CN101489586A - 流感疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单价流感疫苗制剂和针对流感疾病进行免疫的接种方式、它们在药物中的用途，尤其是它们在增加对各种抗原的免疫响应中的用途，和制备方法。尤其是，本发明涉及单价流感免疫原性组合物，该组合物包含与水包油乳液佐剂组合的流感抗原或其抗原性制品，所述流感抗原或其抗原性制品得自流感病毒株，毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力，水包油型乳液佐剂包括可代谢的油、甾醇或生育酚例如α生育酚、和乳化剂。

Description

流感疫苗

技术领域

本发明涉及流感疫苗制剂和用于免疫对抗流感疾病的接种方案、其在药物中的用途，尤其是其在增大对各种抗原的免疫应答方面的用途，并涉及制备方法。具体地说，本发明涉及单价流感免疫原性组合物，该组合物包含与水包油乳液佐剂组合的、低量的流感病毒抗原或其抗原性制品，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自流感病毒株，毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。

技术背景

流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感引起显著的经济负担、发病率乃至死亡率。

流感病毒是RNA包膜病毒，颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为：内部为与核蛋白结合的核糖核酸(RNA)的核衣壳(nucleo capsid)或核心，外部包绕着脂质双层结构和外层糖蛋白的病毒被膜。病毒被膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。流感病毒包含两种表面抗原：糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，它们作为10-12nm长的刺突显露在颗粒表面上。就是这些表面蛋白、尤其是血细胞凝集素，决定了流感亚型的抗原特异性。病毒株是依据以下分类的：宿主物种的起源、地理位置和分离的年代，序列号和对于流感A，依据亚型HA和NA的血清学性质。对于甲型流感病毒，已经确定了16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)[Webster RG等人，Evolution and ecology of influenza A viruses.Microbiol.Rev.1992；56：152-179；Fouchier RA等人，Characterization of aNovel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype(H16)Obtained fromBlack-Headed Gulls.J.Virol.2005；79：2814-2822)。从1918年以来，已经从水禽中取得了所有HA和NA亚型的病毒，但只有三个HA亚型(H1、H2和H3)和两个NA亚型(N1和N2)在人类种群中形成了稳定的族系。对于乙型流感病毒(B)，只识别了一个HA的亚型和一个NA的亚型。

甲型流感病毒(A)连续地进行演变和经受了抗原性的变化[Wiley D，Skehel J.The structure and the function of the hemagglutinin membraneglycoprotein of influenza virus.Ann.Rev.Biochem.1987；56：365-394]。由于缺乏病毒RNA聚合酶的有效校正，导致高比例(rate)转录错误，这可以在表面糖蛋白上产生氨基酸取代基。这称为“抗原性漂移”。链段化的病毒基因组可提供第二类抗原变异。如果两个流感病毒同时感染宿主细胞，称为“抗原性转变”的遗传重组可以产生具有新表面或内部蛋白的新病毒。这些抗原性改变叫做‘漂移’和‘转变’，是不可预见的，由免疫学观点看可能具有显著的影响，因为它们最终导致出现新流感株，能使病毒逃逸免疫系统，几乎每年都引起众所周知的流行病。这两种遗传修饰引起对人类流行病具有责任的新病毒变体。

HA是确定不同流感株的血清学特异性的最重要抗原。此75-80kD的蛋白包含众多的抗原决定簇，其中几个位于在不同毒株中经历序列改变的区域中(毒株特异性决定簇)，其余的位于许多HA分子共有的区域中(共同决定簇)。

流感病毒几乎每年冬天都引起大流行，甲(A)型或乙(B)型病毒的感染率在6周的时间段内高达40％。流感感染产生各种病症，由无症状的感染至轻微的上呼吸道感染到严重的病毒性肺炎。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。疾病的严重性主要由宿主的年龄、其免疫状况和感染部位决定。

65岁和以上的老年人尤其易受攻击，占发达国家所有流感相关死亡的80-90％。患有基础性慢性疾病的个体也非常有可能经历这种并发症。幼儿也可能患严重疾病。因此，这些群体尤其需要受保护。除了这些‘风险’群体以外，卫生当局还推荐对卫生保健者进行预防接种。

接种对控制每年的流感大流行起关键作用。目前可用的流感疫苗是失活流感疫苗或减毒活流感疫苗。失活流感疫苗由三种可能形式的抗原制备物组成：失活全病毒、其中纯化的病毒颗粒被溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏的亚病毒体(所谓的“裂解疫苗”)或纯化的HA或NA(亚单位疫苗)。这些失活疫苗是肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)给予的。

所有种类的流行病使用的流感疫苗通常都是三价疫苗。一般来说，它们含有的抗原得自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株。据单向放射免疫扩散法(SRD)的检测(J.M.Wood等：An improvedsingle radial immunodiffusion technique for the assay of influenzahaemaggiutinin antigen：adaptation for potency determination of inactivatedwhole virus and subunit vaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，International collaborative study of single radial diffusion andImmunoelectrophoresis techniques for the assay of haemaggiutinin antigenof influenza virus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330)，在大多数情况下，标准0.5ml注射剂量含有每种毒株的15μg血细胞凝集素抗原组分。

每个季节加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO协同国家卫生管理局以及疫苗生产商共同确定。目前可用的流感疫苗被认为在所有年龄组都是安全的(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，很少有证据表明当前的流感疫苗在2岁以下的小孩中有作用。而且，预防典型的已确认流感疾病的疫苗效力其报告比率对老年人为23-72％，这显著低于对较年轻成年人所报告的60-90％有效率(Govaert，1994，J.Am.Med.Assoc，21，166-1665；Gross，1995，Ann Intern.Med.123，523-527)。业已表明，流感疫苗的有效性与针对病毒株的血凝反应抑制(HI)抗体的血清滴度相关，几个研究已发现较年长的成年人在流感免疫后表现出的HI滴度低于较年轻成年人(Murasko，2002，Experimental gerontology，37，427-439)。

对于老年人和处于危险之中的人群，用水包油乳液形式的佐剂MF59作佐剂的亚单位流感疫苗已商品化，已表现出其诱导高于无佐剂亚单位疫苗所获抗体滴度的抗体滴度的能力(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，在后来的出版物中，相同疫苗没有表现出其比无佐剂裂解疫苗改善的模式(Puig-Barbera等，2004，Vaccine23，283-289)。

作为背景，在大流行之间的时间段内，与之前大流行的流感病毒相关的流感病毒传播。病毒以和生命早期感染不同的免疫性水平在人之间传播。在通常2-3年的时间段内，这种传播促进对已改变得足以在一般群体中再引起流行病的新毒株的选择；此过程称为‘抗原漂移’。‘漂移变体’在任一年中在不同的社区、地区、国家或洲都具有不同影响，尽管在几年内其总体影响经常是相似的。换句话说，当出现人群对其没有免疫性的新流感病毒时，发生流感大流行。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。老年人或患有基础性慢性疾病的人最有可能经历此并发症，而幼儿也可能患严重疾病。

新流感病毒以不可预见的间隔出现，其具有与之前季节流行的毒株完全不同亚型的关键表面抗原血细胞凝集素。此时，产生的抗原可以先前于人中循环的毒株的对应蛋白的20％至50％变化。这可导致病毒逃逸‘群体免疫’，并形成大流行。此现象叫做‘抗原转变’。一般认为，至少在过去已发生了大流行，当时不同物种的流感病毒例如禽或猪流感病毒已穿过种间屏障。如果这种病毒具有人与人之间传播的潜力，它们可在数月至一年内全球扩散，导致大流行。例如，在1957年(亚洲流感大流行)，H2N2亚型病毒取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少从首先分离到该病毒的1918年开始就在人群中循环。H2HA和N2NA在1957年至1968年之间经历了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出现的H3N2流感病毒亚型替代，此后N2NA连同H3HA继续漂移(Nakajima等，1991，Epidemiol.Infect.106，383-395)。

给予流感病毒株引起大流行爆发潜力的流感病毒株特征是：与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素，其可伴有或不伴有神经氨酸酶亚型的改变；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的或乃至整个群体以前都没有遇到该抗原，在免疫学上对该抗原是原初态的。

在未接触抗原的人群中，已经对单价候选疫苗(含有大流行菌株例如非循环H2N2或H9N2菌株)进行了一些临床研究，用于评价安全和免疫原性。在有或者没有明矾佐剂的条件下，这些研究已经探究了各种HA浓度(每剂量1.9、3.8、3.8、7.5或15微克HA)的分裂或全病毒制剂。在′香港大流行期间′，当H2N2亚型的流感病毒被H3N2菌株替代时，其从1957年流行到1968年。当今，1968之后出生的个体对于H2N2菌株是免疫原初态的。已经证明这些候选疫苗是免疫原性的并且具有较好的耐受性。结果报道在下列中：Hehme，N等人2002，Med.Microbiol.Immunol.191，203-208；in Hehme N.等人2004，Virus Research103，163-171；两个研究对于H5N1进行了报道(Bresson JL等人TheLancet.2006：367(9523)：1657-1664；Treanor JJ等人N Engl J Med.2006；354：1343-1351)。其它研究已经报道了MF59作为佐剂的流感疫苗的结果。一个研究报道说，用MF59作为佐剂的两个剂量的H5N3流感疫苗，在主要人群中可促进对于流感H5N1的免疫性(Stephenson等人，Vaccine 2003，21，1687-1693)，另一个研究已经报道了对于所获得的H5N1病毒的交叉反应的抗体应答(三剂量的MF59-佐剂的流感H5N3疫苗之后)(Stephenson等人，J.Infect.Diseases 2005，191，1210-1215)。

处于流感大流行的危险情况下的人员可能不同于季节性流感的并发症所定义的危险群体。按照WHO，由禽流行性感冒菌株H5N1所引起的50％的人类病例发生在低于20岁的人群中，90％出现在年龄<40岁的人群之中。(WHO，每周疫情管理，2006年6月30日)。

在大流行期间，抗病毒药物不足以满足要求，并且处于流感危险之中的个体数目大于流行病周期中间的数目，因此，开发具有大量制备潜力和有效分配与给予潜力的合适疫苗是必要的。为此，针对大流行，需要开发单价疫苗来代替三价疫苗，以便减少疫苗用量，为了在免疫原初态接受者中实现保护性抗体水平，基本上需要两个剂量的疫苗(Wood JM等人Med Mircobiol Immunol.2002；191：197-201.Wood JM等人Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2001；356：1953-1960)。

这些问题可以用佐剂解决，其目标是提高疫苗的免疫原性，以便能够降低抗原含量(抗原减量)，由此提高可利用疫苗剂量的数目。使用佐剂也可以解决抗原在原初态人群中的潜在弱免疫原性。已经证明上述的例子可使用铝盐作为佐剂的完全失活的H2N2或H9N2病毒(N.Hehme等人Virus Research 2004，103，163-171)。对于普通的亚病毒体H5N1疫苗或氢氧化铝佐剂的分裂病毒H5N1疫苗，已经进行了临床试验。这些试验的结果表明，普通的和带有佐剂的H5N1病毒疫苗对于高达90微克的抗原剂量是安全的(只以普通亚病毒粒子疫苗的方式试验)(Bresson JL等人The Lancet.2006：367(9523)：1657-1664；Treanor JJ等人N Engl J Med.2006；354：1343-1351)。

因此，还需要增加了免疫原性的新疫苗，尤其是对抗弱的或非免疫原性的大流行菌株、或针对免疫低下的个体例如老年人。也需要具有交互保护潜力的新疫苗，在大流行之前或发生大流行时，其可以用作引发免疫原初态人群对抗大流行菌株的大流行前的或贮存疫苗。带有有效佐剂的疫苗抗原制剂是提高对于亚病毒粒子抗原的免疫应答的合适方法。在此，提供了新的佐剂制剂，其可以使抗原减量制剂对于所有年龄群体提供充分的保护(使血清阴性的受试者进行血清转化至被认为是保护性的HI滴度，1:40或滴度增加四倍)。

本发明陈述

在本发明的第一个方面，提供了一种流感免疫原性组合物，尤其是疫苗，其包含与佐剂组合的低量流感病毒抗原或其抗原性制品，所述流感病毒或其抗原性制品得自流感病毒菌株，流感病毒菌株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力，其中低抗原数量每剂量不超过15μg的血细胞凝集素(HA)，其中所述佐剂是水包油乳液，其包括可代谢油、甾醇或生育酚例如α生育酚、和乳化剂。合适的疫苗组合物是单价组合物。

贯穿该文件，大流行菌株是指与流感疾病的突发有关或对相关的流感疾病突发敏感的流感菌株形式，例如大流行性流感A菌株。合适的大流行菌株是但不局限于：H5N1，H9N2，H7N7，H2N2，H7N1和H1N1。在人类中，其它合适的大流行菌株是H7N3(在加拿大报道了2个病例)、H10N7(在埃及报道了2个病例)和H5N2(在日本报道了1个病例)。

在另一个方面，本发明提供了制备用于大流行情况或大流行前的情况的流感免疫原性组合物的方法，尤其是制备疫苗的方法，该方法包括：将流感病毒抗原或其抗原性制品与如上文定义的水包油乳液佐剂混合，提供每剂量包含不超过15μg流感血细胞凝集素抗原的疫苗单元，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自单一流感病毒菌株，其与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。流感病毒可以是卵(egg-derived)衍生的、植物衍生的、细胞培养物衍生的或可以是重组产生的。合适的是，流感病毒抗原是卵衍生的或细胞培养物衍生的。

在第三个方面，本发明提供了一种本文定义的用于药物的免疫原性组合物。

在另一方面，本发明提供了(a)本文所定义的低量流感病毒抗原或其抗原性制品和(b)水包油乳液佐剂在制备免疫原性组合物或试剂盒中的用途，所述免疫原性组合物用于在人中诱导对抗所述病毒抗原或抗原性组合物的以下至少一种：i)改善的CD4T-细胞免疫应答，ii)改善的B-细胞记忆应答，(iii)改善的体液应答，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自于单一流感菌株，流感菌株与大流行相关或具有与大流行有关的潜力。特别是，在免疫低下的个体或人群例如高风险的成年人或老年人中引起所述免疫应答。合适的免疫原性组合物如本文所定义。

本发明还提供了流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐剂在制备本文定义的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于对老年人进行抗流感接种。

在一个具体实施方案中，相比于用无佐剂抗原或抗原性组合物获得的应答，所述免疫原性组合物能够诱导改善的CD4T-细胞免疫应答和改善的B-记忆细胞应答。在另一个具体实施方案中，相比于用无佐剂抗原或抗原性组合物获得的应答，所述免疫原性组合物能够诱导改善的CD4T-细胞免疫应答和改善的体液应答。优选，所述体液免疫应答或保护满足至少一个、合适地两个、典型地所有三个用于流感疫苗效果的EU或FDA管理标准。合适地，所述免疫应答或保护是在一个、合适地两个剂量疫苗之后获得的。具体地说，在一个剂量的佐剂疫苗之后，所述免疫应答或保护满足至少一个、合适地两个、或所有三个用于流感疫苗效果的EU或FDA管理标准。具体地说，在仅仅一个剂量的疫苗之后，满足至少一个、合适地两个FDA或EU标准。下面进一步详述按照本发明组合物的效果标准(参见表1和下面的“效果标准”)。合适地，胃肠外给予所述组合物，优选通过肌注或皮下途径。

在进一步的实施方案中，提供了低量流感病毒或其抗原性制品在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用单价流感免疫原性组合物接种的人，所述单价流感免疫原性组合物包含与本文定义的水包油乳液佐剂组合的流感抗原或其抗原性制品，所述流感抗原或其抗原性制品得自单一流感病毒菌株，流感病毒菌株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。

在一个具体实施方案中，用于再接种的组合物可无佐剂，或者可含有佐剂，具体是水包油乳液佐剂。在另一个具体实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制品，它们与用于第一次接种的流感病毒或其病毒抗原性制品共有共同的CD4T-细胞表位。用于再接种的免疫原性组合物可以包含典型数量(即大约15μgHA)的所述变体大流行菌株。

合适地，再接种在已于前一季进行抗流感接种的个体中进行。合适地，用包含与第一次接种所用的相同亚型(例如H5N1越南)的流感菌株(例如H5N1越南)的疫苗进行再接种。在一个具体实施方案中，用同样亚型的漂移菌株例如H5N1印度尼西亚进行再接种。在另一个实施方案中，用于再接种的所述流感菌株是转变(shift)菌株，即其不同于第一次接种所用的菌株，例如它具有不同的HA或NA亚型，例如H5N2(与H5N1相同的HA亚型，但不同的NA亚型)或H7N1(与H5N1不同的HA亚型，但相同的NA亚型)。

合适地，在大流行开始时进行第一次接种，随后进行再接种。或者，作为引发策略，第一次接种是大流行前策略的一部分，并且在宣告大流行开始之前进行，由此，使免疫系统被引发，随后进行再接种。通常，再接种在第一次接种后至少4个月进行，优选在第一次接种后6或8-14个月进行，更优选在第一次接种后约10-12个月后或更长时间进行。合适地，一年以后或比一年以后更长的时间进行再接种，能够促进抗体和/或细胞免疫应答。这是特别重要的，因为进一步的感染高潮可能在第一大流行突发之后几个月发生。按照需要，再接种可以进行不止一次。

优选地，所述水包油乳液包含可代谢(metabolisable)油、甾醇或生育酚例如α生育酚和乳化剂。在另一个具体实施方案中，所述水包油乳液佐剂包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有小于1μm的直径。合适地，所述生育酚(例如α生育酚)是以所述免疫原性组合物的总体积的1.0％至20％的量存在的，优选1.0％至5％的量。

在本发明的另一个方面，提供了得自于第一种大流行性流感菌株的抗原或抗原性制品在制备本文定义的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于抗变体流感菌株引起的流感感染的保护作用。

在具体方面，本发明提供了接种例如高风险成人或老年人的免疫低下人类个体或群体的方法，所述方法包括：给予所述个体或人群流感免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含与本文所定义的水包油型乳状液佐剂组合的、得自于单一大流行性流感病毒株的低数量流感抗原或其抗原性制品。

在再另一个实施方案中，本发明提供了一种再接种先前用单价流感免疫原性组合物接种的人的方法，所述单价流感免疫原性组合物包含与水包油乳液佐剂组合的流感抗原或其抗原性制品，所述流感抗原或其抗原性制品得自单一大流行性流感病毒株，所述方法包括给予所述人有佐剂或无佐剂的、含流感病毒的免疫原性组合物。

在另一个实施方案中，提供了一种方法：接种人类群体或个体对抗一种大流行性流感病毒株，接着再接种所述人或群体对抗变体流感病毒株，所述方法包括给予所述人：(i)第一组合物，其包含得自于第一种大流行性流感病毒株的流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐剂，和(ii)第二免疫原性组合物，其包含所述第一种流感病毒菌株的流感病毒菌株变体。在一个具体实施方案中，所述变异菌株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。在另一个具体实施方案中，所述变异菌株是多价组合物的一部分，除了所述大流行性流感病毒变体之外，其包含至少一种循环(季节性)流感病毒菌株。优选，所述大流行性流感病毒株分别是另外包含一种、两或三种季节性菌株的二价、或三价或四价组合物的一部分。

贯穿该文件，可互换使用低数量大流行性流感病毒抗原在制备用于防止流感感染或疾病的本文所定义组合物中的用途、和使用所要求组合物来治疗人的方法。

在下面优选实施方案的详细说明中，进一步描述了本发明的其它方面和益处。

附图说明

图1：依据PCS检测的SB62水包油乳液的油滴粒度分布。图1A显示了用Malvern Zetasizer 3000HS检测的SB62批号1023的粒度测量结果：A＝稀释度1/10000(Rec22至Rec24)(用Contin和适合的光学模型1.5/0.01分析)；B＝稀释度1/20000(Rec28至Rec30)(用Contin和适合的光学模型1.5/0.01分析)。图1B显示了依据强度的记录22(上部)和记录23(下部)的示意图。

图2：雪貂实验。图2A：在用不同剂量H5N1A/Vietnam免疫的雪貂中的血球凝集抑制试验(GMT)。图2B：死亡或安乐死的当天雪貂肺组织的平均H5N1 PCR数据(左曲线)和平均病毒滴定数据(右曲线)(PCR数据可以表示为对照稀释单元(CDU)，其是用标准曲线测定的，标准曲线是由连续稀释的病毒原料产生的，用和试验样品同样的方法，即每个稀释物经受核苷酸提取和Taqman PCR扩增。病毒滴定数据可以表示为TCID₅₀/g组织)。

图3：在用不同剂量H5N1 A/越南免疫的雪貂中的抗A/印度尼西亚中和抗体应答。

图4：流感单价原液的制备综述。

图5：最终抗原原液的制剂流程图。

图6：采用剂量范围的H5N1分裂病毒抗原(带有或不带有佐剂AS03)的人临床试验。在第0、21和42天的时间点的抗HA抗体的GMT′s(具有95％CI)。

图7：采用剂量范围的H5N1分裂病毒抗原(带有或不带有佐剂AS03)的人临床试验。接种后21天和42天的抗HA抗体的血清转化率(具有95％CI)。

图8：采用剂量范围的H5N1分裂病毒抗原(带有或不带有佐剂AS03)的人临床试验。在每个时间点(0天、21天和42天)的抗HA抗体的血清保护率(具有95％CI)。

图9：采用剂量范围的H5N1分裂病毒抗原(带有或不带有佐剂AS03)的人临床试验。接种后21天和42天的抗HA抗体的血清转化因子(具有95％CI)。

图10：对于H5N1 Vietnam菌株的中和滴度(GMT：图10A；血清转化率：图10B)。HN4＝无佐剂的3.8μg HA；HN8＝无佐剂的7.5μg HA；HN4AD＝AS03佐剂的3.8μg HA；HN8AD＝AS03佐剂的7.5μg HA.

图11：对于H5N1 Vietnam菌株的CD4特异性应答。HN4＝无佐剂的3.8μg HA；HN8＝无佐剂的7.5μg HA；HN4AD＝AS03佐剂的3.8μgHA；HN8AD＝AS03佐剂的7.5μg HA.

详细说明

本发明人已发现，相比于用无佐剂病毒或其抗原性制品获得的应答，含低数量流感病毒或其抗原性制品连同水包油乳液佐剂的流感制剂能够在人或人群体中改善抗所述抗原或抗原性组合物的体液免疫应答、和/或CD4T-细胞免疫应答和/或B细胞记忆应答，其中流感病毒或其抗原性制品与大流行相关或对大流行敏感，所述水包油乳液佐剂含可代谢油、甾醇或生育酚例如α生育酚和乳化剂。它们可以防止同源流感菌株所引起的发病/致死。用本文定义的水包油乳液佐剂佐剂化的制剂有利地用于诱导抗流感的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子提呈的流感表位。用本文定义的水包油乳液佐剂进行佐剂化的制剂有利地用于诱导可交叉反应的免疫应答，即对抗变异菌株或对抗大范围相关菌株的可检测的免疫性(体液和/或细胞)。佐剂化的制剂可有效地靶向体液和/或细胞介导的免疫系统，以便提高针对同源和漂移流感菌株的响应性(当接种和感染时)。它们也有利地用于诱导交叉-引发策略，即诱导“已引发的”免疫记忆，便于在用变异菌株进行再接种(一个剂量)时的应答。

按照本发明的佐剂化的大流行性流感组合物具有几个优势：

1)改善的免疫原性：它们将对较少的免疫原性流感菌株的弱免疫应答提高至高于非佐剂化制剂所获得的免疫应答的水平；

2)使用佐剂可以在原初态人群中克服抗原的潜在的弱免疫原性；

3)它们可以在特定人群例如老年人(典型地超过60岁)中引起改善的免疫原性，达到在18至60岁的较年轻的人中所看到的水平(抗体和/或T细胞应答)；

4)它们可以引起改善的交互保护特性：改善的交叉反应性、对变异的(漂移的)流感菌株的交互保护提供了交叉引发策略的建立，其中，它们可以用作大流行前的疫苗，进一步允许，为了增强对(循环)大流行菌株，仅仅需要单剂量的大流行疫苗；

5)通过用减低的抗原剂量达到任何或所有这些进一步的益处，它们可以在紧急状况下或有准备的大流行情况下(在大流行情况下的抗原减量)确保增加的能力。

从下面说明书和实施例部分可明显地看出其它益处。根据满足流感相关性保护作用的人受试者数目的评价，本发明使用的组合物已能够在再免疫后提供更好的抗流感的血清保护作用。而且，相比于无佐剂组合物，本发明使用的组合物还能够诱导受试验人的第一次接种后的高体液应答或B细胞记忆应答，和再接种后的高应答。

相比于无佐剂化组合物所获得抗体的保护性水平，所要求的佐剂化组合物，在更多个体中不但能够诱导而且能够保持抗疫苗中存在的流感菌株的抗体保护性水平。

因此，在另一个实施方案中，要求保护的组合物能够确保针对流感相关疾病的持续性免疫应答。具体地说，所述持续性是指HI抗体免疫应答能够在接种后至少3个月后、优选至少6个月后满足管理标准。具体地说，要求保护的组合物能够在至少3个月后，在>50％的个体中、合适地在>60％的个体中、在>70％的个体中、适宜地在>80％的个体中或适宜地在>90％的个体中诱导针对疫苗中存在的大流行性流感菌株的抗体保护性水平(用保护率(参见表1)测定)。在一个具体方面，在接种后至少6个月获得针对疫苗组合物中流感菌株的>90％的抗体保护性水平。

按照本发明的进一步方面，与所提供的疫苗流感菌株的EU要求相比，要求保护的组合物能够诱导血清保护和血清阳转至更高程度。下面将其进一步详述(参见表1和下面的“效果标准”)。

流感病毒株和抗原

在一个实施方案中，按照本发明使用的流感病毒或其抗原性制品可以是裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制品。在一个替代性实施方案中，流感病毒制品可包含另一类型的失活流感抗原，例如失活全病毒或重组体和/或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)，或流感病毒颗粒。在更进一步实施方案中，流感病毒可为减毒活流感病毒制品。

适宜地，按照本发明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制品为失活病毒制品，其中病毒颗粒用去污剂或其它试剂破坏以溶解脂质包膜。适宜地，裂解病毒或其裂解病毒抗原性制品如下制备：用溶解浓度的有机溶剂或去污剂将感染性或失活的全流感病毒片段化，随后去除全部或大部分溶解剂和某些或大部分病毒脂质物质。所述其裂解病毒抗原性制品是指相比于裂解病毒可能已经受了一定程度的纯化而保留了裂解病毒组分的大部分抗原特性的裂解病毒制品。例如，当在卵中产生时，裂解病毒可从卵污染蛋白中去除，或者在细胞培养物中产生时，裂解病毒可从宿主细胞杂质中去除。裂解病毒抗原性制品可包含一种以上病毒株的裂解病毒抗原性组分。含裂解病毒的疫苗(叫做‘流感裂解疫苗’)或含裂解病毒抗原性制品的疫苗一般包含残余的基质蛋白和核蛋白，有时包含脂质以及膜包膜蛋白。这种裂解病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒结构蛋白，但不一定和它们在全病毒中存在的比例相同。

或者，流感病毒可为全病毒疫苗形式。对于大流行情况来说，其可表现出超越裂解病毒疫苗的优势，因为其避免了有关针对新流感病毒株是否可成功地产生裂解病毒疫苗的不确定性。对于某些毒株来说，用于产生裂解病毒的常规去污剂可损伤病毒，并使其无用。尽管经常有可能使用不同的去污剂和/或开发不同的裂解疫苗产生方法，但这会耗时，在大流行情况下可能不可用。全病毒法除了较大程度的确定性以外，还有比裂解病毒大的疫苗生产能力，因为在制备适宜的裂解疫苗时所必需的额外纯化步骤中有相当大量的抗原损失。

在另一个实施方案中，流感病毒制品为纯化的亚单位流感疫苗形式。亚单位流感疫苗一般包含两种主要的包膜蛋白HA和NA，可能具有超越全病毒体疫苗的额外优势，因为它们一般无反应原性，尤其是在年轻的接种者中。亚单位疫苗可重组产生，或者可由破裂的病毒颗粒纯化。

在另一个实施方案中，流感病毒制品为病毒体形式。病毒体是球形的单层囊泡，其保留了真实构象中的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA，插入病毒体的磷脂双层膜中。

所述流感病毒或其抗原性制品可为卵源的或组织培养源的。它们也可以在其它系统中产生，例如在昆虫细胞、植物、酵母菌或细菌中产生，或重组产生。

例如，按照本发明的流感病毒抗原或其抗原性制品可来源于常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的尿囊液。卵可在短时间内大量累积。或者，它们可来源于任一种使用组织培养物的新生产方法，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基质包括例如狗肾细胞，例如MDCK或由MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括Vero细胞，合适的猪细胞系，或适于生产疫苗用途的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基质还包括人细胞，例如MRC-5或Per-C6细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如原初细胞，如小鸡胚成纤维细胞，还包括禽细胞系。

流感病毒抗原或其抗原性制品可通过众多工业用方法中的任一种生产，例如在专利号DD 300833和DD 211444(通过引用结合到本文中)中描述的裂解流感病毒法。裂解流感病毒传统上使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚组合Tween^TM(称作“Tween-醚”裂解)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如在专利号DD 155875(通过引用结合到本文中)中描述的脱氧胆酸钠。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)；其它离子去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子去污剂，如上述的一种，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals 28，95-103描述的方法中)和Triton N-101；或者任何两种或多种去污剂的组合。

裂解疫苗的制备方法可包括众多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交换)步骤，以及任选的例如采用热、甲醛或β-丙酸内酯或紫外线的失活步骤，其可在裂解前或后进行。裂解过程可以分批、连续或半连续过程进行。用于裂解免疫原性组合物的优选裂解和纯化方法描述于WO 02/097072中。

按照本发明的合适裂解流感疫苗抗原制品包含生产过程剩余的残余量的Tween 80和/或Triton X-100，虽然这些物质可在裂解抗原制备后加入或调整其浓度。优选地，Tween 80和Triton X-100都存在。疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为：

Tween 80:0.01-1％，优选大约0.1％(v/v)

Triton X-100:0.001-0.1(％w/v)，优选为0.005-0.02％(w/v)。

在一个具体实施方案中，Tween 80的终浓度在0.045％-0.09％(w/v)的范围内。在另一个具体实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Tween 80浓度在0.045％-0.2％(w/v)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。

在另一个具体实施方案中，Triton X-100的终浓度在0.005％-0.017％(w/v)的范围内。在另一个具体实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Triton X-100浓度在0.005％-0.034％(w/v)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。

优选地，流感病毒制品在低水平防腐剂、尤其是硫柳汞存在下制备，或优选地在没有硫柳汞的情况下制备。优选地，获得的流感制品在没有有机汞防腐剂的情况下是稳定的，具体地说，所述制品不含残余硫柳汞。具体地说，流感病毒制品包含在没有硫柳汞的情况下或在低水平硫柳汞(一般来说为5μg/ml或以下)的情况下稳定的血细胞凝集素抗原。具体地说，乙型流感毒株的稳定利用α生育酚的衍生物如α生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯，即VES)来实施。这种制品及其制备方法公开于WO 02/097072中。

或者，尤其是多剂量容器，为了降低污染危险，应该存在硫柳汞或任何其它合适的防腐剂。这尤其与大流行疫苗相关，这种大流行疫苗是为了在最短的合适时间内接种尽可能多的人而设计的。

除了大流行性流感菌株之外，用于再接种的合适组合物还包含三种失活裂解病毒体抗原(由WHO建议的合适流感季病毒的菌株制备)

在一个实施方案中，流感病毒或其抗原性制品和水包油型乳状液佐剂包含在相同器皿中。这被称为‘单瓶法’。优选地，所述瓶为预填充注射器。在一个替代实施方案中，流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐剂包含在单独的容器或瓶或单元中，并在给予个体之前不久或给予个体时混合。这被称为‘双瓶法’。作为实例，当疫苗为0.5ml总注入剂量体积的2组分疫苗时，浓缩抗原(例如浓缩失活裂解病毒体抗原)可以存在于1个瓶(330μl)(抗原容器，例如管瓶)中，预填充注射器含佐剂(400μl)(佐剂容器，例如针筒)。典型地，大流行疫苗是0.5ml注射剂量，并且多次剂量瓶包含1:1管瓶：管瓶混合物，而后第一次给个体注入。或者，大流行疫苗是1.0ml管瓶：针筒注射剂量。在注射时，使用含佐剂的注射器将含浓缩的失活裂解病毒体抗原的瓶中的内容物由瓶中取出，接着轻微混合注射器。在注射前，使用的针用肌内针替换，体积调整到530μl。一剂重配的佐剂化流感疫苗候选物相当于530μl。

优选，佐剂化大流行性流感候选疫苗是由0.5ml浓缩失活裂解病毒体抗原(存在于I型玻璃管中)和包含0.5ml佐剂的预先填充的I型玻璃注射器组成的2组份疫苗。或者，疫苗是存在于2个管瓶(一个用于抗原，一个用于佐剂，每个10剂量)中的2组分疫苗，在给予第一个患者之前进行混合，随后在4℃贮存短时期(例如至多一周)，用于随后的给予。在注射时，将包含佐剂的预装填针筒的内含物注入到管瓶中，该管瓶包含浓缩三价体失活裂解病毒抗原。混合之后，将内含物排出到针筒中，用肌注针替代上述针。一剂重配的佐剂化流感病毒候选疫苗相当于0.5ml。0.5ml的每个疫苗剂量包含1.9μg、3.8μg、7.5μg、15μg或30μg血细胞凝集素(HA)或任何合适数量的HA，其是根据疫苗组合物满足本文所定义的效果标准来确定的。1ml的疫苗剂量(0.5ml佐剂加上0.5ml抗原制剂)也是合适的。

根据本发明，在本文定义的单价免疫原性组合物中的流感病毒菌株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。这种毒株在下文还可称为‘大流行株’。具体地说，当疫苗为用于再接种的多价疫苗如二价或三价或四价疫苗时，至少一种毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。适宜的毒株是、但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1和H1N1。在人类中，其它大流行菌株：H7N3(在加拿大报道了2个病例)、H10N7(在埃及报道了2个病例)和H5N2(在日本报道了1个病例)。

用于再接种的所述流感病毒或其抗原性制品适宜地为多价的，例如二价或三价或四价，或包含甚至更多流感病毒菌株。优选地，用于再接种的流感病毒或其抗原性制品为三价的或四价的，其具有得自三种不同流感株的抗原，至少一种菌株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。优选，该再接种组合物包含大流行菌株(其可以是存在于用于第一次接种的组合物中的大流行菌株的变体)和三种其它的菌株，典型地是传统流行的菌株。

或者，合适的大流行前疫苗策略需要用不同的潜在大流行菌株来定期(例如每1-2年)免疫，随着时间的推移，可以保持和扩大对这些病毒的应答的目标。例如，在一个实施方案中，在一年中用要求保护的佐剂化单价疫苗(包含一种大流行菌株例如H5N1)进行第一次接种，而后在下一个时点(例如六个月、一年或两年之后)接种包含不同大流行性流感菌株例如H9N2的佐剂化组合物，然后用包含另一种大流行性流感菌株例如H7N7的佐剂化组合物接种，等等。由于不可能预计a)潜在大流行的时间和b)具体大流行菌株，在适当时候，依赖要求保护的佐剂化组合物的这种策略将增加保护性免疫应答的最大幅度和宽度的保险性。在这些策略中，优选本文所定义的佐剂。

引起大流感疾病流行或与大流行性流感菌株相关的流感疾病爆发潜在性的流感病毒株的特征是：与当前循环菌株中的血细胞凝集素相比，其包含新血细胞凝集素，因此几乎所有的人是免疫原初态的；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的或乃至整个群体以前都没有遇到该抗原，在免疫学上对该抗原是原初态的。目前，作为一种WHO确定的可在人类中潜在地引起大流行的甲型流感病毒，是高度致病的H5N1禽流感病毒。因此，按照本发明的大流行疫苗优选包含H5N1病毒。

一般来说，在大流行环境下，某些群体被流感感染的风险增加。老年人、慢性疾病患者和小孩尤其易感，但许多年轻人和表面上健康的人也有风险。对于H2流感，1968年后出生的部分群体承受的风险增加。对这些群体重要的是尽快地和以简单的方式有效地进行保护。

承受增加的风险的另一个人群是旅行者。今天，人们比以往任何时候都更常旅行，到达出现最多新病毒的地区；中国和东南亚在近些年已成为受欢迎的旅行目的地。传播模式的这种改变能使新病毒在约数周内而不是数月或数年内到达全球。

因此，对于这些人群来说，在大流行情况下或潜在大流行的情况下特别需要接种保护来防止流感。适宜的大流行毒株是、但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H7N1、H2N2和H1N1。在人类中，其它的大流行菌株：H7N3(在加拿大报道了2个病例)、H10N7(在埃及报道了2个病例)和H5N2(在日本报道了1个病例)。

水包油乳液佐剂

本发明的佐剂组合物包含水包油乳液佐剂，优选，所述乳液包含可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，该油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。

为了使任意水包油组合物适于给予人，乳液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢可定义为‘能够通过代谢被转化’(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，25th edition(1974))。所述油可为任意植物油、鱼油、动物油或合成油，它们对接受者是无毒的，能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常用的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括商品化油，例如NEOBEE

等。特别合适的可代谢油是鲨烯。鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的特别优选的油。鲨烯是可代谢油缘于以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(Merck index，第10版，编目流水号8619)。

水包油乳液自身在本领域众所周知，已表明可用作佐剂组合物(EP399843；WO 95/17210)。

适宜地，可代谢油以免疫原性组合物总体积的0.5％至20％(终浓度)的量存在，优选以总体积的1.0％至10％的量存在，优选以总体积的2.0％至6.0％的量存在。

在一个具体实施方案中，可代谢油以免疫原性组合物总体积的约0.5％、1％、3.5％或5％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，可代谢油以免疫原性组合物总体积的0.5％、1％、3.57％或5％的最终量存在。鲨烯的合适数量为每疫苗剂量大约10.7mg，优选每疫苗剂量10.4至11.0mg。

优选，本发明的水包油乳化系统具有亚微米范围的小油滴粒度。适宜地，油滴的直径大小在120-750nm的范围内，更优选直径大小在120-600nm的范围内。典型地，水包油乳液包含油滴，其至少70％(以强度(intensity)计)的直径低于500nm，优选至少80％(以强度计)的直径低于300nm，更优选至少90％(以强度计)的直径在120-200nm的范围内。

按照本发明的油滴粒度，即直径，以强度给出。有几种方法测定以强度计的油滴直径大小。强度使用粒度测量仪检测，适宜地通过诸如Malvern Zetasizer 4000或优选Malvern Zetasizer 3000HS的动态光散射检测。详细的方法在实施例II.2中给出。第一个可能性是通过动态光散射(PCS-光子相关光谱法)测定z均值直径ZAD；该方法额外给出了多分散指数(PDI)，ZAD和PDI这二者均用累积量算法计算。这些值不需要粒子折射率的信息。第二个方法是通过Contin或NNLS的另一种算法或自动化“Malvern”法(由粒度测量仪提供的默认算法)测定整体粒度分布来计算油滴直径。多半情况下，由于复杂组合物的粒子折射率是未知的，所以只能考虑强度分布，如果有需要，考虑由该分布获得的强度平均值。

按照本发明的水包油乳液包含甾醇或生育酚，例如α生育酚。甾醇在本领域众所周知，例如胆固醇是周知的，例如公开于Merck Index，第11版，341页，为动物脂肪中天然存在的甾醇。其它适宜的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇和麦角钙化甾醇。所述甾醇适宜地以免疫原性组合物总体积的0.01％至20％(w/v)的量存在，优选以0.1％至5％(w/v)的量存在。优选，当甾醇为胆固醇时，其以免疫原性组合物总体积的0.02％至0.2％(w/v)的量存在，典型地以0.5ml疫苗剂量体积的0.02％(w/v)的量存在，或者以0.5ml疫苗剂量体积的0.07％(w/v)的量存在，或者以0.7ml疫苗剂量体积的0.1％(w/v)的量存在。

适宜地，存在α-生育酚或其衍生物例如α-生育酚琥珀酸酯。优选，a-生育酚以免疫原性组合物总体积的0.2％至5.0％(v/v)的量存在，更优选以0.5ml疫苗剂量体积的2.5％(v/v)的量存在，或者以0.5ml疫苗剂量体积的0.5％(v/v)的量存在，或者以0.7ml疫苗剂量体积的1.7-1.9％(v/v)、优选以1.8％的量存在。为明晰起见，以v/v给出的浓度可通过应用以下转换系数转变为以w/v表示的浓度：5％(v/v)a-生育酚浓度等于4.8％(w/v)a-生育酚浓度。α-生育酚的合适数量为每疫苗剂量大约11.9mg，优选每疫苗剂量11.6至12.2mg。

水包油乳液含有乳化剂。以免疫原性组合物重量计(w/w)，乳化剂可以以0.01-5.0％的量存在，优选以重量计(w/w)以0.1-2.0％的量存在。以总组合物的重量计(w/w)的合适浓度为0.5-1.5％。

乳化剂可适宜地为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween80)。在一个具体实施方案中，0.5ml疫苗剂量体积含1％(w/w)Tween80，和0.7ml疫苗剂量体积含0.7％(w/w)Tween80。在另一个具体实施方案中，Tween80的浓度是0.2％(w/w)。聚山梨酸酯80的合适数量为每疫苗剂量大约4.9mg，优选每疫苗剂量4.6至5.2mg。

合适地，疫苗剂量包含大约11.9mg(每疫苗剂量)量的α-生育酚、10.7mg(每疫苗剂量)量的鲨烯和大约4.9mg(每疫苗剂量)量的聚山梨酸酯80。

水包油乳液佐剂可与其它佐剂或免疫刺激剂一起使用，因此本发明的一个重要实施方案是一种含鲨烯或另一种可代谢油、生育酚例如a-生育酚和tween80的水包油制剂。水包油乳液还可包含span85和/或卵磷脂。典型地，水包油包含免疫原性组合物总体积的2-10％的鲨烯、2-10％的a-生育酚和0.3-3％的Tween 80，并可按照WO 95/17210中描述的方法生产。优选，鲨烯：a-生育酚的比率等于或小于1，因为其提供更稳定的乳液。Span85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯)也可例如以1％的水平存在。

用于本发明的第一次接种的免疫原性组合物的免疫原性特性

在本发明中，相比于用无佐剂(即不含任何外源佐剂)的对应组合物(本文称为‘普通组合物’)获得的CD 4T-细胞免疫应答，单价流感组合物能够针对至少一种组成抗原或抗原性组合物诱导改善的CD4 T-细胞免疫应答。在一个具体的实施方案中，所述改善的CD4 T-细胞免疫应答是针对大流行流感株。

所述‘改善的CD4 T-细胞免疫应答’指在给予佐剂化的免疫原性组合物之后在人类受试者中获得的CD4应答高于在给予无佐剂的相同组合物后获得的免疫应答。例如，与给予含流感病毒或其抗原性制品的无佐剂免疫原性组合物之后诱导的应答相比，在给予含流感病毒或其抗原性制品连同水包油乳液佐剂的免疫原性组合物时于人类患者中获得较高的CD4 T-细胞应答，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、生育酚例如α生育酚和乳化剂。这种制剂将有利地用于诱导抗流感的CD 4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子提呈的流感表位。

优选，由本发明使用的佐剂化裂解流感病毒组合物诱导的所述免疫应答，高于用任意其它无佐剂常规流感疫苗(例如亚单位流感疫苗或全流感病毒疫苗)诱导的免疫应答。

具体地但非排它性地，所述‘改善的CD4 T-细胞免疫应答’是在免疫学未初免的受试者(即对所述流感病毒或抗原为血清阴性的受试者)中获得的。此血清阴性可能是由于从未面对此病毒或抗原的所述受试者(所谓的‘原初’受试者)的结果，或者是在曾经遭遇时未能对所述抗原应答的所述受试者的结果。优选，所述改善的CD4 T-细胞免疫应答在免疫应答受损受试者中获得，所述免疫应答受损受试者例如为老年人，通常至少50岁，典型地为65岁或以上，或者是具有高风险医疗状况的小于65岁的成人(‘高风险成人’)，或者是2岁以下的儿童。

改善的CD4 T-细胞免疫应答可通过检测产生以下任一种细胞因子的细胞数目来评价：

·产生至少两种不同细胞因子(CD40L，IL-2，IFNγ，TNFα)的细胞

·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2，TNFα，IFNγ)的细胞

·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L，TNFα，IFNγ)的细胞

·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2，TNFα，CD40L)的细胞

·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2，CD40L，IFNγ)的细胞

当和给予无佐剂组合物相比在给予有佐剂组合物后产生任一种以上细胞因子的细胞的量较高时，将存在改善的CD4 T-细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少一种、优选两种将被实现。在一个具体实施方案中，与无佐剂组相比，有佐剂组中产生全部四种细胞因子的细胞将以更高量存在。

在一个具体实施方案中，本发明的有佐剂流感组合物可以赋予改善的CD4 T-细胞免疫应答，并且所述应答可在单次给药后理想地获得。例如在快速发展的爆发情况下，单剂方法将有极为重大的意义。在某些情况下，尤其是对于老年人群，或者对于首次接种流感病毒的小孩(9岁以下)，或在大流行情况下，给予两剂相同的该季组合物可能是有益的。第二剂所述相同组合物(仍被看作是‘用于首次接种的组合物’)可在初始免疫应答正在进行的过程中给予，并有足够的时间间隔。通常，第二剂组合物在首剂后数周或约1个月(例如2周、3周、4周、5周或6周)给予，以帮助触发无应答或低应答个体的免疫系统。在一个具体方面，首次接种后，随后进行包含异源流感病毒菌株的佐剂化疫苗产品的接种过程。

在一个具体实施方案中，与在无佐剂组合物免疫的个体中诱导的B记忆细胞应答相比，交替地或额外地给予所述免疫原性组合物，在给予有佐剂免疫原性组合物的受试者中诱导改善的B-记忆细胞应答。改善的B-记忆细胞应答意指在遭遇抗原时能够分化为分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率增加，这通过体外分化刺激进行检测(参见实施例部分，例如Elispot B细胞记忆的方法)。

在另一个具体实施方案中，用有佐剂的首次接种用组合物接种，对CD8应答没有可检测的影响。

合适地，与水包油型乳状液佐剂一起配制的包含流感病毒或其抗原性制品的要求保护的组合物，可在免疫低下的人群中有效地促进T细胞应答，优选，水包油型乳状液佐剂包含可代谢的油、甾醇或生育酚例如α生育酚和乳化剂。合适地，根据流感疫苗保护作用的关联性评价，与用无佐剂流感疫苗接种提供的血清保护作用相比，给予单剂本发明所述的首次接种用免疫原性组合物，接着针对流感病毒再接种，能够提供更好的血清保护作用。相比于用无佐剂制剂获得的免疫应答，要求保护的佐剂化制剂还将针对流感病毒诱导改善的CD4 T-细胞免疫应答。这种性能可能与接种或面对流感抗原性接触的感染时增加的应答性相关。而且，其还可能与交叉反应性相关，即对变体流感株应答的能力较高。这种定性和/或定量改善的应答可能在大流行情况下的所有人群中是有利的，特别是在免疫缺失人群如老年人群(65岁和以上)中，尤其是高风险老年人中是如此。这对于婴儿人群(5岁以下，优选2岁以下)也是有益的。在大流行突发之前或在大流行突发开始时，这种改善的应答对于例如用包含漂移变体的贮存疫苗进行引发的用途是有益的。这可导致降低整体的发病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感样疾病的紧急入院。而且，与用无佐剂制剂诱导的应答相比，其允许诱导时间更持久的CD4 T细胞应答，例如在首次接种后仍存在1年。

优选，CD4 T-细胞免疫应答，例如在未接触抗原的个体中获得的改善的CD4 T-细胞免疫应答，包括诱导交叉反应性CD4 T辅助应答。具体地说，增加了交叉反应性CD4 T细胞的量。所述‘交叉反应性’CD4应答是指CD4 T-细胞靶向流感株之间的共有表位。

通常，可用的流感疫苗仅有效对抗具有相似抗原性特征的血细胞凝集素的流感病毒感染株。当感染(循环)性流感病毒已经历了表面糖蛋白(具体地说是血细胞凝集素)的微小变化(例如点突变或导致氨基酸改变的点突变累积)时(抗原漂移变体病毒株)，疫苗仍可提供一些保护作用，虽然其可能仅提供有限的保护作用，因为新产生的变体可能逃脱先前流感感染或接种诱导的免疫性。抗原漂移是流行间隔期间发生的年度大流行的原因(Wiley & Skehel，1987，Ann.Rev.Biochem.56，365-394)。交叉反应性CD4 T细胞的诱导为本发明组合物提供了额外的优势，因为其还可提供交叉保护作用，换句话说是抗异源感染的保护作用，所述异源感染即由为免疫原性组合物中包含的流感病毒株的变体(例如漂移变体)的循环流感病毒株引起的感染。这在循环菌株难以在卵中繁殖或难以在组织培养物中产生时可能是有利的，使漂移株用作备选工作株。这在受试者以几个月或一年间隔接受第一次和第二次接种时也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性组合物中的流感株是用于首次接种的组合物中使用的菌株的漂移变体株。

因此，本文定义的佐剂化流感免疫原性组合物在接种的老年受试者中具有较高的诱导血清保护作用和交叉反应性CD4 T细胞的能力。该特征可能与对免疫原性组合物中存在的菌株的变体株应答的能力较高有关。这在大流行情况下可证明是重要的优势。例如，在随后用所述漂移株接种时或由所述漂移株感染时，含H5、H2、H9、H7或H6菌株中的任一种的单价流感免疫原性组合物可提供较高的对大流行变体(即所述大流行株的漂移株)应答的能力。

用流感疫苗接种后的交叉反应性CD4 T-细胞的检测

在给予传统的三价流感疫苗后(3周)，外周血CD4 T-细胞对抗原性菌株制品(全病毒或裂解抗原)应答的频率显著增加，所述抗原性菌株制品与疫苗中存在的一种抗原(H3N2：A/Panama/2007/99，H1N1：A/NewCaledonia/20/99，B：B/Shangdong/7/97)(参见实施例III)是同源的。如果用分类为漂移株(H3N2：A/悉尼/5/97，H1N1：A/北京/262/95，B：B/Yamanashi/166/98)的流感株再刺激外周血CD4 T-细胞，则可以见到相当大的频率增加。

相反，如果由本领域的专家用分类为转变株(H2N2：A/新加坡/1/57；H9N2：A/香港/1073/99)的流感株再刺激外周血CD4 T-细胞，则在接种后没有可观测的增加。

能够识别同源和漂移的流感株两者的CD4 T-细胞在本文件中已命名为“交叉反应性”。如本文所述的有佐剂流感组合物已能够显示出异亚型的交叉反应性，因为存在可观测的抗漂移流感株的交叉反应性。如上所述，大流行疫苗制剂有效对抗漂移大流行菌株的能力在大流行情况下可证明是重要的特征。

与以上观测结果相一致，已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4T-细胞表位(Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995 J Virol.199569(12)：7497-506)。

由于其免疫原性的性能，要求保护的组合物能针对人类流感病毒大流行的威胁来建立预防性接种策略，包括贮存大流行前疫苗，以便较好地预防大流行的开始。

具体地说，大流行前疫苗是已经生产的疫苗，例如通过使用反向遗传学、使用与目前在鸟群中流行的菌株相似的H5N1的菌株(禽流感病毒)。在对大流行前疫苗应答中形成的免疫性使免疫系统得到‘引发’或‘训练’而做好准备，并因此在遇到真实的大流行病毒株(引起对流感病毒的相关大流行菌株的低敏感性)之后，更快速形成保护性的免疫应答。一旦WHO已经宣布大流行、并且确定最终大流行菌株是漂移菌株时，也可以使大流行前疫苗对大流行疫苗更快速的产生免疫应答(当后者可得到时)。

在一个具体实施方案中，有佐剂组合物可提供额外利益，该利益提供了针对循环菌株的更好的保护作用，所述循环菌株经历了血细胞凝集素的大改变(例如基因重组，例如两个不同物种之间的基因重组)(抗原转变)，现行疫苗对其无效。

其它佐剂

组合物可包含另外的佐剂，具体地说为TRL-4配体佐剂，适宜地为脂质A的无毒衍生物。适宜的TRL-4配体为3脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。其它适宜的TLR-4配体为脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。

在一个实施方案中，所述组合物可另外包括Toll样受体(TLR)4配体，例如脂质A的无毒衍生物，具体地说是单磷酰脂质A，或者更具体地说是3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。

3D-MPL由Corixa公司(现在的GSK)以商标MPL

销售(本文称为MPL)，主要促进具有IFN-γ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。其可按照GB 2 220 211 A中公开的方法制备。在化学上，其是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选，在本发明组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒度使得其可通过0.22μm滤器除菌过滤。此制备描述于WO94/21292和实施例II中。

3D-MPL可以例如每个组合物剂量1-100μg(w/v)的量使用，优选以每个组合物剂量10-50μg(w/v)的量使用。合适量的3D-MPL例如为每个组合物剂量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg(w/v)中的任一个。更优选，每个组合物剂量的3D-MPL的量在25-75μg(w/v)的范围内。通常，组合物剂量将在约0.5ml至约1ml的范围内。典型的疫苗剂量为0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1ml。在一个合适实施方案中，每ml疫苗组合物包含50μg3D-MPL的终浓度，或每0.5ml疫苗剂量包含25μg3D-MPL的终浓度。在其它合适实施方案中，每ml疫苗组合物包含35.7μg或71.4μg3D-MPL的终浓度。具体地说，0.5ml疫苗剂量体积每剂含25μg或50μg 3D-MPL。

MPL的剂量适宜地能够在人中增强针对抗原的免疫应答。具体地说，相比于无佐剂组合物，或相比于用另一种MPL量作佐剂的组合物，适宜的MPL量是能改善所述组合物的免疫效力的量，同时反应原性模式可接受。

合成的脂质A的衍生物是已知的，其中一些被描述为TLR-4激动剂，其包括但不限于：

OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026)

OM 294DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)

其它合适的TLR-4配体例如为脂多糖及其衍生物、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞体病毒的F蛋白。

用于本发明的另一种合适的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。QuilA是分离自南美奎拉雅属皂树(Quilaja Saponaria Molina)的皂苷制品，首先由Dalsgaard等在1974年描述(“Saponin adjuvants”，Archiv.fü r diegesamte Virusforschung，44卷，Springer Verlag，Berlin，243-254页)具有佐剂活性。已通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留了佐剂活性，没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS-21是一种来源于奎拉雅属皂树(Quilaja Saponaria Molina)树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答，在本发明范围内是优选的皂苷。

业已描述了QS21的具体制剂，它们是特别优选的，这些制剂还包含甾醇(WO96/33739)。构成本发明一部分的皂苷可为水包油乳液形式(WO 95/17210)。

再接种和用于再接种的组合物(加强组合物)

本发明的一个方面提供了流感抗原在制备流感免疫原性组合物中的用途，所述流感免疫原性组合物用于再接种先前用本文要求保护的单价流感组合物或含变体流感株的所述单价流感组合物接种的人，所述单价流感组合物与本文定义的水包油乳液佐剂一起配制。

通常，再接种于首次接种后至少6个月进行，优选于首次接种后8-14个月进行，更优选于首次接种后约10-12个月进行。

用于再接种的免疫原性组合物(加强组合物)可包含任意类型的抗原制品，其是失活的、重组的或者是活减毒的。其可包含相同类型的抗原制品，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制品、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒，作为首次接种用的免疫原性组合物。或者，加强组合物可包含首次接种所使用流感抗原类型之外的另一种类型的流感病毒抗原，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制品、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒。优选，使用裂解病毒或全病毒体疫苗。

相应地，在一个实施方案中，本发明提供了流感病毒或其抗原性制品在制备免疫原性组合物中的用途，该免疫原性组合物用于再接种先前用本文要求保护的单价大流行免疫原性组合物接种的人。

加强组合物可有佐剂或无佐剂。在一个实施方案中，用于再接种的组合物是无佐剂的，并且是传统的流感疫苗，其包含3种由WHO推荐的适宜流感季毒株制备的失活裂解病毒体抗原，例如肌肉内给予的Fluarix^TM/

在另一个实施方案中，用于再接种的组合物是有佐剂的。优选，加强组合物包含水包油型乳状液佐剂，尤其是包含可代谢的油、甾醇或生育酚例如α生育酚和乳化剂的水包油型乳状液佐剂。具体地说，所述水包油乳液佐剂包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，该油滴的至少70％(以强度计)具有小于1μm的直径。或者，加强组合物包含明矾佐剂，既可以是氢氧化铝、也可以是磷酸铝或两者的混合物。

在一个实施方案中，用本文所定义的大流行性流感组合物进行第一次接种，优选用裂解流感病毒组合物，并且如下进行再接种。

在另一个具体实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制品，它们与用于第一次接种的流感病毒或其病毒抗原性制品共有共同的CD4 T-细胞表位。共同的CD4 T-细胞表位意指可由相同CD4细胞识别的不同抗原的肽/序列/表位(参见例如以下描述的表位：Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 JVirol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995J Virol.199569(12)：7497-506)。

在按照本发明的一个实施方案中，加强组合物为一种单价流感组合物，其包含与大流行相关或具有与大流行相关的潜力的流感菌株。适宜的毒株是、但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1和H1N1。所述菌株可与存在于首次接种用组合物中的菌株相同，或与其中一种菌株相同。在一个替代实施方案中，所述菌株可为首次接种用组合物中存在的菌株的变体菌株，即漂移菌株。

在另一个具体实施方案中，用于再接种的组合物是多价流感疫苗。具体地说，当加强组合物为多价疫苗如二价、三价或四价疫苗时，至少一种毒株与大流行相关或具有与大流行相关的潜力。在一个具体实施方案中，加强组合物中的两种或多种毒株是大流行菌株。在另一个具体实施方案中，加强组合物中的至少一种大流行菌株与首次接种用组合物中存在的菌株同型，或与其中一种菌株同型。在一个备选实施方案中，至少一种菌株可为首次接种用组合物中存在的至少一种大流行菌株的变体株，即漂移株。

因此，在本发明的另一方面，提供得自第一种大流行流感菌株的流感病毒或其抗原性制品在制备本文定义的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于对抗由流感菌株(为所述第一种流感菌株的变体)引起的流感感染而起保护作用。

因此，在本发明的另一方面，提供了

(a)得自第一种流感菌株的流感病毒或其抗原性制品和

(b)本文定义的水包油乳液佐剂

在制备本文所定义的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于针对流感菌株(为所述第一种流感株的变体)引起的流感感染而起保护作用。

再接种用组合物可有佐剂或无佐剂。

通常在使用时，加强组合物于下一个流感季给予，例如在第一个免疫原性组合物之后约1年给予。加强组合物还可每个随后年给予(第三次、第四次、第五次接种等)。加强组合物可与首次接种所使用的组合物相同。适宜地，加强组合物包含流感病毒或其抗原性制品，其为首次接种所使用的流感病毒的变体株。具体地说，流感病毒株或其抗原性制品是按照世界卫生组织发布的参考材料选择的，使得它们适合于在再接种年循环的流感菌株。合适地，在大流行开始时进行第一次接种，随后进行再接种。合适地，用包含与第一次接种相同亚型(例如H5N1 Vietnam)的流感菌株(例如H5N1 Vietnam)的疫苗进行再接种。在一个具体实施方案中，用同样亚型的漂移菌株例如H5N1印度尼西亚进行再接种。在另一个实施方案中，用于再接种的所述流感菌株是转变(shift)菌株，即其不同于第一次接种所用的菌株，例如它具有不同的HA或NA亚型，例如H5N2(与H5N1相同的HA亚型，但不同的NA亚型)或H7N1(与H5N1不同的HA亚型，但相同的NA亚型)。

用于再接种的流感抗原或抗原性组合物优选包含适宜的上述佐剂或水包油乳液。所述佐剂可为如上文所述的水包油乳液佐剂，其是优选的，任选地包含额外的佐剂，例如TLR-4配体，如3D-MPL或皂苷，或者可为另一种合适的佐剂，例如明矾或明矾替代物，例如聚磷腈。

优选，相比于用无佐剂流感病毒或其抗原性制品第一次接种后诱导的对等应答，再接种诱导以下的任一种、优选两种或全部：(i)针对流感病毒或其抗原性制品的改善的CD4应答，或(ii)改善的B细胞记忆应答或(iii)改善的体液应答。优选，用本文定义的有佐剂流感病毒或其抗原性制品再接种后诱导的免疫应答高于用无佐剂组合物再接种后诱导的相应的应答。优选，在用有佐剂的、优选裂解的流感病毒组合物首次接种的人群中，用无佐剂的、优选裂解的流感病毒再接种后诱导的免疫应答高于在用无佐剂的、优选裂解的流感病毒组合物首次接种的人群中的对应应答。

按照本发明的一方面，用含流感病毒和本文定义的水包油乳液佐剂的加强组合物再接种受试者，显示出的抗体滴度高于用无佐剂组合物首次接种并用无佐剂组合物加强的人群中的对应值，其中所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇或生育酚例如α生育酚和乳化剂。佐剂增强针对再接种的抗体应答的效力，在已知对流感病毒接种或感染具有低应答的老年人中尤其重要。尤其是，就改善再接种后的CD4 T-细胞应答而言，与有佐剂组合物相关的利益也是显著的。

相比于对照疫苗赋予的保护作用，本发明的有佐剂组合物能够诱导抗漂移菌株(下一流感季的流感菌株)的更好的交叉响应性。所述交叉响应性表现出的持久性比用无佐剂制剂获得的持久性高。所述佐剂增强抗漂移菌株的交叉响应性的作用对于大流行情况很重要。

在进一步的实施方案中，本发明涉及一种接种方案，其中首次接种用含流感菌株的流感组合物、优选裂解流感组合物进行，其中所述流感菌株可潜在地引起大流行爆发，再接种用包含至少一种流行菌株(既可以是大流行菌株、也可以是传统菌株)的单价或多价组合物进行。

HA中的CD4表位

此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表位区。已知被病毒用于逃避宿主免疫系统的适应性应答的不同流感株之间CD4和B细胞表位的任何差异都将在流感接种中起重要作用。

由不同的流感菌株共享的CD4T细胞表位已经在人类中鉴别出(见例如：Gelder C等人，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM et al.1996 J Virol.70(7)：4787-90；and Gelder CM等人，1995 J Virol.199569(12)：7497-506)。

在一个具体的实施方案中，再接种使用含流感病毒或其抗原性制品的加强组合物进行，所述流感病毒或其抗原性制品与第一次接种所使用的流感病毒抗原或其抗原性制品共有共同的CD4 T-细胞表位。因此，本发明涉及含大流行流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐剂(具体地说为含可代谢油、甾醇或生育酚例如a生育酚和乳化剂的水包油乳液佐剂)的免疫原性组合物在制备多剂量疫苗的首次接种组份中的用途，所述多剂量疫苗还包含作为加强剂量的流感病毒或其抗原性制品，它们与第一次接种时所给予剂量的大流行流感病毒抗原或其病毒抗原性制品共有共同的CD4 T-细胞表位。

接种方法

本发明的组合物可通过任意合适的递送途径给予，例如皮内、粘膜如鼻内、口服、肌内或皮下。其它传递途径在本领域众所周知。

肌内递送途径对有佐剂流感组合物是特别优选的。按照本发明的组合物可以存在于单剂量器皿中，或者存在于多剂量器皿中，尤其适于大流行疫苗。在这种情况下，典型地存在抗菌防腐剂例如硫柳汞，以防止在使用期间污染。优选存在5μg/0.5ml剂量(即10μg/ml)或10μg/0.5ml剂量(即20μg/ml)的硫柳汞浓度。可以使用合适的IM递送装置，例如无针液体喷射注入装置，例如Biojector 2000(Bioject，Portland，OR)。或者笔式喷射器，例如，用于家庭递送肾上腺素，可用于自我给予疫苗。使用这种递送装置尤其可以用于大规模免疫活动，例如在大流行期间所要求的免疫。

皮内递送是另一个适宜的途径。任意合适的装置都可用于皮内递送，例如在US 4,886,499、US 5,190,521、US 5,328,483、US5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662中描述的短针装置。皮内疫苗还可通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的装置给予，例如描述于WO99/34850和EP1092444的装置及其功能等同物，这两个文献通过引用结合到本文中。快速注射装置也是适宜的，其经液体快速注射器或经刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针输送液体疫苗至真皮。快速注射装置描述于例如

                       US 5,480,381，US 5,599,302，US 5,334,144，US 5,993,412，US5,649,912，US 5,569,189，US 5,704,911，US 5,383,851，US 5,893,397，US 5,466,220，US5,339,163，US 5,312,335，US 5,503,627，US 5,064,413，US 5,520,639，US 4,596,556US4,790,824，US 4,941,880，US 4,940,460，WO 97/37705和WO 97/13537中。喷射粉末/颗粒递送装置也是适宜的，其使用压缩气体加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规注射器可用于皮内给予的传统结核菌素皮内试验法。

另一个合适的给予途径是皮下途径。任意合适的装置都可用于皮下递送，例如传统的针。优选，使用例如在

                                          WO 01/05453，WO 01/05452，WO01/05451，WO 01/32243，WO 01/41840，WO 01/41839，WO 01/47585，WO 01/56637，WO 01/58512，WO 01/64269，WO 01/78810，WO 01/91835，WO 01/97884，WO02/09796，WO 02/34317中公开的无针快速注射器装置。优选，所述装置用液体疫苗制剂预填充。

或者，疫苗鼻内给予。典型地，疫苗局部给予于鼻咽部，优选没有吸入到肺中。理想的是，使用将疫苗制剂传递入鼻咽部而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内传递装置。

按照本发明的疫苗的合适鼻内给予装置是喷雾装置。适宜的商用鼻喷雾装置包括Accuspray^TM(Becton Dickinson)。雾化器产生非常细小的雾滴，其可被轻易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。

用于鼻内使用的合适喷雾装置的性能与使用者提供的压力无关。这些装置称为压力域装置。只有在提供临界压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的雾滴。适用于本发明的压力域装置在本领域是已知的，描述于例如WO 91/13281和EP 311 863 B和EP 516636，这些文献通过引用结合到本文中。这种装置可从Pfeiffer GmbH购买，还描述于Bommer，R.Pharmaceutical Technology Europe，1999年9月。

优选的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体进行检测)范围为1-200μm，优选10-120μm。小于10μm存在吸入风险，因此理想的是10μm以下的液滴不超过约5％。120μm以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超过约5％。

双剂量递送是用于按照本发明疫苗的鼻内传递系统的更合适特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔给予一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于一个室中，装置的构造允许每次有效递送单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置给予按照本发明的疫苗。

或者，本发明还设想了表皮或透皮接种途径。

在本发明的一方面，首次给予的佐剂化免疫原性组合物可肌内给予，有佐剂或无佐剂的加强组合物可通过不同途径给予，例如皮内、皮下或鼻内。在一个具体实施方案中，首次给予的组合物可包含用于大流行性流感菌株的小于15μg的HA数量，加强组合物可包含15μg的标准数量，或优选低数量的HA，即低于15μg，根据给药途径，可以以较小体积给予。

接种群体

接种的目标群体是全部人群，例如健康的年轻成人(例如18-60岁)，老年(典型地60岁以上)或幼儿/儿童。目标人群可以优选免疫低下的人群。与健康的成人相比，免疫低下人一般不能对抗原作出反应，尤其是对流感病毒抗原。

在按照本发明的一方面，目标群体是未对流感初免的群体，他们或者是原初态的(例如相对于大流行毒株)，或者先前不能对流感感染或接种应答。优选，目标群体是老年人，适宜地为至少60岁或65岁和65岁以上，较年轻的高风险成人(即18-64岁)，例如在保健机构工作的人，或者具有高风险因素例如心血管病和肺病或糖尿病的年轻成人。另一个目标群体是所有6个月和以上的儿童，尤其是6-23个月龄的儿童，他们经历了相对高的流感相关住院率。

接种方案、给药和效力标准

适宜地，按照本发明的免疫原性组合物在大部分情况下为标准0.5ml注射剂量，并且包含小于15μg的血细胞凝集素抗原组份(得自于大流行性流感菌株)，根据单辐射免疫扩散(SRD)检测(J.M Wood等人：J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等人J.Biol.Stand.9(1981)317-330)。适宜地，疫苗剂量体积在0.5ml至1ml之间，具体地说是标准0.5ml或0.7ml疫苗剂量体积。根据原液样品中的HA浓度，可常规地轻微调整剂量体积，并且也根据递送途径，通过鼻内或真皮内途径给予较小剂量。

适宜地，所述免疫原性组合物含低剂量的HA抗原-例如每流感菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14μgHA中的任一个，或每菌株不超过15μgHA。所述低量的HA数量可以低到实际上的可行数量，条件是：允许配制可满足国际例如EU或FDA效果标准的疫苗，如下面所详述(参见表1和列出的具体参数)。合适的低量HA是每流感病毒菌株1至7.5μg HA之间，优选每流感病毒菌株在3.5至5μgHA之间，例如每流感病毒菌株3.75或3.8μgHA，典型地，每流感病毒菌株大约5μgHA。另一种合适的HA量是每流感病毒菌株在0.1和5μg HA之间，优选每流感病毒菌株在1.0和2μg HA之间，例如每流感病毒菌株1.9μg HA。

有利地，按照本发明的疫苗剂量，尤其是低HA数量疫苗，可以以比一般为每剂约0.5、0.7或1ml的常规注射裂解流感疫苗小的体积提供。按照本发明的小体积剂量优选每剂低于500μl，典型地每剂低于300μl，优选每剂不超过约200μl或以下。

因此，按照本发明的一个方面，合适小体积疫苗剂量是在小体积中具有低抗原剂量的剂量，例如在约200μl体积中有约15μg或约7.5μgHA或约3.0μg HA(每菌株)。

本发明的流感药物优选满足疫苗的某些国际标准。国际上提出了检测流感疫苗效力的标准。对于与流感疫苗的每年特许程序有关的临床试验，按照European Agency的人用医学产品的评价标准(CHMP/BWP/214/96，Committee for Proprietary MedicinalProducts(CPMP).Note for harmonization of requirements for influenzavaccines，1997.CHMP/BWP/214/96 circular N°96-0666：1-22)评价血清变量(表1)。对于成年种群(18-60岁)和老年人群(>60岁)的要求是不同的(表1)。对于流行性流感疫苗，针对包含在疫苗中的所有流感病毒菌株，至少一种评价(血清转化因子、血清阳转率、血清保护率)应该满足欧洲要求。认为滴定度的比例等于或大于1:40是最相关的，因为期望这些滴定度与保护作用有最好的相关性[Beyer W等人1998.Clin DrugInvest.；15:1-12]。

按照”Guideline on dossier structure and content for pandemicinfluenza vaccine marketing authorisation application.(CHMP/VEG/4717/03，2004年4月5日)所具体说明的那样，在没有针对衍生自非流行菌株的流感疫苗的特定标准的情况下，可以预料在两剂疫苗之后大流行候选物疫苗应该(至少)能够引起充分的免疫学的应答，以合适地满足所有三个为在未初免的成人或老年受试者中存在的疫苗确定的现行标准。

对于包含在组合物中的大流行菌株，本发明的组合物合适地满足表1所列保护作用的至少一个这种标准(一个标准足以获准)，合适地至少两个，或典型地至少所有三个标准。

表1(CHMP标准)

 

	18-60岁	>60岁
			血清阳转率*	>40％	>30％
转化因子**	>2.5	>2.0
			保护率***	>70％	>60％

^*血清阳转率定义为：具有保护性的接种后滴度(titre)≥1:40的各个组中受试者的比例。简而言之，血清阳转率是具有接种之前为<1:10和接种之后为≥1:40的HI滴度的受试者的百分数。然而，如果初始滴度≥1:10，那么在接种之后，则需要至少四倍的抗体增加量。

^**转变因子定义为：接种后针对每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数。

^***保护率定义为：在接种之前血清阴性受试者和具有接种后(保护性)HI滴度≥1:40的受试者的比率，或在接种之前血清反应阳性的受试者和接种后滴度显著增加4倍的受试者的比率；通常将其视作表明的保护作用。

欧洲卫生制定规章的当局(CHMP-Committee for Medicinal Productsfor Human Use)定义的70％血清保护率，是三个标准之一，通常要求每年的季节性流感疫苗满足该标准，并且CHMP也期望大流行候选疫苗也满足该标准。然而，数学模拟表明，针对某些漂移菌株仅仅30％有效率的疫苗，在帮助降低大流行幅度方面也是有益的(Ferguson等人，Nature 2006)。

FDA已经在Clinical Data Needed to Support the Licensure ofPandemic Influenza Vaccines上公开了指导草案(来源：Office ofCommunication，Training and Manufacturers Assistance(HFM-40)，1401Rockville Pike，Suite 200N，Rockville，MD 20852-1448，或呼叫1-800-835-4709或301-827-1800，或得自于国际互联网：http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm)，并且推荐的标准也基于CHMP标准。合适的终点类似地包括：1)达到HI抗体滴度≥1:40的受试者的百分比，和2)血清阳转率，定义为：接种后HI抗体滴度升高四倍。在结果中，应该包括几何平均滴度(GMT)。应该提供这些评价的点估计的这些数据和95％置信区间(CI)。

相应地，在本发明的一方面，提供了本文要求保护的组合物、方法或用途，其中通过给予预期的大流行组合物所诱导的所述免疫应答或保护作用可以满足流感疫苗效果的所有三个EU管理标准。合适地，对于组合物的大流行菌株，可以满足下列标准的至少一个、优选两个或三个：

-在成年人口(18-60岁)中，和/或也合适地在老年人群(>60岁)中，血清阳转率>50％、>60％、>70％、优选>80％或>90％；

-在成年人口(18-60岁)中，和/或也合适地在老年人群(>60岁)中，保护率>75％、>80％、>85％、优选>90％；

-在成年人口(18-60岁)中，和/或也合适地在老年人群(>60岁)中，转化因子>4.0、>5.0、>6.0、>7.0、>8.0、>9.0或10或10以上；

在一个具体实施方案中，在成年人口中，按照本发明的组合物可同时满足血清阳转率>60％或>70％或合适地>80％，和保护率>75％、优选>80％。在另一个具体实施方案中，在成年人口中，按照本发明的组合物可同时满足转化因子>5.0或>7.0或优选>10.0，和血清阳转率>60％或>70％或优选>80％。在另一个具体实施方案中，在成年人口中，按照本发明的组合物可同时满足转化因子>5.0或>7.0或优选>10.0，和保护率>75％、优选>80％。在另一个具体实施方案中，按照本发明的组合物可同时满足转化因子为10.0或10.0以上，血清阳转率为80％或80％以上，和保护率80％或80％以上。

在另一个实施方案中，针对漂移菌株，要求保护的疫苗可以满足至少30％的血清保护率，针对漂移菌株，优选至少40％，或>50％或>60％。针对漂移菌株，优选，血清保护率>70％，或优选>80％。

合适地，对于其它人群，任何或所有这种标准也都能满足，例如儿童和任何免疫受损人群。

合适地，上述应答是在一个剂量、典型地两个剂量之后获得的。正是由于要求保护的组合物的具体优势，使得仅仅一个剂量的佐剂化疫苗之后就可获得免疫应答。相应地，在本发明的一方面，提供了失活的大流行性流感病毒抗原制品、尤其是裂解流感病毒制品在制备疫苗组合物中的用途，该疫苗组合物用于针对流感病毒的单剂量接种，其中单剂量接种产生免疫应答，其满足针对流感疫苗的国际管理要求的至少一个、合适地两个或三个要求。在另一个具体实施方案中，所述单剂量接种也或另外产生CD4 T细胞免疫应答和/或B细胞记忆应答，其比用非佐剂化疫苗获得的应答高。在具体实施方案中，所述免疫应答是交叉反应的抗体应答或交叉反应的CD4 T细胞应答或两者。在具体实施方案中，人类受试者对接种菌株是免疫原初态的(即不预先存在免疫性)。具体地说，疫苗组合物包含低数量的HA抗原。具体地说，疫苗组合物如本文所定义。尤其是，疫苗组合物的免疫性能如本文所定义。合适地，肌肉内给予疫苗。

就再接种组合物而论，当它是多价组合物时，对于所有的菌株，尤其对于新疫苗，例如通过不同途径的新疫苗，需要满足至少两个或所有三个标准。在一些情况下，两个标准就足够了。例如，可以接受所有菌株满足三项标准中的两项，同时部分的但不是全部的菌株满足第三项标准(例如三种菌株中的两种)。

在进一步的方面，本发明提供了针对已知要通过CD4+T细胞活化治愈或治疗的疾病设计疫苗的方法，其包括：

1)选择含CD4+表位的抗原，和

2)组合所述抗原和上文定义的水包油乳液佐剂，其中所述疫苗在所述哺乳动物中给予时能够在所述哺乳动物中诱导增强的CD4 T细胞应答。

本申请的所有参考文献(包括专利申请和已授予专利)的讲述都完整地通过引用结合到本文中。对于本申请要求优先权的任何专利申请，按照本文描述的出版物和参考文献的方式，以其全部结合到本文中作为参考。

为避免疑惑，本发明人的意图为本文的术语‘包含’在每种情况下都任选地可被术语“由......组成”替代。

本发明将参考以下的非限制性实施例进一步描述：

实施例I描述了雪貂和人研究中使用的免疫解读方法。

实施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐剂制剂的制备和特征。

实施例III说明了在雪貂中的佐剂化和无佐剂流感疫苗的临床前评价。

实施例IV描述了在18-60岁的成年人群中用包含裂解流感病毒抗原制品的疫苗进行的临床试验，所述制品得自于大流行H5N1菌株和AS03佐剂。

实施例I-免疫解读方法

I.1.雪貂法

合适方法如下，用季节性菌株进行的实验通常使用该方法。技术熟练的读者可以理解，根据所使用的流感病毒菌株，可以将其进行一些修改或优化。

I.1.1.血凝反应抑制测试(HI)

测试程序

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对流感病毒菌株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制马红血细胞(RBC)血凝反应的能力。预处理血清(cholera，RDE，热失活)之后，将血清的两倍稀释物用4个血凝反应单位的流感病毒菌株进行培养。然后加入马(适应：火鸡或马)红细胞，记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1:10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。可以在下面的I.2.1.部分中看到更详细的描述。

I.1.2.体温监测

在用氯胺酮-隆朋(rompun)-阿托品混合物(2，5％-0，25％-0，025％)麻醉的第14天，利用植入到腹膜腔中(通过腹白线处的小切口)的温度传感器(Star Oddi，Iceland)探测体温。用缝线封闭伤口，每天检查。

I.2.3.病毒滴定

从所有的动物中收集咽部、鼻和直肠拭子。将单一体拭子放在3ml病毒传播介质(VTM；无菌的PBS或合适的等渗溶液，例如Hank′s BSS，包含抗生素(100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素)和2％胎儿牛血清或0.5％凝胶)中，并在-80℃储藏，直到分析为止。尸体解剖之后，将每个动物右肺的腹侧头向、脊背头向、腹侧尾向和脊背尾向部分称重，并在-80℃储藏，直到分析为止。将肺部分在3ml VTM中均化。利用H5N1特异性TaqMan PCR和Madine Darby犬肾脏(MDCK)细胞上的病毒滴定培养物来测定病毒滴度。

对于TaqMan PCR，病毒H5N1Flu RNAs是从雪貂样品中提取的，而后通过使用引物和探针的(在流感病毒基因组的保守区域设计的)定量RT-PCR试验进行扩增。数据可以分别用控制稀释单元(CDU)和每克肺组织或每ml拭子的TCID₅₀来表示。控制稀释单元(CDU)-CDUs是用标准曲线测定的，标准曲线由连续稀释的病毒原料产生，对各个稀释物进行核苷酸提取，和用和试验样品同样的方法进行Taqman PCR扩增。

对于病毒培养物，将所有样品的系列稀释物转入包含介质和MDCK细胞的微孔板中，而后在35℃培养5-7天。培养之后，通过“Reed andMuench”测定病毒释出滴度，并且以每克肺组织或每ml拭子的LogTCID50的形式表示。

I.1.4.中和抗体试验

对融化的冷冻血清样品进行中和抗体检测。在微量中和实验中，测定包含在血清中的抗体的病毒中和。血清在实验中无需进一步处理即可使用。各个血清以三重测定进行测试。将标准化量的病毒与连续稀释的血清混合并培养，以使抗体结合病毒。然后将含限定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入到病毒和抗血清的混合物中，于33℃培养。培养期后，通过小鸡红细胞的凝集反应显现病毒复制。利用Reed and Muench的方法计算血清的50％中和滴度(Am.J；Hyg.1938，27：493-497)。

I.2.评价人免疫应答的试验

I.2.1.血凝反应抑制试验

使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta，USA(1991)描述的方法，通过测定HI抗体来测定免疫应答。

使用4个血凝反应抑制单位(4HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬浮液(或对于H5N1，使用0.5％禽和马)，用标准的和综合验证过的微量法对融化的冷冻血清样品进行抗体滴度检测。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。

评价所获血清的HI抗体水平。以1:10起始稀释度开始，制备稀释度系列(倍数为2)，直至最终稀释度1:20480。

把显示完全抑制(100％)血凝反应的最高稀释度步骤视为滴定终点。所有实验都以双份进行。

H5N1的修改

使用马红细胞具体说明HI：

将糖蛋白(凝血素)定位在病毒被膜中，并且能够凝聚许多物种例如大仔鸡的红血球(红细胞)。

血细胞凝集抑制试验分为两步骤进行：

抗原抗体反应：使流感抗原(DTA，渗析试验抗原)与受试者血清的抗体反应。

过量抗原的凝集：使过量抗原与加入的红细胞反应

将马的红血球用于H5N1大流行菌株。

在包含0.5％BSA(牛血清白蛋白，终浓度)的磷酸盐缓冲液中的0.5％(终浓度)马红细胞悬浮液。

每天通过用相同磷酸盐缓冲液洗涤红细胞来制备该悬浮液，并且随后进行离心步骤(10分钟，2000每分钟转数)。这种洗涤步骤必须重复一次。

将马红细胞加入到反应混合物(受试者血清和病毒悬浮液)中之后，必须在室温下(RT，20℃+/-2℃)培养平皿两个小时，因为马红细胞的沉降速率低。

I.2.2.神经氨酸酶抑制试验

在涂渍胎球蛋白的微量滴定板中进行试验。制备2倍连续稀释的抗血清，与标准化量的甲型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。试验基于由胎球蛋白酶的酶作用释放神经氨酸的神经氨酸酶生物活性。在裂解末端神经氨酸后，β-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出来。向各孔加入来自落花生的辣根过氧化物酶(HRP)标记的花生凝集素，其特异性结合半乳糖结构。可在含四甲基联苯胺(TMB)的底物反应中检测和定量结合凝集素的量。表明仍抑制病毒神经氨酸酶活性达至少50％的最高抗体稀释度为NI滴度。

I.2.3中和抗体试验

对融化的冷冻血清样品进行中和抗体检测。

在微量中和实验中，测定包含在血清中的抗体的病毒中和。血清在实验中无需进一步处理即可使用。

各个血清以三重测定进行测试。将标准化量的病毒与连续稀释的血清混合并培养，以使抗体结合病毒。然后将含限定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入到病毒和抗血清的混合物中，并于33℃培养。培养期后，通过小鸡红细胞的凝集反应显现病毒复制。利用Reed and Muench的方法计算血清的50％中和滴度(Am.J；Hyg.1938，27：493-497)。

I.2.4.通过细胞因子流式细胞仪(CFC)评价细胞介导的免疫性

如果用其对应抗原培养，可将外周血抗原特异性CD4和CD8T细胞进行体外再刺激，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFN。

因此，抗原特异性CD4和CD8 T细胞可在常规免疫荧光标记的细胞表型以及胞内细胞因子产生后通过流式细胞仪计数。在本研究中，流感疫苗抗原用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或CD8 T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8 T细胞的频率。

I.25.利用ELISPOT的记忆B细胞

ELISPOT技术可以定量分析记忆B细胞对于所给定抗原的特异性。用CpG培养5天之后，可以诱导记忆B细胞体外分化为浆细胞。因此，可以使用ELISPOT试验，计数体外产生的抗原特异性浆细胞。简要地说，在涂有抗原的培养皿中培养体外产生的浆细胞。抗原特异性浆细胞形成抗体/抗原斑点，其可以通过常规免疫酶催过程检测。在目前研究中，使用流感疫苗菌株或抗人免疫球蛋白来涂渍培养皿，以便分别计数流感特异性抗体或IgG屏蔽(secreting)浆细胞。结果可以表示为：在产生IgG的浆细胞内的流感特异性抗体屏蔽浆细胞的频率。

I.2.6统计方法

I.2.6.1.主要终点

·在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中诉求的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同接种的关联。

·在接种后的21天随访期(即接种日和随后20天)以及整个过程中主动提供的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同与接种的关联。

·整个研究过程中严重不良事件的发生。

I.2.6.2.次要终点

对于体液免疫应答：

观察的变量：

·在0天和21天：血清血凝反应抑制(HI)和NI抗体滴度，分别对疫苗中代表的三种流感病毒菌株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。

·在0天和21天：中和抗体滴度，分别对疫苗中代表的三种流感病毒株的每一种测试。

衍生的变量(具有95％置信区间)：

·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMTs)

·21天时具有95％CI的血清阳转率*

·21天时具有95％CI的转变因子**

·21天时具有95％CI的血清保护率***

·在所有时间点的血清NI抗体GMT(具有95％置信区间)

^*血清阳转率定义为：相比于第0天，在第21天时针对每种疫苗株的血清HI滴度增加至少4倍的接种者的百分率。

^**转变因子定义为：相比于第0天，在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT增加的倍数。

^***保护率定义为：接种后(针对每种疫苗株)的血清HI滴度等于40的接种者百分率，通常将该滴度看作指示保护作用。

对于细胞介导的免疫(CMI)应答

观察的变量

在第0天和21天：不同测试中每10⁶当中细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试都定量CD4/CD8T细胞针对以下物质的应答：

·肽流感(pf)抗原(这些抗原的精确性质和来源必须给出/解释)

·裂解流感(sf)抗原

·全流感(wf)抗原

衍生的变量：

·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞

·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞

·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞

·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞

·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞

I.3.5.3.免疫原性的分析

免疫原性分析基于总接种群体。对于每个治疗组，计算以下参数(具有95％置信区间)：

·在第0天和21天时HJ和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)

·在第0天中和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)

·21天时的转变因子

·21天时的血清阳转率(SC)，定义为：相比于第0天，在第21天时血清HI滴度增加至少4倍的接种者百分率。

·21天时的保护率定义为：血清HI滴度＝1:40的接种者百分率。

·在各个时间点(第0天、第21天)针对每个接种组和针对每种抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和全流感(wf)抗原)总结CD4/CD8T-淋巴细胞屏蔽应答的频率(描述统计)。

·在各5种不同测试中对于每个接种组和每种抗原(pf、sf和wf)，在时间点(接种后-接种前)之间个体应答差异的描述统计。

·使用无参数检验(Kruskall-Wallis检验)比较3组之间的局部差异，以各5种不同测试计算每种抗原的统计学p-值。所有显著性检验都是双尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是统计学显著的。

实施例II-水包油乳液和佐剂制剂的制备和特征

除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的油/水乳液包含两种油(α-生育酚和鲨烯)组成的有机相和含Tween 80作为乳化剂的PBS水相。除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的水包油乳液佐剂制剂都制成含以下的水包油乳化组分(给出终浓度)：2.5％鲨烯(v/v)、2.5％α-生育酚(v/v)、0.9％聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(v/v)(Tween 80)，参见WO95/17210。该乳液在随后的实施例中称为AS03，如下制备为2倍浓缩物。

II.1.乳液SB62的制备

II.1.1.实验室规模制备

将Tween80溶解在磷酸缓冲盐水(PBS)中，获得2％的PBS溶液。为提供100ml的2倍浓缩乳液，旋转5g DLα生育酚和5ml鲨烯，以彻底混合。加入90ml PBS/Tween溶液，彻底混合。然后将获得的乳液通过注射器，最后使用M110S微流控设备进行微射流。获得的油滴具有约120-180nm的大小(表示为通过PCS检测的Z均值)。

将其它佐剂/抗原组分加入到简单混合物的乳液中。

II.1.2.放大规模的制备

通过在强搅拌下混合由疏水组分(α-生育酚和鲨烯)组成的油相和含水溶性组分(Tween 80和PBS mod(改良型)，pH6.8)的水相，制备SB62乳液制品。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转移至水相(9/10总体积)，于室温搅拌混合物15分钟。然后在微流控器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000 PSI，8个循环)，以产生亚微米油滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。然后使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将除菌的原乳液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或氩气)通入SB62最终原乳化液容器的死体积中达至少15秒。

SB62乳液的最终组成如下：

Tween 80:1.8％(v/v)19.4mg/ml；鲨烯：5％(v/v)42.8mg/ml；α-生育酚：5％(v/v)47.5mg/ml；PBS-mod：NaCl121mM，KCl2.38mM，Na₂HPO₄7.14mM，KH₂PO₄1.3mM；pH6.8±0.1。

II.2.油滴粒度的动态光散射检测

II.2.1.简介

油滴直径的大小按照以下方法并在以下实验条件下测定。油滴粒度量度以强度量度提供，并表示为通过PCS检测的z均值。

II.2.2.样品制备

对水包油乳液佐剂进行粒度检测，所述水包油乳液佐剂为：按照放大规模方法制备的SB62、AS03和AS03+MPL(50μg/ml)，后两种临使用前制备。样品的组成在下文给出(参见章节II.2.4)。样品用PBS7.4稀释4000倍至8000倍。

作为对照，用10mM NaCl稀释PL-Nanocal粒度标准品100nm(目录号6011-1015)。

II.2.3.Malvern Zetasizer 3000HS粒度检测

所有的粒度检测都用两台Malvern Zetasizer 3000HS检测。

样品以合适的稀释度(通常为4000倍至20000倍的稀释度，取决于样品浓度)在用于Malvern分析的塑料比色皿中检测，并采用两种光学模式：

-或者真实的粒子折射率0和假想折射率0。

-或者真实的粒子折射率1.5和假想折射率0.01(按照在文献中得到的值，对乳液采用适合的光学模式)。

技术条件如下：

-激光波长：532nm(Zeta3000HS)。

-激光功率：50mW(Zeta3000HS)。

-于90°检测的散射光(Zeta3000HS)。.

-温度：25°C，

-持续时间：由软件自动确定，

-次数：3次连续检测，

-z均值直径：通过累积量分析

-粒度分布：通过Contin或自动化方法。

自动化Malvern算法使用累积量、Contin和非负最小二乘(NNLS)算法的组合。

由于Mie理论，强度分布可转变为体积分布。

II.2.4.结果(参见表2)

累积量分析(Z均值直径)：

表2

 

样品	稀释度	记录	计数率	ZAD	多分散性
						SB62	5000	123平均值	7987752065867364	153153152153	0.060.060.070.06
SB62(实施例IV)	8000	123平均值	8640865686348643	151151150151	0.030.000.000.01
						SB62+MPL25μg(*)	8000	123平均值	8720865987108697	154151152152	0.030.030.020.02

(^*)如下制备：注射用水、PBS10x浓缩液、250μl SB62乳液和25μgMPL混合在一起，以达到280μl终体积。

z均值直径(ZAD)大小以样品中各种粒度的散射光量来权重(weighed)度量。该值与样品的单峰分析相关，主要用于重现目的。

计数率(CR)是散射光的检测结果：其对应于每秒光子的千数。

多分散性(Poly)指数是分布的宽度。其是分布广泛性的无量纲检测结果。

Contin和自动化分析：

已按照以上阐述并带有下述些微改变的方法制备和评价两种另外的SB62制品(2倍浓缩的AS03)：

在为获得用于Zetasizer 3000HS的最佳计数率值而确定的两个稀释度：10000x和20000x，在用于Malvern分析的塑料比色皿中检测样品，光学模式与以上实施例中使用的相同。

结果示于表3中。

表3

“-“此时获得的值不一致。

这些结果的示意图示于图1的制剂1023。由其可见，绝大部分粒子(例如至少80％)以强度计具有小于300nm的直径。

II.2.5.整体结论

用Malvern Zetasizer 3000HS和两种光学模式检测不同稀释度的SB62制剂。以上评价的制剂的粒度ZAD(即通过累积量分析获得的强度平均值)约为150-155nm。

当使用累积量算法时，我们观察到稀释度对ZAD和多分散性没有影响。

实施例III-佐剂化大流行裂解流感疫苗(包含H5N1菌株)在雪貂中的临床前评价

III.1.基本原理和目标

考虑感染敏感性和临床应答，雪貂模式的流感感染接近地类似人类流感。雪貂对甲型和乙型流感病毒(不含先前采用的病毒株)感染是高度敏感的。因此，对于通过给予流感疫苗而赋予的保护研究，它提供了出色的模型系统。

该研究探究了用AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗针对用H5N1同株A/越南/1194/2004或用异株A/印度尼西亚进行死亡攻击的雪貂的保护效果。实验的目标是为了相比于用PBS或单独佐剂进行免疫的雪貂，证明佐剂化流感疫苗的效果。

III.2.实验设计

III.2.1.治疗/组(表4)

在第0天和21天，用全部人剂量(500μl疫苗剂量)肌肉内注射36只成年远系繁殖雄性雪貂(Mustela putorius furo)(6只雪貂/组)(年龄大约8个月，体重0.8-1.5kg)。用与AS03组合的四个不同浓度的A/越南/1194/2004(NIBRG-14)(15、5.0、1.7和0.6μg HA)(标准人类剂量，250μl/剂量)使四组雪貂(n＝6)免疫。两个对照组由安慰剂和AS03处理的动物组成。在第21天和42天收集血清，用于分析血清应答。通过血凝抑制反应试验，测定同源病毒的抗体滴度(HI滴度)。在第49天，通过鼻内途径，用10⁶TCID₅₀剂量的同型菌株A/越南/1194/04攻击动物。在攻击期间，收集鼻、咽喉和直肠拭子，以评价病毒释出。尸体解剖之后，将每个动物右肺的腹侧头向、脊背头向、腹侧尾向和脊背尾向部分称重，并在-80℃储藏，直到分析为止。利用H5N1特异性TaqMan PCR和MDCK细胞上的病毒滴定培养物来测定病毒滴度。数据可以分别用控制稀释单位(CDU)和每克肺组织或每ml拭子的TCID₅₀来表示。CDU是用标准曲线测定的，标准曲线由连续稀释的病毒原料产生，对各个稀释物进行核苷酸提取，并用和试验样品同样的方法进行Taqman PCR扩增。

表4

 

组	抗原+/-佐剂	剂量	途径/日程表	其它治疗
					1	PBS		IM第0和21天	攻击H5N1(A/越南/1194/04)第49天
2	H5N1 AS03	15μg HA	IM第0和21天	攻击H5N1(A/越南/1194/04)第49天
					3	H5N1 AS03	5μg HA	IM第0和21天	攻击H5N1(A/越南/1194/04)第49天
4	H5N1 AS03	1.7μg HA	IM第0和21天	攻击H5N1(A/越南/1194/04)第49天
					5	H5N1 AS03	0.6μg HA	IM第0和21天	攻击H5N1(A/越南/1194/04)第49天
6	单独AS03		IM第0和21天	攻击H5N1(A/越南/1194/04)第49天

III.2.2.疫苗制剂的制备

III.2.2.2.用500μl剂量的水包油型乳状液佐剂AS03A佐剂化的裂解H5N1

方案1

在包含硫柳汞、Tween 80和Triton X100(其数量应考虑它们在菌株中的浓度)的最终原液缓冲液(PBS pH7.4)中预先制备预混合的缓冲液。免疫的当天，将15-5-1.7或0.6μg的H5N1菌株加入到预混合缓冲液中。搅拌30分钟之后，加入250μl的SB62乳液。搅拌制剂30分钟。在制剂完成1小时之内，进行注射。

方案2

合适地，制剂制备如下。将Tween 80、Triton X100和硫柳汞加入到最终原液缓冲液(其数量应考虑它们在菌株中的浓度)中。搅拌5分钟之后，加入15-5-1.7或0.6μg的H5N1菌株。搅拌30分钟之后，加入250μl的SB62乳液。搅拌制剂30分钟。在制剂完成1小时之内，进行注射。

III.2.2.3.500μl剂量AS03A

方案1

将250μl SB62乳液与250μl PBS pH6.8混合，搅拌5分钟，在4℃储藏，直到给予为止。

方案2

合适地，制剂制备如下。将250μl SB62乳液与250μl PBS pH6.8混合，搅拌5分钟。在制剂完成1小时之末，进行注射。

注释：在各个制剂中，加入10倍浓缩的PBS，达到等渗，并且在最终体积中是1倍浓缩的。计算水体积，以达到目标体积。

III.2.3.解读(表5)

表5

 

解读	时点	分析方法
			保护	D+5攻击后	％保护(每组活泼雪貂数/雪貂总数)
HI滴度	第42天	血凝反应抑制试验
			病毒释出	第49天至54天	在喉拭子和肺组织的MDCK上的病毒滴定培养物
遥测	第49天至54天	体温

III.3.结果和结论

表6总结了用同源H5N1菌株攻击之后的保护数据、HI滴度和肺组织与咽部拭子所带病毒(在雪貂中获得)。

表6.针对用同源H5N1流感病毒的攻击，用AS03佐剂化的H5N1接种的雪貂的保护。

^a在接种期间(25天)，将用PBS免疫的一个动物和用1.7μg佐剂化疫苗的HA免疫的一个动物安乐死。在接种和这些致死率之间不存在明显的联系。

^b几何平均HI滴度(D42)：+++(>160)，++(60-160)+(40-60)，-(<40)。

^C利用病毒培养物，确定带有病毒载荷>10²TCID₅₀(每g组织或每ml拭子)的动物数目。

III.3.1.保护数据

在用H5N1攻击之前，将两个动物安乐死。在接种期间(14天)，将用PBS免疫的一个动物安乐死(因为过分失重)。在接种期间(25天)，将用1.7μg佐剂化疫苗的HA免疫的一个动物安乐死(因为过分失重)。在接种和这些致死率之间不存在明显的联系。

在用AS03佐剂化的H5N1疫苗接种的雪貂中，用A/越南/1194/04攻击，表明了抗原剂量-依赖性保护或存活曲线(表6)。可以保护所有用5或15μg用AS03佐剂化的疫苗的HA免疫的动物抗死亡攻击。重要的是，在所有用AS03佐剂化疫苗免疫的雪貂组中，针对同源A/越南/1194/2004病毒的平均HI滴度≥40，包括在得到最低剂量的组中，在用AS03佐剂化的0.6和1.7μgH5N1裂解疫苗免疫的雪貂中，针对同源攻击分别获得66.67和80.00％的保护。用PBS或单独佐剂免疫的所有雪貂，显示出高于10⁵TCID₅₀/g肺组织的病毒载荷，并且在咽部，在整个感染期间，所有动物释出高水平病毒。相反，在大部分动物中，给予AS03佐剂化疫苗可以降低病毒载荷，至低于每克肺组织或每ml液体(得自于咽部拭子)10²TCID₅₀的阈值(表6)。用AS03佐剂化疫苗免疫的每组雪貂中，仅仅一或两个具有中等至高病毒载荷(>10²TCID₅₀)。

根据这些数据进行的统计分析产生下列结论：

-所有的疫苗剂量统计上不同于对照组

-P值(Fischer′s精密试验)范围从0.0276(对于最低的剂量)至0.0006(对于最高的剂量)

-在这种模型中，诱导90％保护的估计剂量是2.9μg

-在这种模型中，诱导100％保护的最低剂量估计在2.9和5μg之间。

III.3.2.体液应答(HI滴度)

在每次免疫之后的第21和42天，测定体液对接种的免疫应答。使用马红血球，通过血凝反应抑制(HI)试验测试血清样品。结果提供于表6中。

相比于用单独PBS或AS03免疫的雪貂，AS03佐剂化单价H5N1裂解制剂诱导对同源菌株的最强的HI应答。与接受两个最低剂量(佐剂化疫苗的1.7或0.8μgHA)的雪貂中的较低免疫应答相比，可以在用最高抗原剂量(佐剂化疫苗的15或5μgHA)的剂量免疫的雪貂中观察到所获得的具有最高HI滴度的抗原剂量效果。

如表6和图2A所示，在用A/越南H5N1攻击的雪貂中，发现在Hi滴度和保护之间具有相关性。在用H5N1裂解疫苗(用AS03佐剂化)免疫的雪貂中，高于40的HI滴度似乎与保护有关。

III.3.3.体液应答(中和抗体滴度)

在每次免疫之后的第21和42天，也通过中和作用试验来测试体液对接种的免疫应答。结果提供于图3中。

相比于单独用PBS或AS03免疫的雪貂，AS03佐剂化单价H5N1裂解制剂诱导对异源菌株的最强的中和抗体应答。与接受两个最低剂量(佐剂化疫苗的1.7或0.8μgHA)的雪貂中的较低免疫应答相比，可以在用最高抗原剂量(佐剂化疫苗的15或5μgHA)的剂量免疫的雪貂中观察到所获得的具有最高HI滴度的抗原剂量效果。

III.3.4.A/越南H5N1同源攻击之后的病毒释出

利用肺组织和鼻/咽喉/直肠拭子上的病毒培养物和TaqMan PCR进行病毒释出。

如表6所示，在用AS03佐剂化H5N1裂解疫苗免疫的雪貂中，根据肺组织和咽部拭子所荷载的病毒的减少(大部分动物低于10²TCID₅₀每克组织或每ml拭子)，也观察到保护作用。单独用PBS或佐剂免疫的所有雪貂，在整个感染期间，在肺组织和在咽部，显示出高病毒载荷。

图2B表明，在各个组中，通过PCR和病毒培养物，测定了平均病毒荷载。这表明，相对于单独得到PBS或佐剂的对照组，得到佐剂化疫苗的所有组往往显现出病毒荷载减少，用0.7μg佐剂化疫苗的HA免疫的雪貂显示了病毒荷载的更适度的减少。可以看到，在用1.6、5或15μg佐剂化疫苗的HA免疫的雪貂之间差别不大。最后，对于肺中的病毒载荷，PCR结果与病毒滴定一致。

此外，通过病毒培养物和PCR，在鼻和直肠拭子以及血浆中探究了病毒释出。一般，与PCR分析相比较，病毒滴定不太敏感。该分析表明，接受PBS的2/5雪貂的鼻腔和直肠拭子中存在H5N1病毒。在该组中，1/5动物也在血清中释出病毒。在直肠拭子或血浆中，用AS03佐剂化H5N1裂解疫苗免疫的动物，都没有释出病毒。有趣的是，各个独立雪貂的分析表明，一些保护的雪貂具有高病毒载荷和低HI滴度，表明获得保护作用的机理至少部分地是由于对细胞免疫的诱导(不在该实验中评价)。

III.3.5.体温

探测所有动物的体温。在接种期间，没有观察到身体温度变化。用A/越南/1194/04攻击可以引起发烧，身体温度从40℃至42℃，起始攻击之后，在12至24小时之间具有峰值。在经受得住攻击的动物中，在感染期间，身体温度降低至正常水平。在第5天之前死亡的动物，在达到发烧峰值之后，显示了体温的快速降低。

总之，血清学试验表明，相比于单独用PBS或佐剂免疫的动物，在用佐剂化疫苗免疫的动物中获得的HI滴度显著地高。用同源A/越南/1194/04病毒攻击，显示了抗原剂量依赖性存活曲线，相比于对照组，肺组织和咽部拭子(得到佐剂化疫苗的组)中的病毒载荷减少。对照组中的所有动物(用PBS或佐剂单独免疫)释出病毒到上呼吸道中，病毒载荷高于10⁵TCID₅₀/g肺，而在得到佐剂化疫苗的组中，仅仅一定比例的动物释出病毒到上呼吸道中(4/17，10⁵至10⁷TCID₅₀/g肺组织。大部分低于10²TCID₅₀每克肺或每ml咽部拭子)。此外，与仅仅用安慰剂和佐剂治疗的组相比，得到佐剂化疫苗的组的肺组织中的病毒滴度降低。这种降低部分地由于抗原剂量依赖性，在5μg抗原处达到明显的平台期。

实施例IV在成年人口(年龄在18和60岁之间的成人)中用包含裂解流感抗原制剂和AS03佐剂的疫苗的临床试验

IV.1.简介

在2006年在年龄18至60岁的成年人群中，普遍进行I期、盲测、随机化的研究，以便评价大流行性流感候选物(以不同的抗原剂量(3.8μg，7.5μg，15μg和30μg HA)给予，用佐剂AS03佐剂化、或不用佐剂AS03)的反应原性和免疫原性。两次肌注给予候选疫苗制剂的每次之后21天，测定体液免疫应答(即抗血凝素、中和和抗神经氨酸酶抗体滴度)和细胞介导的免疫应答(CD4和/或CD8T细胞应答)。对于得到相同抗原含量的相应的佐剂化组，无佐剂化的组充当参比。

IV.2.研究设计

使八个组(每组50个受试者)(计划)平行得到下列疫苗(肌肉内)：

■一个组的50个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含3.8μgHA)

■一个组的51个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含3.8μgHA并用AS03佐剂化)

■一个组的50个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含7.5μg HA)

■一个组的50个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含7.5μgHA并用AS03佐剂化)

■一个组的50个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含15μg HA)

■一个组的50个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含15μgHA并用AS03佐剂化)

■一个组的50个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含30μgHA)

■一个组的49个受试者得到两次给予大流行裂解病毒流感疫苗(包含30μgHA并用AS03佐剂化)

进行注册，以保证每个组的一半受试者年龄在18和30岁之间。

接种日程：在第0和21天，两次注射大流行性流感候选疫苗，收集血样，在第21和42天解读分析(HI抗体测定，NI抗体测定，中和抗体测定，和CMI分析)，研究结论(第51天)和研究终点(第180天)。

IV.3.研究目标

IV.3.1.主要目标

-按照抗血球凝集素抗体滴度，评价所研究疫苗引起的体液免疫应答。

-按照诱发的(solicited)局部和一般不利状况、未诱发的(unsolicited)不利状况和严重的不利状况，评价所研究疫苗的安全和反应原性。

对于体液免疫应答：

在第0、21、42和180天观察变量：血清血凝-抑制抗体滴度。

衍生变量(具有95％置信区间)：

-在第0、21、42和180天血清抗体的几何平均滴度(GMT)

-在第21、42和180天的血清阳转率^*

-在第21、42和180天的转化因子^**

-在第0、21、42和180天的保护率^***

^*血球凝集素抗体应答的血清阳转率定义为：接种前滴度<1∶10和接种后滴度≥1:40或接种前滴度≥1:10并且接种后滴度具有至少四倍增加的接种者的百分比

^**转化因子定义为：相比于第0天，接种后血清HI GMT的增加倍数；

^***保护率定义为：接种之后血清HI滴度≥40的接种者的百分比，通常将该滴度视作指示保护作用。

安全/反应原性评价：

1.在每次接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中诱发的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同接种的关联。

2.在首次接种后的21天随访期，在第二次接种后的30天随访期以及整个过程中主动提供的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同与接种的关联。

整个研究过程中严重不良事件的发生。

IV.3.2.次要目标

-按照血清中和抗体滴度，评价所研究疫苗引起的体液免疫应答。

-按照流感特异性CD4/CD8T淋巴细胞的频率，评价所研究疫苗引起的细胞介导免疫反应。

此外，使用Elispot技术，评价接种对流感特异性记忆B细胞的影响。

对于体液免疫应答：

在第0、21、42和180天观察的变量：血清中和抗体滴度。

衍生的变量(具有95％置信区间)：

-在第0、21、42和180天血清抗体的几何平均滴度(GMT)

-在第21、42和180天的血清阳转率^*

^*中和抗体应答的血清阳转率定义为：接种后滴度最少增加4倍的接种者的百分比。

对于CMI应答：

1.在产生至少两种不同细胞因子(CD40L，IL-2，TNF-α，IFN-γ)的试验中，细胞因子CD4/CD8细胞(每10⁶)的频率

2.在至少产生CD40L和另一个信号分子((IL-2，IFN-γ，TNF-α))的试验中，细胞因子阳性CD4/CD8细胞(每10⁶)的频率

3.在至少产生IL-2和另一个信号分子(CD40L，IFN-γ，TNF-α)的试验中，细胞因子阳性CD4/CD8细胞(每10⁶)的频率

4.在至少产生TNF-α和另一个信号分子(IL-2，IFN-γ，CD40L)的试验中，细胞因子阳性CD4/CD8细胞(每10⁶)的频率

在至少产生IFN-γ和另一个信号分子(CD40L，IL-2，TNF-α)的试验中，细胞因子阳性CD4/CD8细胞(每10⁶)的频率

试验中，在第0、21、42和180天，每10⁶个细胞的流感特异性记忆B细胞的频率。

IV.4.疫苗组合物和给予(表7)

III.4.1.疫苗制备

III.4.1.1.AS03佐剂化的流感疫苗的组合物

AS03包含水包油SB62乳液，SB62乳液由包含DL-α-生育酚和鲨烯的油相与包含非离子型去污剂聚山梨酸酯80的水相组成。

大流行性流感疫苗候选物的活性物质是衍生自疫苗病毒株A/越南/1194/2004(H5N1)NIBRG-14的甲醛失活的裂解病毒抗原。HA抗原的剂量是每剂量3.8至30μg。

用于制备AS03佐剂化流感疫苗的裂解病毒单价原液是按照与GSK生物制品特许的流行病流感疫苗Fluarix^TM/

所使用方法的相同方法制备的。为了该临床试验，用于制备临床批次的病毒株是H5N1疫苗株A/越南/1194/04 NIBRG-14重组体H5N1原型疫苗株，其衍生自高度致病的A/越南/1194/04。通过NIBSC，使用反向遗传学，已经形成这种重组体原型菌株(合适参考文献是Nicolson等人2005，Vaccine，23，2943-2952))。重配株使H5和N1片段与A/PR/8/34菌株骨架结合，并且使H5消除氨基-酸在HA裂解位点(其负责原始菌株的高毒性)的多元伸展。这是如下获得的：带有含人类HA基因(改性，以除去高致病性决定因素)和NA基因的质粒的转染Vero细胞分离A/越南/1194/2004(H5N1)和包含PR8的内部基因的质粒。使救活的病毒两次通过卵，然后按照参考文献命名为病毒NIBRG-14。这种H5N1重配株的减毒特征在临床前的安全评估(由NIBSC进行)中进行了广泛的记载，通常也用于传统的流感疫苗株。

按照本发明的AS03佐剂化的大流行性流感候选疫苗是由0.5ml浓缩失活裂解病毒体抗原(存在于I型玻璃管中)和包含0.5ml AS03佐剂的预先填充的I型玻璃注射器组成的2组份疫苗。在注射时，将包含佐剂的预装填针筒的内含物注入到管瓶中，管瓶包含浓缩失活的裂解病毒抗原。混合之后，将内含物排出到针筒中，用肌注针替代原来的针。一剂重配的AS03佐剂化流感病毒候选疫苗相当于1ml。1ml的每个疫苗剂量包含3.8、7.5、15或30μg血细胞凝集素(HA)或任何合适数量的HA，该量是根据疫苗满足本文所详述的效果标准来确定的。

或者，按照本发明的AS03佐剂化的大流行性流感候选疫苗是由0.25ml浓缩失活裂解病毒体抗原(存在于I型玻璃管中)和包含0.25mlAS03佐剂的预先填充的I型玻璃注射器组成的2组份疫苗。在注射时，将包含佐剂的预装填针筒的内含物注入到管瓶中，管瓶包含浓缩失活的裂解病毒抗原。混合之后，将内含物排出到针筒中，用肌注针替代原来的针。一剂重配的AS03佐剂化流感病毒候选疫苗相当于0.5ml。0.5ml的每个疫苗剂量包含3.8、7.5、0.55或30μg血细胞凝集素(HA)或任何合适数量的HA，该量是根据疫苗满足本文所详述的效果标准来确定的。

疫苗赋形剂是聚山梨酸酯80(Tween80)、辛基酚聚醚10(TritonX-100)、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化镁六水合物和注射用水。加入硫柳汞作为抗菌防腐剂，防止在使用期间污染，这是由于预料到，当大流行发生时，主要在多剂量器皿(管瓶或安瓿)中提供疫苗，这就需要防腐剂。为此，将大流行疫苗与硫柳汞(5μg/剂量，作为防腐剂)一起配制。合适地，将大流行疫苗与作为防腐剂的10μg/剂量的硫柳汞一起配制，或稍微更高的剂量，例如最高达25μg/剂量疫苗。

III.4.1.2.制备裂解失活的流感H5N1抗原制剂

通过在胚胎母鸡卵中培育H5N1工作种来制备单价病毒原液。裂解失活的流感H5N1菌株单价原液的制备方法(在图4中说明)，与制备单价原液α-Rix^TM的方法相同。

基本上，单价原液的制备方法分成四个主要部分：

1)在授精母鸡蛋中繁殖工作种，收集和集中感染的尿囊液，以便获得“粗品单价全病毒原液”(步骤1)。

2)将各个病毒株纯化，产生“纯化的单价全病毒原液”(步骤2-6)。

3)用脱氧胆酸钠裂解纯化的单价全病毒原液，产生“纯化的单价裂解病毒原液”(步骤7-8/1)。

4)纯化的单价裂解病毒原液的失活分为两步：用脱氧胆酸钠和用甲醛培养，而后进行超滤和无菌过滤，以便获得“纯化的单价失活裂解病毒原液”或“单价原液”(步骤8/2-9)。

1)粗品单价全病毒原液的制备

病毒接种物的制备：

胚胎卵的接种当天，通过将工作病毒晶种与包含25μg/mL氢化可的松和0.5mg/mL庆大霉素硫酸盐的磷酸盐缓冲液混合来制备接种物。将病毒接种物在室温保持，直到接种为止。

胚胎卵的接种：

将十一天大的培养前的胚胎卵用于病毒复制。用甲醛薰蒸壳之后，将卵转移到制备室中。将大约120,000个卵用0.2mL病毒接种物进行接种，每个使用自动鸡胚接种装置。将接种卵在34.0℃培养72小时。

在培养期的最后，视觉检查卵的活胚胎与合适龄期的血管的存在。通过冷却卵来杀死胚胎，并在2-8℃储藏12-46小时。

收集

利用卵收集机械，从冷却的胚胎卵中收集尿囊液(大约12mL)。将尿囊液收集在不锈钢罐中(在2-8℃进行热调节)。在此步骤中，产品被称作“粗品单价全病毒原液”。不用储藏粗品单价全病毒原液，而是紧接着将其转入澄清步骤。

2)纯化单价全病毒原液的制备

所有的操作在2-8℃进行，直到通过超速离心流动为止，其是在室温下进行的。

澄清：

通过连续中速离心，将收集的尿囊液澄清。该步骤可除去大的颗粒，其是在收集尿囊液期间收集到的大的颗粒(例如卵壳部分)。

吸附步骤：

通过吸附到磷酸氢钙凝胶上，该步骤通过病毒物质的沉淀而进一步澄清尿囊液。

为了获得磷酸氢钙(CaHPO4)凝胶，将0.5mol/L磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)和0.5mol/L氯化钙(CaCl₂)加入到澄清病毒中，达到每L1.87g CaHPO₄的最后浓度。

沉降至少8小时至最大36小时之后，除去上清液，通过加入8.7％乙二胺四乙酸二钠溶液，将包含流感病毒的沉降物再溶解。

过滤：

将再悬浮的流感沉降物通过6-μm滤膜过滤，除去潜在剩余的球粒。

流过超速离心：

通过等密超速离心(以线性蔗糖梯度(0-55％)，每小时8-20升的流速)，将流感病毒进一步纯化(除去蛋白和磷脂)和浓缩。使用含有0.01％噻汞撒的蔗糖溶液55％(w/w)和含有0.01％噻汞撒的磷酸盐缓冲液(pH值7.4)，形成梯度。这是在100±15μg/mL硫柳汞的存在下进行的，以便控制加工生物负荷，因为离心是在室温下进行的。

通过折射计测定蔗糖浓度，回收四个不同的馏份：

馏份4/1：55-47％蔗糖

馏份4/2：47-38％蔗糖

馏份4/3：38-20％蔗糖

馏份4/4：20-0％蔗糖

选择馏份4/2的上限，以在高纯度系数HA/蛋白和全病毒的最大回收之间进行平衡。选择馏份4/2和4/3之间的限制，从而将馏份4/2中的卵清蛋白含量减到最小。基于在低蔗糖梯度范围中得到的HA含量，选择馏份4/3的下限。

馏份4/2和4/3用于进一步的制备。大部分病毒收集在馏份4/2中。将包含病毒和蛋白两者的馏份4/3进一步纯化。首先，通过超滤法使馏份4/3的蔗糖浓度减到低于6％(为随后的离心步骤所必需)。然后，通过离心使馏份4/3成粒，以除去任何溶解的污染物(蛋白)。将球粒再悬浮在磷酸盐缓冲液(pH值7.4)中，并彻底地混合，获得均相悬浮液。

对于馏份4/3，保持时间最大36小时，对于馏份4/2，最大60小时，对于纯化馏份4/3，最大36小时。

稀释

收集两个馏份(处理的馏份4/3和未处理的馏份4/2)，通过加入60L磷酸盐缓冲液(pH值7.4)进行稀释。

在此步骤中，物质的集中相当于“纯化单价全病毒原液”。

3)纯化单价裂解病毒原液的制备

在脱氧胆酸钠的存在下流过超速离心：

将流感病毒裂解，利用离心进一步纯化(通过线性蔗糖梯度(0-55％，用蔗糖溶液S8a和缓冲液S6a形成，包含1.5％脱氧胆酸钠)。Tween-80以0.1％存在于梯度。以每小时8升的速度处理病毒。离心的最后，收集三个不同的馏份。基于裂解条件的菌株依赖性效果，选择主要馏份(馏份7/2)的范围，目标是收集主要由断裂的流感病毒抗原组成的馏份，同时尽可能地将剩余全病毒颗粒和磷脂(得自于裂解之后的病毒膜)减到最小。

对于A/越南/1194/2004NIBRG-145，馏份7/2的范围设置在20-41％蔗糖。

在馏份7/2中浓缩血球凝集素抗原，其包含大约1.2％脱氧胆酸钠。这种物质相当于“纯化单价裂解病毒原液”。

4)纯化的最终单价裂解失活病毒原液的制备

过滤：

将馏份7/2在磷酸盐缓冲液S7c(包含0.025％Tween-80)中稀释三倍。然后，将馏份7/2逐渐滤出到0.45μm滤膜上，简要地进行超声处理(便于过滤)，过滤通过0.2μm膜。在过滤的最后，用包含0.025％Tween-80的磷酸盐缓冲液(S107c)冲洗过滤器。由于过滤和冲洗，滤液的最终体积是原始馏份7/2体积的5倍。

脱氧胆酸钠失活：

将得到的溶液在22±2℃培养至少84小时。

第一个失活步骤完毕后，用磷酸盐缓冲液S7c稀释该物质，以减少总蛋白含量至500μg/mL的计算浓度：

甲醛失活：

将甲醛加入至100μg/mL的计算最后浓度。在20±2℃，在单次使用的低密度聚乙烯100L袋中进行至少72小时的失活。

超滤：

使用连续缓冲液S7b和S1b，通过膜将失活的裂解病毒物质进行超滤，切断(cut off)30,000 Dalton分子量。

体积减少之后，通过加入包含0.01％Tween-80的磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(S1b)，使体积在超滤(透滤)期间保持恒定。

在超滤期间，甲醛、NaDoc和蔗糖含量降低。

将该物质浓缩至15-25升，紧接着转移至最终过滤步骤。

无菌过滤：

超滤之后，将裂解失活物质逐渐滤出至0.2μm膜上。

通过0.22μm无菌级膜的最终无菌过滤是在100级环境中进行的。在过滤的最后，用包含0.01％Tween-80的磷酸盐缓冲盐水溶液S1b冲洗过滤器。与此同时，将滤液稀释至小于1000μg/mL的蛋白浓度，以避免在随后的贮存期间聚集。

得到的物质是“纯化单价失活裂解病毒原液”或“单价原液”。

贮存：

将最后的裂解失活流感H5N1病毒的单价原液在2-8℃、在I型玻璃瓶中储藏，最多18个月。

III.4.1.3.带有AS03佐剂化的H5N1的疫苗组合物的制备

1)组合物

肌注给予在一期临床试验评价的AS03佐剂化的失活裂解病毒大流行性流感候选疫苗H5N1-007。疫苗是由浓缩失活裂解病毒体(H5N1)抗原(存在于I型玻璃管中)和包含在预先填充的I型玻璃注射器中的AS03佐剂组成的2组份疫苗。

一剂重配的AS03佐剂化大流行性流感疫苗相当于1ml。表7中给出组合物。由于研究H5N1-007是剂量探测研究，对于所测试的每个临床批次，每剂量的HA含量是不同的。一个剂量包含3.8、7.5、15或30μgHA。疫苗包含下列得自于药物制备过程的残余物：甲醛，卵清蛋白，蔗糖，硫柳汞和脱氧胆酸钠。

表7 重配AS03佐剂化的大流行性流感候选疫苗的组合物

2)配制

AS03佐剂化的大流行性流感疫苗的制备由三个主要步骤组成：

(a)配制无佐剂的裂解病毒最终原液(2x浓缩)并分装入抗原容器中

(b)制备AS03佐剂，并装入佐剂器皿中

(c)AS03佐剂化的裂解病毒疫苗的临时重组

1)配制无佐剂的最终原液并分装入抗原容器中。

配制流程图提供在图5中。

单价原液的体积基于HA含量(在配制之前按单价原液计量)和4000ml的目标体积。

在连续搅拌下，将最终原液缓冲液(配制缓冲液包含：氯化钠：7.699g/l；磷酸二钠十二水合物：2.600g/l；磷酸二氢钾：0.373g/l；氯化钾：0.2g/l；氯化镁六水合物：0.1g/l)和合适体积的Triton X-100(5％辛基酚聚醚10(Triton X-100)溶液)和硫柳汞(0.9％硫柳汞储备溶液)混合在一起。然后在得到的原液缓冲液-Triton X-100-硫柳汞中稀释单价原液H5N1，以便具有每ml最终原液60/30/15/7.6μgH5N1的最后浓度(每ml30、15、7.5或3.8μgHA/500μl最终原液)。将混合物搅拌30-60分钟。pH值是7.2±0.3。不必加入Tween80，因为在单价原液中存在的Tween80的浓度(822μg/ml)足以达到浓度目标(12.26μg/μg HA)。

将最终原液无菌填充到3ml无菌I型(Ph.Eur.)玻璃管中。每个管瓶包含0.65ml±0.05ml的体积。

2)AS03无菌佐剂原液的制备并装入佐剂容器中。

通过将两个组分(SB62乳液和磷酸盐缓冲液)混合来制备佐剂AS03。

SB62乳液

通过在强搅拌下混合由疏水组分(α-生育酚和鲨烯)组成的油相和含水溶性组分(Tween 80和磷酸盐-盐水缓冲液，pH6.8)的水相，制备SB62乳液。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转移至水相(9/10总体积)，于室温搅拌混合物15分钟。然后在微流控器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000 PSI，8个循环)，以产生亚微米油滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。然后使SB62乳液通过0.22mm膜过滤除菌，将除菌的乳化原液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气)通入SB62乳化最终原液容器的死体积中达至少15秒。

SB62乳液的最终组成如下(表8)：

表8

 

Tween80：	1.8％(v/v)	19.4mg/ml
			鲨烯：	5％(v/v)	42.8mg/ml
α-生育酚：	5％(v/v)	47.5mg/ml
			磷酸盐-盐水缓冲液
NaCl		121mM
			KCl		2.38mM
Na2HPO4		7.14mM
			KH2PO4		1.3mM
pH		6.8±0.1

AS03佐剂系统

通过将缓冲液(PBS mod)与SB62原液混合来制备AS03佐剂系统。在室温下搅拌混合物15-45分钟，用NAOH(0.05或0.5M)/HCl(0.03M或0.3M)将pH值调节至6.8±0.1。在室温下再搅拌15-20分钟之后，测定pH值，通过0.22μm膜过滤来消毒混合物。将无菌AS03佐剂在+2-8℃储藏，直到无菌填充到1.25ml无菌I型(Ph.Eur.)玻璃注射器中为止。每个针筒包含超出720μl(500μl+220μl超填部分)的体积。

AS03佐剂的最终组成如下(表9)：

表9

 

SB62	0.25ml
		鲨烯	10.68mg
生育酚	11.86mg
		聚山梨酸酯80	4.85mg
PBS-mod：
		NaCl	137mM
KCl	2.7mM
		Na2HPO4	8.1mM
KH2PO4	1.47mM
		pH	6.8±0.1
体积	0.5ml

3)AS03佐剂化的裂解病毒疫苗的临时重组。

在注射时，将包含佐剂的预装填针筒的内含物注入到管瓶中，管瓶包含浓缩三价失活的裂解病毒体抗原。混合之后，将内含物排出到针筒中，用肌注针替代原有的针。一剂重配的AS03佐剂化流感候选疫苗相当于1ml。

III.4.2疫苗制备

在非惯用胳臂的三角肌区，肌肉内给予疫苗。大流行性流感候选疫苗是2组分疫苗，其由存在于管瓶(抗原器皿)中的抗原和包含佐剂(佐剂器皿)或稀释剂的预填充针筒组成。在注射时，将预装填针筒的内含物注入到管瓶中，管瓶包含抗原。混合之后，将内含物排出到针筒中。用肌注针替代所使用的针。疫苗的一个剂量相当于1ml。

IV.5研究人群结果

总共400名受试者加入该研究：8个组的每个组中有49至51名受试者。在接种的时候，总接种群的平均年龄是34.3岁，标准偏差12.76岁。分布在8个疫苗组中的受试者的平均年龄和性别是相似的。

IV.6安全结论

在研究群体(即18和60岁之间的成年人)中给予AS03佐剂化的大流行性流感候选疫苗是安全的，在临床上是良好耐受的。

IV.7免疫原性结果

对ATP群体的免疫原性进行分析(394名受试者)。

III.7.1.体液免疫应答

为了评价由AS03佐剂化的大流行性流感H5N1候选疫苗诱导的体液免疫应答，计算每个治疗组的以下参数(具有95％置信区间)：

·在第0天、21天和42天时HI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)；

·在第21和42天的血清阳转率(SC)；

·21天和42天时的转化因子；

·21天和42天时的保护率。

III.7.1.1抗血凝素抗体应答

a)HI几何平均滴度(GMT)

具有95％CI的HI抗体的GMT示于表10(抗HI抗体的GMT)和图6中。对于H5N1接种菌株，在八个研究组中，抗体的预接种GMT在相同范围之内。首次接种之后，在所有的非佐剂化组中，抗血球凝集素抗体水平仅仅以剂量依赖性方式很少量地增加。在佐剂化接种组中，首次接种之后，观察到抗血球凝集素抗体水平更显著的增加，在得到最高抗原剂量(HN30AD)的组中具有最高的GMT。第二次接种后，非佐剂化组的GMT比首次接种后的GMT有稍微提高。比较起来，在所有佐剂化组中，第二次接种之后观察到显著提高的GMT，从3.8μg至7.5μg至15μg组，观察到剂量依赖性增加。对于30μg组，观察到的GMT比7.5μg组的GMT低。所有佐剂化研究组(包括3.8μg HA的最低剂量)，可以引起免疫应答，该免疫应答满足基于FDA制定指导(2006年3月)以及EMEA所建立标准的大流行疫苗的特许标准。

表10-在不同时点的抗HA抗体的几何平均滴度(GMT)(对免疫原性的ATP群组)

HN30        ＝H5N1 30μg

HN15        ＝H5N1 15μg

HN8         ＝H5N1 7.5μg

HN4         ＝H5N1 3.8μg

HN30AD      ＝H5N130μg+AS03

HN15AD      ＝H5N1 15μg+AS03

HN8AD       ＝H5N1 7.5μg+AS03

HN4AD       ＝H5N1 3.8μg+AS03

GMT＝对所有受试者计算的几何平均抗体滴度

N＝具有可利用结果的受试者数目

n/％＝在特定范围内具有滴度的受试者的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限

MIN/MAX＝最小/最大

PRE＝预接种剂量1

PI(D21)＝接种后21天

PII(D42)＝接种后42天

数据源＝附表IIIA

b)抗HI抗体滴度的转化因子、血清保护率和血清阳转率(与人中建立的流感疫苗保护作用的关联)

结果提供在表11(转化因子)、12(血清保护率)和13(血清阳转率)中。

转化因子(表11，图9)表示：相比于第0天，在第21天和42天时针对疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。在4个非佐剂化组中，第二次接种之后的转化因子从1.2至3.9之间变化，在佐剂化组中，从27.9至60.5之间变化。在AS03佐剂化组中，转化因子达到优于欧洲官方对于成人流行暴发之间的疫苗要求的GMT(列出在表1中)的2.5倍增加。普遍地，对于大流行候选疫苗，相同标准适用于流行暴发之间的流感疫苗每年的特许。值得注意的是，除最低抗原浓度外，首次接种之后，所有的佐剂化组都获得≥2.5的转化因子。

血清保护率(表12，图8)表示在第21和42天的血清HI滴度≥40的受试者的比例。在接种之前，发现3个受试者(1个在HN15组中，1个在HN8AD组中，1个在HN4D组中)对于疫苗株H5N1A/越南/1194/2004具有抗体的保护性水平。对于H5N1，在接种之前，获得血清保护个体的极低百分数，证明了先前研究中的观察结果(Bresson JL等人The Lancet.2006：367(9523)：1657-1664；Treanor JJ et al.N EnglJ Med.2006；354：1343-1351)。在第21天，在非佐剂化组中，血清保护率在0.0％至28.6％(表12)的范围，而在佐剂化组中，受试者的26.0％至58.3％获得保护性滴度。大流行性流感候选疫苗的第二个剂量之后，4.0至42.9％的受试者(在非佐剂化组中)和84.0％至95.9％的受试者(在佐剂化组中)具有等于或高于阈值的滴度，所述阈值认为是保护性的(即HI滴度≥1:40)。因而，2次接种之后，得到佐剂化大流行候选疫苗的高达95.9％的受试者(15HNAD组)具有≥40的血清HI滴度，他们被视为针对H5N1接种菌株是被保护的。所有四个候选制剂超过70％的血清保护率，这是欧洲官方要求的(18-60岁人群)，即，首次剂量之后，相当大比例的受试者获得保护性等级，而非佐剂化候选疫苗没有达到该标准。

血清阳转率(表13，图7)表示接种前滴度<1:10和接种后滴度≥1:40的接种者的百分比，或接种前滴度≥1:10并且与第0天相比、在接种后的第21和42天滴度至少增加四倍的接种者的百分比。首次接种之后，非佐剂化组中的血清阳转率在0.0％至14.9％的范围(表13)。在相应的佐剂化研究组中，首次接种之后，观察到24.0％和58.3％之间的血清阳转率，在接受不同抗原含量的4个佐剂化组中的3个组中，已经超过EMEA的要求(在18-60岁人群中，要求血清阳转率大于40％)。第二次接种之后，有4.0％和40.8％之间的受试者(在非佐剂化组中)、但有82.0％至95.9％的受试者(在佐剂化组中)，或获得血清阳转或四倍增加。因此，两次接种之后，候选疫苗的所有四个佐剂化制剂满足EMEA设定的特许标准，但只有最高剂量的非佐剂化疫苗才能达到该阈值(HN30：40.8％)。

表11-在每个接种后的时点的HAI抗体滴度的血清阳转因子(免疫原性的ATP群组)

HN30            ＝H5N1 30μg

HN15            ＝H5N1 15μg

HN8             ＝H5N1 7.5μg

HN4             ＝H5N13.8μg

HN30AD          ＝H5N130μg+AS03

HN15AD          ＝H5N11 5μg+AS03

HN8AD           ＝H5N1 7.5μg+AS03

HN4AD           ＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝具有可利用结果的受试者数目

n/％＝在特定范围内具有滴度的受试者的数目/百分数

PRE＝接种前

PI(D21)＝接种后21天

PII(D42)＝接种后42天

表12-在第0天、21天和42天的血清保护率，定义为：具有血清抗HA滴度≥1:40的接种者的百分比(免疫原性的ATP群组)

HN30            ＝H5N1 30μg

HN15            ＝H5N1 15μg

HN8             ＝H5N1 7.5μg

HN4             ＝H5N1 3.8μg

HN30AD          ＝H5N130μg+AS03

HN15AD          ＝H5N1 15μg+AS03

HN8AD           ＝H5N1 7.5μg+AS03

HN4AD           ＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝具有可利用结果的受试者数目

n/％＝在特定范围内具有滴度的受试者的数目/百分数

PRE＝接种前

PI(D21)＝接种后21天

PII(D42)＝接种后42天

表13：每次接种后第21天和42天的抗HA抗体滴度的血清阳转率(免疫原性的ATP群组)。

HN30           ＝H5N1 30μg

HN15           ＝H5N1 15μg

HN8            ＝H5N1 7.5μg

HN4            ＝H5N1 3.8μg

HN30AD         ＝H5N1 30μg+AS03

HN15AD         ＝H5N1 15μg+AS03

HN8AD          ＝H5N1 7.5μg+AS03

HN4AD          ＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝具有可利用结果的受试者数目

PI(D21)＝接种后21天

PII(D42)＝接种后42天

数据源＝附表IIIA

n/％＝接种前滴度<1:10和接种后滴度≥1:40的受试者的数目/百分数，或接种前滴度≥1:10并且接种后滴度具有至少四倍增加的受试者的数目/百分数。

95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

结论：

在流感大流行的情况下，大比例的人群对于大流行性流感菌株是原初态的，并且可能2剂量疫苗的保护。为了降低潜在大流行疫苗中的抗原含量并因此增加疫苗供应，使用佐剂策略，因为已经表明，非佐剂化H5N1候选疫苗(H5N1是引起下一次流感大流行的标志性候选物)只是在使用大剂量抗原以后可以引起免疫应答(Treanor JJ等人N Engl JMed.2006；354：1343-1351)。

在本文报道的第一个试验中，对于含有AS03的H5N1大流行性流感候选疫苗，可以获得下列结果：

·对于所有测试的不同血凝素剂量，与普通抗原制剂相比，佐剂AS03有明显的益处。第二次接种后，在HI抗体的GMT中，观察到佐剂化组有明显的优势：得到最低抗原剂量(3.8μgHA)的测试的佐剂化组的GMT，还比在非佐剂化组中由最高抗原剂量(2次注射30μg HA)引起的、获得的最高GMT高7.5倍。在第42天，在佐剂化组的任何一个与非佐剂化组的任何一个之间，没有95％CI重叠。

·对于3.8μg、7.5μg、15μg和30μg加上佐剂的组，在第42天的血清阳转率分别是82.0％、90.0％、95.9％和85.6％。这对于所测试的用AS03佐剂化的所有四个抗原含量，优于欧洲官方所要求的40％。只有一个非佐剂化组(最高抗原剂量组(30μg))，刚能达到高于设定阈值的百分数。

·对于3.8μg、7.5μg、15μg和30μg加上佐剂的组，在四个佐剂化组中，在第42天的血清保护率分别是84.0％、90.0％、95.9％和85.4％。对于低于60岁的成年组，EMEA要求的百分数是70％，因此，所有的佐剂化组满足该标准，而普通的非佐剂化组都不能获得所要求的血清保护率。

·在该研究中，用不同的候选疫苗制剂接种两次之后，对于四个佐剂化组，血清阳转因子大于27.9，因此大大地超过2.5的设定要求。对于非佐剂化组，得到最高抗原剂量(15μg和30μg)的2个组以2.8(HN15组)和3.9(HN30组)满足要求。

对于EMEA列出的三个标准，其对评价大流行性流感候选疫苗也合适，使用第二剂量的相应H5N1疫苗(用AS03佐剂化)之后，所有的佐剂化组都达到了对该年龄组所限定的所有三个标准。第二剂量之后，所有的佐剂化组也达到了FDA推荐的血清阳转、血清保护和转化因子标准。

III.7.1.2 抗血凝素抗体应答异源菌株

认为针对抗原性不同的H5N1菌株(得自于疫苗株)评价免疫原性，可以进一步评价大流行疫苗候选物的潜力。对得到接种菌株的受试者的血清进行交叉反应性测试，并且评价由疫苗对抗原性不同的菌株作出反应而诱导的抗体的潜力。为了评价交叉反应性，选择H5N1A/印度尼西亚/5/2005。H5N1A/印度尼西亚属于进化枝2，而H5N1A/越南/1194/2004，疫苗株，属于进化枝1，并且是第一次大流行疫苗原型菌株，得自于WHO公开的新遗传组。因此，可以认为两个菌株的抗原性是不同的。

a)在研究H5N1-007中，针对H5N1印度尼西亚的几何平均滴度和血清阳性(表14)

血清反应阳性的定义为：HI抗体滴度≥1:10。对于印度尼西亚，在用越南菌株第一次接种之前，所有的受试者是血清反应阴性的。第二次接种之后，佐剂化组的高达48％的受试者(28％3.8μg组，48％7.5

μg组，26.5％15μg组，33.3％30μg组)获得血清阳性状态。比较起来，在3.8、7.5和15μg非佐剂化组中根本观察不到血清阳性，而在最高抗原非佐剂化组(30μg)中，对于H5N1印度尼西亚，仅仅发现2％(1个受试者)是血清反应阳性的。

表14：在第0天、21天和42天(利用疫苗组)时，HI抗体滴度的血清阳性率和GMT(免疫原性的ATP群组)

HN30＝H5N1 30μg，HN15＝H5N1 15μg，HN8＝H5N1 7.5μg，HN4＝H5N1 3.8μg

HN30AD＝H5N1 30μg+AS03，HN15AD＝H5N1 15μg+AS03，HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03，HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝可利用结果的受试者数目

n/％＝血清反应阳性受试者(HI滴度>＝1:10)的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

GMT＝几何平均抗体滴度

Min/Max＝最小/最大

PRE＝接种前剂量1(第0天)

PI(D21)＝首次接种之后21天(第21天)

PII(D42)＝第二次接种之后21天(第42天)

b)在研究H5N1-007中，针对H5N1印度尼西亚的血清保护(表15)第二次接种之后，在佐剂化组中，发现高达32.0％的受试者针对印度尼西亚菌株(不包含在疫苗中)是血清保护的。在3.8μg、7.5μg、15μg和30μg佐剂化组中，第二次接种之后，20.0％、32.0％、20.4％和29.2％的受试者分别具有≥1:40的滴度。在非佐剂化组中，没有受试者是血清保护的。

表15-在第0天、21天和42天(利用疫苗组)时HI抗体滴度的血清保护率(SP)(免疫原性ATP群组)。

HN30＝H5N1 30μg，HN15＝H5N1 15μg，HN8＝H5N1 7.5μg，HN4＝H5N1 3.8μg

HN30AD＝H5N1 30μg+AS03，HN15AD＝H5N1 15μg+AS03，HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03，HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

PRE＝接种前剂量1(第0天)

PI(D21)＝首次接种之后21天(第21天)

PII(D42)＝第二次接种之后21天(第42天)

N＝可利用结果的受试者的数目

n/％＝血清保护受试者(HI滴度>＝1:40)的数目/百分数

n/％UNPROT＝无保护受试者(HI滴度<1:40)的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

c)在研究H5N1-007中，针对H5N1印度尼西亚的血清阳转(表16)

在佐剂化组中，高达32.0％的受试者针对印度尼西亚菌株(不包含在疫苗中)获得血清阳转。在3.8μg、7.5μg、15μg和30μg佐剂化组中，第二次接种之后，各自20.0％、32.0％、20.8％和29.2％的受试者是血清阳转的。在非佐剂化组中，没有受试者表明是血清阳转的。

表16：在第21天和42天(利用疫苗组)时HI抗体滴度的血清阳转率(SC)(免疫原性ATP群组)。

HN30＝H5N1 30μg，HN15＝H5N1 15μg，HN8＝H5N1 7.5μg，HN4＝H5N1 3.8μg

HN30AD＝H5N1 30μg+AS03，HN15AD＝H5N1 15μg+AS03，HN8AD＝H5N1

7.5μg+AS03，HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

PI(D21)＝首次接种之后21天(第21天)，PII(D42)＝第二次接种之后21天(第42天)

N＝可利用结果的受试者的数目

n/％＝在特定POST处血清阳转的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

d)在研究H5N1-007中，针对H5N1印度尼西亚的血清阳转因子

在该试验中，佐剂化组获得2和2.8之间的血清阳转因子。在3.8μg、7.5μg、15μg和30μg佐剂化组中，血清阳转因子分别是2.0、2.8、2.1和2.3。

e)针对H5N1A/印度尼西亚的交叉反应性数据的结论

在结论中，2个剂量的裂解病毒候选疫苗(用AS03佐剂进行佐剂化)之后，与在亚洲引起人类相当多发病和致死率的疫苗株相比较，H5N1菌株(源于不同的进化枝)获得的交叉反应性数据是阳性的。高达48％的受试者显示了被引发迹象，高达32％的受试者针对非疫苗株实际上是血清保护的。这些结果表明，大流行疫苗的佐剂化可以针对疫苗候选物中使用的大流行菌株的漂移变体提供交叉反应性。这些结果证明了佐剂化疫苗的引发和交叉引发的潜力。

III.7.1.3 对同源菌株H5N1A/越南的中和抗体应答

中和试验是定量分析可抑制流感病毒与细胞粘附、渗入到细胞中以及在细胞中繁殖的抗体的方法。尽管对于血球凝集素抑制试验确定了血清保护阈值，但对于该试验，情况不是这样的。或者，中和滴度增加四倍可用于评价接种的个体是否针对接种菌株或异源菌株具有应答。血清阳转率是CHMP/FDA用以评价候选流感疫苗效果的一个关键免疫原性参数。在使用漂移菌株的这种中和试验中，预计血清样品的测试将至少可以预报已经针对给定菌株(不同于疫苗株)“被引发的”个体的频率。

a)在研究H5N1-007中，在针对H5N1越南的中和试验中测定的几何平均滴度和血清阳性(表17)

血清阳性的阈值设置为≥1:28的滴度，中和试验也是高灵敏度的试验。在非佐剂化组中，在第0天的GMT的范围是14.0至18.1，在佐剂化组中，GMT的范围是18.5至25.2。第二次接种之后，对于3.8、7.5、15和30μg组的非佐剂化组，滴度以剂量依赖性方式分别增加至43.9、61.7、86.9和177.8。在佐剂化组中，对于3.8、7.5、15和30μg组，分别获得381.0、421.2、464.7和333.3的滴度，完全重复了HI滴度中的观察结果：从3.8μg至7.5μg至15μg的佐剂化组，观察到GMT的剂量依赖性增加(表17)。

表17：在第0天、21天和42天，中和抗体滴度的血清阳性率和GMT(免疫原性的ATP群组)

HN30＝H5N1 30μg；HN15＝H5N1 15μg；HN8＝H5N1 7.5μg；HN4＝H5N1 3.8μg

HN30AD＝H5N1 30μg+AS03；HN15AD＝H5N1 15μg+AS03；HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03；HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝可利用结果的受试者的数目

n/％＝血清反应阳性受试者(HI滴度>＝1:10)的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

GMT＝几何平均抗体滴度

Min/Max＝最小/最大

PRE＝接种前剂量1(第0天)

PI(D21)＝首次接种之后21天(第21天)

PII(D42)＝第二次接种之后21天(第42天)

b)在研究H5N1-007中，针对H5N1越南的中和抗体滴度的血清阳转率(表18)

如上所述，针对流感菌株，四倍增加用于测定血清阳转。因此，如果获得四倍增加，在第0天仅仅包括血清反应阳性的受试者，因此减去潜在背景。

第二次剂量之后，在非佐剂化组中，可以再次以剂量依赖性方式观察到血清阳转：在3.8、7.5、15和30μg组中，血清阳转的受试者分别为20.9、37.5、53.5和76.0％。在佐剂化组中，在3.8、7.5、15和30

μg组中，86.0、83.3、86.0和100.0％的受试者分别具有血清阳转，因此也证明了HI结果。值得注意的是，佐剂化疫苗的首次剂量之后，在四个佐剂化组中，66.7至88.0％的受试者实现血清阳转。

表18：在接种后的各个时点的中和抗体滴度(源于Dresden)的血清阳转率(SC)(免疫原性的ATP群组)

HN30＝H5N1 30μg；HN15＝H5N1 15μg；HN8＝H5N1 7.5μg；HN4＝H5N1 3.8μg

HN30AD＝H5N1 30μg+AS03；HN15AD＝H5N1 15μg+AS03；HN8AD＝H5N17.5μg+AS03；HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝可利用结果的受试者的数目

n/％＝血清阳转(接种后(at POsT)至少4倍增加)的受试者的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

对于越南菌株，在10A和10B中分别说明了GMT滴度和血清阳转率。在结论中，针对疫苗株(越南)测定的中和抗体证明了HI所获得的结果。首次剂量后的大流行候选疫苗之后，在所有的佐剂化组(包括3.8μg的最低剂量组)中，超过65％的受试者获得了血清阳转，第二剂量的大流行候选疫苗之后，超过80％的受试者获得了血清阳转。

III.7.1.4 对异源菌株H5N1 A/印度尼西亚的中和抗体应答

本文下面提供了(3.8μg和7.5μg HA佐剂化组)的部分数据。正如所讨论的那样，由于测定抗体(除了抑制病毒粘附之外，还抑制流感病毒渗入到细胞中，和抑制流感病毒在细胞与细胞间的繁殖)的中和试验的性质，评价漂移菌株可以进一步评价疫苗对于非疫苗株的引发潜力。

a)在研究H5N1-007中，针对H5N1A/印度尼西亚的中和试验中所测定的几何平均滴度和血清阳性(表19)

在两个最低的佐剂化组中，两个剂量疫苗之后，对于3.8μg和7.5μg佐剂化组，针对印度尼西亚菌株获得的GMT分别是70.6和73.1。

表19：在第0天、21天和42天，针对印度尼西亚菌株的中和抗体滴度的血清阳性率和GMT(免疫原性的ATP群组)

HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03，

HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝可利用结果的受试者的数目

n/％＝血清反应阳性受试者(HI滴度>＝1:10)的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

GMT＝几何平均抗体滴度

Min/Max＝最小/最大

PRE＝接种前剂量1(第0天)，PI(D21)＝首次接种之后21天(第21天)，PII(D42)＝第二次接种之后21天(第42天)

b)在研究H5N1-007中，针对H5N1A/印度尼西亚的中和抗体滴度的血清阳转率(表20)

针对抗原性不同的非接种菌株，3.8和7.5μg佐剂化组得到了高血清阳转率：当针对A/印度尼西亚菌株测试时，84.2％的受试者实现血清阳转。

表20：在接种后的各个时点的中和抗体滴度(针对印度尼西亚菌株)的血清阳转率(SC)(免疫原性的ATP群组)

HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03，

HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

PRE＝接种前剂量1(第0天)，PI(D21)＝首次接种之后21天(第21天)，PII(D42)＝第二次接种之后21天(第42天)

N＝可利用结果的受试者的数目

n/％＝血清阳转(接种后至少4倍增加)的受试者的数目/百分数

95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限

在中和试验中，交叉反应性的可利用数据表明了佐剂化疫苗(包含异源菌株)对于试验的印度尼西亚菌株的显著效果，并且证明了候选疫苗的可交叉反应的潜力。

III.7.1.5 细胞介导的免疫(CMI)

为了评价CMI，请参见I.2、I.3和IV.3.2部分。佐剂在提高疫苗的免疫原性方面的一个重要性能是能够刺激细胞介导的免疫(CMI)。在这种试验中，可以预见流感特异性CD4-和CD8-细胞的评价(包括Th1相关的细胞因子的频率)以及记忆B细胞的频率的评价。对两个最低抗原组(用AS03佐剂化或不用AS03佐剂化)的T细胞应答，数据是可得到的。

CMI结果可以表示为：细胞因子-阳性CD4 T细胞的频率。

中间值(包括第一和第三个四分点，参见表21)提供在图11中。结果表明，与非佐剂化组相比，佐剂化组明显地引起更强得多的CD4应答。

表21：在各个时点对频率-阳性CD4T细胞(每百万个CD4T细胞)的描述统计学(免疫原性的ATP群组)

HN8＝H5N1 7.5μg

HN4＝H5N1 3.8μg

HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03

HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

N＝可利用结果的受试者的数目；N miss.＝失去结果的患者的数目

GM＝几何平均

SD＝标准偏差

Q1，Q3＝四分之一和四分之三

MIN/MAX＝最小/最大

推理分析证明，首次接种之后的21天(IFNγ阳性CD4细胞除外)和第二次接种之后在第42天，与得到相同剂量的非佐剂化组相比，在佐剂化组中，细胞因子阳性CD4细胞的诱导显著地高。因此，在由疫苗引起的抗体的血清评价中看到的佐剂效果，通过CMI结果得到了证明。类似方式的分析表明，对CMI的效果清楚地是佐剂依赖性，而不是剂量依赖性的(只对比3.8μg和7.5μg剂量)，其与HI结果一致(参见表22)。

表22：在各个时点对细胞因子-阳性CD4 T细胞频率的推论统计学(p-值得自于克鲁斯凯-沃利斯检验)

HN8＝H5N1 7.5μg

HN4＝H5N1 3.8μg

HN8AD＝H5N1 7.5μg+AS03

HN4AD＝H5N1 3.8μg+AS03

总之，用两个最低的测试抗原剂量，与潜在大流行菌株A/越南组合的AS03能够刺激细胞介导的免疫应答。此外，在佐剂化组中观察到的应答比无佐剂化组诱导的CD4应答更强。

IV.8.总体结论

IV.8.1.反应原性和安全结果

下次流感大流行的标志(leading)候选物是禽病毒H5N1，其在鸟与人之间传播的病例中已经导致了高死亡率，虽然没有完全证明有效的人与人之间的传播。H5N1表明了与全球输送网组合的人与人之间有效扩散的能力，该结果可能是影响高比例个体的广泛的流感突发，在所有国家引起增加的致死和发病率。

因此，必须建立接种的免疫有效和抗原减量(sparing)方法，以潜在地防止大流行的破坏效果。这可以通过使用合适佐剂来实现，并且新佐剂增加H5N1候选疫苗效果的免疫原性可以首次示于这种试验中。

设计这种研究，评价(1)在健康成人中，用水包油乳化液(即AS03)佐剂化的或不用其佐剂化的大流行性流感候选疫苗的安全和反应原性，(2)抗体和细胞介导的免疫应答。

反应原性数据表明，与无佐剂组相比较，佐剂化的大流行候选疫苗可以诱导(与抗原含量无关)更多局部和全身症状。然而，所有4个佐剂化组的安全特性在临床上是可接受的。没有报道严重的不利状况。

由这些结果可以断定，用AS03佐剂化的大流行候选疫苗的反应原性和安全特性是令人满意和临床上可接受的。

IV.8.2.免疫原性结果

关于免疫应答，用AS03佐剂化的大流行性流感候选疫苗对所有抗原内容都测试(3.8μg，7.5μg，15μg和30μgHA，H5N1A/越南/1194/2004)均超出了欧洲官方对裂解病毒体流感疫苗的年注册要求(“Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenzaVaccines”for the immuno-logical assessment of the annual strainchanges-CPMP/BWP/214/96)，该要求目前用作评价大流行候选流感疫苗的基础(Guideline on dossier structure and content for pandemicinfluenza marketing authorization application，CPMP/VEG/4717/03)。

对于在该试验中测试的佐剂化大流行性流感候选疫苗的四个不同抗原含量，在健康成人中是免疫原性的，其对流感血球凝集素形成出色的抗体应答，通过HI测定(表23)。

表23

 

变量	抗体应答的EU标准	30HNAD	15HNAD	7.5HNAD	3.8HNAD
						转化因子	>2.5	27.9	38.1	60.5	36.4
血清阳转率(％)	>40％	85.4	95.9	90.0	82.0
						保护率(％)	>70％	84.0	90.0	95.9	85.4

此外，评价对抗原性不同菌株(H5N1 A/印度尼西亚/5/05)的交叉反应性的数据(用血球凝集素抑制试验)表明，在佐剂化组中，还产生了针对漂移菌株的接种者的交叉引发。通过使用同源与异源菌株的中和试验的评价，完成血清测定。同样，通过中和试验，可以证明疫苗候选物的免疫原性和交叉保护潜力。

总之，2剂量的新佐剂化大流行性流感候选疫苗可以在在3.8μg的最低测试剂量、在很高比例的受试者中(针对疫苗株H5N1A/越南/1194/2004)诱导保护性滴度，优于评价流感疫苗的免疫原性所建立的所有标准。此外，获得的结果证明了候选大流行前疫苗针对漂移(drift)菌株诱导免疫性的能力。

该结果支持了要求保护的疫苗组合物在大流行情况下实现血清保护的用途，其中，大流行前引发是用包含菌株(其对循环大流行菌株是异源的)的疫苗进行的。换句话说，要求保护的组合物可用于引发对漂移的大流行菌株的随后应答。该结果支持了要求保护的组合物用异源和同源的1-和2-剂量来引发-加强大流行单价(H5N1)流感疫苗(用AS03佐剂化)的用途：

-用一或两个剂量的佐剂化疫苗(包含一种大流行菌株(例如越南菌株))、以选择的剂量(包括低HA数量)来引发患者，

-几个月以后(例如6或12个月以后)，随后给予通过一个剂量的i)相同大流行菌株(例如越南菌株，即同源引发-加强)或ii)异源(例如印度尼西亚菌株，即异源引发-加强)菌株，作为加强。

这种佐剂化疫苗的价值重要地在于如下状况，在这种状况中，在大流行开始之前或大约在大流行开始时，个体已经被与‘大流行’菌株相同的菌株或与其不同的菌株引发一次或两次之后宣布大流行。

Claims (44)

1.单价流感疫苗组合物，其包含与佐剂组合的低量流感病毒抗原或抗原性制品，所述流感病毒或其抗原性制品得自流感病毒菌株，该流感病毒菌株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力，其中低抗原数量每剂量不超过15μg的血细胞凝集素(HA)，和其中所述佐剂是水包油乳液，其包含可代谢油、甾醇或生育酚和乳化剂。

2.按照权利要求1的组合物，其中所述生育酚是α-生育酚。

3.按照权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述可代谢的油是鲨烯。

4.按照权利要求1至3的任一项的组合物，其中所述可代谢的油是以所述免疫原性组合物的总体积的0.5％至20％的量存在的。

5.按照权利要求1至4的任一项的组合物，其中所述可代谢的油是以所述免疫原性组合物的总体积的1.0％至10％的量存在的。

6.按照权利要求1至5的任一项的组合物，其中所述可代谢的油是以所述免疫原性组合物的总体积的2.0％至6.0％的量存在的。

7.按照权利要求1至6的任一项的组合物，其中所述生育酚或α-生育酚是以所述免疫原性组合物的总体积的1.0％至20％的量存在的。

8.按照权利要求1至7的任一项的组合物，其中所述生育酚或α-生育酚是以所述免疫原性组合物的总体积的1.0％至5.0％的量存在的。

9.按照权利要求1至8的任一项的组合物，其中鲨烯∶生育酚或鲨烯∶α生育酚的比例等于或小于1。

10.按照权利要求1至9的任一项的组合物，其中所述乳化剂是Tween 80。

11.按照权利要求1至10的任一项的组合物，其中所述乳化剂是以所述免疫原性组合物的0.01至5.0％重量(w/w)的量存在的。

12.按照权利要求1至11的任一项的组合物，其中所述乳化剂是以所述免疫原性组合物的0.1至2.0％重量(w/w)的量存在的。

13.按照权利要求1至12的任一项的组合物，其中HA抗原的量不超过每剂量10μg。

14.按照权利要求13的组合物，其中HA抗原的量每剂量不超过8μg或4μg或2μg。

15.按照权利要求12至14的任一项的组合物，其中HA抗原的量在每剂量1-7.5μg或1-5μg之间。

16.按照权利要求15的组合物，其中HA抗原的量包含每种菌株2.5至7.5μg之间的HA。

17.按照权利要求1至16的任一项的组合物，其中所述大流行性流感病毒株选自：H5N1，H9N2，H7N7，H2N2，H7N1和H1N1。

18.按照权利要求17的组合物，其中所述大流行性流感病毒株选自：H5N1，H9N2，H7N7，H2N2，H7N1和H1N1。

19.按照权利要求1至19的任一项的组合物，其中抗原或抗原组合物是下列形式：纯化的全流感病毒，无活性流感病毒，或流感病毒的亚单位组份。

20.按照权利要求19的组合物，其中所述无活性流感病毒是裂解流感病毒。

21.按照权利要求1至20的任一项的组合物，其中所述流感抗原或抗原性组合物源自于细胞培养物或在胚胎期的卵中制备。

22.权利要求1至20的任一项所要求的组合物在药物中的用途。

23.一种试剂盒，其包括：包含低数量流感病毒抗原或其抗原性制品的单元和包含权利要求1至12的任一项所定义的水包油佐剂的单元。

24.按照权利要求23的试剂盒，其中所述抗原是HA。

25.按照权利要求24的试剂盒，其中所述HA的数量如权利要求1或权利要求13至16中所定义。

26.制备用于大流行情况或大流行前的情况的流感疫苗组合物的方法，该方法包括：将流感病毒抗原与水包油乳液佐剂混合，提供每剂量包含不超过15μg流感血细胞凝集素抗原的疫苗单元，所述流感病毒抗原得自单一流感病毒菌株，其与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。

27.权利要求26所要求的方法，其中水包油乳状液佐剂如权利要求1至12的任一项所定义。

28.(a)低数量的流感病毒抗原或其抗原性制品和(b)水包油乳液佐剂在制备权利要求1-22的任一项所要求的免疫原性组合物中的用途，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自于单一流感菌株，其与大流行相关或具有与大流行有关的潜力，所述免疫原性组合物用于诱导以下至少一种：i)改善的CD4T-细胞免疫应答，ii)在人中针对所述病毒或抗原性组合物改善的B-细胞记忆应答，iii)改善的体液应答。

29.按照权利要求28的用途，其中所述CD4T细胞免疫应答包括：诱导可交叉反应的CD4T辅助应答，或诱导可交叉反应的体液免疫应答。

30.(a)低数量的大流行性流感病毒抗原或其流感病毒血球凝集素抗原的抗原性制品，其得自于单一流感菌株，与大流行相关或具有与大流行有关的潜力，和(b)权利要求1至12的任一项所定义的水包油乳液佐剂，在制备用于针对流感病毒感染进行保护的批量疫苗或疫苗试剂盒中的用途。

31.按照权利要求29至30的任一项的用途，其中所述免疫应答或保护作用满足至少一个、至少两个、或所有三个关于流感疫苗效果的国际管理标准。

32.按照权利要求28至31的任一项的用途，其中所述免疫应答或保护作用是在一或两个剂量的疫苗之后获得的。

33.按照权利要求29至32的任一项的用途，其中所述疫苗是胃肠外给予的。

34.权利要求27至28的任一项所要求的方法或权利要求29至34的任一项所要求的用途，其中所述HA抗原数量如权利要求14至17的任一项所定义。

35.流感病毒或其抗原性制品在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于预先用权利要求1至21的任一项所要求的免疫原性组合物预先接种的人的再接种。

36.按照权利要求35的用途，其中再接种所使用的组合物包含佐剂。

37.按照权利要求36的用途，其中所述佐剂是水包油乳状液佐剂。

38.按照权利要求35至37的任一项的用途，其中所述用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制品，所述流感病毒或其抗原性制品与大流行有关或具有与大流行有关的潜力。

39.按照权利要求38的用途，其中所述大流行毒株选自：H5N1，H9N2，H7N7，H2N2，H7N1和H1N1。

40.按照权利要求38或权利要求39的用途，其中所述用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制品，它们与用于第一次接种的流感病毒或其抗原性制品共有共同的CD4T-细胞表位或共同的B细胞表位。

41.按照权利要求35至40的任一项的用途，其中首次接种用包含可潜在地引起大流行的流感菌株的流感组合物进行，再接种用包含循环大流行菌株的流感组合物进行。

42.得自于第一种流感菌株的抗原或抗原性制品在制备权利要求1至21的任一项所要求的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于针对变异流感菌株所引起流感的保护作用。

43.按照权利要求42的用途，其中第一种流感菌株与大流行有关或具有与大流行有关的潜力。

44.按照权利要求42的用途，其中变体流感菌株与大流行有关或具有与大流行有关的潜力。

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