
А325_1_1	РРЕ	193	149	77,2	70,6	82,9
ΡΙ(ϋ21)	193	192	99,5	97,1	100
А350_1_4	РРЕ	192	139	72,4	65,5	78,6
ΡΙ(ϋ21)	192	182	94,8	90,6	97,5
А350_1_2	РРЕ	189	145	76,7	70,0	82,5
Р1(021)	189	184	97,4	93,9	99,1
Р1и_Е!_О	РРЕ	187	144	77,0	70,3	82,8
ΡΙ(ϋ21)	188	183	97,3	93,9	99,1
ΡΙϋ_ΥΝΟ	РРЕ	197	77	39,1	32,2	46,3
ΡΙ(ϋ21)	197	195	99,0	96,4	99,9

- 69 024250

Таблица 37

8СК для титра ΗΙ антител в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности ΗΙ)

	зек
		95% С1
Штамм вакцины	Группа	N	η	%	Ι_Ι_	иь
А/Зо1отоп ΙδΙβηάδ	А503_1_4	191	133	69,6	62,6	76,1
А303_1_2	191	138	72,3	65,3	78,5
А503_1_1	139	154	81,5	75,2	86,7
А525_1_4	194	130	67,0	59,9	73,6
А525_1_2	192	142	74,0	67,1	80,0
А825_1_1	193	151	78,2	71,7	83,8
А350_1_4	192	129	67,2	60,1	73,8
А350_1_2	189	146	77,2	70,6	83,0
Ии_ЕЮ	187	99	52,9	45,5	60,3
Πυ_ΥΝΟ	197	135	68,5	61,5	74,9
ΑΜ/ΐδΟοηδίη	А303_1_4	191	108	56,5	49,2	63,7
А303_1_2	191	124	64,9	57,7	71,7
А303_1_1	189	141	74,6	67,8	80,6
А825_1_4	194	104	53,6	46,3	60,8
А825_1_2	192	124	64,6	57,4	71,3
А825_1_1	193	142	73,6	66,8	79,6
А350_1_4	192	110	57,3	50,0	64,4
А350_1_2	189	131	69,3	62,2	75,8
Пи_ЕЮ	187	69	36,9	30,0	44,2
ΡΙιι_ΥΝΟ	197	130	66,0	58,9	72,6
В/Ма1ау51а	А803_1_4	191	47	24,6	18,7	31,3
А303_1_2	191	73	38,2	31,3	45,5
А303_1_1	189	65	34,4	27,6	41,6
А325_1_4	194	44	22,7	17,0	29,2
А525_1_2	192	45	23,4	17,6	30,1
А525_1_1	193	79	40,9	33,9	48,2
А850_1_4	192	50	26,0	20,0	32,9
А850_1_2	189	55	29,1	22,7	36,1
Ни_ЕЮ	187	47	25,1	19,1	32,0
ΓΙυ_ΥΝΟ	197	147	74,6	67,9	80,5

Сероконверсия определена как:

для изначально серонегативных субъектов титр антитела не мене 40 М)П, после вакцинации, для изначально серопозитивных субъектов титр антитела после вакцинации не менее 4-кратного титра антитела до вакцинации,

Ν - количество субъектов с имеющимися результатами до и после вакцинации, п/%- количество/процент субъектов с сероконверсией,

95% С1 - 95%-ный доверительный интервал, 1,1, - нижний предел, ИЬ - верхний предел.

Таблица 38

8СР для титра ΗΙ антител в день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности ΗΙ)

- 70 024250

	ЗСР
		95% С!
Штамм вакцины	Группа	N	Значение	1_1_	υι_
	А525_1_2	192	2,3	2,1	2,6
А325_1_1	193	3,2	2,8	3,7
А350_1_4	192	2,7	2,3	3,1
А850_1_2	189	2,8	2,4	3,2
Р1и_ЕЮ	187	2,3	2,0	2,6
Ρ!ιι_ΥΝΟ	197	12,0	9,7	15,0

8СИ- фактор сероконверсии или среднее геометрическое соотношение (среднее[1од 10(после/до)]),

Источник данных - прилагаемая таблица ΙΙΙΑ.

Промежуточное заключение относительно гуморального иммунного ответа.

Очевидный эффект дозы Α503 (эмульсия типа масло в воде) виден из ΗΙ данных.

ОМТ были статистически значимо выше в группах с адъювантной вакциной против гриппа по сравнению с группой И1и_ЕТО для штамма Α/Зо^топ Шапб® (за исключением Αδ03_1_4 и Αδ50_1_4) и штамма Α/Α^8сοп8^п. Для штамма В/Ма1ау81а ОМТ были статистически значимо выше в группе Αδ25_1_1 по сравнению с группой И1и_ЕЬ0. Для штамма Η3Ν2 (Α/ΆίδΟ-οιίδίιι) гуморальный ответ повышен до уровня, наблюдаемого у молодых взрослых людей, для всех групп с адъювантной вакциной против гриппа, за исключением групп, в которых была использована 1/4 дозы эмульсии.

5СК были статистически значимо выше в группе с адъювантной вакциной против гриппа по сравнению с группой И1и_ЕТО для штамма Α/Зо^топ Ыапб8 (за исключением Αδ25_1_4 и Αδ50_1_4) и штамма Α/Α^8сοп8^п. Для штамма В/Ма1ау81а 5СК были статистически значимо выше в группе Αδ25_1_1 по сравнению с группой И1и_ЕТВ.

ΧΙ.5. Анализ клеточно-опосредованного иммунного ответа.

Частоты встречаемости специфических в отношении вируса гриппа СЭ4 Т-клеток, продуцирующих по меньшей мере два цитокина (все пары) в день 0 и день 21, представлены в табл. 39 и на фиг. 23 для клеток, рестимулированных пулами вакцинных штаммов.

Таблица 39

Частота встречаемости цитокинпозитивных СЭ4 Т-клеток (на миллион СЭ4 Т -клеток) для пула штаммов в день 0 и день 21 (АТР когорта в отношении иммуногенности СМЦ

Описание теста	Группа	Момент времени	N	N0)155	ОМ	СО	Μΐη	О1	Среднее	ОЗ	Мах
СЭ4-ВСЕ ПАРЫ	А303_1_4	РКЕ	42		1013,57	679,94	1,00	819,00	1202,00	1790,00	2841,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	2038,17	1508,79	422,00	1479,00	2156,00	3215,00	6834,00
А303_1_2	РНЕ	38		1085,68	912,10	1,00	939,00	1382,50	1921,00	3502,00
ΡΙ(ϋ21)	39	0	2780,75	1529,68	426,00	2023,00	2851,00	4126,00	8108,00
А303_1_1	РКЕ	48		870,96	1342,41	1,00	685,00	1035,50	1534,50	6956,00
Р1(О21)	49	0	2563,84	1840,16	280,00	1907,00	2826,00	3636,00	8830,00
А325_1_4	РКЕ	47	0	1089,72	853,67	139,00	664,00	1177,00	1933,00	3321,00
Ρ1(ϋ21)	47	0	2186,84	1776,15	506,00	1447,00	2155,00	3234,00	9385,00
А325_1_2	РКЕ	41	2	1124,53	1071,90	384,00	674,00	1194,00	1717,00	4917,00
РЦ021)	4з!	0	2153,42	1871,41	348,00	1383,00	1978,00	3751,00	8426,00
А325_1_1	РКЕ	44	0	1106,74	3071,01	140,00	669,00	1140,50	1731,00	20615,00
ΡΙ(ϋ21)	44	0	2771,86	2784,80	526,00	1742,00	2773,50	4855,00	15247,00
А350_1_4	РКЕ	41	2	867,17	666,69	77,00	559,00	835,00	1364,00	2671,00
Р1Щ21)	43	0	2067,82	1008,33	303,00	1560,00	2142,00	2949,00	5044,00
А350_1_2	РКЕ	41	6	1067,79	1038,58	169,00	794,00	1192,00	1512,00	6122,00
ΡΙ(β21)	47	0	2421,78	6581,38	202,00	1447,00	2389,00	4010,00	46387,00
Р1и_ЕЮ	РКЕ	42	3	960,35	998,67	189,00	561,00	863,50	1706,00	4356,00
Р1(021)	45	0	1509,05	2074,14	211,00	897,00	1452,00	2818,00	11117,00
ΡΙιι_ΥΝ<3	РКЕ	40	6	1681,05	1196,39	225,00	1144,00	1907,50	2611,00	5110,00
ΡΙ(ϋ21)	46	0	2687,64	2151,90	830,00	1900,00	2459,50	4241,00	11758,00
СО4- СО40Ь	А303_1_4	РКЕ	42		967,13	664,97	1,00	842,00	1186,50	1742,00	2748,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1916,56	1502,81	168,00	1353,00	2102,00	3122,00	6538,00
А303_1_2	РКЕ	38		1060,88	878,50	1,00	891,00	1384,00	1921,00	3398,00
ΡΙ(ϋ21)	39	0	2714,74	1519,80	486,00	1957,00	2829,00	4076,00	8038,00
А303_1_1	РКЕ	48		762,13	1329,02	1,00	645,00	1022,50	1541,00	6797,00
Р1(021)	49	0	2428,54	1856,48	210,00	1862,00	2733,00	3589,00	8809,00
А325_1_4	РКЕ	47	0	994,17	865,71	35,00	579,00	1076,00	1912,00	3340,00
ΡΙ(ϋ21)	47	0	1982,33	1801,26	73,00	1293,00	2055,00	3159,00	9312,00
А325_1_2	РКЕ	41	2	1039,63	1062,10	116,00	596,00	1152,00	1715,00	4899,00
Р1(Э21)	43	0	1998,69	1842,77	309,00	1396,00	1946,00	3459,00	8149,00

- 71 024250

	А325_1_1	РКЕ	44	0	1048,77	1485,48	145,00	674,00	1108,50	1632,50	8844,00
Р1(О21)	44	0	2529.59	2189,87	102,00	1599,50	2763,00	4419,50	9999,00
А550_1_4	РКЕ	41	2	847,56	663,49	95,00	549,00	842,00	1350,00	2588,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1673,39	1043,51	1,00	1413,00	2062,00	2880,00	4884,00
А350_1_2	РКЕ	41	6	1037,41	982,61	171,00	799,00	1168,00	1492,00	5650,00
Р1(О21)	47	0	2268,52	6584,73	117,00	1447,00	2245,00	3739,00	46410,00
Р1и_ЕЮ	РКЕ	42	3	923,98	976,85	110,00	607,00	816,50	1597,00	4296,00
Р1(О21>	45	0	1299,05	2034,85	1,00	896,00	1545,00	2818,00	10836,00
ΡΙυ_ΥΝΟ	РКЕ	40	6	1636,72	1186,79	233,00	1068,00	1878,50	2418,00	5088,00
Р1(О21)	46	0	2575,50	2169,43	456,00	1862,00	2331,50	4178,00	11718,00
004-ΙΡΝγ	А303_1_4	РКЕ	42		721,19	483,64	114,00	475,00	772,00	1142,00	2052,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1394,52	1096,51	347,00	898,00	1305,00	2261,00	5075,00
А303_1_2	РКЕ	38		712,34	598,18	1,00	566,00	936,50	1412,00	2422,00
ΡΙ(ϋ21)	39	0	1894,63	1156,37	581,00	1297,00	2083,00	3016,00	6342,00
А303_1_1	РКЕ	48		527,46	1053,96	1,00	395,00	544,00	985,50	6583,00
Р1(О21)	49	0	1623,21	1383,09	104,00	1208,00	1652,00	2380,00	6983,00
А525_1_4	РКЕ	47	0	741,88	643,41	36,00	430,00	770,00	1401,00	2602,00
ΡΙ(ϋ21)	47	0	1433,90	1206,49	246,00	861,00	1374,00	2301,00	5754,00
А325_1_2	РКЕ	41	2	670,69	656,68	218,00	380,00	596,00	1151,00	3664,00
Р1(О21)	43	0	1279,87	1279,29	173,00	617,00	1330,00	2402,00	5385,00
А325_1_1	РКЕ	44	0	597,78	2794,11	1,00	372,50	652,50	1226,00	18946,00
Р1(О21)	44	0	1802,95	2189,25	258,00	1133,50	1970,00	3238,00	13164,00
А350_1_4	РКЕ	41	2	571,79	448,58	134,00	335,00	597,00	945,00	1901,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1325,52	769,76	188,00	936,00	1428,00	1959,00	3841,00
А350_1_2	РКЕ	41	6	601,27	513,44	32,00	485,00	743,00	1025,00	2283,00
Р1(Э21)	47	0	1550,79	6051,21	41,00	1016,00	1624,00	2710,00	42697,00
Р!и_ЕЮ	РКЕ	42	3	584,91	588,62	77,00	396,00	598,00	955,00	2680,00
ΡΙ(ϋ21)	45	0	980,97	1396,79	137,00	614,00	876,00	1662,00	6633,00
ΡΙιι.ΥΝΘ	РКЕ	40	6	1156,67	945,24	126,00	731,50	1248,00	2152,50	3774,00
ΡΙ(ϋ21)	46	0	1811,65	1618,60	411,00	1162,00	1813,00	2524,00	8432,00
СО4-И2	А303_1_4	РКЕ	42		805,41	572,67	1,00	683,00	971,50	1429,00	2562,00
Р1(О21)	43	0	1563,40	1203,93	296,00	1116,00	1509,00	2516,00	5786,00
А303_1_2	РКЕ	38		881,32	713,88	1,00	727,00	1191,50	1605,00	2791,00
Р1(О21)	39	0	2057,58	1251,53	205,00	1522,00	2184,00	3140,00	7019,00
А503_1_1	РКЕ	48		640,10	1098,72	1,00	513,50	813,50	1240,50	6391,00
ΡΙ(ϋ21)	49	0	1955,75	1528,09	232,00	1407,00	2088,00	2874,00	7173,00
А325_1_4	РКЕ	47	0	864,60	696,78	117,00	557,00	896,00	1612,00	2771,00
		ΡΙ(ϋ21)	47	0	1629,80	1344,02	330,00	1080,00	1595,00	2504,00	6819,00
А325_1_2	РКЕ	41	2	887,73	863,40	275,00	554,00	924,00	1431,00	4256,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1656,38	1486,45	316,00	1128,00	1617,00	2760,00	6311,00
А325_1_1	РКЕ	44	0	834,27	755,62	131,00	537,00	877,00	1457,50	4105,00
Р1(О21)	44	0	2028,18	1595,73	325,00	1334,00	2044,50	3624,00	7175,00
А350_1_4	РКЕ	41	2	690,38	574,37	35,00	466,00	730,00	1132,00	2423,00
Р1(О21)	43	0	1533,43	780,68	194,00	1145,00	1477,00	2269,00	3752,00
А350_1_2	РКЕ	41	6	831,91	720,68	102,00	620,00	879,00	1221,00	3918,00
Р1(О21)	47	0	1862,37	5848,13	158,00	1154,00	1852,00	3278,00	41253,00
Р1и_ЕЮ	РКЕ	42	3	729,05	856,17	177,00	369,00	716,00	1299,00	3514,00
ΡΙ(ϋ21)	45	0	1191,28	1688,15	145,00	620,00	1301,00	2414,00	9166,00
ΡΙυ.ΥΝΟ	РКЕ	40	6	1210,88	920,74	138,00	747,00	1308,50	1909,50	3925,00
Р1<021)	46	0	2033,00	1700,20	684,00	1429,00	1940,50	3296,00	9375,00
ΟΟ4-ΤΝΡα	А303_1_4	РКЕ	42	1	652,51	499,99	1,00	538,00	778,00	1141,00	2037,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1147,97	942,25	126,00	677,00	1251,00	2054,00	4142,00
А303_1_2	РКЕ	38	1	755,02	646,69	1,00	607,00	985,00	1429,00	2844,00
Р1(О21)	39	0	1596,30	975,22	295,00	1113,00	1695.00	2577,00	4927,00
А303_1_1	РКЕ	4ί	1	550,23	1016,73	1,00	343,50	605,50	1001,00	5709,00
Р1(О21)	49	0	1445,35	1172,61	132,00	989,00	1578,00	2128,00	5107,00
А325_1_4	РКЕ	47	0	673,18	622,76	91,00	352,00	673,00	1460,00	2299,00
Р1(О21)	47	0	1172,10	1122,07	193,00	722,00	1122,00	1987,00	6086,00
А325_1_2	РКЕ	41	2	708,33	761,85	191,00	447,00	730,00	1004,00	3592,00
Р1(О21)	43	0	1228,68	1330,12	171,00	671,00	1224,00	2452,00	6334,00
А325_1_1	РКЕ	44	0	693,62	2910,36	118,00	358,00	615,00	1077,00	19515,00
ΡΙ(ϋ21)	44	0	1435,67	2242,66	13,00	908,50	1490,00	3017,00	13332,00
А350_1_4	РКЕ	41	2	538,80	433,49	37,00	331,00	655,00	935,00	1648,00
ΡΙ(ϋ21)	43	0	1204,59	698,67	364,00	814,00	1295,00	1934,00	3219,00
А350_1_2	РКЕ	41	6	658,48	764,82	75,00	440,00	810,00	1078,00	4501,00
ΡΙ(ϋ21)	47	0	1349,54	4822,50	39,00	895,00	1297,00	2514,00	33798,00
Р!и_ЕЮ	РКЕ	42	3	558,80	704,36	40,00	326,00	627,00	1189,00	2767,00
Р1(О21)	45	0	819,29	1407,45	1,00	543,00	969,00	1694,00	7960,00
ΡΙυ_ΥΝΘ	РКЕ	40	6	1056,84	852,19	221,00	633,00	1129,50	1724,50	3947,00
ΡΙ(ϋ21)	46	0	1426,37	1615,23	385,00	852,00	1505,00	2355,00	9378,00

Щшкк - количество субъектов с отсутствием результатов,

СМ - среднее геометрическое,

СО - стандартное отклонение, (/1,(/3 - первая и третья квартиль,

Мш/Мах - минимум/максимум.

Промежуточное заключение для клеточно-опосредованного иммунного ответа.

Пять адъювантных вакцин (А803_1_1, А803_1_2, А825_1_1, А850_1_2 и А850_1_4) вызывали значительно более высокий ответ СМГ на пулы штаммов по сравнению с Ииапх у субъектов в возрасте 65 лет и старше для всех комбинаций цитокинов с точки зрения индивидуальных различий (день 21 - день

0). Три из этих адъювантных вакцин (А803_1_1, А803_1_2 и А825_1_1) также вызывали значительно более высокий СМГ ответ на объединенные штаммы по сравнению с Ииапх у более молодых взрослых людей для всех комбинаций цитокинов с точки зрения индивидуальных различий (день 21 - день 0).

ХЕ6, Реактогенность.

Локальные симптомы.

Процент субъектов, сообщивших о запрошенных локальных симптомах (любая степень/степень 3) в течение 7-дневного периода после вакцинации, оценивали с использованием шкалы ЕМЕА и РЭЛ для количественно определяемых симптомов.

Шкала ЕМЕА: экхимоз (любая степень [>0 мм] и степень 3 [>50 мм]); боль (любая степень); боль 3 степени; покраснение (любая степень [>0 мм] и степень 3 [>50 мм]) и опухание (любая степень [>0 мм]); опухание 3 степени (> 50 мм).

Шкала РЭА: экхимоз (любая степень [>25 мм] и степень 3 [>100 мм]), покраснение 3 степени (>100 мм); опухание 3 степени (>100 мм), покраснение (любая степень [>25 мм]); опухание (любая степень [>25 мм]).

Общие симптомы.

Шкала ЕМЕА: лихорадка (>37,5°С), лихорадка 3 степени (>39,0°С).

Шкала РЭА: лихорадка (>38°С) и лихорадка 3 степени (>40°С).

Общая частота случаев и природа любой и 3 степени обычных и не обычных симптомов, о которых сообщалось в течение 7-дневного периода (дни 0-6) после вакцинации, представлены на фиг. 24,

Заключение.

Процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном общем симптоме, был статистически значимо выше в группе с адъювантной вакциной против гриппа по сравнению с группой Р1ц_ЕЬП, но в таком же диапазоне, как для группы Р1и_ΥNС (за исключением А803_1_4).

Процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном общем симптоме 3 степени, находился в одном диапазоне для всех групп.

Процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном локальном симптоме, был статистически значимо выше в группе с адъювантной вакциной против гриппа по сравнению с группой Р1ц_ЕЬП и в группе А825_1_1 по сравнению с группой Ππ_ΥΝ&

Процент субъектов, сообщивших по меньшей мере об одном локальном симптоме 3 степени, был статистически значимо выше в группах А803_1_1, А825_1_2, А825_1_1 и А850_1_2 по сравнению с группой Р1ц_ЕЬП и Βί^ΥΝΗ

ХР7. Общее заключение.

Эти данные важны, для того чтобы соответствующим образом сбалансировать иммунный ответ/побочный эффект в человеческой популяции.

С точки зрения иммуногенности ΗΣ продемонстрировано очевидное адъювантное действие, в частности, со значительным увеличением для Η1Ν1 и Η3Ν2 при всех дозах адъюванта. Значительное увеличение получено для штамма В в основном с А825 1/1, а также с А803 1/1, А803 1/2 и А850 1/2. Зависимость доза-эффект показана для компонента адъюванта в виде эмульсии масло в воде, а также для компонента адъюванта МРЬ, хотя для последнего менее четко заметно.

С точки зрения клеточно-опосредованного иммунного ответа эффект адъюванта был также продемонстрирован со значительным различием по сравнению с Р1иаг1х у пожилых людей для объединенных штаммов (частота встречаемости, все измерения) для А803 1/1, А803 1/2, А825 1/1 и А850 1/2. Самые высоки ответы получены с использованием А825 1/1, А803 1/1 и А803 1/2.

С точки зрения реактогенности адъювантные вакцины более реактогенны, чем Р1иапх, что ассоциируется с эмульсией масло в воде в качестве компонента вакцины; зависимость доза МРЬ-эффект также имеет место, хотя менее выражено. А803 1/2 является менее реактогенным по сравнению с А803 1/1, в то же время демонстрируя удовлетворительный профиль иммуногенности в этой пожилой популяции.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека в количестве от 0,2 до 1,5 мл, включающая антиген или антигенный препарат вируса гриппа, содержащий 15 мкг или менее 15 мкг гемагглютинина (НА) на штамм вируса гриппа, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, где адъювант содержит (1) 5-6 мг сквалена, 2-3 мг эмульгатора и 5-7 мг токола на дозу для человека; (2) 2-3 мг сквалена, 1-1,5 мг эмульгатора и 2,5-3,5 мг токола на дозу для человека или (3) 0,5-1,5 мг сквалена, 0,25-0,75 мг эмульгатора и 0,5-1,5 мг токола на дозу для человека.
2. Дозированная форма по п.1, где указанный эмульгатор представляет собой неионное поверхностно-активное вещество.
3. Дозированная форма по п.2, где указанный эмульгатор представляет собой полиоксиэтиленсорбитана моноолеат или сорбитана триолеат или их смесь.
4. Дозированная форма по п.3, где указанный полиоксиэтилен-сорбитана моноолеат выбран из группы, включающей в себя Ро1укогЪа! 80 или Тетееп® 80, и сорбитана триолеат представляет собой 8рап85.
5. Дозированная форма по любому из пп.1-4, где указанный токол представляет собой α-токоферол.

- 73 024250
6. Дозированная форма по любому из пп.1-5, где адъювант дополнительно содержит лиганд ^11подобного рецептора (ΤΕΒ), выбранного из ΤΕΚ-1, ΤΕΚ-2, ΤΕΚ-3, ΤΕΚ-4, ΤΕΚ-7, ΤΕΚ-8, Τ6Β-9 или их комбинаций.
7. Дозированная форма по п.6, где указанный лиганд Τ6Β-4 выбран из производного липида А, которое представляет собой 30-МРб (3-О-деацилированный монофосфориллипид А), ОМ 174 (2-дезокси6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетра-деканоиламино]-4-о-фосфоно-(в-О-глюкопиранозил]-2[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-α-^-глюкопиранозилдигидрофосфат), ОМ 294 (ОР (3§,9К)-3-[(К)додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10диол,1,10-бис(дигидрофосфат)) или ОМ 197 (МР-Ас ОР (3§,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат)), алкилглюкозаминидфосфатов (ЛСР), и химического соединения, выбранного из группы, включающей ЕК 803022, ЕК 803058, ЕК 803732, ЕК 804053, ЕК 804057, ЕК 804058, ЕК 804059, ЕК 804442, ЕК 804680 и ЕК 804764, раскрытые в описании.
8. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 10 мкг НА на штамм вируса гриппа.
9. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 8 мкг НА на штамм вируса гриппа.
10. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 4 мкг НА на штамм вируса гриппа.
11. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 2 мкг НА на штамм вируса гриппа.
12. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 1 мкг НА на штамм вируса гриппа.
13. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее 0,5 мкг НА на штамм вируса гриппа.
14. Дозированная форма по п.1, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит 0,1 мкг НА на штамм вируса гриппа.
15. Дозированная форма по п.1 или 8, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит 2-7,5 мкг НА на штамм вируса гриппа.
16. Дозированная форма по п.1 или 8, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит 1-5 мкг НА на штамм вируса гриппа.
17. Дозированная форма по любому из пп.1 или 15, 16, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее или точно 5 мкг НА на штамм вируса гриппа.
18. Дозированная форма по любому из пп.1 или 15, 16, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее или точно 2,5 мкг НА на штамм вируса гриппа.
19. Дозированная форма по любому из пп.1 или 15, 16, где указанный вирусный антиген или антигенный препарат содержит менее или точно 1 мкг НА на штамм вируса гриппа.
20. Дозированная форма по любому из пп.1-19, в которой иммуногенный препарат является моновалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат из пандемического штамма.
21. Дозированная форма по любому из пп.1-19, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат по меньшей мере из двух штаммов вируса гриппа.
22. Дозированная форма по любому из пп.1-19, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат по меньшей мере из трех штаммов вируса гриппа.
23. Дозированная форма по любому из пп.1-19, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат по меньшей мере из четырех штаммов вируса гриппа.
24. Дозированная форма по любому из пп.1-19, в которой иммуногенный препарат является поливалентным, содержащим вирусный антиген или антигенный препарат по меньшей мере из пяти штаммов вируса гриппа.
25. Дозированная форма по любому из пп.21-24, в которой иммуногенный препарат содержит вирусный антиген или антигенный препарат по меньшей мере из трех сезонных штаммов вируса гриппа (межпандемических).
26. Дозированная форма по п.25, в которой иммуногенный препарат содержит вирусный антиген или антигенный препарат по меньшей мере из одного пандемического штамма вируса гриппа.
27. Дозированная форма по любому из пп.21-24, в которой вирус гриппа выбран из группы, состоящей из (1) двух штаммов А, выбранных из Η1Ν1 и Η3Ν2, и двух штаммов В, выбранных из В/уатадаίа и В/УюЮпа; (2) трех штаммов А, выбранных из Η1Ν1 и Η3Ν2, и одного штамма В, выбранного из В/уатадай или В/УюЮпа; (3) двух штаммов А, выбранных из Η1Ν1 и Η3Ν2, одного штамма Α Η5Ν1 и одного штамма В, выбранного из В/уатадаίа и В/УюЮпа.

- 74 024250
28. Дозированная форма по любому из пп.20 или 26, 27, в которой пандемический штамм вируса гриппа выбран из группы, состоящей из Η5Ν1, Η9Ν2, Η5Ν8, Η5Ν9, Η7Ν4, Η7Ν7, Η2Ν2, Η10Ν7, Η5Ν2, Η7Ν2, Η7Ν1 и Η7Ν3.
29. Дозированная форма по любому из пп.1-27, в которой антиген вируса гриппа или его антигенный препарат получен из вируса гриппа, выращенного на яйцах или на клеточной культуре.
30. Дозированная форма по любому из пп.1-29, в которой антиген вируса гриппа или его антигенный препарат представлен цельным вирусом, расщепленным вирусом, виросомой или одним или более чем одним очищенным антигеном, выбранным из НА, ΝΑ, М1, М2.
31. Дозированная форма по п.30, в которой указанный(е) очищенный(е) антиген(ы) получен(ы) из вируса гриппа, выращенного в клетках млекопитающего, птицы или насекомого.
32. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза составляет от 0,5 до 1,5 мл.
3 3. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза для человека составляет от 0,2 до 1,2 мл.
3 4. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза для человека составляет от 0,2 до 0,7 мл.
35. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 0,25 мл.
36. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 0,5 мл.
37. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 0,7 мл.
38. Дозированная форма по любому из пп.1-31, в которой указанная доза для человека составляет менее или точно 1 мл.
39. Способ приготовления дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа по любому из пп. 1-38, включающий стадию смешивания, по существу, равных объемов эмульсии типа масло-вводе и водной суспензии, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат.
40. Способ приготовления дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа по любому из пп.1-38, включающий стадию смешивания эмульсии типа масло-в-воде и водной суспензии, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат, где объем водной суспензии больше, чем объем эмульсии.
41. Способ по пп.39 или 40, включающий стадию разведения эмульсии типа масло-в-воде водным носителем и затем смешивание полученной разведенной эмульсии с указанной водной суспензией антигена вируса гриппа.
42. Вакцина, содержащая дозированную форму иммуногенного препарата по любому из пп.1-38 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
43. Способ изготовления вакцины по п.42, включающий стадию смешивания дозированной формы иммуногенного препарата по любому из пп.1-38 с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
44. Применение дозированной формы иммуногенного препарата по любому из пп.1-38 для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа у людей.
45. Применение дозированной формы иммуногенного препарата по любому из пп.1-38 для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа у людей, который представляет собой вариант вируса, из которого получен антиген, входящий в состав данного иммуногенного препарата.
46. Применение дозированной формы иммуногенного препарата против гриппа по любому из пп.138 для ревакцинации индивидуумов, ранее вакцинированных указанным иммуногенным препаратом или вакциной по п.42.
47. Применение по любому из пп.44-46, где индивидуумы выбраны из группы, состоящей из пожилых людей в возрасте 65 лет или старше, взрослых людей в возрасте 18-65 лет, детей в возрасте до 18 лет.
48. Применение по любому из пп.44-47, где индивидуумы представляют собой взрослых людей в возрасте 18-50 лет.
49. Применение вакцины по п.42 для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа.
50. Применение вакцины по п.42 для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого вирусом гриппа, который представляет собой вариант вируса гриппа, из которого получен антиген, входящий в состав данной вакцины.