CN105311629A - 水包油乳液流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水包油乳液流感疫苗。本发明提供了免疫原性流感组合物，其剂量体积适合于人类使用，所述组合物包含流感病毒抗原或抗原性制剂，和包含水包油乳液的佐剂组合物，其中所述水包油乳液包含水平低于11mg的可代谢油和水平低于5mg的乳化剂，并且任选包含水平低于12mg的母育酚或甾醇。合适地，每个剂量每种病毒株的流感抗原量是15μg？HA或低量，如少于15μg？HA。

Description

水包油乳液流感疫苗
本申请是申请日为2008年4月16日的中国专利申请200880021000.2“水包油乳液流感疫苗”的分案申请。
技术领域
本发明涉及流感免疫原性组合物和用于对人进行抗流感疾病免疫的接种方案，它们在医学中的用途，特别是它们在增强对各种抗原的免疫应答中的用途，并且涉及制备方法。具体地说，本发明涉及流感疫苗，该疫苗包含与水包油乳液佐剂组合的流感病毒抗原或其抗原性制剂，其中所述水包油乳液佐剂包含可代谢油和乳化剂，并且任选包含母育酚和/或甾醇。
背景技术
流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感产生重大的经济负担、发病率乃至死亡率。
流感病毒是RNA包膜病毒，颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为：内部为与核蛋白缔合的核糖核酸(RNA)核衣壳或核心，其包绕着脂质双层结构和外层糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。流感病毒包含两种表面抗原：糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，它们以10-12nm长的刺突显露在颗粒表面上。就是这些表面蛋白，尤其是血细胞凝集素，决定了流感亚型的抗原特异性。病毒株根据宿主物种来源、地理位置和分离的年份、序列号分类，对于甲型流感，根据HA和NA亚型的血清学特性分类。对于甲型流感病毒，已经鉴定了16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)[WebsterRGetal.EvolutionandecologyofinfluenzaAviruses.Microbiol.Rev.1992；56：152-179；FouchierRAetal..CharacterizationofaNovelInfluenzaAVirusHemagglutininSubtype(H16)ObtainedfromBlack-HeadedGulls.J.Virol.2005；79：2814-2822)。从水鸟回收了所有HA和NA亚型的病毒，但从1918年开始，仅仅3个HA亚型(H1，H2和H3)和两个NA亚型(N1和N2)在人群中建立了稳定的谱系。对于乙型流感病毒，仅仅识别了一个HA亚型和一个NA亚型。
甲型流感病毒持续进化和进行抗原性变化[WileyD，SkehelJ.Thestructureandthefunctionofthehemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus.Ann.Rev.Biochem.1987；56：365-394]。病毒RNA聚合酶缺乏有效的校正，导致高比例的转录错误，这会导致表面糖蛋白中的氨基酸取代。这称作“抗原性漂移”。分段的病毒基因组使得能够进行第二类抗原性变异。如果两种流感病毒同时感染宿主细胞，称作“抗原性转变”的遗传重排可以产生具有新的表面或内部蛋白的新病毒。这些抗原性改变，即‘漂移’和‘转变’，是不可预见的，由免疫学观点看可能具有显著的影响，因为它们最终导致出现新流感病毒株，能使病毒逃逸免疫系统，几乎每年都引起众所周知的流行病。这两种基因修饰都导致了引起人类中的大流行的新病毒变体。
乙型流感抗原性漂移相对于甲型流感较不频繁，并且抗原性转变是未知的。尽管乙型流感的抗原上不同的系(通常是两种，如B/Yamagata和B/Victoria)可能偶尔共同循环(其比例在年与年和国家与国家之间不同)，通常流感疫苗含有仅仅一种乙型流感病毒株。
HA是确定不同流感病毒株的血清学特异性的最重要抗原。此75-80kD的蛋白包含众多的抗原决定簇，其中几个位于在不同株中经历序列改变的区域中(株特异性决定簇)，其余的位于许多HA分子共有的区域中(共同决定簇)。
流感病毒几乎每年冬天都引起大流行，甲型或乙型病毒的感染率在6周的时间段内高达40％。流感感染产生各种疾病状况，由亚临床感染至轻微的上呼吸道感染到严重的病毒性肺炎。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。疾病的严重性主要由宿主的年龄、其免疫状况和感染部位决定。
65岁和以上的老年人尤其易受攻击，占发达国家所有流感相关死亡的80-90％。患有基础慢性疾病或免疫应答受损的个体也非常有可能经历这种并发症。幼儿也可能患严重疾病。因此，这些群体尤其需要受保护。除了这些‘危险’群体以外，卫生当局还推荐对健康护理提供者进行接种。
接种对控制每年的流感大流行起关键作用。目前可用的流感疫苗是灭活流感疫苗或减毒活流感疫苗。灭活流感疫苗由3种可能形式的抗原制剂组成：灭活的完整病毒、其中纯化的病毒颗粒被溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏的亚病毒体(所谓的“裂解”疫苗)或纯化的HA或NA(亚单位疫苗)。这些灭活疫苗肌内(i.m.)、皮下(s.c)或鼻内(i.n.)施用。
所有种类的用于在大流行间使用的流感疫苗通常都是三价疫苗。一般来说，它们含有的抗原得自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株。据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Woodetal.：Animprovedsingleradialimmunodiffusiontechniquefortheassayofinfluenzahaemagglutininantigen：adaptationforpotencydeterminationofinactivatedwholevirusandsubunitvaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Woodetal.，Internationalcollaborativestudyofsingleradialdiffusionandimmunoelectrophoresistechniquesfortheassayofhaemagglutininantigenofinfluenzavirus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330)的检测，在大多数情况下，标准0.5ml注射剂量(至少)含有来自每株的15μg血细胞凝集素抗原组分。除了三个经典的株外，已经报道了含有额外的乙型株(CommunDisIntell2006，30，350-357)或额外的H3N2株(Vaccine1992，10，506-511)的四价疫苗。
每个季节加入到流感疫苗中的大流行间流感病毒株由世界卫生组织协同国家卫生管理局以及疫苗生产商共同确定。目前可以得到的大流行间流感疫苗在所有年龄组中都认为是安全的(DeDonatoetal.1999，Vaccine，17，3094-3101)。
但是，疫苗效力受到接受者的年龄和免疫状态以及疫苗和循环流感病毒株之间的匹配的影响。很少有证据表明当前的流感疫苗在2岁以下的小孩中有作用。而且，预防典型的已确认流感疾病的疫苗效力的报告比率对老年人为23-72％，这显著低于对较年轻成年人所报告的60-90％有效率(Govaert，1994，J.Am.Med.Assoc，21，166-1665；Gross，1995，AnnIntern.Med.123，523-527)。业已表明，流感疫苗的有效性与针对病毒株的血细胞凝集抑制(HI)抗体的血清滴度相关，几个研究已发现较年长的成年人在流感免疫后表现出的HI滴度低于较年轻成年人(Murasko，2002，Experimentalgerontology，37，427-439)。
作为背景，在大流行之间的时间段内，与之前大流行的流感病毒相关的流感病毒传播。病毒在具有与生命早期感染不同的免疫水平的人之间传播。在通常2-3年的时间段内，这种传播促进对已改变得足以在一般群体中引起流行的新毒株的选择；此过程称为‘抗原性漂移’。‘漂移变体’在任一年中在不同的社区、地区、国家或洲都具有不同影响，尽管在几年内其总体影响经常是相似的。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。老年人或患有基础慢性疾病的人最有可能经历此并发症，而幼儿也可能患严重疾病。
新流感病毒以不可预见的间隔出现，其具有与之前季节传播的毒株完全不同亚型的关键表面抗原，即血细胞凝集素。此时，产生的抗原可以先前于人中循环的毒株的对应蛋白的20％至50％变化。这种称作“抗原性转变”的现象这可导致病毒逃逸‘群体免疫’，并建立大流行。换句话说，当出现人群对其没有免疫性的新流感病毒时，发生流感大流行。一般认为，至少在过去已发生了大流行，当时不同物种的流感病毒如禽或猪流感病毒已穿过种间屏障。如果这些病毒具有人与人之间传播的潜力，它们可在数月至一年内全球扩散，导致大流行。例如，在1957年(亚洲流感大流行)，H2N2亚型的病毒取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少从首先分离该病毒的1918年开始就在人群中循环。H2HA和N2NA在1957年至1968年之间经历了抗原性漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出现的H3N2流感病毒亚型替代，此后N2NA连同H3HA继续漂移(Nakajimaetal.，1991，Epidemiol.Infect.106，383-395)。
已经进行了临床研究，用于采用含有大流行株如非循环的H2N2或H9N2株评估未激发的群体中的安全性和免疫原性。研究调查了含有或不含明矾佐剂的各种HA浓度(每个剂量1.9、3.8、7.5或15μgHA)的裂解或完整病毒制剂。H2N2亚型的流感病毒从1957年一直传播到1968年，此时它们被“香港大流行”期间的H3N2株代替。目前，1968年以后初生的个体对H2N2株来说是免疫学幼稚的。这些疫苗候选物已经显示是免疫原性和良好耐受的。结果报道于Hehme，Netal.2002，Med.Microbiol.Immunol.191，203-208；HehmeN.etal.2004，VirusResearch103，163-171；并且报道了采用H5N1的两项研究(BressonJLetal.TheLancet.2006：367(9523)：1657-1664；TreanorJJetal.NEnglJMed.2006；354：1343-1351)。一项研究报道了在激发的群体中，以MF59为佐剂的两剂H5N3流感疫苗是对H5N1流感的加强免疫(Stephensonetal.，Vaccine2003，21，1687-1693)，另一研究报道了在3剂以MF59为佐剂的H5N3流感疫苗后获得了对H5N1病毒的交叉反应性抗体应答(Stephensonetal.，J.Infect.Diseases2005，191，1210-1215)。
在流感大流行的情况下，有危险的患者可以不同于由于季节性流感导致的并发症的确定的危险组。根据WHO，由禽流感病毒株H5N1导致的50％的人类病例发生在20岁以下的人中，90％发生在年龄＜40的人中(WHO，每周流行病学记录，2006年6月30日)。
在大流行中，抗病毒药物可能不足够或有效满足需要，并且有流感危险的个体的数目将大于大流行间阶段，因此开发合适的疫苗是必须的，所述疫苗具有大量生产的可能，并且具有有效分配和施用的潜能。一种方式是迅速释放一些生产力，用于生产大流行流感疫苗。但是，由于大量接种仅仅在大流行开始后才开始，这无论如何将由于鉴定病毒株和生产第一批需要的时间而导致显著延迟。此外，疫苗制造商将具有固定并且因此有限的每周产量。意味着目前的方法在大流行爆发时几乎肯定会在全球留下大部分群体未受保护。对于大部分群体来说，疫苗的获得将会太晚，并且预期死亡率将很高，估计全球将有1.8-3.6亿人死亡。
解决目前的这种窘境的一个方式是在大流行前制备大流行疫苗，并且设计具有“最佳候选大流行株”的单价疫苗代替三价疫苗，以尝试减少疫苗体积，主要是由于两剂疫苗可能是在免疫幼稚的接受者中达到保护性抗体水平所必须的(WoodJMetal.MedMircobiolImmunol.2002；191：197-201.WoodJMetal.PhilosTransRSocLondBBiolSci.2001；356：1953-1960)。然后，这种疫苗可以用于在大流行间阶段积蓄或用于激发群体。
不幸的是，由于目前的生产设备随着在北半球和南半球中每年接种的季节性三价疫苗的生产而每年完全消耗，上面提到的两种方法都不是可行的，因为没有额外的生产能力来生产“最佳候选大流行株”。此外，应该注意到，迫切需要找到应对在每年的流感季中常规遇到的大流行间流感疫苗短缺的解决方案。一种解决方案是建立额外的生产能力，但是这将需要数年的建设，这在随后几年间的大流行爆发中无论如何不是足够的方法。
目前，迅速获得额外能力的唯一方式将是缩短每年的三价疫苗的生产时间。在大多数国家中，每个季节发生的重复出现的流感疫苗短缺排除了被认为是发生严重流感疾病和并发症的高危群体的最佳覆盖。抗原生产是流感疫苗生产的限速因素，需要开发替代的抗原节约策略。
一些方法依赖于使用佐剂，其目的是增加疫苗的免疫原性，以便能够减少抗原含量(抗原节约)并且因此增加可以获得的疫苗剂数。佐剂的使用也可以克服幼稚群体中抗原的潜在弱免疫原性。已经发表了一些方法。采用以铝盐为佐剂的灭活H2N2或H9N2病毒(N.Hehmeetal.VirusResearch2004，103，163-171)或采用普通的亚病毒体H5N1疫苗或以氢氧化铝为佐剂的裂解病毒H5N1疫苗(BressonJLetal.TheLancet.2006：367(9523)：1657-1664；TreanorJJetal.NEnglJMed.2006；354：1343-1351)显示了实例。该最终试验的结果表明，普通和含佐剂的H5N1病毒疫苗在最多至90μg的抗原剂量下是安全的(仅仅作为普通亚病毒体疫苗测试)。但是，采用这种高剂量抗原与抗原节约策略不相容，而所述策略在大流行的情况下是必须的。用水包油乳液形式的佐剂MF59为佐剂的亚单位流感疫苗对于老年人和有危险的群体已经是可以购买的，已表现出其诱导高于无佐剂亚单位疫苗所获抗体滴度的抗体滴度的能力(DeDonatoetal.1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，在后来的出版物中，相同疫苗没有表现出其比无佐剂理解疫苗改进的模式(Puig-Barberaetal.，2004，Vaccine23，283-289)。
因此，仍然需要有效同时解决抗原节约考虑的新疫苗。这些新疫苗将具有可接受的(如果不是改进的)免疫原性，特别是抗弱或非免疫原性大流行株或用于免疫受损个体如老年群体的免疫原性。这些新疫苗将理想地具有交叉保护潜能，使得它们能够用作大流行前疫苗或储存疫苗，用于在宣布大流行前或后激发免疫学幼稚群体抗大流行株。
发明内容
发明人发现，为了改进流感疫苗的供应，可以开发新的有效的免疫原性流感制剂，其中含有佐剂，由此使得能够使用更低量的流感抗原。此处提供了新的含佐剂的组合物，其使得节约抗原的制剂能够在细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答方面给所有年龄组提供足够的保护。
发明人特别发现了可以依赖于免疫原性流感组合物，所述组合物的特征在于免疫原性组合物中佐剂的各个组分的每一种或全部都是比以前认为有用的水平更低的水平。这带来了保持抗抗原的免疫原性水平同时降低宿主接受者中的反应原性的优点。
因此，在本发明的第一方面，提供了免疫原性流感组合物，特别是疫苗，其剂量体积适合于人类使用，所述组合物包含与水包油乳液佐剂组合的流感病毒抗原或抗原性制剂，其中所述水包油乳液佐剂包含可代谢油和乳化剂，并任选包含母育酚和/或甾醇，并且其中所述可代谢油在所述人类剂量中以低于11mg的水平存在，并且所述乳化剂在所述人类剂量中以低于5mg的水平存在。当存在时，所述母育酚和/或甾醇在所述人类剂量中以低于12mg的水平存在。合适地，每个剂量每株的流感抗原的量是15μgHA或低量，如低于15μgHA。
另一方面，本发明提供了疫苗试剂盒，其中包含流感病毒抗原组分或流感病毒抗原性制剂组分，任选包含低量抗原组分，并且进一步包含本文定义的佐剂的同时或序贯施用。
第三方面，本发明提供了生产用于大流行状况、大流行前状况或大流行间(季节性)状况的流感免疫原性组合物的方法，所述方法包括将流感病毒抗原或其抗原性制剂与本文定义的水包油乳液佐剂混合。具体地，本发明提供了用于生产流感疫苗的方法，所述方法包括将含佐剂的免疫原与药学可接受的赋形剂混合，并且提供含有每个剂量不超过15μg流感血细胞凝集素抗原的疫苗单位的步骤。流感病毒可以是卵来源的、植物来源的、细胞培养物来源的或可以是重组产生的。合适地，流感病毒抗原是卵来源的或细胞培养物来源的。
第四方面，提供了用于治疗或预防流感感染导致的疾病的本文定义的免疫原性组合物或疫苗。在一个相关方面，本发明提供了流感病毒抗原或其抗原性制剂和本文定义的水包油乳液在制备免疫原性组合物如疫苗中的用途，所述免疫原性组合物用于提供抗流感病毒导致的感染或疾病的保护作用。
另一方面提供了(a)本文定义的来自流感病毒株的低量流感病毒抗原或其抗原性制剂和(b)本文定义的水包油乳液佐剂在制备免疫原性组合物或试剂盒中的用途，所述免疫原性组合物或试剂盒用于诱导以下之一：与用不含佐剂的组合物获得的应答相比，人类中抗所述病毒抗原或抗原组合物的i)改进的CD4T-细胞免疫应答，ii)改进的B细胞记忆应答，iii)改进的体液应答。
另一方面，提供了上文定义的方法或用途，用于提供抗流感病毒导致的感染或疾病的保护作用，所述流感病毒是免疫原性组合物中的抗原所来源的病毒的变体。在另一实施方案中，提供了上文定义的方法或用途，用于提供抗病原体导致的流感感染或疾病的保护作用，所述病原体包含抗原，所述抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。
本发明也涉及接种方法，包括送递抗原和本文定义的水包油乳液佐剂。
在下文优选实施方案的详述中进一步描述了本发明的其他方面和优点。
附图说明
图1：临床试验：不同时间点的抗-HA抗体的几何平均滴度(GMTs)(免疫原性的ATP队列)。
图2：临床试验：第0和21天采用95％置信区间的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)(免疫原性的ATP队列)。
图3：临床试验：第21天采用95％置信区间的HI抗体滴度的血清转变率(SCR)(免疫原性的ATP队列)。
图4：临床试验：第21天采用95％置信区间的HI抗体滴度的血清转变因数(SCF)(免疫原性的ATP队列)。
图5：小鼠研究：用异亚型株(剂量范围AS03)激发的BALB/c小鼠中的血细胞凝集素测试(GMT+/-IC95)。图5A：抗-A/NewCaledonia/20/99HI滴度；图5B：抗-A/Panama/2007/99HI滴度。图5C：抗-B/Shandong/7/97HI滴度。
图6：小鼠研究：用异亚型株(剂量范围AS03)激发的C57Bl/6小鼠中的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。
图7：小鼠研究：来自用异亚型株(剂量范围AS03)激发的C57Bl/6小鼠的PBMC中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)。
图8：小鼠研究：来自用异亚型株激发并且用以剂量范围AS03为佐剂的低剂量抗原(0.5μg)免疫的C57Bl/6小鼠的PBMC中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)。
图9：小鼠研究：对于两个不同的抗原剂量：1.5μg(A，C和E)或0.38μg(B，D和F)，免疫后14天的H5N1特异性血清IgELISA滴度(A和B)和抗-H5N1IgG1(C和D)和IgG2b(E和F)同种型应答(GMT+/-IC95)。
图10：小鼠研究：对于两个不同的抗原剂量：1.5μg(A)或0.38μg(B)，免疫后21天(GMT+/-IC95)的血细胞凝集素测试(GMT+/-IC95)。
图11：小鼠研究：以剂量范围AS03为佐剂的不同剂量的H5N1疫苗(1.5或0.38μg)免疫的幼稚C57Bl/6小鼠中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)：(A)1.5μgHAAg(抗原)或(B)0.38μgHAAg(抗原)。
图12：猪研究。用同源株(剂量范围AS03)激发的猪中的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。
图13：用普通或以AS03或AS03/2为佐剂的TIV或QIV免疫的C57Bl/6幼稚小鼠中的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。
图14：用B/Victoria样病毒激发并且用普通或以AS03或AS03/2为佐剂的TIV或QIV免疫的C57Bl/6小鼠中的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。
图15：人临床试验(佐剂剂量范围)：d0和d21的HI抗体滴度的GMTs。
图16：人临床试验(成人中的佐剂剂量范围)：d0和d21的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)。
图17：人临床试验(成人中的佐剂剂量范围)：图17A：PI(第21天)的HI抗体滴度的血清转变率(SCR)；图17B：根据年龄分类。
图18：人临床试验(成人中的佐剂剂量范围)：图18A：PI(第21天)的HI抗体滴度的血清转变因数(SCF)；图18B：根据年龄分类。
图19：人临床试验(老年人中的佐剂剂量范围)：d0和d21的HI抗体滴度的GMTs。
图20：人临床试验(老年人中的佐剂剂量范围)：d0和d21时采用95％置信区间的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)。
图21：人临床试验(老年人中的佐剂剂量范围)：PI(第21天)的HI抗体的血清转变率(SCR)。
图22：人临床试验(老年人中的佐剂剂量范围)：第21天时采用95％置信区间的HI抗体滴度的SCF(免疫原性HI的ATP队列)。
图23：人临床试验(老年人中的佐剂剂量范围)：第0天和第21天时合并的病毒株的细胞因子阳性CD4T-细胞(CMI的ATP队列)。
图24：人临床试验(老年人中的佐剂剂量范围)：在接种后7天(0-6天)阶段报道相关有主诉和无主诉症状(所有分级/第3级)的受试者的百分比(总的接种队列)。
具体实施方式
本发明人发现包含可代谢油和乳化剂并且任选包含母育酚和/或甾醇的佐剂组合物(其中每种组分以比以前使用的水平更低的每个人类疫苗剂量的水平存在)可以改进对流感制剂的免疫应答，而同时比一些现有技术的制剂具有更低的反应原性，所述现有技术的制剂中佐剂组分以每个人类剂量更高的水平存在(合适地是高两倍或更多)。
本发明人进一步发现，包含流感病毒或其抗原性制剂以及本文定义的佐剂，任选还包含免疫刺激剂如脂质A衍生物如3D-MPL的流感制剂能够i)与用不含佐剂的病毒或其抗原性制剂获得的应答相比，改进抗所述抗原或抗原性组合物的CD4T-细胞免疫应答和/或体液免疫应答，和/或ii)产生与用每种组分以更高(合适地是高两倍或更多)水平存在的佐剂为佐剂的组合物获得的应答相似的抗所述抗原或抗原性组合物的CD4T-细胞免疫应答和/或体液免疫应答。以所述佐剂为佐剂的制剂有利地用于诱导能够检测由MHCII类分子呈递的流感表位的抗流感CD4T细胞应答。本申请人发现，它能够有效靶定细胞介导的免疫系统，从而增加抗同源和漂移流感病毒株的反应性(在接种和感染后)。
在本发明的特定实施方案中，用于本发明中的组合物可以在人类中提供以下效果之一或两者：(i)与不含佐剂的组合物相比，在再次接种后更好的抗流感血清保护作用，和(ii)与每种组分以更高水平存在的含佐剂的组合物相比，在再次接种后相似的抗流感血清保护作用，这是通过满足任何一个、几个或全部流感保护相关标准(即血清转变率、转变因数、保护率)的人类受试者的数目而评估的。此外，另一特定实施方案是用于本发明的组合物也将能够诱导以下效果之一或两者：(i)与不含佐剂的组合物相比，在第一次接种人类受试者后更高的B细胞记忆应答，和再次接种后更高的体液应答，和(ii)与每种组分以更高(合适地是高两倍或更多)水平存在的含佐剂的组合物相比，在第一次接种人类受试者后相似的B细胞记忆应答，和再次接种后相似的体液应答。
本发明的含佐剂的流感组合物具有一些优点。可以通过与等同的不含佐剂的组合物比较，或通过与每种佐剂组分以更高水平存在的含佐剂的组合物比较，评估这些优点：
1)与不含佐剂的组合物相比，改进的免疫原性，从而能够达到以下任何或全部效果：i)改进对免疫原性较低的流感病毒株的弱免疫应答，达到比用不含佐剂的制剂获得的水平更高的水平；ii)使特定群体，如老年人(超过50岁，典型地超过65岁)中的弱免疫应答恢复到在年轻人中的水平(抗体和/或T细胞应答)；
2)佐剂的使用能够克服幼稚群体或年幼婴儿(6个月-4岁，特别是小于1岁的儿童)中抗原的潜在弱免疫原性，并且诱导激发和保护作用；
3)除了提供与经典疫苗(如可商购的裂解疫苗)相比至少等同的抗疫苗株的保护作用，它们可以通过导致改进的交叉保护谱而赋予抗漂移株的额外的保护作用层：增加的交叉反应性、抗变体(漂移的)流感病毒株，使得能够建立交叉激发策略(当它们能够用作大流行前疫苗时这特别有意义)，进一步使得增强抗(循环)大流行株的保护作用仅仅需要一剂大流行疫苗；这也是有意义的，因为它能够解决H3N2漂移，其倾向于比在其他大流行间甲型流感病毒株H1N1中更迅速出现；
4)与用每种组分以更高(合适地高2倍或更多)水平存在的组合物所获得的谱相比，含佐剂的组合物的减少的免疫原性谱，同时保持满意的免疫原性潜能。
通过以减少的抗原剂量(典型地低于15μg/株/剂)和减少的佐剂剂量进一步实现任何或全部所述优点，它们将确保紧急情况下增加的能力或用于大流行状况的准备(大流行状况下的抗原节约)并且提供在大流行间接种季节中群体可以获得更高的疫苗剂数的可能性。
通过依赖于减少的抗原剂量和/或减少的佐剂剂量的组合，它们将使得能够开发更复杂的流感组合物，如四价疫苗，其中包含要加入标准三价疫苗中的第四株，其可以是第二种乙型流感病毒株或大流行流感病毒株。
在本发明的另一方面，本文定义的含佐剂的免疫原性组合物证明了抗体产生和流感特异性(任选交叉反应性)CD4的接种后频率方面的免疫原性结果分别大于或等于用不含佐剂的疫苗或用佐剂组分以更高水平存在的佐剂为佐剂的疫苗产生的免疫原性结果。这种效果在儿科群体或老年群体中特别有价值，这使得比目前的商购疫苗具有更高效力，同时与接受佐剂组分以更高(合适地高2倍)量存在的含佐剂的疫苗的组相比，显示更低或更少的反应原性症状。
水包油乳液佐剂
本发明的佐剂是乳液，特别是水包油乳液，并且可以任选包含其他免疫刺激剂。特别是，乳液系统的油相包含可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢可定义为“能够通过代谢被转化”(Dorland′sIllustratedMedicalDictionary，W.B.SandersCompany，第25版(1974))。所述油可为任意植物油、鱼油、动物油或合成油，它们对接受者是无毒的，能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常用的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括商品化油，例如等。特别合适的可代谢油是鲨烯。鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的油。鲨烯是可代谢油是由于以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(Merckindex，第10版，条目号8619)。
水包油乳液本身是本领域公知的，并且已经建议用作佐剂组合物(EP399843B)；同样，水包油乳液与其他活性剂的组合已经描述为用于疫苗的佐剂：WO95/17210；WO98/56414；WO99/12565；WO99/11241；WO2006/100109；WO2006/100110；WO2006/100111，其公开了基于鲨烯、α-生育酚和TWEEN80的乳液佐剂，其任选与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL一起配制)。已经描述了其他基于水包油乳液的佐剂，例如公开于WO90/14837；WO00/50006；WO2007/080308；WO2007/006939中的那些，它们都形成油乳液体系(特别是当基于鲨烯时)，以形成本发明的替代佐剂和组合物。
在一个特定实施方案中，水包油乳液包含可代谢的、无毒的油，如鲨烷或鲨烯，任选包含母育酚如生育酚，特别是α生育酚(任选鲨烯和α生育酚两者)和乳化剂(或表面活性剂)如非离子型表面活性剂TWEEN80TM或Polysorbate80。在特定实施方案中，油乳液进一步包含甾醇如胆固醇。
母育酚(如维生素E)也经常用于油乳液佐剂中(EP0382271B1；US5667784；WO95/17210)。可以如EP0382271B1中的描述配制用于本发明的油乳液(任选水包油乳液)中的母育酚，其中母育酚可以是直径任选小于1微米的任选包含乳化剂的母育酚小滴的分散体。或者，母育酚可以与其他油组合使用，形成油乳液的油相。本文描述了可以与母育酚组合的油乳液的实例，如上文描述的可代谢油。
制备水包油乳液的方法是本领域技术人员公知的。通常，该方法包括将油相与表面活性剂如PBS/TWEEN80TM溶液混合，然后用匀浆器进行匀浆。本领域技术人员将清楚了解，包含使混合物通过注射器针头两次的方法将适用于对小体积液体进行匀浆。同样，本领域技术人员可以改进微流化器(M110S微流化机，在6巴的最大压力输入(输出压约850巴)，对于2分钟的阶段，最多50次通过)用于产生更小或更大体积的乳液。通过常规实验可以实现这种改进，所述常规实验包含测量得到的乳液，直到用需要直径的油滴实现了制备。
在水包油乳液中，油和乳化剂应该是在含水载体中。含水载体可以是例如磷酸缓冲盐水。
存在于稳定的水包油乳液中的油滴的大小任选小于1微米，可以是基本30-600nm的范围，任选直径基本大约30-500nm，任选直径基本150-500nm，特别是直径大约150nm，这是通过光子关联能谱法测定的。在这方面，80％数目的油滴应该在范围内，任选超过90％，任选超过95％数目的油滴在定义的大小范围内。
本发明的关键方面是以下事实：存在于免疫原性组合物的佐剂中的组分的量低于以前认为有用的量，合适地是每个人类剂量的免疫原性组合中低于11mg可代谢油(如鲨烯)，例如0.5-11mg，0.5-10mg或0.5-9mg，以及低于5mg乳化剂(合适地如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)，例如0.1-5mg。合适地，母育酚(如α-生育酚)以低于12mg，例如0.5-12mg的量存在。本发明的佐剂组合物包含水包油乳液佐剂，合适地，所述乳液包含0.5-10mg量的可代谢油，0.4-4mg量的乳化剂，和任选0.5-11mg量的母育酚。合适地，所述乳液中至少70％，合适地至少80％强度的油滴具有小于1μm的直径。
因此，本发明提供了人类剂量的含佐剂的免疫原性组合物，其中所述佐剂所述佐剂包括含有可代谢油的水包油乳液佐剂，所述可代谢油合适地是鲨烯，其水平低于每个人类剂量11mg，合适地是每个人类剂量0.5-11、0.5-10、0.5-9、1-10、1-11、2-10，4-8或4.5-5.5(如2-3、5-6或9-10mg)可代谢油。在另一实施方案中，本发明提供了人类剂量的含佐剂的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括含有乳化剂的水包油乳液佐剂，所述乳化剂合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(如Tween80或Polysorbate80TM)，其水平低于每个人类剂量5mg，合适地是每个人类剂量0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-4、1-2或2-3mg(如0.4-1.2、2-3或4-5mg)乳化剂。在另一实施方案中，本发明提供了人类剂量的含佐剂的免疫原性组合物，其中所述佐剂进一步包含母育酚，合适地是α-生育酚，其水平低于每个人类剂量12mg，合适地是每个人类剂量0.5-12、10-11、1-11、2-10、4-9、5-7mg(如10-11、5-6、2.5-3.5、1-2或1-3mg)母育酚。
合适地，本发明的人类剂量的佐剂免疫原性组合物是这样的：其中所述水包油乳液佐剂包含4.5-5.5或5-6mg可代谢油(合适地是鲨烯)，5-7mg母育酚(合适地是α-生育酚)和2-3mg乳化剂，所述乳化剂可以是非离子型表面活性剂(合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯如Tween80TM或Polysorbate80TM)。根据另一合适的实施方案，本发明的人类剂量的佐剂免疫原性组合物是这样的：其中所述水包油乳液佐剂包含2-3mg可代谢油(合适地是鲨烯)，2.5-3.5mg母育酚(合适地是α-生育酚)和1-1.5mg乳化剂(合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯如Tween80TM或Polysorbate80TM)。在另一实施方案中，本发明的人类剂量的佐剂免疫原性组合物是这样的：其中所述水包油乳液佐剂包含0.5-1.5mg可代谢油(合适地是鲨烯)，0.5-1.5mg母育酚(合适地是α-生育酚)和0.25-0.75mg乳化剂(合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯如Tween80TM或Polysorbate80TM)。在一些情况下，可能有利的是本发明的疫苗将进一步含有稳定剂。
术语“人类剂量”是指以适合人类使用的体积送递的流感组合物剂量(在混合佐剂和抗原组分后)。通常这是0.25-1.5ml。在一个实施方案中，人类剂量是约0.5ml。在进一步的实施方案中，人类剂量高于0.5ml，例如是约0.6、0.7、0.8、0.9或约1ml。在进一步的实施方案中，人类剂量是1ml-1.5ml。在另一实施方案中，特别是当免疫原性组合物是用于儿科群体时，人类剂量可以小于0.5ml，例如0.25-0.5ml，或准确地是0.1ml、0.2ml、0.25ml、0.3ml或0.4ml。本发明的特征在于免疫原性组合物内的佐剂的各个组分的每一个或全部是比以前认为有用的水平更低并且典型地如上文所述的水平。特别合适的组合物包含以下水包油佐剂组分，其在最终体积的人类剂量(合适地是约0.5ml或约0.7m1)中是如下量(表1)：
表1A-本发明的特定基于水包油乳液的佐剂
*合适的水包油体积是为了说明给出的，不是限制性的
()括号之间是上文值附近的合适范围(+/-5％)
表1B-本发明的特定基于水包油乳液的佐剂
()括号之间是上文值(+/-5％)附近的合适范围(+/-5％)
应该理解，给出的所有数值(如以％或以mg表示)，包括表1的数值，应该允许5％变化，即，4.88mg鲨烯应该理解为表示4.64-5.12mg。
可以进行对每种组分(水包油乳液和抗原)的预先稀释，以产生含佐剂的疫苗，所述疫苗送递所需的HA量和所需的佐剂组分量。
在本发明的一方面，可以不超过或合适地低于总剂量体积一半的体积添加本发明的含佐剂疫苗的水包油乳液(预先稀释或不预先稀释)。举例说明，对于表1A中举例说明的制剂A-H的乳液组分，给出合适的体积(如125μl-25μl)。根据本发明的一方面，提供了制备含佐剂的流感疫苗的方法，包括将第一体积的水包油乳液和第二体积的包含流感病毒或其抗原性制剂的含水悬浮液混合的步骤，其中第二体积大于第二体积。合适地，在稀释浓缩的乳液后获得第一体积的水包油乳液。
或者，混合基本相同体积(无论是在预先稀释后或不预先稀释)的水包油乳液和抗原悬浮液，以产生本发明的含佐剂的疫苗组合物。然后，每种组分各自的体积将典型地比其他组分的体积最多过量10％(即佐剂乳液：抗原悬浮液比例是1∶1.1-1.1∶1)，合适地最多过量5％(即水包油乳液：抗原悬浮液比例是1∶1.05-1.05∶1)，合适地最多过量2.5％(即佐剂乳液：抗原悬浮液比例是1∶1.025-1.025∶1)。因此，在本发明的另一方面，提供了制备含佐剂的流感疫苗的方法，包括将基本相同体积的水包油乳液和包含流感病毒或其抗原性制剂的含水悬浮液混合的步骤。合适地，在稀释浓缩的乳液后获得第一体积的水包油乳液。
在另一实施方案中，本发明的含佐剂疫苗的水包油乳液佐剂是以超过总剂量体积一半的体积添加的。因此，在本发明的另一方面，提供了制备含佐剂的流感疫苗的方法，包括将第一体积的水包油乳液和第二体积的包含流感病毒或其抗原性制剂的含水悬浮液混合的步骤，其中第一体积大于第二体积。合适地，在稀释浓缩的乳液后获得第一体积的水包油乳液。
在所有三种方法中，最终人类剂量体积中的乳液组分和任选HA的量低于以前认为有用的量，并且在本文中要求保护。合适地，它们是本文所要求保护的特定量。
疫苗内每种单独组分的量可以表示为总疫苗组合物的百分比，例如，以％(v/v)或％(w/v)表示。以下转换数字将是本领域技术人员已知的，并且可以应用：鲨烯0.855g/ml，α-生育酚0.949g/ml，polysorbate801.080g/ml，和Span850.94g/ml。
因此，可代谢油(合适地是鲨烯)在疫苗组合物中以总疫苗体积的0.5％-2％，合适地0.25-2或0.25-1.75或0.5-1.65或0.6-1.5或0.8-1.4或1-1.25％(w/v)油的量存在。在另一特定实施方案中，可代谢油(合适地是鲨烯)以疫苗组合物总体积的约1.25％或约0.6％(w/v)的最终量存在。在另一特定实施方案中，可代谢油以总疫苗体积的0.25％(w/v)的最终量存在。
母育酚的量可以表示为总疫苗组合物体积的百分比。合适地，母育酚在疫苗组合物中以免疫原性组合物总体积的0.25％-2％(w/v)的量存在，例如，0.25-2包括总疫苗体积的0.25-2或0.25-1.75或0.5-1.65或0.6-1.5或0.8-1.4或1-1.25％(w/v)的母育酚。在本发明的一个实施方案中，母育酚以疫苗组合物总体积的0.2％-2％(v/v)的量存在，或以0.5ml疫苗剂量体积中1.25％(v/v)的量存在。在一个特定实施方案中，母育酚以免疫原性组合物总体积的约1.25％的最终量存在。在另一特定实施方案中，母育酚以总疫苗体积的0.25％(v/v)或0.5ml疫苗剂量体积中的1.25％(v/v)，或0.7ml疫苗剂量体积中的0.9％(v/v)，或0.5ml疫苗剂量中的0.5％(v/v)，或0.7ml疫苗剂量中的0.35-0.37％或0.36％的最终量存在。
在本发明的一个实施方案中，乳化剂以每个人类剂量0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.4-1.2、0.5-4、1-2、2-3或4-5mg的量存在。当存在一种以上乳化剂时，例如当Tween80和Span85都存在时，要求保护的量理解为是乳化剂的总量。乳化剂的量可以表示为总疫苗组合物体积的百分比。合适地，乳化剂在疫苗组合物中以免疫原性组合物总体积的0.125-0.8％(w/v)，例如总疫苗体积的0.08-.05或0.1-0.7或0.2-0.6或0.25-0.55或0.3-0.52或0.4-0.5％(w/v)的量存在。在一个特定实施方案中，乳化剂以总疫苗组合物体积的1％、0.5％或0.2％(w/v)的量存在。
在一个特定实施方案中，0.5ml疫苗剂量体积含有0.5％(w/w)Tween80，0.7ml疫苗剂量体积含有0.35％(w/w)Tween80。在另一特定实施方案中，0.5ml疫苗剂量含有0.2％(w/w)乳化剂，0.7ml疫苗剂量含有0.14％(w/w)乳化剂。Span85(脱水山梨糖醇三油酸酯)也可以在本发明中使用的乳液中以0.1-1％的水平存在，合适地是0.5％或更低。在一个特定实施方案中，当存在时，Span85以与polysorbate80相同的百分比添加。
在一些情况下，可能有利的是本发明的免疫原性组合物和疫苗将进一步含有稳定剂，例如其他乳化剂/表面活性剂，包括辛酸(merckindex第10版，条目号1739)，例如甘油三辛酸酯。
本发明进一步提供了包含上文定义并且如上文定义的量(例如，但不限于表1所举例说明的)的各个组分的佐剂组合物。典型地，所述佐剂组合物是人类剂量合适的体积。当佐剂是要与抗原组合物的液体形式组合的液体形式时，佐剂组合物将是作为预期人类剂量的最终体积的一部分的人类剂量合适的体积，例如，大约是预期人类剂量的最终体积的一半，例如，对于0.7ml的预期人类剂量是360μl体积，或对于0.5ml的预期人类剂量是250μl体积。如果人类疫苗剂量增加，预期佐剂组分的量(以mg表示)不会由于这种剂量体积的增加而改变，仅仅是变得更稀。当与抗原组合物组合以提供疫苗的最终人类剂量时，按需要稀释佐剂组合物。当然，所述剂量的最终体积将根据佐剂组合物的最初体积和添加到佐剂组合物中的抗原组合物的体积而改变。
在一种替代的实施方案中，用液体佐剂重配冻干的抗原组合物。在这种实施方案中，佐剂组合物的人类剂量合适的体积大约等于人类剂量的最终体积。将液体佐剂组合物添加到含有冻干的抗原组合物的管形瓶中。最终的人类剂量可以在0.5-1.5ml之间变化。在一个特定实施方案中，人类剂量是大约0.5ml或大约0.7ml，在此实施方案中，本发明的疫苗组合物包含低于11mg或上文定义量的可代谢油水平，例如，合适地是每0.5ml人类剂量0.5-11、1-11、2-10、4-8或5-6mg(如2-3、5-6或9-10mg)，此外，在此实施方案中，本发明的佐剂组合物包含低于11mg或上文定义量的可代谢油水平，例如合适地是每250μl佐剂组合物或每500μl佐剂组合物0.5-11、1-11、2-10、4-8或5-6mg(如2-3、5-6或9-10mg)可代谢油，这分别取决于所述佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。同样，在人类剂量是0.5ml的特定实施方案中，在该实施方案中，本发明的疫苗组合物将包含一定水平的乳化剂，合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(如Tween80TM或Polysorbate80TM)，其水平低于每个人类剂量5mg，合适地是每0.5ml人类剂量0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-4或2-3mg(如0.4-1.2、2-3或4-5mg)乳化剂。此外，在该实施方案中，本发明的佐剂组合物将包含一定水平的乳化剂，合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(如Tween80TM或Polysorbate80TM)，其水平低于每个人类剂量5mg，合适地是每250μl佐剂组合物或每500μl佐剂组合物0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-4或2-3mg(如0.4-12、2-3或4-5mg)乳化剂，这分别取决于所述佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。类似地，在人类剂量是0.5ml的特定实施方案中，在该实施方案中，本发明的疫苗组合物将包含一定水平的母育酚，合适地是α-生育酚，其水平低于每个人类剂量12mg，合适地是每0.5ml人类剂量0.5-12、1-11、2-10、4-9、5-7mg(如10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)母育酚。此外，在该实施方案中，本发明的佐剂组合物将包含一定水平的母育酚，合适地是α-生育酚，其水平低于每个人类剂量12mg，合适地是每250μl佐剂组合物或每500μl佐剂组合物0.5-12、1-11、2-10、4-9、5-7mg(如10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)母育酚，这分别取决于所述佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。
任选地，油(如鲨烯)：母育酚(如α-生育酚)的比例是等于或小于1，因为这提供更稳定的乳液。
在一些情况下，可能有利的是本发明的疫苗将进一步包含稳定剂。
组分的剂量(此剂量下佐剂在免疫原性组合物中起作用)合适地能够增强人类中对抗原的免疫应答。具体地，可代谢油、母育酚和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯的合适量是在目标人群中与不含佐剂的组合物相比改进组合物的免疫原性潜能的量，或是产生与用以包含另一更高量的所述组分的佐剂为佐剂的组合物获得的免疫潜能相似的免疫潜能的量，所述量同时是反应原性谱可接受的。
任选的免疫刺激剂
在本发明的一个特定实施方案中，佐剂是水包油乳液佐剂，其中包含上文定义的量的可代谢油，如鲨烯，母育酚，如α-生育酚和表面活性剂如polysorbate80，并且不含任何另外的免疫刺激剂，特别是它不含无毒的脂质A衍生物(如3D-MPL)或皂苷(如QS21)。
在本发明的另一实施方案中，提供了包含抗原或抗原组合物的疫苗组合物和包含水包油乳液并任选包含一种或多种另外的免疫刺激剂的佐剂组合物，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油(合适地是鲨烯)，0.5-11mg母育酚(合适地是α-生育酚)和0.4-4mg乳化剂。
在一个特定实施方案中，水包油乳液佐剂任选包含除QS21和/或MPL之外的一种或多种另外的佐剂或免疫刺激剂。
在另一特定实施方案中，水包油乳液佐剂和免疫原性组合物进一步包含另外的免疫刺激剂，它是脂多糖，合适地是脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A，或更特别是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL是固体的，由GlaxoSmithKlineBiologicalsN.A命名为MPL，并且在本文件中称作MPL或3D-MPL。参见例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。可以根据GB2220211A中公开的方法生产3D-MPL。在化学上，其是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明组合物中可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒度使得其可通过0.22μm滤器除菌过滤。此制剂描述于WO94/21292。
所述脂多糖，如3D-MPL，可以每个人类剂量的免疫原性组合物中1-50μg的量使用。所述3D-MPL可以约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或25μg的量使用。在另一实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含约10μg，例如5-15μg，合适地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或10μg水平的3D-MPL。在进一步的实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含约5μg，例如1-9μg，或2-8μg或合适地3-7μg或4-6μg，或5μg水平的3D-MPL。
在另一实施方案中，脂质A的合成衍生物被用作任选的另外的免疫刺激剂，一些描述为TLR-4激动剂，包括但不限于：
OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO95/14026)
OM294DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO00/0462)
OM197MP-AcDP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO01/46127)
可以使用的其他TLR4配体是烷基磷酸氨基葡糖苷(AGPs)，如WO9850399或US6303347中公开的那些(也公开了制备AGPs的方法)，合适地是US6764840中公开的RC527或RC529或AGPs的药学可接受的盐。一些AGPs是TLR激动剂，一些是TLR4拮抗剂。这两者都被认为可以用作佐剂。
能够导致通过TLR-4进行的信号传递反应(Sabroeetal，JI2003p1630-5)的其他合适的TLR-4配体是例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特别是LPS的无毒衍生物(例如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热激蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性剂蛋白A、乙酰透明质酸寡糖、硫酸肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防卫素-2、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP60、70或90。其他合适的TLR-4配体描述于WO2003/011223和WO2003/099195，如WO2003/011223的第4-5页或WO2003/099195的第3-4页公开的化合物I、化合物II和化合物III，特别是，在WO2003/011223中公开为ER803022，ER803058，ER803732，ER804053，ER804057，ER804058，ER804059，ER804442，ER804680和ER804764的化合物。合适地，所述TLR-4配体是ER804057。
Toll样受体(TLRs)是I型跨膜受体，在昆虫和人之间是进化保守的。目前已经确定了10种TLRs(TLRs1-10)(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。TLR家族成员具有相似的胞外和胞内结构域；它们的胞外结构域已经显示具有富含亮氨酸的重复序列，并且它们的胞内结构域类似于白介素-1受体(IL-1R)的胞内区。TLR细胞在免疫细胞和其他细胞(包括血管上皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肠上皮细胞)之间差异表达。TLRs的胞内结构域可以与在其细胞质区也具有IL-1R结构域的适体蛋白Myd88相互作用，导致细胞因子的NF-KB激活；这种Myd88途径是通过TLR激活实现的细胞因子释放的一种方式。TLRs的主要表达是在诸如抗原呈递细胞(如树突细胞、巨噬细胞等)的细胞类型中。
通过经TLRs的刺激进行的树突细胞的激活，导致树突细胞的成熟，并且产生炎症细胞因子如IL-12。目前为止进行的研究发现，TLRs识别不同类型的激动剂，但一些激动剂是几种TLRs共有的。TLR激动剂主要来源于细菌或病毒，并且包括分子如鞭毛蛋白或细菌脂多糖(LPS)。“TLR激动剂”表示能够通过作为直接配体的TLR信号传递途径或间接通过产生内源或外源配体而导致信号传递反应的组分(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。
在另一实施方案中，将TLR分子的其他天然或合成激动剂用作任选的另外的免疫刺激剂。这些可以包括但不限于TLR2，TLR3，TLR7，TLR8和TLR9的激动剂。
因此，在一个实施方案中，所述佐剂和免疫原性组合物进一步包含选自下组的另外的免疫刺激剂：TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或其组合。
在本发明的一个实施方案中，使用能够通过TLR-1导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-1导致信号反应的TLR激动剂选自：三酰基化脂肽(LPs)；可溶于酚的modulin；结核分枝杆菌LP；S-(2，3-二(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸化物(Pam3Cys)LP，其模拟细菌脂肽和来自布氏疏螺旋体的OspALP的酰基化的氨基末端。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-2导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-2导致信号反应的TLR激动剂是以下一种或多种：脂蛋白、肽聚糖、来自结核分枝杆菌、布氏疏螺旋体、苍白密螺旋体的细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌的物种的肽聚糖；磷脂壁酸质、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、细菌菌毛、耶尔森菌毒力因子、CMV病毒体、麻疹血细胞凝集素和来自酵母的酵母聚糖。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-3导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-3导致信号反应的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)或聚肌胞苷酸(PolyIC)，即与病毒感染相关的分子核酸模式。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-5导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-5导致信号反应的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-6导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-6导致信号反应的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白，即二酰基化LP和可溶于酚的modulin。其他TLR6激动剂描述于WO2003043572中。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-7导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeeta1，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-7导致信号反应的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、罗唑利宾、位置N7和C8上的鸟苷类似物或咪唑并喹琳化合物或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特。其他TLR7激动剂描述于WO02085905中。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-8导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-8导致信号反应的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑并喹琳分子，例如resiquimod(R848)；resiquimod也能够被TLR-7识别。其他可以使用的TLR-8激动剂包括WO2004071459中描述的那些。
在一个替代的实施方案中，使用能够通过TLR-9导致信号传递反应的TLR激动剂(Sabroeetal，JI2003p1630-5)。合适地，能够通过TLR-9导致信号反应的TLR激动剂是HSP90。或者，能够通过TLR-9导致信号传递反应的TLR激动剂是细菌或病毒DNA、含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特别是已知为CpG基序的序列内容。含cpG的寡核苷酸诱导占优势的Th1应答。所述寡核苷酸是公知的，并且描述于例如WO96/02555，WO99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462。合适地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于本发明的免疫原性组合物中的合适的寡核苷酸是含CpG的寡核苷酸，任选含有由至少3个，合适地至少6个或更多个核苷酸分隔开的两个或多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞苷酸，后面是鸟苷酸。本发明的CpG寡核苷酸典型地是脱氧核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或合适地是硫代磷酸酯键，但磷酸二酯和其他核苷酸间键也在本发明的范围内。本发明的范围内还包括具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。生产硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153，US5,278,302和WO95/26204。优选寡核苷酸的实例具有以下序列。所述序列可以含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。
寡核苷酸1(SEQIDNO：1)：TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)
寡核苷酸2(SEQIDNO：2)：TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)
寡核苷酸3(SEQIDNO：3)：ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACG
寡核苷酸4(SEQIDNO：4)：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006or7909)
寡核苷酸5(SEQIDNO：5)：TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)
寡核苷酸6(SEQIDNO：6)：TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)
合适地，使用硫代磷酸酯主链CPG7909(SEQIDNO：4)。或者，CpG寡核苷酸可以包含上文指定的序列，但它们具有无关紧要的缺失或添加。可以通过本领域已知的任何方法合成用于本发明中的CpG寡核苷酸(例如参见EP468520)。方便地，所述寡核苷酸可以用自动化合成仪进行合成。
在另一实施方案中，佐剂和免疫原性组合物进一步包含皂苷佐剂。特别适用于本发明的皂苷是QuilA及其衍生物。QuilA是一种从南美洲的树木-南美皂皮树(QuillajaSaponariaMolina)分离的皂苷制剂，并且在1974年由Dalsgaard等人首先描述(“Saponinadjuvants”，Archiv.fürdiegesamteVirusforschung，Vol.44，SpringerVerlag，Berlin，p243-254)具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了QuilA的纯化片段，其保留佐剂活性而没有与QuilA相关的毒性(EP0362278)，所述片段例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)。QS-21是一种来源于南美皂皮树的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和占优势的IgG2a抗体应答，并且是本发明的上下文中的优选皂苷。在本发明的一种合适的形式中，免疫原性组合物中的皂苷佐剂是南美皂皮树QuilA的衍生物，如QuilA的免疫活性级分，例如QS-17或QS-21，合适地是QS-21。在一种实施方案中，本发明的组合物含有基本纯的形式的免疫活性皂苷级分。在一种实施方案中，本发明的组合物含有基本纯的形式的QS21，也就是说，QS21是至少90％纯的，例如，至少95％纯或至少98％纯。
其它有用的皂苷来源于植物-欧洲七叶树或Gyophillastruthium。描述于文献中的其它皂苷包括七叶素，其在Merckindex(12版：条目3737)中描述为存在于七叶树(拉丁文是Aesculushippocastanum)的种子中的皂苷混合物。描述其分离是通过色谱和纯化(Fiedler，Arzneimittel-Forsch.4，213(1953))，以及通过离子交换树脂(Erbring等，US3,238,190)。已经纯化了七叶素的级分，并且显示是生物活性的(YoshikawaM等，(ChemPharmBull(Tokyo)1996Aug；44(8)：1454-1464))。来自Gypsophillastruthium的Sapoalbin(R.Vochten等，，1968，J.Pharm.Belg.，42，213-226)也是一种选择。
所述免疫活性皂苷，如QS21，可以每个人类剂量的免疫原性组合物1-50μg的量使用。有利地，以约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg或25μg的水平使用QS21。在另一实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含约10μg，例如5-15μg，合适地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或10μg水平的QS21。在进一步的实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含约5μg，例如1-9μg或2-8μg或合适地3-7μg或4-6μg或5μg水平的QS21。
3D-MPL和/或QS21的剂量合适地能够增强对人类中的抗原的免疫应答。特别是，合适的3D-MPL和/或QS21的量是与不含佐剂的组合物相比，或与以另外的3D-MPL或QS21量为佐剂的组合物相比改进组合物的免疫潜能，同时是反应原性谱能够接受的量。典型地，对于人类施用，皂苷(如QS21)和/或LPS衍生物(如3D-MPL)将以每个剂量1μg-200μg，如10-50μg，或1μg-25μg的范围存在于人类剂量的免疫原性组合物中。
在一个特定实施方案中，本发明的佐剂和免疫原性组合物包含与甾醇(如胆固醇)一起存在于上文描述的乳液中的皂苷(如QS21)和/或LPS衍生物(如3D-MPL)。这些甾醇是本领域公知的，例如胆固醇在MerckIndex第11版341页中公开为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。此外，油乳液(特别是水包油乳液)可以含有Span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。包含水包油乳液、甾醇和皂苷的佐剂描述于WO99/12565中。其他免疫刺激剂的实例描述于本文和“VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach”1995，PharmaceuticalBiotechnology，Volume6，Eds.Powell，M.F.，andNewman，M.J.，PlenumPress，NewYorkandLondon，ISBN0-306-44867-X中。
当包含鲨烯和皂苷(任选QS21)时，有益的是在制剂中也包含甾醇(任选胆固醇)，因为这使得能够减少乳液中油的总水平。这导致生产成本降低、改进接种的总体舒适度，也能够定性和定量改进得到的免疫应答，如改进的IFN-γ产生。因此，本发明的佐剂系统典型地包含200∶1-300∶1范围的可代谢油：皂苷(w/w)的比例，本发明也可以以“低油”形式使用，其任选范围是1∶1-200∶1，任选20∶1-100∶1，或基本48∶1，这种疫苗保持了所有组分的有益佐剂特性，同时具有很大程度减少的反应原性谱。因此，一些实施方案具有范围是1∶1-250∶1或20∶1-200∶1或20∶1-100∶1或基本48∶1的鲨烯∶QS21(w/w)比值。任选地，也包含以本文描述的皂苷：甾醇比例存在的甾醇(如胆固醇)。
任选包括了另外的免疫刺激剂的佐剂特别适合婴儿和/或老年人疫苗制剂。
因此，本发明的水包油乳液佐剂可以任选进一步包含5-60、10-50或20-30μg(如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。水包油佐剂可以任选包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)甾醇(例如胆固醇)，1-60、10-50或20-30μg(如1-10、5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL或脂质A的任何合成衍生物)和1-60、10-50或20-30μg(如1-10、5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂苷(例如QS21)。
流感病毒株和流感抗原、接种方案、剂量和效力标准
所述流感病毒或其抗原性制剂可以来源于卵或来源于细胞培养物。例如，本发明的流感病毒抗原或其抗原性制剂可来源于常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的尿囊液。卵可在短时间内大量累积。或者，它们可来源于任一种使用细胞或细胞培养物的新生产方法，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基质包括例如狗肾细胞，例如MDCK或来自MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括Vero细胞，合适的猪细胞系，或适于生产疫苗用途的流感病毒的任意其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基质还包括人细胞，例如MRC-5细胞或Per.C6细胞系。合适的细胞基质不限于细胞系；例如原代细胞，如鸡胚成纤维细胞，还包括禽细胞系，例如鸡或鸭细胞系(如Ebx细胞系如EB14或EB24，它们分别来源于鸡或鸭胚胎干细胞)。合适的昆虫细胞是Sf9或Hi5。
在一个实施方案中，根据本发明使用的流感病毒或其抗原性制剂可以是裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制剂。在一个替代实施方案中，流感制剂可以包含另一类型的灭活流感抗原，如灭活的完整病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)或流感病毒体。在另一实施方案中，流感病毒可以是活减毒流感制剂。
根据本发明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制剂合适地是灭活的病毒制剂，其中用去污剂或其他试剂溶解脂质包膜，从而破坏病毒颗粒。裂解病毒或其裂解病毒抗原性制剂合适地是通过以下方法制备的：用溶解浓度的有机溶解或去污剂使传染性或灭活的完整流感病毒断裂，随后除去溶解剂的所有或大部分以及病毒脂质材料的一些或大部分。其裂解病毒抗原性制剂表示这样的裂解病毒制剂：与裂解病毒相比，其可以进行某种程度的纯化，同时保留裂解病毒组分的大部分抗原性特性。例如，当在卵中产生时，可以从裂解病毒清除卵污染蛋白，或当在细胞培养物中产生时，可以从裂解病毒清除宿主细胞污染物。裂解病毒抗原性制剂可以包含一种病毒株以上的裂解病毒抗原性组分。含裂解病毒的疫苗(称作“流感裂解疫苗”)或裂解病毒抗原性制剂通常含有残留的基质蛋白和核蛋白(有时候含脂质)以及膜包膜蛋白。所述裂解病毒疫苗通常含有大部分或全部病毒结构蛋白，但不必与它们在完整病毒中存在时的比例相同。商购裂解疫苗的实例是例如FLUARIXTM，FlUSHIELDTM或FLUZONETM。
或者，流感病毒可以是完整病毒疫苗的形式。对于大流行状况，这可以证明相对于裂解病毒疫苗是有利的，因为它避免了关于针对流感病毒的新株是否能够成功产生裂解病毒疫苗的不确定性。对于一些株，用于产生裂解病毒的常规去污剂会破坏病毒并且使它不可用。尽管总是可能使用不同的去污剂和/或开发生产裂解疫苗的不同方法，这将需要时间，在大流行状况下可能不可获得。除了采用完整病毒方法的更高程度的确定性，也存在比裂解病毒更高的疫苗生产能力，因为在制备合适的裂解疫苗所必须的额外纯化步骤中损失显著量的抗原。
在另一实施方案中，流感病毒制剂是纯化的亚单位流感疫苗的形式。亚单位流感疫苗通常含有两种主要的包膜蛋白HA和NA，并且相对于完整的病毒体疫苗可能具有额外的优点，因为它们通常具有较低的反应原性，特别是在年轻的疫苗接种者中。可以重组产生或从破坏的病毒颗粒纯化亚单位疫苗。商购亚单位疫苗的实例是例如AGRIPPALTM或FLUVIRINTM。在一个特定实施方案中，从至少一种主要的包膜组分例如血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2，合适地从HA制备亚单位疫苗。合适地，它们包括两种或更多种抗原的组合，例如流感结构蛋白HA、NA、Matrix1(M1)和M2中的至少两种的组合，合适地是HA和NA这两者的组合，任选包含M1。合适地，通过重组DNA技术生产流感组分，即，由从重组DNA操作得到的核酸得到或由所述核酸表达流感组分，包括活的重组载体(牛痘)或重组亚单位蛋白(杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、酵母、植物或细菌)。合适的昆虫细胞是草地夜蛾(Sf9)昆虫细胞或从粉纹夜蛾开发的HighFive(Hi5)昆虫细胞(Invitrogen)，合适的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV)(Baculogold，BectonDickinson，PharMingen)或所谓的杆粒系统。
在一个实施方案中，流感病毒制剂是病毒体的形式。病毒体是球形、单层小泡，其将功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA保持为真实构象，插入病毒体的磷脂双层膜中。商购病毒体疫苗的实例是例如INFLEXALVTM或INVAVACTM。
在另一实施方案中，亚单位流感组分以病毒样颗粒(VLP)或壳粒形式表达，合适地是植物制造或昆虫细胞制造的VLPs。VLPs以其天然形式呈递抗原。VLP亚单位技术可以完全基于流感蛋白，或可以依赖于它们的病毒如鼠白血病病毒(MLV)，并且可以因此包含非流感抗原如MLVgag蛋白。合适的VLP包含至少一种，合适地至少两种流感蛋白，任选具有其他流感或非流感蛋白，如M1和HA，HA和NA，HA、NA和M1或HA、NA和MLAgag。它可以在植物或昆虫细胞中产生。VLPs也可以携带来自一种以上流感病毒株的抗原，例如从两种季节性株(如H1N1和H3N2)或从一种季节性和一种大流行株(如H3N2和H5N1)制备的VLPs。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自在卵或细胞培养物上生长的流感病毒的流感病毒抗原或其抗原性制剂。在另一实施方案中，所述流感病毒抗原或其抗原性制剂包含完整病毒、裂解病毒、病毒体或选自HA、NA、M1、M2的一种或多种纯化的抗原。在另一实施方案中，所述纯化的抗原从在哺乳动物、禽类或昆虫细胞上生长的流感病毒制备。特别地，所述纯化的抗原是重组生产的。它们可以是病毒样颗粒的形式。
流感病毒抗原或其抗原性制剂可通过众多商业可获得方法中的任一种生产，例如在专利号DD300833和DD211444(引入本文作为参考)中描述的分裂流感病毒法。裂解流感病毒传统上使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚与TweenTM的组合(称作“Tween-醚”分裂)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它分裂剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆盐，例如在专利号DD155875(引入本文作为参考)中描述的脱氧胆酸钠。可用作分裂剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)；其它离子型去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子型去污剂，如上述的一种，包括TritonX-100(例如在Lina等，2000，Biologicals28，95-103描述的方法中)和TritonN-101；或者任何两种或多种去污剂的组合。
裂解疫苗的制备方法可包括众多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交换)步骤，以及任选的例如采用热、甲醛或β-丙酯(β-Propiolactone)或紫外线的灭活步骤，其可在裂解前或后进行。裂解过程可以分批、连续或半连续过程进行。用于裂解免疫原性组合物的优选裂解和纯化方法描述于WO02/097072。
本发明的优选裂解流感疫苗抗原制剂包含生产过程剩余的残余量的Tween80和/或TritonX-100，但这些物质可在裂解抗原制备后加入或调整其浓度。在一个实施方案中，Tween80和TritonX-100都存在。来自抗原性制剂的疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为：
Tween80：0.01-1％，或约0.1％(体积/体积)
TritonX-100：0.001-0.1％(重量/体积)，或0.005-0.02％(重量/体积)。
在一个特定实施方案中，来自抗原性制剂的Tween80的终浓度在0.025％-0.09％的范围内。在另一个特定实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Tween80浓度在0.025％-0.2％(w/v)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。
在另一个特定实施方案中，TritonX-100的终浓度在0.004％-0.017％w/v的范围内。在另一个特定实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的TritonX-100浓度在0.005％-0.034％(w/v)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。
在一个实施方案中，流感制剂在低水平硫柳汞存在下制备，或在没有硫柳汞的情况下制备。在另一实施方案中，获得的流感制剂在没有有机汞防腐剂的情况下是稳定的，具体地说，所述制剂不含残余硫柳汞。具体地说，流感病毒制剂包含在没有硫柳汞的情况下或在低水平硫柳汞(一般来说为5μg/ml或以下)的情况下稳定的血细胞凝集素抗原。具体地说，乙型流感毒株的稳定利用α生育酚衍生物如α生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯，即VES)来实施。这种制剂及其制备方法公开于WO02/097072。
优选的组合物含3种灭活的裂解病毒体抗原，它们由WHO推荐的适宜流感季的病毒株制备。
在一个实施方案中，流感病毒或其抗原性制剂和本发明的佐剂包含在同一容器中。这被称为‘单管形瓶法’。在另一实施方案中，所述管形瓶为预填充注射器。在一个替代实施方案中，流感病毒或其抗原性制剂和本发明的佐剂包含在分开的容器或管形瓶中，并在给予受试者之前不久或给予受试者时混合。这被称为‘双管形瓶法’。合适地，2组分疫苗由存在于I型玻璃管形瓶(抗原容器)中的0.5ml浓缩的灭活裂解病毒体抗原和含有0.5ml佐剂的预填充的I型玻璃注射器(佐剂容器)组成。或者，疫苗是存在于两个管形瓶(一个用于抗原，一个用于佐剂，每个10剂)中的2组分疫苗，所述组分用于在施用于第一个患者前24小时内在室温下混合，并且随后在4℃下短时间储存(如最多1周)，用于随后施用。在注射时，将多剂管形瓶或含佐剂的注射器的内容物注射到含有浓缩的裂解病毒体抗原的管形瓶中。混合后，将内容物抽取到注射器中，其针头用肌内针头代替。一个剂量的重配的含佐剂流感候选疫苗相应于0.5ml。
在一个实施方案中，每个人类剂量的免疫原性组合物包含每个剂量每种流感病毒株15μgHA，这是通过SRID测定的。对于老年群体，这特别有用。
本发明的一个重要方面是以下事实：流感抗原可以比以前认为有用的量更低的量使用，合适地是低于每种病毒株15μgHA的水平，例如每个人类剂量的免疫原性组合物、每株1-10μgHA。
因g，在一个实施方案中，每个人类剂量的免疫原性组合物包含低剂量的血细胞凝集素(HA)，定义为每个剂量低于15μgHA的量，合适地低于10μg，这是通过单辐射免疫扩散(SRD)测量的(J.M.Woodetal.：J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Woodetal.，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)。在一个特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含水平为约10μg，例如5-15μg，合适地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg或10μg的每株的血细胞凝集素(HA)剂量。在进一步的实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含水平为约5μg，例如1-9μg或2-8μg或合适地3-7μg或4-6μg或5μg的每株的血细胞凝集素(HA)剂量。合适的量是1.9μg、2.5μg、3.8μg、5.0μg、7.5μg或10μgHA，或比15μg更低的任何合适的HA量，所述量可以确定，从而使疫苗组合物满足本文定义的效力标准。有利地，可以使用能够满足表2定义的管理标准的1μgHA或甚至更低，如0.5μgHA的HA剂量。HA的合适的量是例如以下任意量：每个人类剂量的免疫原性组合物每种流感病毒株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14μg(w/v)。所述低量HA可在实践可行的条件下尽量低，前提是它能够允许配制下文所述满足国际例如或EU或FDA效力标准的疫苗(参见表2和阐述的具体参数)。
合适地使用0.5ml的疫苗剂量。1ml(0.5ml佐剂+0.5ml抗原性制剂)的疫苗剂量也是合适的。有利地，本发明的疫苗剂量，特别是低HA量疫苗，可以比常规注射的裂解流感疫苗体积(通常是每个剂量约0.5、0.7或1ml)更小的体积提供。本发明的低体积剂量合适地低于每个剂量500μl，典型地低于每个剂量300μl，合适地不超过每个剂量约200μl或更低。将根据原始体积样品，或根据送递途径(其中鼻内或皮内途径给出更小剂量)，或根据目标群体(例如婴儿可能接受成人剂量的一半)常规进行剂量体积的微小调整。
合适地，要包含在免疫原性或疫苗组合物中的流感病毒株是大流行间(季节性)株，或与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜能的株，或合适地，在多价组合物中，是这些株的混合物。
大流行间株是例如在大流行间阶段全球循环的株，例如但不限于H1N1，H1N2，H3N2或B。可商购的流感疫苗是三价组合，包括一种乙型流感病毒株和两种甲型流感病毒株(H1N1，H3N2)。
给予流感病毒株引起与大流行流感病毒株相关的流感疾病大流行或爆发的潜能的流感病毒株特征是：与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新的血细胞凝集素，因此几乎所有人都是免疫学幼稚的；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新的血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于禽类物种(鸟类)中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大多数或至少大比例的或乃至整个群体以前都没有遇到该抗原，在免疫学上对该抗原是幼稚的。目前，被WHO鉴定为可能能够导致人类中的大流行的甲型流感病毒是高致病性H5N1禽流感病毒。因此，本发明的大流行疫苗将合适地包含H5N1病毒。用于引入要求保护的组合物中的两种其他合适的株是H9N2或H7N1。
一般来说，在大流行情况下，某些群体被流感感染的风险增加。老年人、慢性疾病患者和幼儿尤其易感，但许多年轻人和表面上健康的人也有风险。对于H2流感，1968年后出生的部分群体承受的风险增加。对这些群体重要的是尽快地和以简单的方式有效地受保护。
承受增加的风险的另一个人群是旅行者。今天，人们比以往任何时候都更常旅行，出现最多新病毒的地区中国和东南亚在近些年已成为受欢迎的旅行目的地。旅游模式的这种改变能使新病毒在约数周内而不是数月或数年内到达全球。
因此，对于这些人群来说，在大流行情况下或潜在大流行的情况下特别需要接种来产生抗流感的保护。适宜的病毒株是但不限于：H5N1，H5N8，H5N9，H7N4，H9N2，H7N7，H7N3，H2N2和H7N1。人类中的其他大流行株：H7N3(在加拿大报道了2例)、H10N7(在埃及报道了2例)和H5N2(在日本报道了1例)和H7N2。作为大流行株或容易与大流行相关的株的流感病毒株在本文中将称作“大流行株”。
本发明的流感药物合适地满足疫苗的某些国际标准。标准是国际应用的，以测量流感疫苗的效力。对于与流感疫苗的每年批准程序相关的临床试验，根据关于评价人类使用的医学产品的欧洲机构的标准(CHMP/BWP/214/96，CommitteeforProprietaryMedicinalProducts(CPMP).Noteforharmonizationofrequirementsforinfluenzavaccines，1997.CHMP/BWP/214/96circularN°96-0666：1-22)评估了血清学变量(表2)。对成年人群(18-60岁)和老年人群(大于60岁)的要求是不同的(表2)。对于大流行间流感疫苗，对于所有包括在疫苗中的流感病毒株，至少一项评估(血清转变因数、血清转变率、血清保护率)应该满足欧洲要求。等于或大于1∶40的滴度比例被认为是最相关的，因为预期这些滴度与保护作用相关性最好[BeyerWetal.1998.ClinDrugInvest.；15：1-12]。
如“关于大流行流感疫苗上市批准申请的档案结构和内容的指南(CHMP/VEG/4717/03，2004年4月5日，或www.emea.eu.int上可获得的命名为“关于从具有导致大流行的潜能的病毒制备的流感疫苗的指导”的2007年1月4日的更近的EMEA/CHMP/VWP/263499/2006)所指出的，在不存在来源于非循环株的流感疫苗的指定标准的情况下，预期大流行候选疫苗应该(至少)在两剂疫苗后能够引起足够的免疫应答，以合适地满足为未激发成人或老年受试者中存在的疫苗设立的所有3个现行标准。EMEA指南描述了以下状况：在大流行的情况下，群体将是免疫幼稚的，因此认为大流行候选疫苗将满足季节性疫苗的所有3个CHMP标准。不需要在接种前血清阴性受试者中明确要求证明它。
本发明的组合物合适地满足包括在组合物中的大流行株的至少一个所述标准(一个标准足以获得批准)，合适地满足表2A所示的至少两个标准，或典型地满足所有三个保护标准。
表2A(CHMP标准)
18-60岁 ＞60岁
血清转变率* ＞40％ ＞30％
转变因数** ＞2.5 ＞2.0
保护率*** ＞70％ ＞60％
*血清转变率定义为具有≥1∶40的保护性接种后滴度的每个组中的受试者比例。简单表示的血清转变率是在接种前具有＜1∶10的HI滴度和接种后具有≥1∶40的HI滴度的受试者的百分比。但是，如果最初的滴度是≥1∶10，则接种后的抗体量需要至少4倍的增加。
**转变因数定义为接种后针对每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数。
***保护率定义为在接种前是血清阴性并且具有≥1∶40的(保护性)接种后HI滴度或在接种前是血清阳性并且在接种后具有滴度的显著的4倍增加的受试者的比例，其通常认为是表示保护作用。
70％的血清保护率由欧洲健康调节机构(CHMP-人类使用的医学产品委员会)定义为每年的季节性流感疫苗通常需要满足，并且CHMP预期大流行候选疫苗也满足的三个标准之一。但是，数学建模已经表明，在群体水平在抗某些漂移株方面仅仅30％有效的疫苗在帮助减少大流行强度方面也可以是有效的，并且，使用在抗大流行株方面具有30％效力的(大流行前)疫苗的大流行接种活动也可以使临床攻击率有效减少75％，并且因此减少群体内的发病率/死亡率(Fergusonetal，Nature2006)。
FDA发表了关于支持大流行流感疫苗的批准所需的临床数据的草拟指南(CBER草拟标准)(可以从联系、训练和制造商协助(HFM-40)，1401RockvillePike，Suite200N，Rockville，MD20852-1448，或通过拨打电话1-800-835-4709或301-827-1800，或从网站http：//www.fda.gov/cber/guidelines.htm获得)，并且所述提议的标准也是基于CHMP标准。FDA使用略微不同的年龄截止点。合适的终点类似地包括：1)达到HI抗体滴度≥1∶40的受试者的百分比，和2)血清转变率，定义为接种后HI抗体滴度增加4倍。几何平均滴度(GMT)应该包括在结果中，但数据应该不仅包括点估计值，也应该包括血清转变出现率的95％置信区间的下限，并且第42天时HI滴度≥1∶40的出现率必须超过目标值。因此，应该提供这些数据和这些评价的点估计值的95％置信区间(CI)。FDA草拟指南需要满足这两项标准。这概括在表2B中。
表2B(CBER草拟标准)
18-64岁 ＞64岁
血清转变率* ＞40％ ＞30％
HI滴度≥1∶40的比例 ＞70％ ＞60％
*血清转变率定义为：a)对于基线滴度≥1∶10的受试者，4倍或更大的增加；或b)对于基线滴度＜1∶10的受试者，提高到≥1∶40。
在真实值的95％CI的下限必须满足这些标准。
因此，在本发明的一方面，提供了本文要求保护的组合物、方法或用途，其中由施用所考虑的流感组合物诱导的所述免疫应答或保护作用满足流感疫苗有效性的所有三个EU管理标准。合适地，对于病毒株或组合物的每种病毒株，满足以下标准中的至少一个，合适地两个或三个：
-在成年群体(年龄18-60)中＞50％、＞60％、＞70％，合适地＞80％或＞90％的血清保护率，和/或合适地在老年群体(年龄＞60岁)中也是如此；
-在成年群体(年龄18-60)中＞75％、＞80％、＞85％，合适地＞90％的保护率，和/或合适地在老年群体(年龄＞60岁)中也是如此；
-在成年群体(年龄18-60)中＞4.0、＞5.0、＞6.0、＞7.0、＞8.0、＞9.0或10或高于10的转变因数，和/或合适地在老年群体(年龄＞60岁)中也是如此。
在一个特定实施方案中，本发明的组合物将满足以下两个标准：在成人群体中血清转变率＞60％或＞70％或合适地＞80％，和保护率＞75％，合适地＞80％。在另一特定实施方案中，本发明的组合物将满足以下两个标准：在成人群体中转变因数＞5.0或＞7.0或合适地＞10.0，和血清转变率＞60％或＞70％或合适地＞80％。在另一特定实施方案中，本发明的组合物将满足以下两个标准：在成人群体中转变因数＞5.0或＞7.0或合适地＞10.0，和保护率＞75％，合适地＞80％。在另一特定实施方案中，本发明的组合物将满足以下两个标准：转变因数为10.0或更高、血清转变率为80％或更高，和保护率为80％或更高。
在另一实施方案中，含有大流行株或容易与大流行相关的株的要求保护的疫苗，合适地是大流行前疫苗，将具有30％的抗循环大流行株的效力(30％的交叉保护作用)。具体地，要求保护的疫苗将满足至少30％的抗漂移株，合适地至少40％，或＞50％或＞60％的抗漂移株的血清保护率。合适地，抗漂移株的血清保护率将＞70％，或合适地＞80％。所述能够赋予交叉保护作用的大流行前疫苗将能够使总体感染攻击率显著减少至少50％，或合适地至少75％，并且因此减少群体内的发病率/死亡率。
在另一实施方案中，要求保护的含佐剂的疫苗能够在至少50％的受试者、至少60％、合适地至少70％，或合适地在超过75％的受试者中诱导抗漂移株或来自不同进化枝的株的中和抗体。合适地，以低剂量抗原，如7.5μgHA或甚至更低的抗原剂量如3.8μg或1.9μgHA实现这种效果。
合适地，对于其他群体，例如儿童和任何免疫受损的群体，也满足任何或所有所述标准。
在本发明的一个方面，人类剂量的免疫原性组合物包含来自单一流感病毒株的血细胞凝集素(HA)，并且称作“单价”流感组合物。在本发明的另一方面，人类剂量的免疫原性组合物包含来自一种以上流感病毒株的血细胞凝集素(HA)，并且称作“多价”流感组合物。本发明的合适的多价组合物是二价组合物(包含来自两种流感病毒株，例如但不限于两种与大流行相关或容易与大流行相关的株，如H5＝H2的血细胞凝集素(HA))、三价组合物(包含来自三种流感病毒株，任选来自两种甲型株和一种乙型株，例如但不限于B/yamagata或B/Victoria的血细胞凝集素(HA))、四价组合物(包含来自四种流感病毒株的血细胞凝集素(HA))或五价组合物(包含来自五种流感病毒株的血细胞凝集素(HA))。合适的四价组合物包含来自两种甲型株和两种来自不同系的乙型株(例如B/yamagata或B/Victoria)的血细胞凝集素。或者，四价组合物包含来自三种甲型株(任选H1N1、H3N2和一种与大流行相关或容易与大流行相关的甲型株)和一种乙型株(如B/yamagata或B/Victoria)的血细胞凝集素。另一种替代的四价组合物包含来自四种来自与大流行相关或容易与大流行相关的病毒株的甲型株，如禽流感病毒株的血细胞凝集素，如H5+H2+H7+H9。具体地，多价含佐剂大流行组合物例如大流行二价(如H5+H2)或三价或四价(如H5+H2+H7+H9)组合物提供了预先的抗大流行甲型流感威胁亚型免疫和可持续的抗威胁亚型激发作用的优点。典型地，用常规方案(如隔开6-12个月)从6周龄开始给予两剂，任选预见周期性加强(如10岁)。任选地，所述大流行疫苗可以与季节性疫苗组合。
多价组合物也可以包含5种以上流感病毒株，如6、7、8、9或10种流感病毒株。
当多价季节性组合物中使用两种乙型株时，它们可以来自两个不同的系(任选来自B/Victoria和B/Yamagata)。至少所述乙型株之一，合适地这两种乙型株，将来自循环系。所述组合物特别适用于儿童。合适地，当用于儿童中的多价组合物包括两种乙型株时，通常分配给乙型株的抗原量是在两种乙型株之间分配。具体地，含佐剂的四价(H1+H3+两种乙型系)流感疫苗提供了以下优点：增强的对于幼稚儿童的预防作用的优点，作为其与不含佐剂的疫苗相比的优越效力(在同源性和漂移防护及其抗两种循环乙型系的有效性方面)，以及基于年龄的可能的整年免疫。从6周龄开始，或在6-35个月之间，尽早施用一剂或两剂。
在一个特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物是包含来自两种甲型株(任选H1N1，H3N2)和一种乙型株的三价免疫原性或疫苗组合物。合适地，每株的HA是低量HA(任选每株10μgHA或更低)并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg、约2.5μg或更低。佐剂如本文所定义，特别是表1所定义。合适地，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量5-6mg、5-6mg和2-3mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。这些含佐剂的免疫原性组合物或疫苗特别适合成人(18-60岁)或较大儿童(3-17岁)群体，并且可以提供抗来自不同系的H3N2漂移变体和抗乙型株的交叉保护作用。
在另一特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物是包含来自两种甲型株(任选H1N1，H3N2)和两种乙型株(任选来自不同的系，如来自B/Victoria和B/Yamagata)的四价免疫原性或疫苗组合物。合适地，每个剂量每株的HA是大约15μg。合适地，每株的HA是低量HA(任选每个剂量每株约10μgHA或更低，以实现每个剂量40-45μgHA的最大值)，并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg，约2.5μg或更低。佐剂如本文所定义，特别是表1所定义。合适地，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量5-6mg、5-6mg和2-3mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。这样的包含第二乙型株的组合物特别适用于非常年幼的儿童，特别是在前面的暴露或激发是重要的情况下。该佐剂将提供给这个群体带来增加的保护作用的优点。用于儿童群体的人类剂量的免疫原性组合物合适地是成人剂量的一半，合适地包含每株2.5μgHA以及包含每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。
或者，所述另外的乙型株(合适地具有上述关于四价组合物定义的特征和量)可以单价组合物的形式添加到上文描述的三价组合物中。采用低量10，例如10μg或低于10μg或5μg或低于5μg，或任选对于幼儿，2.5μg或低于2.5μg，将具有限制另外的流感病毒株对总体疫苗供应的影响的优点。合适地，当两种乙型株包含在疫苗组合物中时，分配给乙型株的抗原量在两种乙型株之间分配。
在另一特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物是包含来自两种大流行间甲型株(任选H1N1，H3N2)、一种乙型株和一种与大流行相关或容易与大流行相关的甲型株(任选H5N1，H9N2，H7N7，H5N8，H5N9，H7N4，H7N3，H2N2，H10N7，H5N2，H7N2和H7N1)的血细胞凝集素(HA)的四价免疫原性或疫苗组合物。合适地，每株的HA是低量HA(任选每株10μgHA或更低)并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg、约2.5μg或更低。佐剂如本文所定义，特别是表1所定义。合适地，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量5-6mg、5-6mg和2-3mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。
在另一特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物是包含来自三种大流行间甲型株(任选H1N1和两种H3N2株)和一种乙型株的四价免疫原性或疫苗组合物。合适地，每株的HA是低量HA(任选每株10μgHA或更低)并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg、约2.5μg或更低。佐剂如本文所定义，特别是表1所定义。合适地，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量5-6mg、5-6mg和2-3mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。这样的包含第三种季节性甲型株的组合物特别适用于非常年幼的儿童。合适地，三种大流行间株中的两种是H3N2株，第二种H3N2株与第一种H3N2株相比是近或远的进化枝。该佐剂将提供给这个群体带来增加的保护作用的优点。用于儿童群体的免疫原性组合物的人类剂量合适地是成人剂量的一半，合适地包含每株2.5μgHA以及包含含量为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。
在另一特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物是包含来自两种大流行间甲型株(任选H1N1，H3N2)、两种乙型株(任选来自不同的系，例如来自B/Victoria和B/Yamagat)和一种与大流行相关或容易与大流行相关的甲型株(任选H5N1，H9N2，H5N8，H5N9，H7N4，H7N7，H7N3，H2N2，H10N7，H5N2和H7N1)的五价免疫原性或疫苗组合物。合适地，每个剂量每株的HA是约15μg。合适地，每株的HA是低量HA(任选每个剂量每株约10μgHA或更低，以实现每个剂量40-45μgHA的最大值)，并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg、约2.5μg或更低。佐剂如本文所定义，特别是表1所定义。合适地，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量5-6mg、5-6mg和2-3mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。
在另一特定实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物是包含来自三种大流行间甲型株(任选H1N1，和两种H3N2株)和两种乙型株(任选来自不同的系，如来自B/Victoria和B/Yamagata)的血细胞凝集素(HA)的五价免疫原性或疫苗组合物。合适地，每株的HA是低量HA(任选每株10μgHA或更低)并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg、约2.5μg或更低。佐剂如本文所定义，特别是表1所定义。合适地，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量5-6mg、5-6mg和2-3mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含含量分别为每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。
因此，在一个特定实施方案中，本发明提供了包含鲨烯和HA的流感免疫原性组合物，其中鲨烯：HA总量(包括所有流感病毒株)的重量比在约50-150或约150-400(如约200-300)的范围内。所述组合物合适地但不专门用于老年群体并且最佳地平衡反应原性和免疫原性。在另一实施方案中，本发明提供了包含鲨烯和HA的免疫原性组合物，其中鲨烯：HA总量(包括所有流感病毒株)的重量比是约50-400，如约50-100、75-150、75-200、75-400、100-200、100-250或200-400。该比例将合适地使得满足针对特定群体的至少两个，合适地所有三个保护作用标准(表2)。可以包含TLR激动剂，合适地是TLR-4(如选自3D-MPL，MPL；AGP分子如RC527或RC529或ER804057)或TLR-9(合适地是CpG寡核苷酸如CPG7909)激动剂。合适的鲨烯：TLR-4的重量比是约100-450，如50-250、50-150、100-250、200-250、350-450。合适的鲨烯：TLR-9的重量比是约50-1000，如50-500、100-1000、100-400、400-600。HA可以来自季节性流感病毒株。所述组合物合适地但不是专门用于成人或儿科群体，并且最佳地平衡反应原性和免疫原性。合适地，HA来自至少三种、至少四种流感病毒株。合适地，存在三种季节性(如H1N1，H3N2，B)株。合适地，当存在四种株时，它们来自下组：四种季节性株(如H1N1，H3N2，两种乙型株；或H1N1，B，两种H3N2株)或一种大流行(如禽流感)株加上三种季节性株(如H1N1，H3N2，B)。
所有要求保护的含佐剂的免疫原性组合物或疫苗可以有利地依赖于佐剂在接种后超过6个月，合适地12个月的时间内提供持续的免疫应答。
合适地，上述应答是在相同的正在进行的初次免疫应答期间施用一剂，或典型地施用两剂后获得的。要求保护的组合物的一个特别的优点是仅仅在一剂含有佐剂的组合物或疫苗后就获得了免疫应答。在相同的正在进行的初次免疫应答期间施用两剂也是合适的，合适地用于幼稚或免疫受损的群体或个体。合适地，儿童中，特别是小于6岁或9-10岁的以前未接种过的儿童中可能需要两剂。
因此，在本发明的一方面中提供了非存活的大流行流感病毒抗原制剂，特别是裂解流感病毒或其抗原性制剂在制备疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物用于进行一剂或两剂抗流感接种，其中所述一剂或两剂接种产生满足流感疫苗的至少一个，合适地至少两个或三个国际管理要求的免疫应答。在另一特定实施方案中，所述一剂接种也或额外产生比用不含佐剂的疫苗获得的应答更高的CD4T细胞免疫应答和/或B细胞记忆应答。在一个特定实施方案中，所述免疫应答是交叉反应性抗体应答或交叉反应性CD4T细胞应答或这两者。在一个特定实施方案中，人类患者对接种株是免疫学幼稚的(即，没有预先存在的免疫)。特别是，疫苗组合物包含低HA抗原量和水包油乳液佐剂，所述佐剂具有比以前认为有用的水平更低水平的组分，并且其量如上文所定义。特别是，疫苗组合物如本文的定义。具体地，疫苗组合物的免疫原性特性如上文所定义。合适地，肌内施用疫苗。
用于本发明的接种(任选第一次接种)的免疫原性组合物的免疫原性特性
在本发明中，与用不含佐剂，即不含任何外源佐剂的相应组合物(本文也称作“普通组合物”)获得的CD4+T细胞免疫应答相比，含佐剂的免疫原性组合物合适地能够诱导抗组分抗原或抗至少一种组分抗原或抗原性组合物的改进的CD4+T细胞免疫应答。在一个特定实施方案中，当免疫原性流感组合物来自几种流感病毒株时(其中一个是第二乙型株或第三大流行间甲型株或大流行株)，所述改进的CD4+T细胞免疫应答抗这些株中的至少一种。在另一实施方案中，含佐剂的免疫原性组合物(其中佐剂组分的水平比以前认为有用的水平低，并且典型地如上文所定义)合适地能够诱导抗组分抗原或抗至少一种组分抗原或抗原性组合物的CD4+T细胞免疫应答，其至少与用一些现有技术的佐剂为佐剂的组合物所获得的上述CD4+T细胞免疫应答相似。该特征在下文中将称作“相似的CD4+T细胞免疫应答”。
所述“改进的CD4+T细胞免疫应答”指在施用本文定义的含佐剂的免疫原性组合物之后在人类患者中获得的CD4+应答高于在施用无佐剂的相同组合物后获得的免疫应答。例如，与施用含流感病毒或其抗原性制剂的无佐剂免疫原性组合物之后诱导的应答相比，在施用含流感病毒或其抗原性制剂以及水包油乳液佐剂的免疫原性组合物时于人类患者中获得更高的CD4T-细胞应答，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油(任选鲨烯)、母育酚(任选α生育酚)和乳化剂(任选聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯如Tween80TM或Polysorbate80TM)。这种含佐剂的制剂将有利地用于诱导抗流感的CD4+T细胞应答，该应答能够检测由MHCII类分子呈递的流感表位。
合适地，由本发明使用的含佐剂的裂解流感组合物诱导的所述免疫应答高于用任意其它不含佐剂的常规流感疫苗(例如亚单位流感疫苗或完整流感病毒疫苗)诱导的免疫应答。
具体地但非排它性地，所述“改进的CD4+T细胞免疫应答”或“相似的CD4+T细胞免疫应答”在免疫学未激发的患者(即对所述流感病毒或抗原为血清阴性的患者)中获得。此血清阴性可能是从未面对此病毒或抗原的所述患者(所谓的‘幼稚’患者)的结果，或者是在遭遇时不能对所述抗原应答的所述患者的结果。合适地，所述改善的CD4+T细胞免疫应答在免疫受损的受试者中获得，所述免疫受损的受试者例如为老年人，通常至少50岁，典型地为65岁或以上，或者是具有高风险医学状况的小于65岁的成人(‘高风险’成人)，或者是2岁以下的儿童。
(改进的)CD4+T细胞免疫应答可通过检测产生以下任一种细胞因子的细胞数来评价：
·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞
·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞
·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞
当和施用不含佐剂的组合物相比在施用含佐剂的组合物后产生任一种以上细胞因子的细胞的量较高时，将存在“改进的”CD4T-细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少一种、合适地两种将被实现。在一个具体实施方案中，与不含佐剂的组相比，含佐剂的组中产生全部4种细胞因子的细胞将以更高量存在。当与用一些现有技术的佐剂为佐剂(即具有高水平的相同组分)的组合物获得的应答相比，用含佐剂的免疫原性组合物(其中佐剂组分以比以前认为有用的水平更低并且典型地如本文定义的水平存在)获得的应答没有显著(任选没有统计学显著)降低时，将存在“相似的”CD4+T细胞应答。
在一个特定实施方案中，改进的CD4T细胞免疫应答可以由本发明的含佐剂的流感组合物赋予，并且理想地可以在单次施用后获得。例如在快速发展的爆发情况下单剂方法将有极为重大的意义。在某些情况下，尤其是对于老年人群，或者对于第一次抗流感接种的幼儿(9岁以下)，或在大流行情况下，施用两剂相同的该季节的组合物可能是有益的。第二剂所述相同组合物(仍被看作是‘用于第一次接种的组合物’)可在正在进行的初始免疫应答期间施用，并有足够的时间间隔。通常，第二剂组合物在首剂后数周或约1个月(例如2周、3周、4周、5周或6周)施用，以帮助激发无应答或低应答个体的免疫系统。在一个特定方面，初次接种后是含佐剂的疫苗产品的后续接种过程，所述疫苗产品含异源流感病毒株。
在一个具体实施方案中，与在用不含佐剂的组合物免疫的个体中诱导的B记忆细胞应答相比，在施用含佐剂的免疫原性组合物的患者中替代地或额外地诱导改进的B-记忆细胞应答。改进的B-记忆细胞应答意指在遭遇抗原时能够分化为分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率增加，这通过体外分化刺激检测(参见实施例部分，例如ElispotB细胞记忆的方法)。在另一实施方案中，含佐剂的免疫原性组合物(其中佐剂组分以比以前认为有用的水平更低并且典型地如本文定义的水平存在)合适地能够诱导与用一些现有技术的佐剂为佐剂的组合物获得的B记忆细胞应答相似的抗组分抗原或抗至少一种组分抗原或抗原性组合物的B记忆细胞应答。该特征在上下文中将称作“相似的B记忆应答”。
在再另一个具体实施方案中，用含佐剂的第一次接种用组合物接种对CD8应答无可检测的影响。
合适地，用水包油乳液佐剂，特别是包含例如本文定义的低量可代谢油(任选鲨烯)、母育酚(任选α生育酚)和乳化剂(任选聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯如Tween80TM或Polysorbate80TM)的水包油乳液佐剂配制的包含流感病毒或其抗原性制剂的要求保护的组合物能在免疫受损的或免疫学幼稚的人群中有效促进T细胞应答。合适地，通过进行抗流感再接种后流感疫苗保护作用的关联性评价，与用不含佐剂的流感疫苗接种相比，施用单剂本发明所述的用于第一次接种的含佐剂的免疫原性组合物能够提供更好的血清保护作用。相比于用不含佐剂的制剂获得的T细胞免疫应答，要求保护的含佐剂的制剂还能够有利地诱导抗流感病毒的改进的CD4T细胞免疫应答。该特性可能与接种或面对流感抗原暴露的感染时增加的应答性相关。而且，其还可能与交叉反应性相关，即对变体流感病毒株应答的能力较高。这种定性和/或定量改进的应答可能在大流行情况下所有群体中，并且特别是在免疫受损人群如老年群体(65岁和以上)以及尤其是高风险老年人群中特别有益。这还可对最幼稚的婴儿群体(5岁以下，合适地2岁以下)有益。当组合物包含至少一种大流行株时，这种改进的应答对于用于在大流行爆发前或开始时激发(例如从含漂移变体的储存疫苗)的用途是有益的。这可能导致减少总体发病率和死亡率，并且防止由于肺炎和其他流感样疾病紧急入院。而且，与用不含佐剂的制剂诱导的应答相比，其允许诱导时间更持久的CD4T细胞应答，例如在第一次接种后仍存在1年。用要求保护的佐剂组合物可以获得所有这些优点，同时与具有更高组分含量的佐剂相比降低总体反应原性。
合适地，CD4T细胞免疫应答，例如在未激发的受试者中获得的“改进的”或“相似的”CD4T细胞免疫应答，包括诱导交叉反应性CD4T辅助应答。具体地说，增加交叉反应性CD4T细胞的量。所述‘交叉反应性’CD4应答指CD4T细胞靶向流感病毒株之间的共有表位，所述流感病毒株任选来自不同的进化枝或谱系。
通常，可用的流感疫苗仅有效对抗具有相似抗原性特征的血细胞凝集素的流感病毒感染株。当感染(循环)性流感病毒已经历了表面糖蛋白(特别是血细胞凝集素)的微小变化(例如点突变或导致氨基酸改变的点突变累积)时(抗原性漂移变体病毒株)，疫苗仍可提供一些保护作用，但其可能仅提供有限的保护作用，因为新产生的变体可能逃脱先前流感感染或接种诱导的免疫性。抗原性漂移是大流行间发生的年度大流行的原因(Wiley&Skehel，1987，Ann.Rev.Biochem.56，365-394)。交叉反应性CD4T细胞的诱导为本发明组合物提供了额外的优势，因为其还可提供交叉保护作用，换句话说是抗异源感染的保护作用，所述异源感染即由作为免疫原性组合物中包含的流感病毒株的变体(例如漂移变体)的循环流感病毒株引起的感染。这在循环毒株难以在卵中繁殖或难以在组织培养物中生产时可能是有利的，使漂移株用作备选工作株。这在受试者以几个月或一年间隔接受第一次和第二次接种时也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性组合物中的流感病毒株是用于第一次接种的组合物中使用的病毒株的漂移变体株。
因此，本文定义的含佐剂的流感免疫原性组合物在接种的老年或幼儿受试者中具有较高的诱导血清保护作用和交叉反应性CD4T细胞的能力。该特征可能与对免疫原性组合物中存在的病毒株的变体株应答的能力较高有关。这在大流行情况下可证明是重要的特征。例如，在随后用所述漂移株接种时或由所述漂移株感染时，含至少一种大流行株，任选H5、H2、H9、H7或H6株中的任一种或多种的免疫原性流感组合物可提供较高的对大流行变体(即所述大流行株的漂移株)应答的能力。例如，含佐剂的疫苗组合物包含A/Indonesian株，并且能够产生抗漂移株，如A/HongKong、A/Turkey、A/Vietnam和/或A/Anhui株中的一种，合适地一种以上的交叉保护性和/或交叉反应性免疫应答。
用流感疫苗接种后的交叉反应性CD4T细胞的检测
在施用经典的三价流感疫苗后(3周)，对抗原性病毒株制剂(完整病毒或裂解抗原)应答的外周血CD4T细胞的频率显著增加，所述抗原性病毒株制剂与疫苗中存在的病毒株(H3N2：A/Panama/2007/99，H1N1：A/NewCaledonia/20/99，B：B/Shangdong/7/97)同源(参见实施例III)。如果用分类为漂移株(H3N2：A/Sydney/5/97，H1N1：A/Beijing/262/95，B：B/Yamanashi/166/98)的流感病毒株再刺激外周血CD4T细胞，则可以见到相似的频率增加。相反，如果由本领域的专家用分类为漂移株(H2N2：A/Singapore/1/57，H9N2：A/Hongkong/1073/99)的流感病毒株再刺激外周血CD4T细胞，在接种后没有可观察到的增加。
能够识别同源和漂移的流感病毒株两者的CD4T细胞在本文件中已命名为“交叉反应性”。如本文所述的含佐剂的流感组合物已能够显示出异亚型的交叉反应性，因为存在可观测的抗漂移流感病毒株的交叉反应性。如上所述，包含至少一种大流行株的疫苗制剂有效抗漂移大流行株的能力在大流行情况下可证明是重要的特征。
与以上观测结果相一致，已在人中鉴别出不同流感病毒株共有的CD4T细胞表位(GelderC等，1998，IntImmunol.10(2)：211-22；GelderCM等，1996JVirol.70(7)：4787-90；GelderCM等，1995JVirol.199569(12)：7497-506)。
由于其免疫原性特性，要求保护的组合物可能能够建立抗人类流感大流行威胁的主动接种策略，包括储存大流行前疫苗，以便更好地做好抗大流行开始的准备工作。也可以建立抗循环株的主动接种策略，所述循环株可能不能精确匹配疫苗组合物中存在的株。在一个特定实施方案中，含佐剂的组合物可以提供额外的益处，即，提供抗循环株的更好的保护作用，所述循环株进行了血细胞凝集素中的主要改变(如基因重组，例如，两个不同的种之间)(抗原性漂移)，目前能获得的疫苗对所述循环株无效。
具体地，大流行前疫苗包含类似于目前在鸟类群体中循环的病毒株的至少一种大流行株(任选H5N1(禽流感))，并且例如是通过使用反向遗传学产生的。反应于大流行前疫苗发生的免疫可以使得免疫系统能够有准备地被“激发”或“教育”，从而在遇到实际的大流行病毒株之后更迅速发展保护性免疫应答，导致对流感的相关大流行株的易感性降低。一旦由WHO宣布了大流行，并且鉴定了最终的大流行株(可能是或不是漂移株)，大流行前疫苗也将允许在大流行疫苗可以获得时，对大流行疫苗更快的免疫应答。
再接种和用于再接种的组合物(加强组合物)
本发明的一个方面提供
(a)来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂和
(b)本文定义的水包油乳液佐剂
在制备本文定义的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于提供抗流感病毒株导致的流感感染，所述流感病毒株是所述第一流感病毒株的变体。
也提供了包含来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的水包油乳液佐剂的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物用于提供抗流感病毒株导致的流感感染，所述流感病毒株是所述第一流感病毒株的变体。
本发明的一方面提供了流感抗原在制备用于再接种以前已经接种过(一剂或两剂)本文定义的含佐剂的流感组合物的人的流感免疫原性组合物中的用途。也提供了包含流感病毒或其抗原性制剂，任选含有本文定义的水包油乳液佐剂的免疫原性组合物，所述组合物用于再接种以前已经接种过本文定义的含佐剂的流感组合物的人。
在一个实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制剂，它们与用于第一次接种的流感病毒或其抗原性制剂共有共同的CD4T-细胞表位。共同的CD4T细胞表位意指可由相同CD4细胞识别的不同抗原的肽/序列/表位(参见例如以下文献描述的表位：GelderC等，1998，IntImmunol.10(2)：211-22；GelderCM等，1996JVirol.70(7)：4787-90；GelderCM等，1995JVirol.199569(12)：7497-506)。
在本发明的一个方面，提供了来自第一流感(任选大流行)株的流感病毒或其抗原性制剂在制备本文定义的含佐剂的免疫原性组合物中的用途，所述组合物用于提供抗流感病毒株导致的流感感染，所述流感病毒株是所述第一流感(任选大流行)株的变体。也提供了包含来自第一流感(任选大流行)株的流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的佐剂的含佐剂的免疫原性组合物，所述组合物用于提供抗流感病毒株导致的流感感染的保护作用，所述流感病毒株是所述第一流感(任选大流行)株的变体。
在另一方面，本发明提供了流感病毒或其抗原性制剂在制备流感免疫原性组合物中的用途，所述组合物用于再接种以前用本文要求保护的含佐剂的流感组合物或用包含变体流感病毒株的含佐剂的流感组合物(所述佐剂是本文定义的佐剂)接种过的人。也提供了包含流感病毒或其抗原性制剂，任选包含本文定义的水包油乳液佐剂的流感免疫原性组合物，所述组合物用于再次接种以前用本文要求保护的含佐剂的流感组合物或用包含变体流感病毒株的含佐剂的流感组合物(所述佐剂是本文定义的佐剂)接种过的人。
另一方面，本发明提供了对人群或个体进行抗一种流感病毒株的接种，然后对所述人或群体进行抗变体流感病毒株的再接种的方法，所述方法包括给所述人施用：(i)包含来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的佐剂的第一组合物，和(ii)包含所述第一流感病毒株的流感病毒株变体的免疫原性组合物。在一个特定实施方案中，所述第一病毒株与大流行相关或具有与大流行爆发相关的潜能。在另一特定实施方案中，所述变体株与大流行相关或具有与大流行相关的潜能。具体地，用包含至少一种作为循环大流行株的病毒株的流感组合物进行再接种。在另一实施方案中，所述变体株是漂移变体，任选来自用作第一病毒株的H3N2的近的或合适地，远的进化枝。在另一实施方案中，所述变体株是与第一乙型株不同系的乙型株(如B/yamagata或B/Victoria，属于不同的系)。激发组合物和加强组合物都可以是单价或合适地是多价的，即，可以含有至少两种流感病毒株，如二价、三价、四价或五价疫苗。当组合物是多价时，至少一种株合适地选自：大流行株、乙型株(如B/yamagata或B/Victoria)、H3N2株，并且任选是用于第一次接种的疫苗中存在的病毒株的漂移变体。
第一次接种可以合适地包含两剂，如上文所定义，它们在相同的进行中的免疫应答期间在数周内施用。典型地，再接种是在第一次接种后几个月进行，合适地在第一次接种后至少3个月，或4个月，合适地在8-14个月后，合适地是至少约10-12个月后或甚至更长。合适地，再接种是在第一次接种后至少6个月进行。合适地，再接种是在接近下一个流感季或在下一个流感季进行，例如，大约在第一免疫原性组合物后一年。加强组合物也可以在后一年给予(第3次、第4次、第5次接种等)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了接种方案(或用于所述方案中的组合物)，包括(i)在一年的任何时间(即流感季外)以一剂或两剂(合适地间隔例如3-6周，或间隔3-4周)给予用本发明的含佐剂的组合物进行的初次接种，然后(ii)在第一次接种后至少6周-1年施用加强接种。当在初次接种时施用两剂时，第一剂可以用含佐剂的三价或四价季节性疫苗进行，然后是第二剂含佐剂的大流行(如单价)疫苗。合适地，在第一次接种后至少6周以及在常规接种时间表内的任何时间(例如对于儿童)或在下一个流感季施用加强接种。加强组合物可用任何商业批准的流感疫苗(如经典的三价无佐剂或含佐剂疫苗如FluAdTM)进行，或用本发明的含佐剂组合物(例如含佐剂的三价或四价组合物)进行。合适地，加强组合物包含用于该季节的循环季节性株，其可以是初次疫苗中存在的株的漂移变体。该接种方案适用于大流行群体，所述群体可以在生命早期(如年龄为6个月以下或2个月以下)用可获得的疫苗激发，然后用包含循环株的组合物加强，所述循环株可以是初次组合物中存在的株的漂移变体。
用于再次接种的免疫原性组合物(加强组合物)可以含有任何类型的抗原制剂，其是灭活的或活的减毒的。它可以与用于第一次接种的免疫原性组合物含有相同类型的抗原制剂，例如裂解流感病毒或其抗原性制剂、完整病毒体或纯化的HA和NA(亚单位)疫苗。加强组合物可以与用于第一次接种的组合物含有相同亚型的流感抗原。例如，当在宣布大流行时进行第一次接种，以后进行再次接种时，用包含与用于第一次接种的流感病毒株(如H5N1Vietnam)相同亚型的流感病毒株(如H5N1Vietnam)进行再接种。或者，加强组合物可以含有与用于第一次接种的流感抗原相同亚型的流感抗原的漂移株，如H5N1Indonesia。在另一实施方案中，所述用于再次接种的流感病毒株是漂移株，即与用于第一次接种的不同，例如，它具有不同的HA或NA亚型，例如H5N2(与H5N1相同的HA亚型但不同的NA亚型)或H7N1(与H5N1不同的HA亚型但相同的NA亚型)。例如，用于第一次免疫的疫苗组合物包含A/Indonesian株，加强组合物包含A/HongKong，A/Turkey，A/Vietnam和/或A/Anhui株。
在一个实施方案中，使用裂解病毒。加强组合物可以是含佐剂的或不含佐剂的。不含佐剂的加强组合物可以是肌内给予的FluarixTM/其含有从WHO推荐的合适流感季的病毒株制备的三种灭活的裂解病毒体抗原。具体地，根据世界卫生组织分发的参照物质选择的流感病毒株或其抗原性制剂，使得它们适用于在再接种当年循环的流感病毒株。含佐剂的加强组合物可以合适地包含本文定义的水包油乳液佐剂，任选含有另外的免疫刺激剂，如TLR-4配体，如3D-MPL或皂苷。
合适地，用包含本文定义的佐剂的组合物进行的再接种诱导以下任意，合适地两种或全部效果：与用不含佐剂的流感病毒或其抗原性制剂进行第一次接种后诱导的等同应答相比，(i)抗流感病毒或其抗原性制剂的改进的CD4+T细胞免疫应答，或(ii)改进的B细胞记忆应答，或(iii)改进的体液应答。合适地，用包含本文定义的佐剂的组合物进行的再接种诱导以下任意，合适地两种或全部效果：与用各组分以更高水平存在的佐剂为佐剂的流感病毒或其抗原性制剂进行第一次接种后诱导的等同应答相比，(i)抗流感病毒或其抗原性制剂的相似的CD4+T细胞免疫应答，或(ii)相似的B细胞记忆应答，或(iii)相似的体液应答。
在本发明的一方面，用包含流感病毒和包含上文定义量的可代谢油(任选鲨烯)、母育酚(任选α生育酚)和乳化剂(任选聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)的水包油乳液佐剂的加强组合物再次接种受试者，与用不含佐剂的组合物第一次接种并且用不含佐剂的组合物加强的人群中的相应值相比，将显示更高的抗体滴度。佐剂在增强对再接种的抗体应答中的效果在老年群体或幼儿中特别重要，已知这些群体对流感病毒的接种或感染具有低应答。具体地，含佐剂的组合物相关的益处在改进再接种后的CD4T细胞应答方面也是显著的。
与由对照疫苗赋予的保护作用相比，用于再接种的含佐剂的组合物将能够诱导更好的抗漂移株(来自下一流感季的流感病毒株)的交叉反应性。所述交叉反应性与用不含佐剂的制剂获得的交叉反应性相比，显示更高的持久性。佐剂在增强抗漂移株的交叉反应性方面的效果在大流行状况下是重要的。
在另一实施方案中，本发明涉及接种方案，其中用含有可能潜在导致大流行的流感病毒株的流感组合物，合适地裂解流感组合物进行第一次接种，用包含至少一种循环株，即大流行株或经典株的单价或多价组合物进行再接种。
在一个特定实施方案中，用于再接种的人类剂量的免疫原性组合物是以水包油乳液佐剂为佐剂。合适地但不排他地，该佐剂包含母育酚。合适地，每个剂量每株的HA是约15μg。在一个特定实施方案中，每株的HA是低量HA(任选每个剂量每株约10μgHA或更低，以实现每个剂量40-45μgHA的最大值)并且如上文所定义。合适地，每株的HA是大约或低于5μg，约2.5μg或更低。合适地，佐剂组合物是包含每个剂量分别5-6mg、5-6mg和2-3mg量的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。或者，佐剂组合物是包含每个剂量分别2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg量的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80的水包油乳液。用于再次接种的人类剂量的免疫原性组合物合适地包含水包油乳液佐剂，所述佐剂包含用于初次接种的组合物中存在的组分的一半，并且将合适地包含水包油乳液，所述乳液包含每个剂量2.5-3.5mg、2-3mg和1-2mg的鲨烯、α-生育酚和polysorbate80。在一个特定实施方案中，所述再接种剂量是在初次接种后约1年或约两年给予的。
HA中的CD4表位
此抗原性漂移主要存在于病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表位区。已知被病毒用于逃避宿主免疫系统的适应性应答的不同流感病毒株之间CD4和B细胞表位的任意差异都将在流感接种中起主要作用。
已在人中鉴别出不同流感病毒株共有的CD4T细胞表位(参见例如：GelderC等，1998，IntImmunol.10(2)：211-22；GelderCM等，1996JVirol.70(7)：4787-90；和GelderCM等，1995JViroi.199569(12)：7497-506)。
在一个具体的实施方案中，再次接种使用含流感病毒或其抗原性制剂的加强组合物进行，所述流感病毒或其抗原性制剂与用于第一次接种的流感病毒抗原或其病毒抗原性制剂共有共同的CD4T细胞表位。因此，本发明涉及含大流行流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的水包油乳液佐剂的免疫原性组合物在制备多剂量疫苗的第一次接种组分中的用途，所述多剂量疫苗还包含作为加强剂量的流感病毒或其抗原性制剂，它们与第一次接种时所施用剂量的大流行流感病毒抗原或其病毒抗原性制剂共有共同的CD4T细胞表位。
接种方法
本发明的组合物可通过任意合适的送递途径施用，例如皮内、粘膜如鼻内、口服、肌内或皮下。其它送递途径在本领域众所周知。
肌内送递途径对含佐剂的流感组合物是特别合适的。本发明的组合物可以存在于单剂容器，或存在于多剂容器中，所述容器特别适合大流行疫苗。在此情况下，典型地存在抗微生物防腐剂如柳硫汞，以防止使用期间的污染。柳硫汞浓度可以是25μg/0.5ml剂量(即50μg/mL)。合适地存在5μg/0.5ml剂量(即μg/ml)或10μg/0.5ml剂量(即20μg/ml)的柳硫汞浓度。可以使用合适的肌内送递装置，如不含针头的液体喷射注射装置，例如Biojector2000(Bioject，Portland，OR)。或者，笔式注射器装置，例如用于家庭送递肾上腺素的那种，可以用于自我施用疫苗。所述送递装置的使用可以特别适用于大规模免疫活动，如大流行所需要的。
皮内送递是另一个适宜的途径。任意合适的装置都可用于皮内送递，例如短针装置。皮内疫苗还可通过限制针头进入皮肤的有效穿透长度的装置施用，例如描述于WO99/34850和EP1092444的装置及其功能等同物，这两个文献通过引用结合到本文中。喷射注射装置也是适宜的，其经液体喷射注射器或经刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针头送递液体疫苗至真皮。喷射粉末/颗粒送递装置也是适宜的，其使用压缩气体加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规注射器可用于皮内施用的经典结核菌素皮内试验法。
另一个合适的施用途径是皮下途径。任意合适的装置都可用于皮下送递，例如经典的针。合适地，使用无针喷射注射器装置。合适地，所述装置用液体疫苗制剂预填充。
或者，疫苗鼻内施用。典型地，疫苗局部施用于鼻咽区，合适地没有吸入到肺中。理想的是使用将疫苗制剂送递入鼻咽区而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内送递装置。
本发明疫苗的合适的鼻内施用装置是喷雾装置。合适的商购鼻喷雾装置包括AccusprayTM(BectonDickinson)。雾化器产生非常细小的雾，其可被容易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。
用于鼻内用途的合适喷雾装置是这样的装置：其性能不依赖于使用者提供的压力。这些装置称为压力阈装置。只有在提供阈压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压力阈装置在本领域是已知的，描述于例如WO91/13281和EP311863B和EP516636，这些文献通过引用结合到本文中。这种装置可由PfeifferGmbH购买，还描述于Bommer，R.PharmaceuticalTechnologyEurope，1999年9月。
合适的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体检测)范围为1-200μm，合适地是10-120μm。小于10μm存在吸入风险，因此理想的是10μm以下的液滴不超过约5％。120μm以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超过约5％。
双剂量送递是用于本发明疫苗的鼻内送递系统的更合适特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔施用一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于单个室中，装置的构造允许每次有效送递单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置施用本发明疫苗。
或者，本发明还考虑了表皮或透皮接种途径。
在本发明的一方面，第一次施用的含佐剂的免疫原性组合物可肌内给予，含佐剂或不含佐剂的加强组合物可通过不同途径施用，例如皮内、皮下或鼻内。在一个特定实施方案中，第一次施用的组合物对于大流行流感病毒株包含低于15μg的HA含量，加强组合物可包含15μg的标准量，或合适地包含低量的HA，即低于15μg，并根据施用途径可以更小体积施用。
尽管本发明的疫苗可以作为单剂施用，其组分也可以同时或在不同时间一起共同施用(例如，流感抗原可以与佐剂的施用分开施用或合适地同时施用)。除了单个施用途径，当施用两次注射时，可以使用两种不同的施用途径。例如，含佐剂的流感抗原的第一次施用(如激发剂量)可以IM(或ID)施用，第二次使用(例如加强剂量)可以IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗对于激发剂量可以IM施用，对于加强剂量可以IN施用。
疫苗中的流感抗原的含量典型地将是每种流感病毒株0.1-15μgHA的范围，合适地1-10μg，最典型是1-8μg的范围。流感抗原的合适含量将小于或准确地是疫苗中包含的每种流感病毒株5μgHA。在最初的接种后，受试者可以施用足够间隔的一次或几次加强免疫。
接种群体
接种的目标群体是整个群体，例如健康年轻成人(如年龄为18-50或18-60)、老年人(典型地年龄大于60岁)或婴儿/儿童。目标群体可能特别是免疫受损的人。和健康成人相比，免疫受损的人一般不能很好地对抗原、尤其是流感抗原应答。
在本发明的一方面，目标群体是未进行抗流感激发的群体，他们或者是幼稚的(例如针对大流行病毒株)，或者先前不能对流感感染或接种应答。合适地，目标群体是老年人，合适地为至少60岁，或至少65岁和以上，较年轻的高危成人(即18-60岁)，例如在健康机构工作的人，或者具有危险因素如心血管病和肺病或糖尿病的年轻成人。另一个目标群体是所有从出生开始的儿童，或2个月和以上，或6个月和以上的儿童，尤其是6-23个月龄的儿童，他们经历了相对高的流感相关住院率。另一目标群体是从出生到6个月的更小的儿童。
本申请的所有参考文献(包括专利申请和已授予专利)的教导都完整地通过引用结合到本文中。本申请所要求优先权的专利申请以在本文为公开和参考而描述的方式完整地通过引用结合到本文中。
为避免疑惑，本发明人的意图为本文的术语“包含”、“含有”和“包括”在每种情况下都任选地可以被术语“由......组成”替代。本文涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也可以适用于与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案，反之亦然。所有数值中的术语“约”(或“大约”)允许5％的变异，即约1.25％的值表示1.19％-1.31％。
本发明将参考以下的非限制性实施例进一步描述：
实施例I描述了在小鼠、雪貂、猪和人研究中使用的免疫学读出方法。
实施例II描述了在示例的研究中使用的水包油乳液和佐剂制剂的制备。
实施例III显示了用含有裂解流感抗原制剂和两个剂量的AS03佐剂的疫苗接种的年龄为18-59岁的成人群体中的临床试验。
实施例IV显示激发的BALB/c小鼠中含佐剂的和不含佐剂的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)的临床前评估。
实施例V显示激发的C57Bl/6小鼠中含佐剂的和不含佐剂的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)的临床前评估。
实施例VI显示激发的C57Bl/6小鼠中含佐剂的和不含佐剂的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和低剂量抗原)的临床前评价。
实施例VII显示幼稚C57Bl/6小鼠中含佐剂的和不含佐剂的裂解H5N1疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和抗原)的临床前评价。
实施例VIII显示激发的大白猪中含佐剂的和不含佐剂的流感疫苗的临床前评价。
实施例IX显示幼稚的和激发的C57Bl/6小鼠中含佐剂的和不含佐剂的裂解TIV和QIV季节性疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和抗原)的临床前评价。
实施例X显示用含有裂解流感抗原制剂和各种剂量的AS03佐剂的疫苗在年龄为18-64岁的成人群体中的临床试验。
实施例XI显示用含有裂解流感抗原制剂和各种佐剂在年龄为65岁以上的老年群体中的临床试验。
实施例I-免疫学读出方法
I.1.小鼠法
I.1.1.血细胞凝集抑制测试
测试原理(经典程序)
使用血细胞凝集抑制测试(HI)测定针对3种(季节性)流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制红细胞(RBC)血细胞凝集的能力。热灭活血清用高岭土和RBC处理，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血细胞凝集单位的每种流感病毒株温育。然后加入红细胞，并对凝集抑制评分。滴度表示为完全抑制的血细胞凝集的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶20，所以不可检测水平评分为等于10的滴度。
对H5N1的改进(用马红细胞进行的HI的具体描述)
由于记载过确定抗HA抗体的经典HI测定不能很好地对H5N1株起作用，使用了改进的方案，其中使用马RBC。将马的红细胞用于H5N1大流行株。在含有0.5％BSA(牛血清白蛋白，终浓度)的磷酸缓冲液中0.5％(终浓度)的马红细胞悬浮液。该悬浮液是通过用相同的磷酸缓冲液洗涤红细胞和随后的离心步骤(10min，2000rpm)每天制备的。该洗涤步骤必须重复一次。在血清和病毒悬浮液的反应混合物中加入马红细胞后，平板必须在室温下(RT，20℃+/-2℃)温育2小时，这是由于马红细胞的低沉降速度。
统计学分析
使用UNISTAT对接种后的HI滴度进行统计学分析。用于方差分析的方法可如下简述：
■数据的对数转换
■对每个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性
■对选择的数据进行的方差分析
■双因素ANOVA的相互作用的检验
■用于多重比较的TukeyHSD检验
I.1.2.胞内细胞因子染色
该技术允许根据细胞因子产量对抗原特异性T淋巴细胞进行定量：效应子T细胞和/或产生IFN-γ的效应子-记忆T细胞和/或产生IL-2的中枢记忆性T细胞。在免疫后7天收集PBMC。
在分泌抑制剂(布雷菲德菌素)存在下体外再刺激淋巴样细胞。
然后使用荧光抗体(CD4、CD8、IFN-γ和IL-2)通过常规免疫荧光法处理这些细胞。结果表示为CD4/CD8T细胞中细胞因子阳样的细胞的频率。在第二次免疫后7天对PBMC进行T细胞的胞内细胞因子染色。由小鼠收集血液，并合并在肝素化培养基RPMI+添加物中。对于血液，RPMI+添加物稀释的PBL悬浮液按照推荐的方法(于2500rpm和室温离心20分钟)在Lympholyte-Mammal梯度上分层。去除界面处的单核细胞，用RPMI+添加物清洗2次，用RPMI5％胎牛血清将PBMC悬浮液调整至2×106个细胞/ml。
用完整FI(1μgHA/株)以1x107个细胞/ml(管FACS)的终浓度进行PBMCs的体外抗原刺激，然后在添加抗-CD28和抗-CD49d(两者都是1μg/ml)的条件下37℃下温育2小时。
抗原再刺激步骤后，37℃下在布雷菲德菌素(1μg/ml)存在下温育PBMC过夜，以抑制细胞因子分泌。
IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色如下进行：清洗细胞悬浮液，重悬浮在含2％Fc封闭试剂(1/50；2.4G2)的50μlPBS1％FCS中。于4℃温育10分钟后，加入抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8perCp(3/50)的50μl混合物，于4℃温育30分钟。在PBS1％FCS中清洗后，通过重悬浮在200μlCytofix-Cytoperm(KitBD)中并于4℃温育20分钟使细胞透化。然后用PermWash(KitBD)清洗细胞，并用以PermWash稀释的抗-IFN-γAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)的50μl混合物重悬浮。于4℃温育最少2小时最长过夜后，用PermWash清洗细胞并重悬浮在PBS1％FCS+1％低聚甲醛中。通过FACS进行样品分析。门控(FSC/SSC)活细胞，对CD4+T细胞上的约20,000个事件(淋巴细胞)或35,000个事件进行采集。针对CD4+和CD8+门控的群体计算IFN-γ+或IL2+的百分率。
I.1.3.抗-H5N1ELISA
用裂解H5N1作为包衣，通过ELISA进行抗-H5N1Ig，即IgG1和IgG2b抗体滴度的定量。以每孔100μl使用病毒和抗体溶液。在PBS中以1μg/ml的终浓度稀释裂解病毒H5N1，在4℃下吸附过夜，吸附到96孔微量滴定板(MaxisorbImmunoplateNunc439454)的孔中。然后，用每孔200μl含1％BSA和0.1％Tween20(包含缓冲液)的PBS将平板在37℃下温育1小时。将血清在饱和缓冲液中的12份2倍稀释液加入H5N1包被的板上，37℃下温育1小时30分钟。用PBS0.1％Tween20将平板洗涤4次。在每个孔中加入1/500稀释的生物素缀合的抗小鼠(Prozan-E0413)或生物素缀合的抗小鼠IgG1(Imtech1070-08)或在PBS1％BSA0.1％Tween20中1/4000稀释的生物素化的抗小鼠IgG2b(Imtech1090-08)，37℃下温育1小时30分钟。洗涤步骤后，将平板用PBS1％BSATween20中1/10000稀释的缀合的链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(ProzanP0397)温育30分钟。
对于比色显示，用0.1M柠檬酸缓冲液pH4.2中的对苯二胺(SigmaP4664)0.04％H2O20.03％溶液将平板在22℃下温育20分钟。用H2SO42N终止反应，在490-630nm对微量滴定板读数。
I.2.雪貂法
I.2.1.血细胞凝集抑制测试(HI)
测试程序
使用血细胞凝集抑制测试(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)血细胞凝集的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热灭活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血细胞凝集单位的每种流感病毒株温育。然后加入鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血细胞凝集的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平评分为等于5的滴度。
统计学分析
使用UNISTAT对HI滴度(41天，攻击前)进行统计学分析。用于方差分析的方法可如下简述：
■数据的对数转换
■对每个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性
■对单因素ANOVA的相互作用的检验
■用于多重比较的TukeyHSD检验
I.2.2.体温监测
在攻击期间用传感器并通过遥测法记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI(DataSciencesInternational，Centaurusweg123，5015TCTilburg，TheNetherlands)进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地图养在单独的笼中。
在攻击前4天直至攻击后7天每15分钟记录温度。
I.2.3.鼻清洗
通过在清醒动物的两个鼻孔中施用5mlPBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于干冰上的样品容器中。
鼻清洗液的病毒滴定
所有鼻样品都首先通过SpinX滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染物。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μlMDCK细胞(2.4×105个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育5-7天。
在5-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。
在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲染料的强度与病毒滴定测定结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截止值定义为未感染的对照细胞的OD平均值-0.3OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准差)。OD＜截止值时定义为阳性得分，相反，OD＞截止值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“ReedandMuench”测定，并表示为LogTCID50/ml。
I.3.猪方法
I.3.1.血细胞凝集抑制测试(HI)
测试程序
使用血细胞凝集抑制测试(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)血细胞凝集的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热灭活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将血清的2倍稀释液与4个血细胞凝集单位的每种流感病毒株温育。然后加入鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血细胞凝集的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平评分为等于5的滴度。
统计学分析
使用UNISTAT对HI滴度(41天，攻击前)进行统计学分析。用于方差分析的方法可如下简述：
■数据的对数转换
■对每个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性
■对单因素ANOVA的相互作用的检验
■用于多重比较的Tukey-HSD检验
I.4.评价人中免疫应答的测定
I.4.1.血细胞凝集抑制测定
使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta，USA(1991)描述的方法通过检测HI抗体测定免疫应答。
使用4个血细胞凝集抑制单位(4HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬浮液，用标准的和综合验证过的微量法对融化的冷冻血清样品进行抗体滴度检测。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。
评价所获血清的HI抗体水平。以1∶10起始稀释度开始制备连续稀释液(乘以因数2)，直至最终稀释度1∶20480。把显示完全抑制(100％)血细胞凝集的最高稀释步骤视为滴定终点。所有测定都以双份进行。
I.4.2.神经氨酸酶抑制测定
在包被胎球蛋白的微量滴定板中进行测定。制备2倍连续稀释的抗血清，与标准化量的甲型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。测试基于由胎球蛋白酶解释放神经氨酸的神经氨酸酶生物活性。在切下末端神经氨酸后，β-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出来。向各孔加入来自落花生的辣根过氧化物酶(HRP)标记的花生凝集素，其特异性结合半乳糖结构。可在含四甲基联苯胺(TMB)的底物反应中检测和定量结合凝集素的量。表明仍抑制病毒神经氨酸酶活性达至少50％的最高抗体稀释度为NI滴度。
I.4.3.中和抗体测定
对融化的冷冻血清样品进行中和抗体检测。包含在血清中的抗体的病毒中和以微量中和实验来测定。血清在测定中无需进一步处理即可使用。各个血清以三份重复进行测试。将标准化量的病毒与连续稀释的血清混合并温育，以使抗体结合病毒。然后将含限定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入病毒和抗血清的混合物中，于33℃温育。在温育期后，通过鸡红细胞的血细胞凝集显现病毒复制。利用ReedandMuench的方法计算血清的50％中和滴度。
I.4.4.通过细胞因子流式细胞术(CFC)评价细胞介导的免疫
如果与其对应抗原一起温育，外周血抗原特异性CD4和CD8T细胞可在体外被再刺激，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFN。因此，抗原特异性CD4和CD8T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞术计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或CD8T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8T细胞的频率。
I.4.5.统计方法
I.4.5.1.主要终点
·在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中主诉的局部和全身体征和症状的百分率、强度以及同接种的关联。
·在接种后的21天随访期(即接种日和随后20天)以及整个过程中无主诉的局部和全身体征和症状的百分率、强度以及同与接种的关联。
·整个研究过程中严重不良事件的发生。
I.4.5.2.次要终点
对于体液免疫应答：
观测变量：
·在0天和21天：血清血细胞凝集抑制(HI)和NI抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。
·在0天和21天：中和抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病病毒株的每一种测试。
衍生变量(采用95％置信区间)：
接种前和接种后采用95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMT)
·21天时采用95％CI的血清阳转率*
·21天时采用95％CI的转变因数**
·21天时采用95％CI的血清保护率***
·在所有时间点的血清NI抗体GMT(采用95％置信区间)
*血清转变率定义为相比于第0天，在第21天时针对每种疫苗株的血清HI滴度增加达至少4倍的疫苗接种者的百分率。
**转变因数定义为相比于第0天，在第21天时针对每种疫苗株的血清HIGMT的增加倍数。
***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于40(通常将其接受为指示保护作用)的疫苗接种者的百分率。
应当理解，对于一些临床试验，反应原性/安全性可以是次要终点，免疫原性可以是主要终点。
对于细胞介导的免疫(CMI)应答
观测变量
在第0天和21天：不同测试中每106当中细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试都对CD4/CD8T细胞针对以下物质的应答进行定量：
·肽流感(pf)抗原(这些抗原的精确性质和来源必须给出/解释)
·裂解流感(sf)抗原
·完整流感(wf)抗原
衍生变量：
·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞
·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞
·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞
I.3.5.3.免疫原性分析
免疫原性分析基于总接种队列。对于每个治疗组，计算以下参数(采用95％置信区间)：
·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
·在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
·21天时的转变因数
·21天时的血清转变率(SC)，定义为相比于第0天，在第21天时血清HI滴度增加至少4倍的接种者的百分率。
·21天时的保护率定义为血清HI滴度＝1∶40的疫苗接种者的百分率。
·在各个时间点(第0天、第21天)针对每个接种组和针对每种抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和完整流感(wf)抗原)总结作出应答的CD4/CD8T-淋巴细胞分泌的频率(描述统计)。
·在各5种不同测试中对于每个接种组和每种抗原(pf、sf和wf)，在时间点(接种后-接种前)之间个体应答差异的描述性统计。
·使用非参数检验(Kruskall-Wallis检验)比较3组之间的局部差异，以各5种不同测试计算每种抗原的统计学p-值。所有显著性检验都是双尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是统计学显著的。
实施例II-水包油乳液和佐剂制剂的制备
除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的油/水乳液由2种油(α-生育酚和鲨烯)组成的有机相和含Tween80TM或Polysorbate80TM作为乳化剂的PBS水相组成。除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的水包油乳液佐剂制剂都制成含以下的水包油乳液组分(给出终浓度)：2.5％鲨烯(体积/体积)、2.5％α-生育酚(体积/体积)、0.9％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(体积/体积)(Tween80)，参见WO95/17210。该乳液在随后的实施例中称为AS03，如下制备为2倍浓缩物。
II.1.乳液SB62的制备
该方法用于临床和临床前实施例部分报道的研究中。通过在强搅拌下混合由疏水组分(α-生育酚和鲨烯)组成的油相和含水溶性组分(阴离子型去污剂Tween80和PBSmod(改良型)，pH6.8)的水相，制备SB62乳液制备物。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转移至水相(9/10总体积)，于室温搅拌混合物15分钟。然后在微流化器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000PSI-8个循环，或在实施例III报道的临床试验中使用的佐剂中三个循环)，以产生亚微米油滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。然后使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将除菌的批量乳液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或氩气)通入SB62乳液最终批量容器的死体积中达至少15秒。
SB62乳液的最终组成如下：
Tween80：1.8％(体积/体积)19.4mg/ml；鲨烯：5％(体积/体积)42.8mg/ml；α-生育酚：5％(体积/体积)47.5mg/ml；PBS-mod：NaCl121mM，KCl2.38mM，Na2HPO47.14mM，KH2PO41.3mM；pH6.8±0.1。
实施例III-用含有裂解疫苗抗原制剂和两个剂量的AS03佐剂(Flu-LD-004)进行的年龄为18-59岁的成人群体中的临床试验
III.1.导言
在2006年，在年龄为18-59岁的成人群体中进行II期、对照的、随机化的单盲研究，以评价含有两个剂量的AS03佐剂的GlaxoSmithKlineBiologicals低剂量流感候选疫苗(即每株含5μgHA)的免疫原性、安全性和反应原性。
在肌内施用一剂以AS03为佐剂的疫苗后21天，测量体液免疫应答(即抗血细胞凝集素)。FluarixTM用作参照。
III.2研究设计
平行的三组受试者肌内接受以下疫苗：
■100个受试者的一组接受以AS03为佐剂的含5μgHA的低剂量裂解病毒流感疫苗的一次注射(FluLD1/1)
■100个受试者的一组接受以一半剂量的AS03(AS031/2)为佐剂的含5μgHA的低剂量裂解病毒流感疫苗的一次注射(FluLD1/2)
■100个受试者的一组接受一个剂量的FluarixTM(Fluarix)
方案：在第0天肌内注射1次流感疫苗，第0天和第21天进行研究地点随访，采血样(HI抗体测定)，在第30天额外进行电话联系(研究结束)。
在该研究中使用的标准三价裂解流感疫苗-FluarixTM是从2006/2007年开始可商购的疫苗，由GlaxoSmithKlineBiologicals开发并制造。
III.3.研究目标
III.3.1.主要目标
-在抗血细胞凝集素抗体滴度方面评价研究疫苗诱导的体液免疫应答：
在第0天和21天的观察变量：血清血细胞凝集抑制抗体滴度。
衍生变量(采用95％置信区间)：
-第0天和第21天的血清抗体的几何平均滴度(GMTs)
-第21天的血清转变率*
-第21天的血清转变因数**
-第0天和第21天的血清保护率***
*血细胞凝集素抗体应答的血清转变率定义为接种前滴度＜1∶10并且接种后滴度≥1∶40或接种前滴度≥1∶10，并且接种后滴度至少增加4倍的疫苗接种者
**血清转变因数定义为与第0天相比，接种后血清HIGMTs的增加倍数
***血清保护率定义为接种后血清HI滴度≥1∶40(其通常接受为表示保护作用)的疫苗接种者的百分比
III.3.2.次要目标
-在主诉的局部和全身不良事件、无主诉的不良事件和严重不良事件方面评价研究疫苗的安全性和反应原性：
1.在每个组的每次接种后，在7天随访期(即接种日和随后6天)中主诉的局部和全身体征和症状的发生率、强度以及同接种的关联。
2.在每个组的每次接种后，在30天随访期(即接种日和随后29天)中主诉的局部和全身体征和症状的发生率、强度以及同与接种的关联。
3.每个组中整个研究阶段中严重不良事件的发生和关联。
III.4.疫苗组合物和施用
III.4.1.疫苗制备
不含佐剂的流感疫苗是三价裂解病毒体，即由三个单价病毒抗原成分(分别由流感病毒株A/H1N1，A/H3N2和B制备)组成的灭活的流感疫苗。存在于该疫苗中的抗原与市场上从1992年开始作为FluarixTM 可获得的批准的FluarixTM疫苗相同，并且每个剂量含有15μgHA/株。包含在FluLD临床批中的流感疫苗是选自2006/2007北半球的株：
●A/NewCaledonia/20/99(H1N1)样株：A/NewCaledonia/20/99(H1N1)IVR-116
●A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样株：A/Wisconsin/67/2005(H3N2)NYMCX-161
●B/Malaysia/2506/2004。
抗原来源于卵生长的病毒。在灭活步骤前用脱氧胆酸钠进行裂解，这是通过随后脱氧胆酸钠和甲醛的作用进行的。
以AS03为佐剂的低剂量流感(FluLD)疫苗(临床批)是基于商购的FluarixTM疫苗(分别从流感病毒株A/H1N1，A/H3N2和B制备)，但含有更低的抗原含量并且以GSK佐剂系统AS03为佐剂。AS03由含有两种生物可降解的油，即鲨烯和α-生育酚(维生素E)和表面活性剂polysorbate80(Tween80)的水包油乳液(SB62)组成。通过简单将样品与乳液混合，将流感抗原掺入佐剂系统的水相中。测试了两种制剂，其差异是疫苗批次中与流感抗原一起引入的佐剂的量。含佐剂的疫苗含有每个剂量每种流感病毒株5μg血细胞凝集素(HA)，与全剂量(AS03)或一半剂量(AS031/2)的佐剂系统AS03组合。赋形剂如下：polysorbate80(Tween80)，octoxynol10(TritonX-100)，α-生育酚基琥珀酸氢酯(Tocopherylhydrogensuccinate)，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾，注射用水。以AS03为佐剂的低剂量流感疫苗(FluLD，全剂量或半剂量的AS03)是不含防腐剂的疫苗。但是，它们含有来自制造过程早期的痕量柳硫汞(每个剂量＜1.25μgHg)。它们都以0.5ml/剂量的体积在玻璃(I型)预填充的注射器中提供。
III.4.1.1.AS03为佐剂的流感疫苗的组成
一个剂量的FluLD(全剂量或半剂量的AS03)相应于0.5ml。表3中提供了组成。对于两种制剂，每剂量的HA含量都是5μg，唯一的差别是存在于最终容器中的AS03的量。
表3以AS03为佐剂的低剂量流感疫苗的组成(全剂量和半剂量的AS03)
缩写：HA＝血细胞凝集素
当使用AS03全剂量时，Polysorbate80的总含量相应于每个剂量4.972mg，当使用AS03半剂量时，相应于每个剂量2.547mg。
III.4.1.2.裂解灭活的流感抗原制剂的制备
流感抗原与FluarixTM(流感病毒疫苗)中包含的那些相同。单价成分由从三种流感病毒株，即甲型(H1N1和H3N2)和乙型株的工作种子制备的纯化的灭活分离病毒组成，所述病毒分别在具胚的母鸡蛋中生长。这些工作种子来自从WHO合作中心接受的病毒株，并且按照WHO的年度推荐。作为举例，用于制备抗原参照的方法是WO02/097072中给出的方法。三种单价成分的体积是基于在配制前每种单价成分中测量的HA含量以及基于目标制造体积。
在注射用水中稀释10倍浓缩的磷酸缓冲盐水(当1倍浓缩时是pH7.4)，将Tween80和α-生育酚基琥珀酸氢酯的预混合物，然后室温下搅拌5-30分钟。
然后将三个浓缩的单价成分在得到的磷酸缓冲盐水/Tween80-α-生育酚基琥珀酸氢酯溶液中连续稀释到以下浓度：
每mL中间三价成分(5μgHA每种甲型单价成分和5.83μgHA的乙型/500μl三价最终成分)中
20μgHA每种甲型单价成分(H1N1，H3N2)
23.32μgHA乙型单价成分。
在加入每个单价成分之间，将混合物在室温下搅拌10-30分钟，加入最后的单价成分后，搅拌15-30分钟。
这种也称作“预合并物”的中间三价成分可以在+2-+8℃下保持，或在同一天进一步加工到最终制剂步骤。预合并物的最终体积是每个剂量250μl。
III.4.1.3.含有AS03佐剂的疫苗组合物的制备
含佐剂的疫苗：LDAS031/1(表4)
将10倍浓缩的PBSmod(当1倍浓缩时pH7.4；137mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HPO4，1.47mMKH2PO4，pH7.4)和含有Tween80，TritonX-100和VES(含量考虑了病毒株中存在的去污剂)的混合物加入注射用水中。搅拌5-30分钟后，加入每ml每种病毒株H1N1和H3N220μgHA和每ml乙型株23.32μgHA，每次添加之间搅拌10-30分钟。搅拌15-30分钟后，弃去小体积的所谓的“中间成分”用于分析，并且在+2-+8℃储存。中间成分是在1倍浓缩的PBSmod中。目标的去污剂浓度是每ml488μgTween80，每ml73.6μgTritonX-100和每ml66.6μgVES。
然后制备最终制剂：将等体积的SB62(参见实施例II中的制备)加入每个250μl的预合并物中间成分，室温下混合30-60分钟。检查pH到6.8-7.5的范围。用氮气吹扫制剂，然后在提交之前在+2-8℃储存。
表4AS03为佐剂的低剂量疫苗
(1)：缓冲液最终成分组成是：137mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HPO4，1.47mMKH2PO4，pH7.4
含佐剂的疫苗：LDAS031/2(表5)
将10倍浓缩的PBSmod(当1倍浓缩时pH7.4；参见上文的组成)和含有Tween80，TritonX-100和VES(含量考虑了病毒株中存在的去污剂)的混合物加入注射用水中。搅拌5-30分钟后，加入每ml每种病毒株H1N1和H3N220μgHA和每ml乙型株23.32μgHA，每次添加之间搅拌10-30分钟。搅拌15-30分钟后，弃去小体积的所谓的“中间成分”用于分析，并且在+2-+8℃储存。PBSmod在中间成分中1倍浓缩。目标的去污剂浓度是每ml488μgTween80，每ml73.6μgTritonX-100和每ml66.6μgVES。
然后制备最终制剂：首先用PBSmod缓冲液稀释SB62，室温下搅拌15-30分钟。然后将等体积的该稀释的SB62加入每个250μl的中间成分的预合并物，室温下搅拌30-60分钟，检查pH到6.8-7.5的范围。用氮气吹扫制剂，然后在提交之前在+2-8℃储存。
两种制剂的最终体积都是每个剂量500μl，最终HA浓度是每ml三价最终成分中10μg每种甲型单价成分和11.66μg乙型单价成分。最终的Tween80，TritonX-100(来自H3N2单价成分制造的残留物)和α-生育酚基琥珀酸氢酯(α-生育酚基琥珀酸氢酯是RRR(D异构体)-α-生育酚的酯)目标浓度分别是244μg/ml，58.6μg/ml和33.3μg/ml。
表5AS03为佐剂的低剂量疫苗(一半剂量的佐剂)
(1)：缓冲液最终体积是：137mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HPO4，1.47mMKH2PO4，pH7.4
III.4.2.疫苗施用
将疫苗填充到1.25-ml无菌1型(Ph.Eur.)玻璃注射器中。每个注射器填充到0.57ml的目标(范围：0.54-0.60ml)。疫苗肌内施用于非惯用臂的三角肌区。所有疫苗都作为预填充的注射器(0.5ml)存在。为了确保疫苗的适当肌内注射，使用至少25G和长度为至少2.5cm的针头。
III.5研究群体结果
该研究总共招录了300名受试者：三组中每组各100个受试者。总接种队列的平均年龄在接种时为36.7岁，标准差是13.67随。受试者的平均年龄和性别分布在3个疫苗组之间是相似的。
III.6免疫原性结果
在免疫原性的ATP队列(297个受试者)上进行免疫原性的分析
体液免疫应答
为了评价以AS03为佐剂的低剂量流感候选疫苗诱导的体液免疫应答，对于每个治疗组，计算以下参数(采用95％置信区间)：
第0和21天的所有抗体滴度的几何平均滴度(GMTs)；
第21天的血清转变率(SC)；
第21天的转变因数；
第0和21天的保护率。
III.6.1HI几何平均滴度(GMT)
采用95％CI的HI抗体的GMTs示于表6和图1。各组之间调整的GMT比值示于表7。
在3个治疗组中，所有3种疫苗株的HI抗体的接种前GMTs在相同的范围内。对于所有三种株，在含佐剂的组中第21天观察到的GMTs比Fluarix组高，对于A/Wisconsin疫苗株，在FluLD1/1和Fluarix之间有统计学差异(95％CIs没有重叠，并且调整的GMT比不含有值1)。对于B/Malaysia疫苗株，在FluLD1/2和Fluarix之间观察到了统计学差异(调整的GMT比不含有值1)。
表6-第0和21天抗HA抗体的血清阳性率和几何平均滴度(GMTs)(免疫原性的ATP队列)
FluLD1/1＝含有全剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
GMT＝几何平均抗体滴度
N＝具有可获得的结果的受试者的数目
n/％＝血清阳性(HI滴度＞＝1∶10)受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
MIN/MAX＝最小值/最大值
PRE＝第0天接种前
PI(D21)＝第21天接种后
表7-第21天每种疫苗株的组之间调整的GMT比(免疫原性的ATP队列)
FluLD1/1＝含有全剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
调整的GMT＝针对基线滴度调整的几何平均抗体滴度
N＝可以获得接种前和接种后结果的受试者的数目
95％CI＝调整的GMT比值的95％置信区间(Ancova模型：针对基线滴度的调整-两个以上组合并的方差)；LL＝下限，UL＝上限
III.6.2抗HI抗体滴度的血清转变因数、血清保护率和血清转变率(人中流感疫苗建立的保护的相关性)
血清保护率的结果提供在表8-图2，血清转变率的结果提供在表9-图3，转变因数的结果提供在表10-图4。
在所有组中(至少94.9％)达到了欧洲权威机构要求的血清保护率阈值(70％)。对于每种疫苗株，3个组的第21天的血清保护率在相同的范围内。
在所有组中(至少65％)达到了欧洲权威机构要求的血清转变率的阈值(40％)。
对于A/NewCaledonia疫苗株，3个组在第21天的SCR在相同的范围内。
对于A/Wisconsin疫苗株，FluLD1/1组在第21天的SCR与Fluarix组相比倾向于更高。FluLD1/2组第21天的SCR与Fluarix组相比在相同的范围内。
对于B/Malaysia疫苗株，FluLD1/2组在第21天的SCR与Fluarix组相比倾向于更高。FluLD1/1组第21天的SCR与Fluarix组相比在相同的范围内。
在所有组中(至少6.2)，达到了欧洲权威机构要求的血清转变因数阈值(2.5)。
对于A/NewCaledonia疫苗株，3个组在第21天的SCR看起来在相同的范围内。观察到的FluLD1/2组的值低于对Fluarix组观察到的值，但是可以通过FluLD1/2组中接种前血清保护率更高来解释。
对于A/Wisconsin疫苗株，FluLD1/1组在第21天的SCF与Fluarix组相比倾向于更高。FluLD1/2组第21天的SCF与Fluarix组相比在相同的范围内。
对于B/Malaysia疫苗株，与Fluarix组相比，两个含佐剂组在第21天的SCF倾向于更高。
表8-第0天和21天HI抗体的血清保护率(SPR)(免疫原性的ATP队列)
FluLD1/1＝含有全剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
Fluarix＝Fluarix，疫苗
N＝具有可获得的结果的受试者的数目
n/％＝血清保护的(HI滴度＞＝401/DIL)受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
PRE＝接种前第0天
PI(D1)＝接种后第21天
数据源＝附表IIA
表9-第21天HI抗体滴度的血清转变率(SCR)(免疫原性的ATP队列)
FluLD1/1＝含有全剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
血清转变率定义为：
对于最初血清阴性的受试者，接种后抗体滴度＞＝401/DIL
对于最初血清阴性的受试者，接种后抗体滴度＞＝接种前抗体滴度的4倍
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者的数目
n/％＝血清转变的受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
表10-第21天HI抗体滴度的血清转变因数(SCF)(免疫原性的ATP队列)
FluLD1/1＝含有全剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
FluLD1/2＝含有半剂量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5ugHA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者的数目
SCF＝血清转变因数或几何平均比值(平均值[log10(PI(D21)/PRE)])
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
III.7安全性结论
与Fluarix组相比，含佐剂的疫苗组中主诉的(局部/全身)和无主诉的症状方面更高的反应原性是在本研究中观察到的总体倾向。含佐剂的疫苗中AS03含量的减少对所有全身和局部3级症状具有显著影响。
与Fluarix组(35％)相比，含佐剂的疫苗组(55％和47％的受试者)中无主诉的症状的发生率倾向于更高。
从这些结果，可以概括出候选疫苗的反应原性和安全性谱是满意的和临床可接受的。
III.8.总体结论
III.8.1.免疫原性结果
本研究的主要目的是评估通过含有两种不同浓度的AS03佐剂的低剂量流感疫苗和通过Fluarix诱导的体液免疫应答(抗HI抗体滴度)。
在第21天，三种疫苗超过了欧洲权威机构对裂解病毒体流感疫苗的年度规定(“NoteforGuidanceonHarmonisationofRequirementsforinfluenzaVaccines”fortheimmuno-logicalassessmentoftheannualstrainchanges-CPMP/BWP/214/96)。与Fluarix组相比，含佐剂的组中的GMTs倾向于更高，对于A/Wisconsin(FluLD1/1vs.Fluarix)和B/Malaysia疫苗株(FluLD1/2vs.Fluarix)观察到了统计学显著差异。在所有三个疫苗组中观察到了相似的血清保护率，范围是94.9％-99％。发现含佐剂的组中血清转变率和血清转变因数高于Fluarix组。来自该试验的数据也揭示了含有一半剂量的AS03佐剂的疫苗诱导的免疫原性与用全剂量佐剂诱导的免疫原性相似。
III.8.2.反应原性和安全性结果
以AS03为佐剂的低剂量流感候选疫苗的施用在研究组，即年龄为18-59岁的成年人中是安全的和临床上耐受良好的。含半剂量佐剂的疫苗与含全剂量佐剂的疫苗相比，在主诉的局部和全身症状的发生率方面显示显著减少。
实施例IV-含佐剂的和不含佐剂的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)在激发的BALB/c小鼠中的临床前评价
IV.1.实验设计和目的
在流感激发的小鼠中进行了实验，以便通过AS03，评价用这种水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的体液应答的增加。为了更接近人类状况(大约每两年内由于漂移株的重复感染而血清阳性的人)，用异亚型株激发的动物进行该实验。与用同型株激发相比，异亚型激发也是更严格的模型，并且是区分不同佐剂的更好模型。
IV.1.1.处理/组(表11)
在第0天用三价完整、福尔马林灭活的流感病毒(每株5μgHA)鼻内激发(20μl体积)各个27只成年雌性BALB/c小鼠的组。激发株由包含在疫苗中的株的更早漂移变体(5μgHA完整的灭活H1N1A/Johannesburg/82/96，H3N2A/Sydney/5/97，B/Harbin/7/94)组成。28天后，用总体积为50μl的单个剂量的疫苗候选物肌内接种小鼠。用含单独的裂解抗原的制剂(三价裂解普通)或以两个剂量的AS03(全剂量或1/5)为佐剂的含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的株包括H1N1A/NewCaledonia/20/99，H3N2A/Panama/2007/99，B/Shangdong/7/97病毒抗原(1.5μg/株，人类剂量的1/10th)。
表11
Gr 抗原/制剂 其他处理
1 三价裂解/普通(不含佐剂的) 异源激发D0
2 三价裂解/AS03 异源激发D0
3 三价裂解/AS03 1/5 异源激发D0
IV.1.2.制备疫苗制剂
制备Tween80，TritonX100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中实现750μg/mlTween80，110μg/mlTritonX100和100μg/mlVES的终浓度。用于预混合物中的量是考虑去污剂的量和病毒株中已经存在的VES量计算的。
制备1升10倍浓缩的盐水缓冲液(PBSpH7.4)：在0.8001注射用水中，加入NaCl80g，KCl2g，Na2HPO411.44g，KH2PO42g。溶解后，用注射用水调节到1.0L。当10倍稀释时，pH将是7.4。
三价裂解/普通
根据以下顺序临时制备一个50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(10倍浓缩的PBSpH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟+1.5μgHAH1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μgHAH3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μgHAB株，室温下磁力搅拌15分钟。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
三价裂解/AS03
制备Tween80，TritonX100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中实现750μg/mlTween80，110μg/mlTritonX100和100μg/mlVES的终浓度。用于预混合物中的量是考虑去污剂的量和病毒株中已经存在的VES量计算的。
根据以下顺序临时制备一个50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(10倍浓缩的PBSpH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+1.5μgHAH1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μgHAH3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μgHAB株，室温下磁力搅拌15分钟，对于全剂量AS03+25μlSB62，或对于1/5剂量AS03，+5μlSB62乳液，室温下磁力搅拌15分钟。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
IV.1.3.读出结果(表12)
在免疫前(第28天)和免疫后14天测量对接种的体液免疫应答(27只小鼠/组)。通过血细胞凝集抑制(HI)测试，测试血清样品。
表12
读出结果 时间点 样品类型 分析方法
体液应答 第28天，第42天 血清 IHA
IV.2.结果
IV.2.1.体液免疫
在图5中显示结果。在这种异亚型激发后单次免疫的小鼠模型中，显示了AS03及其稀释液与普通疫苗相比诱导更高的HI滴度。对于甲型流感病毒株，观察到了HI滴度的统计学显著的增加(p＜0.05)。对于H1N1株，在AS03和AS031/5之间也观察到了HI滴度的显著差异(p＜0.05)。与普通疫苗相比，降低剂量的AS03不能增加对乙型株的HI滴度。对于乙型株(B/Shangdong)观察到了非常低的应答；这可能是由于用于激发和疫苗的乙型株之间的显著抗原性漂移。
IV.3.结果的概括和结论
概括起来，与普通疫苗相比，当使用以AS03为佐剂的疫苗时，用异亚型株激发的动物中观察到了HI滴度的增加。对于获得抗所有三种流感疫苗株的强HI滴度来说，全剂量的AS03是最优的。
实施例V-含佐剂的和不含佐剂的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)在激发的C57Bl/6小鼠中的临床前评价
V.1.实验设计和目的
在流感激发的小鼠中进行了实验，以便通过AS03，评价用这种水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的体液和细胞应答的增加。
为了模拟人类状况，用异亚型株激发的小鼠进行该实验。
V.1.1.处理/组(表13)
在第0天用三价完整、福尔马林灭活的流感病毒(每株5μgHA)鼻内激发(20μl体积)各个25只成年雌性C57Bl/6小鼠的组。激发株由包含在疫苗中的株的更早漂移变体(5μgHA完整的灭活H1N1A/Beijing/262/95，H3N2A/Panama/2007/99，B/Shangdong/7/97)组成。28天后，用总体积为100μl的单个剂量的疫苗候选物肌内接种小鼠。用含单独的裂解抗原的制剂(三价裂解普通)或以三个剂量的AS03(全剂量、1/2或1/5)为佐剂的含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的株包括H1N1A/NewCaledonia/20/99，H3N2A/NewYork/55/2004，B/Jiangsu/10/2003病毒抗原(1.5μg/株，人类剂量的1/10th)。
表13
Gr 抗原/制剂 其他处理
1 三价裂解/普通(不含佐剂的) 异源激发D0
2 三价裂解/AS03 异源激发D0
3 三价裂解/AS03 1/2 异源激发D0
4 三价裂解/AS03 1/5 异源激发D0
5 PBS 异源激发D0
V.1.2.制备疫苗制剂
三价裂解/普通
根据以下顺序临时制备一个100μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备的10倍浓缩的PBSpH7.4)+FluarixLotDFLUA014(在最终剂量中1.5μg/株)。
三价裂解/AS03
根据以下顺序临时制备100μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备的10倍浓缩的PBSpH7.4)+FluarixLotDFLUA014(在最终剂量中1.5μg/株)，对于全剂量+25μlSB62乳液，或对于1/2剂量+12.5μlSB62，或对于1/5剂量+5μlSB62乳液。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
V.1.3.读出结果(表14)
在免疫后21天测量对接种的体液免疫应答(10只小鼠/组)，通过血细胞凝集抑制(HI)测试，测试血清样品。通过细胞内细胞因子染色(ICS)，在免疫后7天测试细胞免疫应答(每组15只小鼠)。
表14
读出结果 时间点 样品类型 分析方法
体液应答 第49天 血清 IHA
细胞应答 第35天 PBMCs ICS
V.2.结果
V.2.1.体液免疫(10只小鼠/组).
结果显示在图6中。在这种异亚型激发然后单次免疫的小鼠模型中，显示了AS03及其稀释液(1/2和1/5)与普通疫苗相比诱导更高的HI滴度。对于三种病毒株，在接受以全剂量AS03或降低剂量的AS03为佐剂的疫苗的小鼠之间没有观察到HI滴度的差异。
V.2.2.细胞免疫(15只小鼠/组).
结果显示在图7中。无论AS03的稀释度如何，与用三价裂解普通疫苗免疫的小鼠相比，用以AS03为佐剂的三价裂解疫苗免疫的小鼠中观察到了更高的CD4+T细胞应答。与用以全剂量AS03为佐剂的三价裂解疫苗免疫的小鼠中诱导的应答相比，当用以更低剂量的AS03为佐剂的三价裂解疫苗免疫小鼠时，观察到了更低细胞应答的趋势。
V.3.结果的概括和结论
概括起来，与普通疫苗相比，当使用以AS03为佐剂的疫苗时，用异亚型株激发的动物中观察到了体液和细胞应答的增加。在用全剂量或部分剂量的AS03佐剂免疫的小鼠之间观察到了相似强度的体液应答。但是，佐剂剂量的减少与CD4+T细胞应答的强度降低的趋势相关。
实施例VI-含佐剂的和不含佐剂的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和低剂量抗原)在激发的C57Bl/6小鼠中诱导的细胞免疫应答的临床前评价
VI.1.实验设计和目的
在流感激发的小鼠中进行了实验，以便通过AS03，评价含低剂量抗原(0.5μg/株，人类剂量的1/30th)并且用这种水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的细胞免疫应答的增加。
为了模拟人类状况，用异亚型株激发的小鼠进行该实验。
VI.1.1.处理/组(表15)
在第0天用三价完整、福尔马林灭活的流感病毒(每株5μgHA)鼻内激发(20μl体积)各个15只成年雌性C57Bl/6小鼠的组。激发株由包含在疫苗中的株的更早漂移变体(5μgHA完整的灭活H1N1A/Beijing/262/95，H3N2A/Panama/2007/99，B/Shangdong/7/97)组成。28天后，用总体积为50μl的单个剂量的疫苗候选物肌内接种小鼠。用含单独的裂解抗原的制剂(普通三价裂解)或以三个剂量的AS03(全剂量、1/2或1/5)为佐剂的含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的株包括H1N1A/NewCaledonia/20/99，H3N2A/NewYork/55/2004，B/Jiangsu/10/2003病毒抗原(0.5μg/株，人类剂量的1/30th)。
表15
Gr 抗原/制剂 其他处理
1 三价裂解/普通(不含佐剂的) 异源激发D0
2 三价裂解/AS03 异源激发D0
3 三价裂解/AS03 1/2 异源激发D0
4 三价裂解/AS03 1/5 异源激发D0
5 PBS 异源激发D0
VI.1.2.制备疫苗制剂
三价裂解/普通
根据以下顺序临时制备一个50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备的10倍浓缩的PBSpH7.4)+FluarixLotDFLUA014(在最终剂量中0.5μg/株)。
三价裂解/AS03
根据以下顺序临时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备的10倍浓缩的PBSpH7.4)+FluarixLotDFLUA014(在最终剂量中0.5μg/株)，对于全剂量+25μlSB62乳液，或对于1/2剂量+12.5μlSB62，或对于1/5剂量+5μlSB62乳液。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
VI.1.3.读出结果(表16)
通过细胞内细胞因子染色，在免疫后7天测试细胞免疫应答。
表16
读出结果 时间点 样品类型 分析方法
细胞应答 第35天 PBMCs ICS
VI.2.结果
VI.2.1.细胞免疫
结果显示在图8中。与用三价裂解普通疫苗免疫的小鼠相比，用以AS03(全剂量或1/2剂量)为佐剂的三价裂解疫苗免疫的小鼠中观察到了稍微更高的CD4+T细胞应答。与用三价裂解普通疫苗或以全剂量或半剂量AS03为佐剂的三价裂解疫苗免疫的小鼠诱导的应答相比，当用以1/5剂量的AS03为佐剂的三价裂解疫苗免疫小鼠时，观察到了更高细胞应答。
VI.3.结果的概括和结论
概括起来，与普通疫苗相比，当使用以AS03为佐剂的疫苗时，在异亚型株激发的动物中观察到了CD4+T细胞应答的微小增加。在该实验中没有观察到佐剂剂量反应，并且实际上1/5AS03剂量比用更高佐剂剂量时诱导了更高频率的抗原特异性CD4+T细胞。总体上，这些用每株0.5μgHA产生的数据与用每株1.5μgHA产生的其他临床前实验的数据不相似。
实施例VII-含佐剂的和不含佐剂的裂解H5N1疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和抗原)在幼稚C57Bl/6小鼠中的临床前评价
VII.1.实验设计和目的
进行了H5N1小鼠中的实验，以便通过AS03，评价用这种水包油佐剂配制的H5N1裂解疫苗诱导的体液和细胞免疫应答的增加。在大流行的情况下，预期全世界人群对于新循环的大流行流感病毒株都是免疫学幼稚的。由于这种幼稚的免疫状态，大流行疫苗可能需要两剂疫苗来保护个体免受新的流感病毒株导致的感染和严重疾病。为了代表这种缺乏前期暴露的状况，开发了幼稚小鼠模型来评估疫苗免疫原性。
VII.1.1.处理/组(表17)
在第0天和第21天用大流行H5N1疫苗候选物以50μl的总体积肌内免疫各个15只成年雌性幼稚C57Bl/6小鼠的组。用含有单独的裂解H5N1抗原(H5N1裂解普通疫苗)的制剂或以不同剂量的AS03(双倍、全剂量、1/2或1/5)为佐剂的含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的株包括H5N1A/Vietnam/1194/04病毒抗原(1.5或0.38ug/株，相应于人类剂量的1/10th)。
没有用双倍AS03剂量进行配制，而是同时注射1次50μlH5N1裂解/AS03全剂量+1次50μl剂量AS03。
表17
Gr 抗原/制剂 抗原剂量
1 H5N1裂解/普通(不含佐剂的) 1.5μg
2 H5N1裂解/双倍剂量AS03 1.5μg
3 H5N1裂解/AS03 1.5μg
4 H5N1裂解/AS03 1/2 1.5μg
5 H5N1裂解/AS03 1/5 1.5μg
6 H5N1裂解/普通(不含佐剂的) 0.38μg
7 H5N1裂解/双倍剂量AS03 0.38μg
8 H5N1裂解/AS03 0.38μg
9 H5N1裂解/AS03 1/2 0.38μg
10 H5N1裂解/AS03 1/5 0.38μg
11 PBS
VII.1.2.制备疫苗制剂
制备1升最终容量缓冲液(PBSpH7.2±0.2)：在0.800l注射用水中，加入NaCl7.699g，KCl0.200g，MgCl2x6H2O0.100g，Na2HPO4x12H2O2.600g，KH2PO40.373g。溶解后，用注射用水调整到1.0L。
H5N1裂解/普通
制备50μl剂量：
将柳硫汞(考虑其在病毒株中的浓度的量)和TritonX100加入最终容积缓冲液中。没有加入Tween80，因为病毒株的Tween浓度达到了制剂中的含量目标。最终浓度是在1.5μg制剂剂量中，柳硫汞10μg/ml，Tween80368μg/ml，TritonX10035μg/ml。0.38μg制剂剂量中有10μg/ml柳硫汞，93μg/mlTween80和8.9μg/mlTritonX100。磁力搅拌5-30分钟后，加入1.5或0.38μgHA(H5N1株)。将制剂搅拌30-60分钟。检查pH。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
H5N1裂解/AS03
制备50μl剂量：
将柳硫汞(考虑其在病毒株中的浓度的量)和TritonX100加入最终容积缓冲液中。没有加入Tween80，因为病毒株的Tween浓度达到了制剂中的含量目标。最终浓度是在1.5μg制剂剂量中，柳硫汞10μg/ml，Tween80368μg/ml，TritonX10035μg/ml。0.38μg制剂剂量中有10μg/ml柳硫汞，93μg/mlTween80和8.9μg/mlTritonX100。磁力搅拌5-30分钟后，加入1.5或0.38μgHA(H5N1株)。将制剂搅拌30-60分钟后，加入25或12.5或5μlSB62乳液。将制剂搅拌30-60分钟。检查pH。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
VII.1.3.读出结果(表18A)
在免疫(10只小鼠/组)后14天通过抗Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度测量体液免疫应答(图9，A-F)。也在免疫(10只小鼠/组)后21天通过抗H5N1血细胞凝集抑制测定测量体液免疫应答(图10，A-B)。
在免疫(每组3只小鼠的5个集合)后6天通过流式细胞术计数的抗原特异性CD4+T细胞的细胞内细胞因子染色(ICS)测试细胞免疫应答(图11，A-B)。
表18A
VII.2.结果
VII.2.1.体液免疫应答：ELISA和同种型。
结果显示在图9和表18B中。
表18B
在每个剂量的H5N1裂解疫苗，与不含佐剂的H5N1裂解疫苗相比，所有含佐剂的组都诱导了更高的抗H5N1Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度(图9-A-F)。在每个剂量的H5N1裂解疫苗，抗H5N1IgG1抗体应答比抗H5N1IgG2b抗体应答高4-5倍(图9-C-F)。采用剂量为1.5μgHA的H5N1裂解疫苗，并且与每种剂量的佐剂组合，没有观察到抗H5N1Ig、IgG1和IgG2b抗体应答的差异(图9-A、C和E)。
采用剂量为0.38μgHA的H5N1裂解疫苗，与用以AS03/2(p＝0.7315)和AS031/5(p＝0.9744)为佐剂的H5N1裂解疫苗诱导的应答相比，在用以2倍全剂量为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫后获得了更高抗H5N1Ig滴度的趋势(图9-B)。对于抗H5N1IgG1抗体应答也观察到了该趋势(图9-D)。但是，该权重不足以观察统计学显著的差异(对于1.7倍差异是25％权重，对于2倍差异是47％)。
VII.2.2.体液免疫应答：HI滴度
采用1.5μgHA/小鼠的剂量：
在每个佐剂剂量，与用不含佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中获得的应答相比，所有用以AS03为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠都诱导了更高的HI滴度(图10-A)。当H5N1裂解疫苗以一定剂量范围的AS03为佐剂时，没有观察到统计学显著的HI滴度差异(图10-A)。
采用0.38μgHA/剂的剂量
在每个佐剂剂量，与用不含佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中获得的应答相比，所有用以AS03为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠都诱导了更高的HI滴度(图10B)。
与用以AS03/2为佐剂的H5N1裂解疫苗获得的应答相比，用以2倍全剂量AS03为佐剂的H5N1裂解疫苗观察到了显著更高的HI滴度(对于4倍差异，p＝0.032)(图10B)。
在用以2倍全剂量AS03或全剂量AS03为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中或在用以AS03/2或AS03/5为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间没有观察到HI滴度的统计学显著的差异(图10B)。
抗原剂量之间的比较(1.5μg或0.38μg)：
在用以AS03、AS03/2或AS03/5为佐剂的每个HA剂量的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间没有观察到HI滴度的统计学显著的差异，但是用以AS03/5为佐剂的1.5μgHA裂解H5N1免疫的小鼠与用以2倍全剂量AS03为佐剂的0.38μgHA裂解H5N1免疫的小鼠之间除外，其中前者显示了显著更低的HI滴度(p＝0.01)(图10)。
VII.2.3.细胞免疫应答
为了评价三价季节性流感疫苗诱导的细胞免疫应答，将每株1μgHA的裂解抗原用于再刺激CD4T细胞。为了保持单价H5N1流感疫苗的相同再刺激条件，将3μgHA单价裂解抗原用于该实验。该浓度也显示对于区分不同的佐剂是最优的。结果示于图11。
在每个剂量的H5N1裂解疫苗(1.5或0.38μg)，与用不含佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠相比，在用以各种剂量的AS03为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中观察到了更高的CD4+T细胞应答。
在1.5μgH5N1裂解疫苗的剂量，AS03剂量的减少相应于CD4+T细胞频率的减少(图11A)。但是，在0.38μgH5N1裂解疫苗的剂量，在用以AS03为佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中，在不同的佐剂剂量之间没有观察到CD4+T细胞应答的差异(图11B)。
VII.3.结果的概括和结论
小鼠中的免疫原性研究显示，含佐剂的H5N1裂解疫苗比不含佐剂的H5N1裂解疫苗诱导了显著更高的体液(抗H5N1ELISA和HI滴度)和细胞(CD4+T细胞)应答。
对于含佐剂的1.5μg和0.38μgH5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间的体液免疫应答，没有观察到抗原剂量反应效果(除了VII.2.2部分中提到的两组)，表明在佐剂存在下，可能需要甚至更低剂量的HA就可以在该模型中观察到剂量反应效果。
与普通H5N1疫苗相比，当使用AS03为佐剂的H5N1大流行疫苗时在幼稚小鼠中观察到了CD4+T细胞应答的强增加。当0.38μg剂量的H5N1裂解疫苗用作疫苗候选物时，没有观察到AS03稀释的影响，而当1.5μgH5N1裂解疫苗以减少剂量的AS03为佐剂时，观察到了CD4T细胞应答的减少。
如前面所观察到的，用以全剂量AS03或AS03/2为佐剂的H5N1裂解疫苗(在任一种抗原剂量)免疫的小鼠之间没有观察到体液和细胞免疫应答的差异。当疫苗制剂中使用2倍全剂量的AS03时检测到了免疫应答的一些增强，因此，当AS03/5用于疫苗制剂时，检测到了免疫应答的减少。
总体上，本文报道的数据支持了这种新的佐剂系统在这种疫苗制剂中的效能。
实施例VIII-含佐剂的和不含佐剂的流感疫苗在激发的大白猪中的临床前评价
VIII.1.实验设计和目的
在流感激发的猪中进行了实验，以便通过AS03评价用这种水包油佐剂配制的流感疫苗诱导的的体液应答的增加。
使用了猪，以便在接近人的动物模型中评价AS03的剂量范围。猪显示了广泛的生物类似性，使得这种动物在生理学上最接近人，而只有非常少的例外(DouglasR.，1972)。此外，通常观察到了流感感染在猪中的表现。
VIII.1.1.处理/组(表19)
在第0天用三价完整、福尔马林灭活的流感病毒(每株25μgHA)以200μl的总体积肌内免疫各个10只成年雌性大白猪的组。激发株由与疫苗株同源的株组成(25μgHA完整的灭活H1N1A/NewCaledonia/20/99，H3N2A/Panama/2007/99和B/Shangdong/7/97)。28天后，用单剂疫苗候选物以500μl的总体积肌内接种猪。用含有单独的裂解抗原的制剂(三价裂解普通)或以一定剂量范围的AS03(全剂量、1/2或1/5)为佐剂的含裂解抗原的制剂免疫猪。用于免疫的株包括H1N1A/NewCaledonia/20/99，H3N2A/Panama/2007/99和B/Shangdong/7/97病毒抗原(在一个人类剂量中，H1N1A/NewCaledonia/20/99株，H3N2A/Panama/2007/99株是15μg，B/Shangdong/7/97株是17.5μg)。
表19
Gr 抗原/制剂 其他处理
1 三价裂解/普通(不含佐剂的) 同源激发D0
2 三价裂解/AS03 同源激发D0
3 三价裂解/AS03 1/2 同源激发D0
4 三价裂解/AS03 1/5 同源激发D0
VIII.1.2.制备疫苗制剂
三价裂解/普通
制备Tween80，TritonX100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中实现750μg/mlTween80，110μg/mlTritonX100和100μg/mlVES的终浓度。用于预混合物中的量考虑了它们在病毒株中的含量。
根据以下顺序临时制备一个500μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备的10倍浓缩的PBSpH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+15μgHAH1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+15μgHAH3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+17.5μgHAB株，室温下磁力搅拌15分钟。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
三价裂解/AS03
制备Tween80，TritonX100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中实现750μg/mlTween80，110μg/mlTritonX100和100μg/mlVES的终浓度。用于预混合物中的量考虑了它们在病毒株中的含量。
根据以下顺序临时制备一个500μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备的10倍浓缩的PBSpH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+15μgHAH1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+15μgHAH3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+17.5μgHAB株，室温下磁力搅拌15分钟，对于全剂量AS03+250μlSB62，或对于1/2剂量AS03，+125μlSB62，对于1/5剂量AS03，+50μlSB62乳液，室温下磁力搅拌15分钟。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
VIII.1.3.读出结果(表20)
在鼻内激发前(第0天)、免疫前(第28天)和免疫后14天(10只猪/组)测量对接种的体液免疫应答。通过血细胞凝集抑制(HI)测试，测试血清样品。
表20
读出结果 时间点 样品类型 分析方法
体液应答 第0天，第28天，第42天 血清 IHA
VIII.2.结果和结论
VIII.2.1.体液免疫
结果显示在图12中。无论佐剂的稀释程度如何，以AS03为佐剂的三价裂解制剂在这种异源激发模型中都比普通三价制剂诱导了对所有株的更强HI应答，但对于所有三种株，并不总是达到了统计学显著性。观察到了佐剂剂量效果，株与株之间有微小差异。对于免疫原性较低的株，如B/Shangdong，仅有以全剂量AS03为佐剂的三价裂解疫苗显著与普通疫苗不同。与以全剂量AS03为佐剂的三价裂解疫苗相反，降低剂量的AS03不能对所有三株都使HI滴度高于用普通疫苗观察到的HI滴度。
实施例IX-含佐剂的和不含佐剂的裂解三价或四价(含第二乙型株)疫苗在幼稚和激发的C57Bl/6小鼠中的临床前评价
IX.1.实验设计和目的
进行了在幼稚和激发的小鼠中的实验，以便评价用这种水包油乳液佐剂(AS03或AS03半剂量)配制的流感裂解三价或四价(含第二乙型株)疫苗诱导的体液免疫应答的增加。最近分离的乙型流感病毒的HA基因的系统发生分析证明从二十世纪八十年代中期开始，这种基因进化为由B/Victoria/2/87样和B/Yamagata/16/88样病毒为代表的两种抗原上不同的系。这些实验评价了与三价流感疫苗(TIV)诱导的应答相比，四价流感疫苗(QIV)中第二乙型株的存在对体液免疫应答的影响。
IX.1.1.处理/组(表21)
用10只成年雌性C57Bl/6幼稚小鼠或用与疫苗株相比异源的株激发的小鼠的各组进行这些实验。
在第0天和28天，以1000μl的总体积，用三价或四价流感疫苗候选物肌内免疫幼稚小鼠。
激发的小鼠在第0天用三价的完整、福尔马林灭活的流感病毒(每株5μgHA)首先接受鼻内施用(20μl体积)。激发株由包括在疫苗中的病毒株的漂移株(5μgHA完整的灭活H1N1A/Beijing/262/95，H3N2A/Wellington/1/04和B/Brisbane/32/02)组成。28天后，用单剂疫苗候选物，以100μl的总体积肌内接种小鼠。
用含有单独的TIV或QIV的制剂(普通疫苗)或以不同剂量的AS03(全或半(1/2)剂量)为佐剂的含TIV或QIV的制剂免疫小鼠。用于免疫的株包括H1N1A/NewCaledonia/20/99，H3N2A/Wisconsin/52/05和B/Shangdong/7/97(B/Victoria系包括TIV和QIV两者)，对于QIV疫苗，也包括B/Jiangsu/10/03(B/Yamagata系仅仅包括在QIV中)(1.5μg/株相应于人类剂量的1/10th)。
表21
组 抗原/制剂 抗原剂量
1 TIV普通(不含佐剂的) 1.5μg
2 TIV AS03 1.5μg
3 TIV AS03/2 1.5μg
4 QIV普通(不含佐剂的) 1.5μg
5 QIV AS03 1.5μg
6 QIV AS03/2 1.5μg
7 PBS
IX.1.2.制备疫苗制剂
TIV普通(不含佐剂的)
制备100μl剂量：
将十倍浓缩的PBS以及Tween80，TritonX-100和VES的预混合物(含量考虑了病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。制剂中的终浓度是Tween80354μg/ml，TritonX-10052μg/ml，VES47.37μg/ml。磁力搅拌5分钟后，加入每种病毒株(H1N1，H3N2，乙型株)各1.5μg，在各次添加之间磁力搅拌10分钟。然后将制剂搅拌15分钟。检查pH。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
TIVAS03或AS031/2
制备100μl剂量：
将十倍浓缩的PBS以及Tween80，TritonX-100和VES的预混合物(含量考虑了病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。制剂中的终浓度是Tween80354μg/ml，TritonX-10052μg/ml，VES47.37μg/ml。磁力搅拌5分钟后，加入每种病毒株(H1N1，H3N2，乙型株)各1.5μg，在各次添加之间磁力搅拌10分钟。磁力搅拌15分钟后，加入25μl或12.5μlSB62乳液。然后将制剂搅拌15分钟。检查pH。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
QIV普通(不含佐剂的)
制备100μl剂量：
将十倍浓缩的PBS以及Tween80，TritonX-100和VES的预混合物(含量考虑了病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。制剂中的终浓度是Tween80472μg/ml，TritonX-10069.44μg/ml，VES63.16μg/ml。磁力搅拌5分钟后，加入每种病毒株(H1N1，H3N2，2种乙型株)各1.5μg，在各次添加之间磁力搅拌10分钟。然后将制剂搅拌15分钟。检查pH。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
QIVAS03或AS031/2
制备100μl剂量：
将十倍浓缩的PBS以及Tween80，TritonX-100和VES的预混合物(含量考虑了病毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。制剂中的终浓度是Tween80472μg/ml，TritonX-10069.44μg/ml，VES63.16μg/ml。磁力搅拌5分钟后，加入每种病毒株(H1N1，H3N2，2种乙型株)各1.5μg，在各次添加之间磁力搅拌10分钟。磁力搅拌15分钟后，加入25μl或12.5μlSB62乳液。然后将制剂搅拌15分钟。检查pH。在制备结束后的1小时内注射该制剂。
IX.1.3.读出结果(表22)
在幼稚小鼠中，在每组10只小鼠中，在第一次免疫后28天(D28Post-I)和第二次免疫后21天(D21Post-II)通过血细胞凝集抑制测定，测量体液免疫应答(图13)。
在激发的小鼠中，在每组10只小鼠中，在激发后28天(Day28Post-Prim)和单次免疫后21天(D21Post-Imm)通过血细胞凝集抑制测定，测量体液免疫应答(图14)。
为了简化，并且集中于本实验的目的，仅仅描述了针对乙型株诱导的体液免疫应答。
表22
读出结果 时间点 样品类型 分析方法
体液应答 第28天和第49天 血清 HI滴度
IX.2.结果
IX.2.1.幼稚小鼠中的体液免疫应答：HI滴度。
与用不含佐剂的流感裂解疫苗免疫的小鼠中获得的应答相比，用含佐剂的流感裂解疫苗免疫的幼稚小鼠诱导更高的HI滴度(图13，A和B)。
无论佐剂是什么(AS03或AS03/2)，用含佐剂的TIV或含佐剂的QIV免疫的幼稚小鼠诱导了相似的抗B/Shangdong/7/97(B/Victoria样病毒包括在TIV和QIV两者中)HI滴度(图13；A)。
无论佐剂是什么(AS03或AS03/2)，与在用含佐剂的TIV免疫的幼稚小鼠中观察到的缺乏HI滴度相比，用含佐剂的QIV免疫的幼稚小鼠诱导了更高的抗B/Jiangsu/10/03(B/Yamagata样病毒仅仅包括在QIV中)的HI滴度(图13；B)。
IX.2.2.激发的小鼠中的体液免疫应答：HI滴度。
与用不含佐剂的流感裂解疫苗免疫的小鼠中获得的应答相比，用B/Victoria样病毒激发并且用含佐剂的流感裂解疫苗免疫的小鼠诱导了更高的HI滴度(图14，A和B)。
无论佐剂是什么(AS03或AS03/2)，用B/Victoria样病毒激发并且用含佐剂的TIV或含佐剂的QIV免疫的小鼠诱导了相似的抗B/Shangdong/7/97病毒(B/Victoria样病毒包括在TIV和QIV两者中)HI滴度(图14；A)。
无论佐剂是什么(AS03或AS03/2)，与在用含佐剂的TIV免疫的幼稚小鼠中观察到的缺乏HI滴度相比，用B/Victoria样病毒激发并且用含佐剂的QIV免疫的小鼠诱导了更高的抗B/Jiangsu/10/03(B/Yamagata样病毒仅仅包括在QIV中)的HI滴度(图14；B)。
IX.3.结果的概括和结论
用含佐剂(AS03或AS03/2)的TIV或QIV疫苗免疫的幼稚小鼠或B/Victoria样病毒激发的小鼠显示了抗包含在疫苗中的同型B/Victoria样病毒或属于相同B/Victoria系的异亚型病毒的交叉反应性。用含佐剂(AS03或AS03/2)的TIV疫苗免疫的幼稚小鼠或B/Victoria样病毒激发的小鼠没有显示抗与包含在疫苗中的乙型病毒相比属于另一系(在本实施例中是B/Yamagata样病毒)的异亚型病毒的交叉反应性。
这些实验证明，为了诱导抗属于B/Victoria和B/Yamagata系的乙型病毒的交叉反应，需要第二乙型株和佐剂(AS03或AS03/2)。
实施例X-用含裂解流感抗原制剂和各种剂量的AS03佐剂的疫苗(Flu-LD-012)在年龄为18-64岁的群体中的临床试验
X.1.导言
在2007年，在年龄为18-64岁的成年群体中进行了II期、有对照的、随机的、单盲研究，以便评估与用作参照的FluarixTM(GlaxoSmithKlineBiologicals)相比，肌内施用含有各种剂量的AS03佐剂的GlaxoSmithKlineBiologicals低剂量流感候选疫苗(即每株含5μgHA)的免疫原性、安全性和反应原性。
X.2.研究设计
5组受试者(每组200)肌内平行接受以下疫苗：
-FluLD1/1：5μgHA/株的流感疫苗，以1/1剂量的AS03为佐剂
-FluLD1/2：5μgHA/株的流感疫苗，以1/2剂量的AS03为佐剂
-FluLD1/4：5μgHA/株的流感疫苗，以1/4剂量的AS03为佐剂
-FluLD1/8：5μgHA/株的流感疫苗，以1/8剂量的AS03为佐剂
-一个200名受试者的组接受1个全剂量的FluarixTM15μgHA/株
方案：在第0天接受1次流感疫苗肌内注射，在接种后第0天、第21天和第180天采集血样。
本研究中使用的标准三价裂解流感疫苗-FluarixTM是从2007/2008年开始北半球可以商购的疫苗，由GlaxoSmithKlineBiologicals开发和制造。
X.2.研究目的
X.2.1.主要目的：免疫原性
证明在所有受试者中接种后21天，与Fluarix相比，以AS02(1/1、1/2、1/4、1/8剂量的AS03)为佐剂的低剂量流感疫苗的免疫原性并不差(GMT)。
观察变量：
·在第0和21天：所有受试者中抗这三种疫苗株中每一种疫苗株的血清血细胞凝集抑制(HI)抗体滴度。
衍生变量：
·第0和21天HI抗体滴度的几何平均滴度(GMTs)。
X.2.2.次要目的
·在所有受试者中，评估接种后21天以AS02(1/1、1/2、1/4、1/8剂量的AS03)为佐剂的低剂量流感疫苗和Fluarix诱导的在抗血细胞凝集素(HI)抗体滴度方面的体液免疫应答。
·在所有受试者中，评估接种后180天以AS02(1/1、1/2、1/4、1/8剂量的AS03)为佐剂的低剂量流感疫苗和Fluarix的HI抗体的持续存在。
·在一个亚组的受试者中，评估第0、21和180天以AS02(1/1、1/2、1/4、1/8剂量的AS03)为佐剂的低剂量流感疫苗和Fluarix诱导的在流感特异性CD4/CD8T淋巴细胞频率方面的细胞介导的免疫应答。
·在一个亚组的受试者中，评估第0、21和180天以AS02(1/1、1/2、1/4、1/8剂量的AS03)为佐剂的低剂量流感疫苗和Fluarix诱导的在中和抗体滴度方面的体液免疫应答。
·在所有受试者中，评估整个研究阶段以AS02(1/1、1/2、1/4、1/8剂量的AS03)为佐剂的低剂量流感疫苗和Fluarix的安全性和反应原性(7天中的主诉症状的随访，21天中无主诉症状的随访，6个月中严重不良事件和医学显著状况的随访)。
体液应答的观察变量：
·在第0、21天和180天：所有受试者中抗这三种疫苗株中每一种疫苗株的血清血细胞凝集抑制(HI)抗体滴度。
·在第0、21天和180天：在一个亚组的受试者中，分别测试抗疫苗中代表的三种流感病毒株中每一种的中和抗体滴度。
衍生变量：
·第0、21和180天HI抗体的几何平均滴度(GMTs)
·第21天的血清转变率*
·第21天的血清转变因数**
·第0天和第21天的血清保护率***
*血清转变率定义为接种前滴度＜1∶10并且接种后滴度≥1∶40或接种前滴度≥1∶10并且接种后滴度至少增加4倍的疫苗接种者的百分比。
**血清转变因数定义为与第0天相比，接种后的血清HIGMTs增加的倍数。
***血清保护率定义为血清HI滴度≥1∶40(这通常接受为表示保护)的疫苗接种者的百分比
CMI应答的观察变量(在一个亚组的受试者中)：
·在第0、21和180天：
-在产生至少两种不同的信号分子(IL-2，IFN-γ，TFN-α和CD40L)的测试中每106的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。
-在产生至少CD40L和另一种信号分子(IL-2，IFN-γ，TFN-α)的测试中每106的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。
-在产生至少IL-2和另一种信号分子(CD40L，IFN-γ，TFN-α)的测试中每106的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。
-在产生至少TFN-α和另一种信号分子(IL-2，IFN-γ，CD40L)的测试中每106的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。
-在产生至少IFN-γ和另一种信号分子(CD40L，IL-2，TFN-α)的测试中每106的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。
衍生变量
·对于每个测试，第0、21、180天的特异性流感CD4/CD8T淋巴细胞的几何平均值(GM)。
X.2.3.其他目的：
·在一个亚组的受试者中，评估第0、21和180天在疫苗异源HI滴度(抗漂移株的血清血细胞凝集抑制(HI)抗体滴度)方面的体液免疫应答。
·在一个亚组的受试者中，评估第0、21和180天在疫苗异源中和抗体滴度(交叉反应性流感特异性病毒株(漂移株))方面体液免疫应答。
·在一个亚组的受试者中，评估第0、21和180天在交叉反应性流感特异性CD4/CD8T淋巴细胞频率(异源株)(漂移株或保守的流感表位)方面的CMI应答。
衍生变量和标准(血清保护、血清转变率和血清转变因数)如上文所述。
X.3.疫苗组成和施用
X.3.1.疫苗制备
用于本研究中的以AS03为佐剂的低剂量流感疫苗是以AS03为佐剂的三种不同的裂解灭活流感抗原的等量(即3x5μgHA)液体混合物。它以0.5ml/剂的体积在玻璃(I型)预填充注射器中作为单剂疫苗存在。以AS03为佐剂的低剂量流感候选制剂含有以下株：
■A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)样株：A/SolomonIslands/03/2006(IVR-145)，
■A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样株：A/Wisconsin/67/2005(NYMCX)-161B，
■B/Malaysia/2506/2004样株：B/Malaysia/2506/2004.
该疫苗含有每个剂量每种流感病毒株5μg血细胞凝集素(HA)，与全剂量、半剂量、四分之一剂量或八分之一剂量的佐剂系统AS03组合。通过样品与乳液混合，将流感抗原掺入佐剂系统的水相。
疫苗含有以下来自药物物质的制造过程的残留物：硫柳汞、卵白蛋白、蔗糖、甲醛和脱氧胆酸钠和来自制造过程早期的残留水平的硫柳汞(每个剂量＜1μg)。在商购FluarixTM疫苗的制造过程后进行灭活裂解病毒体抗原的三种单价成分的生产。这是按照III.4.1.2部分的解释进行的。在灭活步骤前用脱氧胆酸钠进行裂解，所述灭活步骤是用甲醛进行的。
X.3.2.疫苗组成
一个剂量的FluLD(全剂量、半剂量、1/4剂量或1/8剂量的AS03)相应于0.5ml。
其组成提供在表23中。对于所有制剂，每个剂量的HA含量是大约5μg，唯一差异是最终容器中存在的AS03的量。
表23AS03为佐剂的低剂量流感疫苗的组成
缩写：HA＝血细胞凝集素；当使用全剂量AS03时，Polysorbate80中的总含量相应于每个剂量4.972mg，当使用半剂量时，相应于每个剂量2.547mg。
X.3.3.用AS03佐剂制备疫苗组合物
抗原制备(“中间成分”)：在PBSmodNa/K(132.7mMNaCl，2.7mMKCl，1.1mMMgCl2，7.26mMNa2HPO4，2.72mMKH2PO4，pH7.2)中以使得中间成分中的终浓度分别为952.5μg/mL、130.9μg/ml和119.1μg/mL的量加入Tween80、TritonX-100和VES。搅拌15-45分钟后，加入每ml每株H1N135.71μgHA，36.90μg/mLH3N2株和每ml乙型株39.29μgHA。
含佐剂的疫苗：将PBSmodNa/K(132.7mMNaCl，2.7mMKCl，1.1mMMgCl2，7.26mMNa2HPO4，2.72mMKH2PO4，pH7.2)加入注射用水，达到每个人类剂量0.5mL的最终体积。搅拌15-45分钟后，加入一定体积的所谓“中间成分”，混合15-45分钟。然后，加入浓缩的PBSmod20x(2.74MNaCl，54mMKCl，142.8mMNa2HPO4，26mMKH2PO4，pH6.8)，混合15-45分钟。这种PBSmod20倍浓缩为与AS03乳液相同组成，加入的量是AS03剂量的函数，并且计算使得疫苗的离子组成恒定，同时减少乳液含量。最后，加入需要的乳液量(31.25或62.5或125或250μl/剂量)，并且混合15-45分钟以达到表23中所示的最终目标值。
X.4.免疫原性结果-体液免疫应答
X.4.1HI几何平均滴度(GMT)
采用95％CI的HI抗体的GMT示于表24和图15。每个年龄组(18-49岁和50-64岁)的采用95％CI的HI抗体的GMT示于表25。
表24-第0天和第21天HI抗体滴度的血清阳性率和GMTs(免疫原性的ATP队列)
FluLD11＝5μgHA/株，采用1/1剂量的AS03；FluLD12＝5μgHA/株，采用1/2剂量的AS03；
FluLD14＝5μgHA/株，采用1/4剂量的AS03；FluLD18＝5μgHA/株，采用1/8剂量的AS03；Fluarix＝Fluarix(15μgHA/株)
N＝具有可获得的结果的受试者数目
n/％＝血清阳性受试者的数目/百分比(HI滴度＞＝1∶10)
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
GMT＝几何平均抗体滴度；PRE＝接种前第0天；MIN/MAX＝最小值/最大值
PI(D21)＝接种后第21天
表25-通过年龄分类的第0天和第21天HI抗体滴度的血清阳性率和GMTs
中间结论
对于A/SolomonIsland(H1N1)，所有研究组的GMTs在相同的范围。对于所有株和所有年龄分类，所有含佐剂的组与Fluarix组相比并不差。对于A/Wisconsin(H3N2)，显示了随着AS03浓度降低，免疫应答降低的趋势，而没有统计学显著的差异。对于B/Malaysia，也显示了随着AS03浓度降低免疫应答降低的趋势，但是对于该株，仅仅在用FluLD1/2和FluLD1/8诱导的GMT之间显示了统计学显著的差异(参见图15)。
当通过年龄组分析数据时，显示了相似的结果。但是，对于B/Malaysia，在更年轻的年龄组中(18-49岁)，用FluLD1/2诱导的GMT统计学显著高于用FluLD1/4诱导的GMT。
X.4.2抗HI抗体滴度的血清转变因数、血清保护率和血清转变率(对 于人类中的流感疫苗所确立的保护作用相关性)
结果显示在表26和26-图16显示血清保护率，表28和29-图17A和17B显示血清保护率，以及表30和31-图17显示转变因数。
表26-第0天和第21天HI抗体的血清保护率(SPR)
F1uLD11＝5μgHA/株，采用1/1剂量的AS03
FluLD12＝5μgHA/株，采用1/2剂量的AS03
FluLD14＝5μgHA/株，采用1/4剂量的AS03
FluLD18＝5μgHA/株，采用1/8剂量的AS03
Fluarix＝Fluarix(15μgHA/株)
血清保护率定义为血清HI滴度≥1∶40的疫苗接种者的百分比
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者数目
n/％＝血清保护的受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
PRE＝接种前第0天；PI(第21天)＝接种后第21天
表27-通过年龄分类的第0天和第21天的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)
符号与表24相同
中间结论
对于所有组和所有三种病毒株，SPT满足CHMP(平均值＞70)和FDA标准(95％CI的LL＞70)。显示了对于所有组，SPR在相同的范围内。
表28-PI(第21天)的HI抗体滴度的血清转变率(SCR)
FluLD11＝5μgHA/株，采用1/1剂量的AS03；FluLD12＝5μgHA/株，采用1/2剂量的AS03；FluLD14＝5μgHA/株，采用1/4剂量的AS03；FluLD18＝5μgHA/株，采用1/8剂量的AS03；Fluarix＝Fluarix(15μgHA/株)
血清转变定义为：
对于最初血清阴性的受试者，接种后抗体滴度＞＝401/DIL
对于最初血清阳性的受试者，接种后的抗体滴度＞＝接种前抗体滴度的4倍
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者数目
n/％＝血清转变的受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
PI(第21天)＝接种后第21天
表29-通过年龄分类的PI(第21天)的HI抗体滴度的血清转变率(SCR)
符号与表26相同
中间结论
对于所有研究疫苗和所有三种病毒株，SCR满足CHMP标准(平均值＞40)和FDA标准(95％CI的LL＞40)。除了B/Malaysia(其中所有结果显示都在相同范围内)外，显示了随着AS03含量减少SCR减少的趋势。对于A/SolomonIsland，与FluLD1/8相比，FluLD1/1诱导了统计学显著更高的SCR。对于所有组，FluLD1/2和FluLD1/4诱导的SCR在相同的范围内。
表30-第21天HI抗体滴度的血清转变因数(SCF)
FluLD11＝5μgHA/株，采用1/1剂量的AS03；F1uLD12＝5μgHA/株，采用1/2剂量的AS03；FluLD14＝5μgHA/株，采用1/4剂量的AS03；FluLD18＝5μgHA/株，采用1/8剂量的AS03；Fluarix＝Fluarix(15μgHA/株)
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者数目
SCF＝血清转变因数或几何平均比(平均值[log10(接种后/接种前)]}
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
PI(第21天)＝接种后第21天
表31-通过年龄分类的第21天的HI抗体滴度的血清转变因数(SCF)
符号与表28相同
中间结论
对于所有研究疫苗，对于所有三种病毒株，SCF远远高于CHMP标准(＞2)。对于所有研究疫苗，SCF在相同的范围内。
X.4.3含佐剂的低剂量疫苗相对于Fluarix(GMT)并不差
表32显示了相对于Fluarix，对于所有三种病毒株，含佐剂的低剂量疫苗在第21天的GMT比值方面并不差。
表32-对于所有三种病毒株，相对于Fluarix，含佐剂的低剂量疫苗在第21天的GMT比值方面并不差。
N＝具有可获得的结果的受试者数目
95％CI＝95％置信区间，90％CI＝90％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
GMT＝几何平均抗体滴度
中间结论
对于所有三种病毒株，FluLD1/1，1/2，1/4显示在GMT比值方面并不比Fluarix差。显示了对于H1N1和H3N2株，FluLD1/8并不差，但对于乙型株则并非如此。
X.5.总体结论
X.5.1安全性结论
与用可商购的Fluarix疫苗显示的反应原性相比，用含佐剂的疫苗显示了更高的反应原性。对于含佐剂的疫苗，用减少量的AS03显示了反应原性降低的趋势。总体上，用FluDL1/4和FluDL1/8获得了相似的反应原性谱。
对于所有疫苗组，无主诉的症状是相同的。
X.5.2免疫原性结论
本研究的主要目的是评估第21天时，LD疫苗制剂与Fluarix相比并不差(GMT)。
在用一个剂量的含佐剂的疫苗FluDL1/1，FluDL1/2和FluDL1/4免疫后21天，显示所有三种病毒株的GMT比值都不比用Fluarix获得的滴度差。在该研究中，显示了对于H1N1和H3N2株，用疫苗FluDL1/8获得的GMT比值并不比用Fluarix获得的GMT比值差，但对于乙型株则并非如此。
除了使用减少量的佐剂显示的免疫应答减少的趋势外，对于所有株，所有疫苗都显示满足管理批准的所有3个CHMP标准。
实施例XI-用含裂解流感抗原制剂和各种佐剂的疫苗在年龄大于65岁的群体中的临床试验
XI.1.导言
经典裂解流感疫苗如FluarixTM在老年人中的效力显著低于在成人或年轻人群中的效力。提示免疫系统的老化(即免疫衰老)是老年人中见到的相对效力缺乏的根本原因，因此需要通过刺激更强的免疫应答来改进疫苗。因此，在2007年，在年龄大于65岁的老年群体中进行了一项II期、有对照的、随机化的单盲研究，以便评价与用作参照的FluarixTM(GlaxoSmithKlineBiologicals)相比，含有8种不同的佐剂制剂的流感候选疫苗的免疫原性、安全性和反应原性。
已经测试了包含水包油乳液和每个剂量25μg3D-MPL的含佐剂的流感疫苗，并且证明是有效的(WO2006/100111)。在该研究中，每种组分的量固定为250μl水包油乳液和25μgMPL。本研究的目的在于确定平衡观察到的反应原性/安全性谱的可接受性与免疫原性的可接受性的最佳疫苗配方。
XI.2.Study设计和目的
10组受试者(每组200名≥65岁的受试者，FluarixYNG组除外，其中是18-40岁的受试者)肌内平行接受以下流感疫苗：
·FluAS031/1：以全剂量水包油乳液为佐剂的疫苗(AS031/1)
·FluAS031/2：以1/2剂量水包油乳液为佐剂的疫苗(AS031/2)
·FluAS031/4：以1/4剂量水包油乳液为佐剂的疫苗(AS031/4)
·FluAS251/1：以25μgMPL+全剂量水包油乳液为佐剂的疫苗(AS25A)
·FluAS251/2：以25μgMPL+1/2剂量的水包油乳液为佐剂的疫苗(AS25B)
·FluAS251/4：以25μgMPL+1/4剂量的水包油乳液为佐剂的疫苗(AS25C)
·FluAS501/2：以50μgMPL+1/2剂量的水包油乳液为佐剂的疫苗(AS25E)
·FluAS501/4：以50μgMPL+1/4剂量的水包油乳液为佐剂的疫苗(AS25F)
·FluarixELD(≥65岁)：FluarixTM
·FluarixYNG(18-40岁)：FluarixTM
方案：在第0天肌内注射一次流感疫苗，在接种后第0天、21天和180天采集血样。用于本研究中的标准三价裂解流感疫苗-FluarixTM与用于实施例X中的相同。
疫苗配方描述于表31-32。
XI.2.1.主要目的：免疫原性
基于接种后21天三种疫苗株的免疫原性(GMT)，鉴定与Fluarix相比，肌内给予年龄≥65岁的受试者的含佐剂的流感疫苗的最佳配方(一个水包油乳液剂量和一个MPL剂量的组合)。变量如实施例X.2.1中所述，并且针对年龄大于65岁的受试者(第21天时的HI抗体滴度和HI抗体滴度的GMTs)。
X.2.2.次要目的是评估：
■接种流感疫苗的所有受试者的安全性和反应原性
■接种后21天，所有受试者中流感疫苗的免疫原性(GMT，SCF，SCR和SPR)
■在所有受试者中，第一次接种后180天的HI抗体的持续性
■在第0、21和180天，在产生至少两种不同的细胞因子(IFN-γ，IL-2，CD40L或TNF-α)的流感特异性CD4/CD8T淋巴细胞的频率方面，流感疫苗诱导的细胞介导的免疫(CMI)应答(仅仅针对受试者的亚组)。
观察变量和衍生变量(和定义)如实施例X的描述。
XI.3.疫苗组成和施用
含佐剂的流感疫苗是基于从1992年开始由GSKBio销售的商购Fluarix疫苗。候选制剂由以下组分组成：三价分裂病毒体、由3个单价病毒抗原成分(分别从2007/2008北半球推荐的流感病毒株A/H1N1、A/H3N2和B制备)组成的灭活的流感抗原，组合了基于MPL和/或水包油(o/w)乳液的佐剂系统。
该试验中测试两个家族的GSKBio拥有的佐剂系统：
-通过每个人类剂量的含佐剂疫苗中的乳液量分类的AS03家族(1/1-1/2-...)
-补充了MPL并且通过每个人类剂量的含佐剂疫苗中每种组分的量分类(A，B...)的AS25家族的水包油乳液。
XI.3.1.疫苗组成
已经描述了从三种流感病毒株，即甲型(H1N1和H3N2)和乙型的工作种子制备的裂解灭活病毒体抗原的三个单价成分的制备，所述病毒株单个生长在具胚的鸡蛋中(参见实施例10)。临床批次含有每个剂量每种流感病毒株15μg血细胞凝集素(HA)。流感抗原以3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂质A(MPL)和/或水包油(o/w)乳液AS03为佐剂。AS的8种不同配方与裂解病毒体流感抗原组合。制备佐剂的方法是从WO2006/100111的实施例II中描述的方法修改的，其中根据表31和32给出的配方修改各个组分的量。赋形剂如下：Polysorbate80(Tween-80)，Octoxynol10(X-100)，α-生育酚基琥珀酸氢酯，氯化钠，氯化镁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾和注射用水。含佐剂的流感疫苗的不同制剂是不含防腐剂的制剂。但是，它们含有来自药物物质生产过程的早期阶段的微量柳硫汞(每个剂量＜1.25μg)，在该过程中添加柳硫汞以减少生物负荷。
含佐剂的流感疫苗是用于注射的、含佐剂的裂解纯化的流感病毒的无菌白色乳液。它作为2组分疫苗存在，所述疫苗由含抗原(悬浮液)的I型玻璃管形瓶和含有佐剂(乳液)的预填充的I型玻璃注射器(PFS)组成。疫苗在2-8℃下储存。在注射时，将抗原预填充的注射器的内容物注射到含浓缩的三价灭活裂解病毒体抗原的管形瓶中。混合后，将内容物吸入注射器，用肌内针头替换该针头。一个剂量的重配含佐剂流感候选疫苗相应于0.7mL(表33和34)。
表33疫苗配方
表34含佐剂的流感疫苗的组成
XI.3.2.疫苗制备
通过用注射用水稀释磷酸缓冲液(Na/K191.4mMP04 3-，2.74mMNaCl，54mMKCL，pH6.8，ad9.57mMP04 3)，制备AS03制剂(室温下搅拌15-45分钟，直到均匀)。然后加入适量的水包油乳液成分。将混合物在室温下搅拌15-45分钟，测量pH。然后通过0.2μm膜过滤，使混合物灭菌。进行无菌惰性气体(氮气)吹扫，以便在最少1分钟的时间内在填充的容器中产生惰性头空间。将无菌AS03佐剂在+2-8℃下保存，直到无菌填充到1.25-ml无菌I型(Ph.Eur.)玻璃注射器中。每个注射器含有60μl的总体积(280μl+60μl过量填充)。
通过用注射用水稀释磷酸缓冲液(室温下搅拌15-45分钟直到均匀)而制备AS25制剂。然后加入适量的SB62成分和MPL液体成分。其余的程序如上文的描述。
一个剂量的重配的含佐剂流感疫苗相应于0.7mL。最终的HA浓度是每ml三价最终成分含有21.4μg每种单价成分。最终的抗原(Ags)成分填充到3ml的玻璃管形瓶中，一个剂量的三价流感抗原相应于0.42ml的体积。将佐剂最终成分装入1.25-ml玻璃PFS中，一个剂量相应于0.28ml的体积。重配后的最终疫苗剂量是0.7ml。
为了在重配后能注射标出的体积(0.7mL)，用0.51ml的目标体积填充每个Ags管形瓶，并且用0.34ml的目标体积填充每个AS注射器。
XI.4.免疫原性结果-体液免疫应答
XI.4.1HI几何平均滴度(GMT)
采用95％CI的HI抗体的GMT显示在表35和图19中。
表35-第0天和21天的HI抗体滴度的血清阳性率和GMTs(免疫原性HI的ATP队列)
Flu_ELD＝Fluarix老年人(年龄＞＝65岁)；Flu_YNG＝Fluarix年轻人(年龄18-40岁)
GMT＝在所有受试者中计算的几何平均值
N＝具有可获得的结果的受试者的数目
n/％＝具有指定范围内的滴度的受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限；MIN/MAX＝最小值/最大值
PRE＝接种前剂量1(第0天)；PI(D21)＝接种后剂量1(第21天)
中间结论
在年龄≥65的受试者中，与Fluarix相比，以一个全剂量的AS03和25μgMPL(AS25_1_1)为佐剂的流感疫苗对B/Malaysia株诱导了统计学显著更好的HI应答。在该研究中，在年龄≥65的受试者中，对于另外两种株，所有含佐剂的疫苗(除了具有1/4剂量AS03的那种)与Fluarix相比更好。
XI.4.2抗HI抗体滴度的血清转变因数、血清保护率和血清转变率 (与在人类中对流感疫苗建立的保护作用相关)
血清保护率的结果提供在表36-图20(每种菌株一个结果)，血清转变率的结果提供在表37-图21，血清转变率的结果提供在表37-图21，血清转变因数的结果提供在表38-图22。
表36-第0天和第21天的HI抗体滴度的SPR(HI的ATP队列)
表37-第21天的HI抗体滴度的SCR(免疫原性HI的ATP队列)
血清转变定义为：
对于最初血清阴性的受试者，接种后抗体滴度＞＝401/DIL
对于最初血清阳性的受试者，接种后的抗体滴度＞＝接种前抗体滴度的4倍
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者数目
n/％＝血清转变的受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
表38-第21天的HI抗体滴度的SCF(免疫原性HI的ATP队列)
N＝具有可获得的接种前和接种后结果的受试者的数目
SCF＝血清转变因数或几何平均值(平均值[log10(PI(D21)/PRE)])
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
数据来源＝附表IIIA
体液免疫应答的中间结论
在HI数据中可以见到AS03的明确剂量效果(水包油乳液)。
对于A/SolomonIslands株(除AS03_1_4和AS50_1_4)和A/Wisconsin株，与Flu_ELD组相比，含佐剂的流感疫苗组中的GMTs统计学显著地更高。对于B/Malaysia株，与Flu_ELD组相比，AS25_1_1组中的GMTs统计学显著地更高。对于H3N2株(A/Wisconsin)，除了使用1/4剂量乳液的组外，对于所有含佐剂的流感疫苗组，体液应答增加到在年轻人中观察到的水平。
对于A/SolomonIslands株(除AS25_1_4和AS50_1_4)和A/Wisconsin株，与Flu_ELD组相比，含佐剂的流感疫苗组中的SCRs统计学显著地更高。对于B/Malaysia株，与Flu_ELD组相比，AS25_1_1组中的SCRs统计学显著地更高。
XI.5.细胞介导的免疫应答的分析
对于用合并的疫苗株再刺激的细胞，第0天和第21天时产生至少两种细胞因子的流感特异性CD4T细胞的频率(所有都是双份)提供在表39和图23中。
表39-在第0天和第21天，对于合并的病毒株，细胞因子阳性CD4T细胞(每百万个CD4T细胞)的频率(免疫原性CMI的ATP队列)
N＝具有可获得的结果的受试者数目
Nmiss＝结果缺失的受试者的数目
GM＝几何平均值
SD＝标准差
Q1，Q3＝第1和第3个四分位
Min/Max＝最小值/最大值
细胞介导的免疫应答的中间结论
在个体差异方面，对于所有的细胞因子组合，在年龄≥65的受试者中，与Fluarix相比，5种含佐剂的疫苗(AS03_1_1，AS03_1_2，AS25_1_1，AS50_1_2和AS50_1_4)诱导了显著更高的CMI应答(第21天-第0天)。在个体差异方面，对于所有的细胞因子组合，在年轻人中，与Fluarix相比，这些含佐剂的疫苗中的三种(AS03_1_1，AS03_1_2和AS25_1_1)也诱导了显著更高的CMI应答(第21天-第0天)。
XI.6.反应原性
局部症状
用EMEA和FDA对可定量症状的分级，评估了接种后7天阶段中报道有主诉的局部症状(任何级/第3级)的受试者的百分比。
EMEA分级：e瘀斑(任何级[＞0mm]和第3级[＞50mm])；疼痛(任何级)；第3级疼痛；发红(任何级[＞0mm]和第3级[＞50mm])和肿胀(任何级[＞0mm])；第3级肿胀(＞50mm).FDA分级：瘀斑(任何级[≥25mm]和第3级[＞100mm])，第3级发红(＞100mm)；第3级肿胀(＞100mm)，发红(任何级[≥25mm])；肿胀(任何级[≥25mm]).
全身症状
EMEA分级：发热(≥37.5℃)，第3级发热(＞39.0℃).FDA分级：发热(≥38℃)和第3级发热(＞40℃)。
在接种后7天(第0-6天)阶段中任何第3级有主诉和无主诉症状的总体发生率和性质显示在图24中。
结论
与Flu_ELD组相比，含佐剂的流感疫苗组中报道至少一种全身症状的受试者百分比统计学显著更高，但与Flu_YNG组(除AS03_1_4外)处于相同范围。
报道至少一种第3级全身症状的受试者的百分比对于所有组都在相同范围内。
与Flu_ELD组相比，含佐剂的流感疫苗组中报道至少一种局部症状的受试者百分比统计学显著更高，与Flu_YNG组相比，AS25_1_1组中统计学显著更高。
与Flu_ELD和Flu_YNG组相比，AS03_1_1，AS25_1_2，AS25_1_1和AS50_1_2组中报道至少一种第3级局部症状的受试者的百分比统计学显著更高。
XI.7.总体结论
这些数据对于合适地平衡人群中的免疫应答/副作用是重要的。
在HI免疫原性方面，证明了明确的佐剂效果，特别是对于所有佐剂剂量，对于H1N1和H3N2显著增加。主要用AS251/1获得了对乙型株的显著增加，但用AS031/1，AS031/2和AS501/2也是如此。用佐剂的水包油乳液组分也显示了剂量-效果，用佐剂的MPL组分也是如此，但后者没有前者显著。
在细胞介导的免疫应答方面，对于AS031/1，AS031/2，AS251/1和AS501/2，对合并的株，在老年人中，也证明了佐剂效果，其中与Fluarix相比，有显著差异(频率，所有测量值)。
在反应原性方面，含佐剂的疫苗比Fluarix的反应原性更高，这与佐剂的水包油乳液组分相关；也存在MPL的剂量效果，但较不明显。在该老年群体中，AS031/2与AS031/1相比反应原性较低，但也显示了满意的免疫原性谱。
序列表
<110>GlaxoSmithKlineBiologicalssa
<120>水包油乳液流感疫苗
<130>VB62342
<160>6
<170>FastSEQforWindowsVersion4.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列，未甲基化的含CG的序列
<400>1
tccatgacgttcctgacgtt20
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列，未甲基化的含CG的序列
<400>2
tctcccagcgtgcgccat18
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列，未甲基化的含CG的序列
<400>3
accgatgacgtcgccggtgacggcaccacg30
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列，未甲基化的含CG的序列
<400>4
tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt24
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列，未甲基化的含CG的序列
<400>5
tccatgacgttcctgatgct20
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列，未甲基化的含CG的序列
<400>6
tcgacgttttcggcgcgcgccg22

Claims (60)

1.免疫原性流感组合物，其剂量体积适合于人类使用，所述组合物包含与水包油乳液佐剂组合的流感病毒抗原或抗原性制剂，其中所述水包油乳液佐剂包含可代谢油和乳化剂，并且其中所述可代谢油在所述人类剂量中以低于11mg的水平存在，并且所述乳化剂在所述人类剂量中以低于5mg的水平存在。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述可代谢油是鲨烯。
3.权利要求1或权利要求2的免疫原性组合物，其中所述可代谢油以每个人类剂量0.5-10、0.5-9、1-10、2-10、4-8、1-2、2-3、4.5-5.5、5-6或9-10mg的量存在。
4.权利要求1-3的任一项的免疫原性组合物，其中所述乳化剂是非离子型表面活性剂。
5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述乳化剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯或脱水山梨糖醇三油酸酯或这两者的混合物。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯选自polysorbate80或80，并且所述脱水山梨糖醇三油酸酯是Span85。
7.权利要求1-6的任一项的免疫原性组合物，其中所述乳化剂以每个人类剂量0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.4-1.2、0.5-4、1-2、2-3或4-5mg的量存在。
8.权利要求1-7的任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂进一步包含母育酚、甾醇或这两者。
9.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述母育酚是α-生育酚。
10.权利要求8或权利要求9的免疫原性组合物，其中所述母育酚以每个人类剂量0.5-12、1-11、2-10、4-9、5-6、5-7、2.5-3.5、1-2、1-3或10-11mg的量存在。
11.权利要求1-10的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自：(i)包含每个人类剂量4.5-5.5或5-6mg可代谢油、2-3mg乳化剂、和当存在时5-7mg母育酚的佐剂；(ii)包含每个人类剂量2-3mg可代谢油、1-1.5mg乳化剂、和当存在时2.5-3.5mg母育酚的佐剂；(iii)包含每个人类剂量0.5-1.5mg可代谢油、0.25-0.75mg乳化剂、和当存在时0.5-1.5mg母育酚的佐剂。
12.权利要求8-11的免疫原性组合物，其中所述甾醇是胆固醇。
13.权利要求8-12的免疫原性组合物，其中所述甾醇以每个人类剂量0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)的量存在。
14.权利要求1-13的免疫原性组合物，其中所述佐剂进一步包含选自下组的TLR配体：TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9或其组合。
15.权利要求14的免疫原性组合物，其中所述TLR-4配体选自：脂质A衍生物、氨烷基磷酸氨基葡糖苷衍生物(AGP)、和选自下组的化合物：ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764。
16.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL或脂质A的任何合成衍生物。
17.权利要求15或16的免疫原性组合物，其中所述TLR-4配体以每个人类剂量5-60、40-50、10-50、20-30、5-15、10、20、30、40或50μg的量存在。
18.权利要求1-17的免疫原性组合物，其中所述佐剂进一步包含皂苷或其衍生物。
19.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述皂苷或其衍生物是QS21。
20.权利要求18或19的免疫原性组合物，其中所述皂苷以每个人类剂量5-60、40-50、10-50、20-30、5-15、10、20、30、40或50μg的量存在。
21.权利要求1-20的免疫原性组合物，其中所述病毒抗原或抗原性制剂是每种流感病毒株每个人类剂量15μg或少于15μgHA。
22.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述病毒抗原或抗原性制剂是每种流感病毒株每个人类剂量少于10μg、或少于8μg、或少于4μg、或少于2μgHA、或少于1μgHA、或少于0.5、或少于0.1μgHA。
23.权利要求21或22的免疫原性组合物，其中所述病毒抗原或抗原性制剂是每种流感病毒株每个人类剂量2-7.5μg或1-5μgHA。
24.权利要求21-23的免疫原性组合物，其中所述病毒抗原或抗原性制剂是每种流感病毒株每个人类剂量少于或准确地5μgHA，或少于或准确地2.5μg或少于或准确地1μg。
25.权利要求1-24的免疫原性组合物，其中所述组合物是单价组合物，其中包含来自至少一种与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜能的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。
26.权利要求1-24的免疫原性组合物，其中所述组合物是多价组合物，其中包含来自至少两种、至少三种、至少四种或至少五种流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。
27.权利要求26的免疫原性组合物，其中所述组合物包含来自至少三种流感季节性(大流行间)株的病毒抗原或抗原性制剂，并且任选包含来自少一种与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜能的流感病毒株的病毒抗原或抗原性制剂。
28.权利要求26或27的免疫原性组合物，其中所述多价组合物包含选自下组的病毒抗原或抗原性制剂：(i)选自H1N1和H3N2的两种大流行间甲型株和选自B/yamagata和B/Victoria的两种乙型株；(ii)选自H1N1和H3N2的三种大流行间甲型株和选自B/yamagata和B/Victori的一种乙型株；(iii)选自H1N1和H3N2的两种大流行间甲型株、一种大流行甲型株和选自B/yamagata和B/Victoria的一种乙型株，所述大流行甲型株是H5N1。
29.权利要求25、27-28的免疫原性组合物，其中所述大流行流感病毒株选自H5N1、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H2N2、H10N7、H5N2、H7N2、H7N1和H7N3。
30.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述流感病毒抗原或其抗原性制剂来自在卵或细胞培养物上生长的流感病毒。
31.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述流感病毒抗原或其抗原性制剂包括完整病毒、裂解病毒、病毒体或选自HA、NA、M1、M2的一种或多种纯化的抗原。
32.权利要求31的免疫原性组合物，其中所述纯化的抗原从在哺乳动物、禽类或昆虫细胞中生长的流感病毒制备。
33.权利要求31或32的免疫原性组合物，其中所述纯化的抗原是重组产生的。
34.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述人类剂量选自：0.5ml或更少、0.5-1.5ml、0.2-1.2ml、0.2-0.7ml和少于0.25或0.5或0.7或1ml或准确地0.25或0.5或0.7或1ml。
35.制备权利要求1-34的任一项的含佐剂的流感疫苗的方法，包括以下步骤：将第一体积的水包油乳液与第二体积的包含流感病毒或其抗原性制剂的含水悬浮液混合，其中所述第一体积大于所述第二体积。
36.制备权利要求1-34的任一项的含佐剂的流感疫苗的方法，包括以下步骤：将基本相同体积的水包油乳液和包含流感病毒或其抗原性制剂的含水悬浮液混合。
37.制备权利要求1-34的任一项的含佐剂的流感疫苗的方法，包括以下步骤：将第一体积的水包油乳液与第二体积的包含流感病毒或其抗原性制剂的含水悬浮液混合，其中所述第二体积大于所述第二体积。
38.权利要求35-37的任一项的方法，包括以下步骤：稀释水包油乳液，然后将得到的稀释的乳液与所述流感含水悬浮液混合。
39.疫苗试剂盒，包含权利要求21-34的任一项定义的流感病毒抗原组分或流感病毒抗原性制剂组分，并且进一步包含同时或序贯施用权利要求1-20的任一项定义的佐剂。
40.疫苗，包含权利要求1-34的任一项的免疫原性组合物和药学可接受的赋形剂。
41.制备权利要求40的疫苗的方法，该方法包括将权利要求1-34的任一项的免疫原性组合物与药学可接受的赋形剂混合的步骤。
42.对人类宿主进行抗流感感染导致的疾病的免疫的方法，包括给宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-34的任一项的免疫原性组合物或权利要求40的疫苗。
43.权利要求42的方法，其中所述人类宿主是年龄为18-50岁的成人、年龄为18-65岁的成人、年龄为65岁或以上的老年人、或年龄为0-18岁的儿童，并且所述疾病是季节性或大流行流感感染之一或这两者。
44.权利要求42或43的方法，其中所述人类宿主是老年人，并且所述疾病是季节性或大流行流感感染之一或这两者。
45.权利要求1-34的免疫原性组合物或权利要求40的疫苗，其用于医学。
46.权利要求1-34的免疫原性组合物或权利要求40的疫苗，其用于治疗或预防流感感染导致的疾病。
47.权利要求1-20的任一项定义的(a)流感病毒抗原或其抗原性制剂和(b)水包油乳液在制备用于治疗或预防流感感染导致的疾病的免疫原性组合物中的用途。
48.权利要求47的用途或权利要求46的用途的组合物，其中所述组合物能够在人类中诱导以下作用中的至少一种或至少两种或全部：(i)与用不含佐剂的组合物获得的应答相比，改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的CD4T细胞免疫应答，(ii)与用不含佐剂的组合物获得的应答相比，改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的体液免疫应答，(iii)与用不含佐剂的组合物获得的应答相比，改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的B记忆细胞应答。
49.权利要求47的用途或权利要求46的用途的组合物，其中所述组合物能够在人类中诱导以下作用中的至少一种或至少两种或全部：(i)与用佐剂组分以更高量存在的含佐剂的组合物获得的应答相比，相似的抗所述抗原或其抗原性制剂的CD4T细胞免疫应答，(ii)与用佐剂组分以更高量存在的含佐剂的组合物获得的应答相比，相似的抗所述抗原或其抗原性制剂的体液免疫应答，(iii)与用佐剂组分以更高量存在的含佐剂的组合物获得的应答相比，相似的抗所述抗原或其抗原性制剂的B记忆细胞应答。
50.权利要求47-49的任一项的用途或用途的组合物，其中所述CD4T细胞免疫应答涉及诱导交叉反应性CD4T辅助应答。
51.权利要求47-49的任一项的用途或用途的组合物，其中所述体液免疫应答涉及诱导交叉反应性体液免疫应答。
52.权利要求1-34的免疫原性组合物或权利要求40的疫苗，用于治疗或预防流感病原体导致的疾病，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原所来源的病原体的变体。
53.权利要求1-20的任一项定义的(a)流感病毒抗原或其抗原性制剂和(b)水包油乳液在制备用于治疗或预防流感病原体导致的疾病的免疫原性组合物中的用途，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原所来源的病原体的变体。
54.权利要求48-49的任一项的用途或用途的组合物，用于抗病原体导致的感染或疾病的保护作用，所述病原体包含抗原，所述抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。
55.免疫原性流感组合物，用于再次接种以前用权利要求1-34的免疫原性组合物或权利要求40的疫苗接种过的个体。
56.抗原在制备用于再次接种个体的免疫原性组合物中的用途，所述个体以前用权利要求1-34的免疫原性组合物或权利要求40的疫苗接种过。
57.权利要求55-56的用途或用途的组合物，其中用于再次接种的组合物包含与用于前次接种的组合物的抗原具有共同CD4T细胞表位的流感抗原。
58.权利要求55-57的任一项的用途，其中用于再次接种的所述抗原或抗原性组合物是含佐剂的。
59.权利要求58的用途，其中用于再次接种组合物的水包油乳液如权利要求1-20的任一项所定义。
60.权利要求46-59的用途，其中所述疾病是人类宿主或人群的季节性或大流行流感感染之一或这两者，所述人类宿主或人群选自：年龄为65岁或以上的老年人、年龄为18-50岁或18-65岁的成人、年龄为0-18岁的儿童。
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