CN111032861A - 重配流感病毒的阶段性制备方法 - Google Patents

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Abstract

在抗原株与供体株具有类似的抗原性的情况下，提供一种具有两种以上的流感病毒的基因组片段的重配流感病毒的制备方法。使用包含抗原蛋白质(x)的第一流感病毒(1)、具有与株(1)类似的抗原性的抗原蛋白质(x’)的第二流感病毒(2)、具有与株(1)不同的抗原性的抗原蛋白质(y)的第三流感病毒(3)、且包含以下工序：使宿主感染株(2)和株(3)并进行共培养来制备重配流感病毒并从该病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)，接着使宿主感染株(1)和上述选择出的株(Y)并进行共培养，并从由株(1)和株(Y)制备的重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)。

Description

重配流感病毒的阶段性制备方法
技术领域
本发明涉及具有两种以上的流感病毒基因组片段的重配流感病毒的制备方法，涉及包括至少两个阶段的重配工序的重配流感病毒制备方法。
本申请要求通过引用而援引于此的日本申请特愿2017-163114号的优先权。
背景技术
流感是每年在世界范围内流行的传染病，其由流感病毒引起。流感病毒属于正粘病毒科，具备具有脂质双层膜结构的包膜。分类为甲型、乙型以及丙型这三个属，分别称为甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。一般情况下，流感病毒特别是指甲型或乙型。甲型、乙型以及丙型的不同基于构成病毒粒子的蛋白质中的M1蛋白质与NP蛋白质的抗原性的不同。另外，即使是相同的甲型、乙型，根据作为包膜表面上的分子的红血球凝聚素(血凝素，以下称为“HA”)、神经氨酸酶(以下称为“NA”)的抗原性的不同，也分类为多个亚型和株。
流感病毒以较高的概率会发生抗原变化，从而产生新型的流感病毒。甲型流感病毒基于其HA以及NA的抗原性而被分类为16种HA(H1～H16)亚型以及9种NA(N1-N9)亚型。甲型流感病毒的三种HA(H1、H2以及H3)亚型是特别重要的病原体。甲型流感病毒的H1N1亚型以及H3N2亚型季节性地传播并引起人类感染。2003年，高致死性的禽源流感病毒H5亚型作为人类病原体出现。2009年4月，H1N1亚型病毒作为一种新型流感病毒出现，并在人群中急速地蔓延。由于流感还有可能会发生大流行，因此要求在数量上确保流感疫苗。
流感疫苗采用利用发育鸡胚而使流感病毒增殖的方法。另外，在培养细胞中使流感病毒增殖的方法也正在实用化。基于由传染病发生动向调查工作获得的国内的流行状况、针对国内分离病毒的抗原性、基因分析的成绩等的信息等，进行下一年度季节流行预测，来选择流感疫苗株。但是，根据株的不同，有时培养上清液的感染效价较低，增殖性的改善是重要的课题。当在流感病毒的增殖中利用发育鸡胚、培养细胞的情况下，根据流感病毒的亚型、株的不同而宿主中的病毒的增殖性降低成为问题。因此，进行了通过基因重组技术来制备提高了宿主中的增殖性的流感病毒的基因重组体的尝试。作为基因重组技术，可举例示出为重配法、反向遗传学法(以下称为“RG法”)。作为RG法之一，可列举为将用于供给病毒RNA(vRNA)的8种质粒(Pol I质粒)和对用于形成病毒粒子所需的结构蛋白质进行编码的4种表达质粒(Pol II质粒)的合计12种质粒同时导入细胞来制备流感病毒的基因重组体的方法(非专利文献1)。
在细胞培养流感疫苗中，优选使用在培养细胞中显示出高增殖性的种子病毒，并且为了稳定地供给疫苗而要求高效地制备该种子病毒。在专利文献1中公开了如下内容：使用具有来源于与抗原株相同的甲型流感病毒亚型的主链序列的核苷酸、在HA序列中导入了弱毒化突变的核苷酸并通过RG法制备的重组病毒在细胞中显示出了高增殖性。但是，在RG法中，由于将多个质粒同时导入细胞，因此对于宿主细胞而言负担较大。另外，由于各种质粒的制备需要时间，因此存在难以迅速地制备基因重组体的问题。
作为流感病毒的基因重组技术，正在进行如下重配法的研究：使宿主共感染至少两种以上的流感病毒，在增殖的过程中交换基因组片段并进行重组来制备基因重组体。通过重配法来尝试制备包含对具有所期望的抗原性的蛋白质进行编码的基因组片段和对所期望的主链的蛋白质进行编码的基因组片段的重配流感病毒。
在重配法中，使宿主共感染两种以上的流感病毒，在增殖的过程中交换基因组片段并进行重组，由此制备基因重组体(非专利文献2、3)。以鸡胚为宿主来进行基于重配法的流感病毒基因重组体的制备。具体而言，通过使发育鸡胚混合感染PR8株等具有高增殖性的供体株和流行株(抗原株)，由此制备兼具高增殖性的主链基因和流行株的抗原基因的基因重组体。但是，在将发育鸡胚用作宿主的重配法中，存在未必能够制备目标基因重组体的问题。因此，出于获得流感病毒的基因重组体的目的，正在研究使用培养细胞来进行重配法。但是，在使用培养细胞的重配法中，也存在未必能够制备目标基因重组体的担忧。在专利文献2中公开了如下内容：作为使用培养细胞的重配法，使有可能阻碍供体株的HA和/或NA的转录、翻译的阻碍因子与感染了两种流感病毒的宿主接触，从而制备重配流感病毒。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许5686741号公报
专利文献2：国际公开WO2011/145081
非专利文献
非专利文献1：Neumann et al.,PNAS Vol.102,p.16825-16829(1999)
非专利文献2：PLoS Pathog.2015Oct；11(10):e1005204.
非专利文献3：J Virol.1976Oct；20(1):248-54.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的问题在于，在抗原株与供体株具有类似的抗原性的情况下，提供一种具有两种以上的流感病毒的基因组片段的重配流感病毒的制备方法、以及所得到的流感病毒。
用于解决问题的手段
本发明的发明人为了解决上述问题而反复进行深入研究的结果是，发现根据使用至少三种流感病毒、包括至少两个阶段的重配工序的方法，能够解决上述问题，从而完成了本发明。
即，本发明由以下构成。
1、一种包含抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的制备方法，是重配流感病毒的制备方法，其特征在于，使用以下所示的(1)～(3)的至少三种流感病毒、且包含以下的工序(A)和工序(B)的至少两个阶段的重配工序：
(1)包含抗原蛋白质(x)的第一流感病毒；
(2)具有与(1)的流感病毒类似的抗原性的抗原蛋白质(x’)的第二流感病毒；
(3)具有与(1)的流感病毒不同的抗原性的抗原蛋白质(y)的第三流感病毒：
工序(A)是使宿主感染流感病毒(2)和流感病毒(3)并进行共培养来制备重配流感病毒并从该重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)的工序；
工序(B)是使宿主感染流感病毒(1)和在所述工序(A)中制备的流感病毒(Y)并进行共培养来制备重配流感病毒并从该重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的工序。
2、根据前项1所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述制备方法包含在所述工序(A)中的对流感病毒(2)和流感病毒(3)进行共培养之前，对流感病毒(3)进行使其具有初期感染能力、且使病毒增殖性丧失或降低的处理的工序。
3、根据前项1或2所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述制备方法包含在所述工序(B)中的对流感病毒(1)和流感病毒(Y)进行共培养之前，对流感病毒(1)进行使其具有初期感染能力、且使病毒增殖性丧失或降低的处理的工序。
4、根据前项1～3中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述工序(A)中的选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)的工序包含使与抗原蛋白(x’)反应的抗体接触的工序。
5、根据前项1～4中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述工序(B)中的选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的工序包含使与抗原蛋白(y)反应的抗体接触的工序。
6、根据前项1～5中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，在所述工序(A)中，包含从重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)。
7、根据前项1～6中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，在所述工序(B)中，包含从重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)。
8、一种流感病毒(X)，其通过前项1～7中任一项所述的制备方法来制备。
9、一种重配流感病毒，其特征在于，包含来源于抗原株流感病毒和供体株流感病毒的至少两种流感病毒的蛋白质、且所述抗原株流感病毒和供体株流感病毒具有类似的抗原性。
发明效果
根据本发明的重配流感病毒的制备方法，在抗原株与供体株具有类似的抗原性的情况下，能够制备具有两种以上的流感病毒的基因组片段的重配流感病毒。
附图说明
图1是表示本发明的重配流感病毒的制备方法的概念的图。
具体实施方式
本发明涉及在抗原株与供体株具有类似的抗原性的情况下制备具有两种以上的流感病毒的基因组片段的重配流感病毒的方法。
流感病毒具有脂质双层膜结构的包膜。包膜的内层主要由作为基质蛋白质以及RNA与蛋白质的复合体的RNP构成。流感病毒具有PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及NS这八个基因(基因组片段)，外层被作为主要抗原蛋白质的NA、HA覆盖。HA以及NA的基因组片段分别对HA以及NA的抗原蛋白质进行编码，除此以外的PB2、PB1、PA、NP、M以及NS片段这六个基因组片段对主链的蛋白质进行编码。
在本说明书中，具有抗原性的蛋白质(以下，称为抗原蛋白质)是指由对HA以及NA进行编码的基因组片段中的任一个表达的蛋白质，主链的蛋白质(以下，称为主链蛋白质)是指由PB2、PB1、PA、NP、M以及NS片段这六个基因组片段中的任一个表达的蛋白质。在本说明书中，将具有对所期望的抗原蛋白质进行编码的基因组片段的流感病毒称为抗原株。另外，在本说明书中，将具有对所期望的主链蛋白质进行编码的基因组片段的流感病毒称为供体株。
在重配法中，基因重组效率低、不能得到目标基因重组体的概率高是较大的问题。另一方面，在上述背景技术一栏所示的专利文献2中记载了为了得到高增殖性的重配流感病毒而需要约35天。即，在重配法中，由于使用病毒本身来制备基因重组体，因此虽然与RG法相比能够缩减准备质粒、细胞所需的时间、成本，但是由于其基因重组效率低，其结果是存在为了得到目标的高增殖性的重配流感病毒而需要较长时间的担忧。
本发明的发明人认为，在重配法中无法获得目标重组基因效率的原因在于，在共感染的流感病毒中，无法对增殖的过程中发生的基因组片段交换进行控制。因此，对以下内容进行了研究：在使用具有所期望的抗原性的第一流感病毒和具有高增殖性的主链的第二流感病毒并通过重配法来制备具有所期望的抗原性、且高增殖性的流感病毒时，通过选择具有病毒初期感染能力、且实施了使病毒增殖性丧失或降低的处理的第一流感病毒和与第二流感病毒共培养而具有第一流感病毒的抗原性的病毒，从而短时间且高效地制备重配流感病毒。在此，作为具有病毒初期感染能力且使病毒增殖性丧失或降低的处理，例如可列举为紫外线照射。作为紫外线照射量，只要是使流感病毒具有初期感染能力、且使该流感病毒的增殖性丧失或降低的照射量即可。
但是，如上所述，流感是每年在世界范围内流行的传染病，以较高的概率会发生抗原性的变化，因此难以对该年流行的流感株(以下，称为流行株)进行预测。本发明的发明人发现，在为了提高所期望的宿主中的流行株的增殖性而尝试进行基因重组的情况下，在具有增殖性优异的主链蛋白质的供体株和流行株具有类似的抗原性的情况下，在以往的重配法中难以制备基因重组体。因此，期望一种即使在抗原株与供体株具有类似的抗原性的情况下也能够制备重配流感病毒的方法。因此，发现根据使用至少三种流感病毒、包括至少两个阶段的重配工序的方法，能够制备重配流感病毒，从而完成了本发明。即，本发明涉及一种包含抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的制备方法，是使用了重配流感病毒的制备方法的流感病毒的制备方法，其特征在于，使用以下所示的(1)～(3)的至少三种流感病毒，包括以下的工序(A)和工序(B)的至少两个阶段的重配工序(参照图1)。
对本说明书中的(1)～(3)的至少三种流感病毒、本发明的流感病毒(X)、以及在制备流感病毒(X)之前所制备的流感病毒(Y)进行说明。作为本发明的目标的流感病毒是包含所期望的抗原蛋白质(x)且具有所期望的主链蛋白质的流感病毒。
在本说明书中，流感病毒(1)是具有所期望的抗原蛋白质(x)的第一流感病毒(抗原株)。在本说明书中，流感病毒(2)是具有与上述抗原蛋白质(x)类似的抗原性的抗原蛋白质(x’)和所期望的主链蛋白质的第二流感病毒(供体株)。在本说明书中，流感病毒(3)是具有与上述抗原蛋白质(x)不同的抗原性的抗原蛋白质(y)的第三流感病毒。
在本说明书中，流感病毒(Y)是使宿主感染上述流感病毒(2)和上述流感病毒(3)并进行共培养而制备的重配流感病毒，是指具有抗原蛋白质(y)和所期望的主链蛋白质的重组供体株。
在本说明书中，流感病毒(X)是使宿主感染上述流感病毒(1)和上述流感病毒(Y)并进行共培养而制备的重配流感病毒，是具有所期望的抗原蛋白质(x)和所期望的主链蛋白质的作为本发明的目标的流感病毒。
在本发明中得到的作为目标流感病毒的流感病毒(X)中，对HA以及NA进行编码的基因组片段中的至少一个(优选为至少对HA进行编码的基因组片段)来源于流感病毒(1)，除此以外的基因组片段中的至少一个来源于流感病毒(2)。
本发明的包含抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的制备方法的特征在于，包括以下的工序(A)和工序(B)的至少两个阶段的重配工序。
工序(A)：使宿主感染流感病毒(2)和流感病毒(3)并进行共培养来制备重配流感病毒，并从该重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)的工序。
工序(A)-1：流感病毒(3)的钝化工序
在制备重配流感病毒之前，对流感病毒(3)进行具有病毒初期感染能力、且使病毒增殖性丧失或降低的处理。具体而言，对流感病毒(3)照射紫外线而对流感病毒进行钝化。紫外线的照射量优选为紫外线照射后的流感病毒具有对宿主的初期感染能力但感染后的病毒增殖性丧失或降低的程度。感染后的病毒增殖性的丧失或降低是指，在使宿主单独感染第一流感病毒时，与未确认宿主内的病毒的增殖性、或未进行紫外线照射的第一流感病毒相比病毒增殖性降低。病毒增殖性可以使用病毒感染效价、PFU(Plaque Forming Unit，蚀斑形成单位)等公知的指标来进行评价。另外，在进行紫外线照射后，在使宿主感染第一流感病毒的情况下，需要具有对宿主的感染能力、即初期感染能力。具有初期感染能力的状态是指在宿主为培养细胞的情况下，观察到由照射紫外线后的病毒引起的CPE(cytopathiceffect，细胞病变效应)。在本工序中，优选在Spectrolinker XL-1000(SpectronicsCorporation)的时间模式(Time Mode)下对第一流感病毒照射与进行紫外线照射的情况下同等的紫外线照射量1～60秒钟，优选为5～50秒钟，进一步优选为10～40秒钟，最优选为10～30秒钟。用于该UV照射的装置(UV强度、距光源的距离等在以下的实施例中记载)以及照射时间等的照射条件为一个例子，只要是与该照射条件相同程度的紫外线照射量，则可以对这些条件适当地进行调整、变更。如果是上述条件的紫外线照射量，则能够高效地得到具有对宿主的初期感染能力但病毒增殖性丧失或降低的流感病毒，因此优选。在本发明中，通过在具有对宿主的初期感染能力的状态下使第一流感病毒的病毒增殖性丧失或降低，能够提高宿主内的基因重组效率。
工序(A)-2：重配流感病毒的制备工序
可以通过使宿主感染流感病毒(2)和上述进行了紫外线照射的流感病毒(3)并进行共培养来制备流感病毒(2)和流感病毒(3)的重配流感病毒。
各流感病毒对宿主的感染可以同时进行，也可以不同时进行。优选在使宿主感染流感病毒(3)之后，再感染流感病毒(2)。通过使宿主与流感病毒接触来进行流感病毒对宿主的感染。优选以1×10-6～10moi使流感病毒(3)与宿主接触，更优选为0.001～1moi，进一步优选为0.1～1moi。优选以0.001～10moi使流感病毒(2)与宿主接触，更优选为0.01～1moi，进一步优选为0.1～1moi。以往，为了使流感病毒共感染宿主，需要以较高的浓度使病毒与宿主接触而使宿主感染。但是，在本发明中，即使是较低的浓度，也能够使流感病毒共感染宿主而高效地制备基因重组体。此外，流感病毒(3)的moi是照射紫外线之前的值。流感病毒的感染效价(TCID50/mL)可以根据国立传染病研究所著的“流感诊断手册(第3版，平成26年9月)”的“Part IV”(以下称为“参考文献1”)中公开的方法来进行确认，可以通过将感染效价除以细胞数来计算出moi。
对感染了流感病毒(3)和流感病毒(2)的宿主进行培养而得到培养物。通过本工序的培养，在宿主内对流感病毒进行重配。宿主的培养条件、例如培养温度等，只要是能够使流感病毒在宿主内增殖的条件，则可以是任何条件。在宿主为培养细胞的情况下，用于培养的培养基优选为液体培养基。在液体培养基中经常添加来源于动物的血清，但是不能否定来源于动物的血清包含阻碍目标流感病毒的增殖的因子的可能性，因此更优选使用不包含该因子的无血清培养基。作为无血清培养基，可举例示出为Eagle’s MEM培养基(日水制药株式会社)、Opti PRO SFM(Thermo Fisher Scientific)、VP-SFM(Thermo FisherScientific)、EX-CELL MDCK(SAFC Biosciences)、UltraMDCK(Lonza)、ProVero 1(Lonza)、BalanCD MDCK(Irvine Scientific)等。培养时间优选为1～5天，更优选为2～3天左右。在本工序中，在培养后得到培养物。在该培养物中，包含在宿主内进行重配而得到的重配流感病毒。重配流感病毒，在宿主为发育鸡胚的情况下包含在尿囊液中，在宿主为培养细胞的情况下包含在培养上清液中。
工序(A)-3：流感病毒(Y)的选择工序
通过从培养物中的重配流感病毒中使包含抗原蛋白质(x’)的流感病毒失活而实现从在工序(A)-2中制备的重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)。可以使用物理方法、化学方法、其他任何方法来实现包含抗原蛋白质(x’)的流感病毒的失活，但优选通过利用与抗原蛋白质(x’)反应的抗体对在工序(A)-2中制备的重配流感病毒进行处理来实现。也可以利用抗体对上述得到的培养物本身进行处理。
供于本工序的培养物中的病毒量可以用病毒感染效价(TCID50/mL)与用量(mL)之积来表示。如果在培养物中含有目标重配流感病毒，则病毒量可以是任何值，优选为102TCID50以上，更优选为103TCID50以上，进一步优选为104TCID50以上。另外，病毒量可以通过利用公知的方法的稀释或浓缩来适当调整。
抗体只要是与抗原蛋白质(x’)反应的抗体即可，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。作为抗体，可以使用针对流感病毒(2)的抗血清。作为最终稀释倍率，优选以2～1000倍、更优选为4～10倍的浓度将抗血清添加在培养物中。如果在该浓度的范围内，则与流感病毒(2)的抗原蛋白质适宜地发生反应，能够使具有该抗原蛋白质的流感病毒有效地失活。
针对流感病毒(2)的抗血清可以通过公知的方法来制备，既可以是免疫血清，也可以是感染血清。优选选择感染血清。这些抗血清可以通过公知的方法来制备。可以通过在对哺乳动物给药流感病毒(2)或者使哺乳动物感染流感病毒(2)之后对该哺乳动物进行采血而得到抗血清。例如，对兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠等哺乳动物作为免疫原而给药流感病毒(2)使其免疫。作为给药手段，可采用腹腔内注射、静脉注射、皮下注射等，根据不同情况也可采用皮内注射。重复数次追加免疫，在最终免疫后的第3～10天对哺乳动物进行采血，从而能够得到免疫血清。另外，也可以使例如雪貂、小鼠等哺乳动物感染流感病毒(2)。作为感染方法，可采用喷雾接种、鼻腔接种等方法。在感染的第10～14天以后对哺乳动物进行采血，从而能够得到感染血清。
对于所得到的抗血清，优选通过例如受体破坏酶RDE(Receptor DestroyingEnzyme)处理、胰蛋白酶处理、高碘酸钾处理等公知的方法，预先使来源于流感病毒(2)的抗原的非特异性中和活性失活。
中和抗体的抗体效价优选事先测定。例如可以通过粒子凝集法(PA)、间接荧光抗体法(IFA)、免疫粘连红细胞凝集法(IAHA)、中和法(NT)、红细胞凝集抑制法(HI)、补体结合法(CF)、酶免疫法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、乳胶凝集比浊法(LA)等公知的方法来测定抗体效价。在培养物的病毒感染效价为107～108TCID50/100μL的实施方式中，可以使用通过HI法测定的抗体效价显示为10以上、优选为12.8以上、更优选为80以上、进一步优选为128以上的抗血清。如果在该范围内，则存在于培养物中的流感病毒(2)的抗原蛋白质与中和抗体适宜地结合，从而能够使具有该抗原蛋白质的流感病毒有效地失活。
利用与抗原蛋白质(x’)反应的抗体对包含在工序(A)-2中制备的重配流感病毒的培养物进行处理，并回收使包含抗原蛋白质(x’)的流感病毒失活的重配流感病毒，由此能够回收目标流感病毒(Y)。具体而言，使上述培养物与中和抗体的混合物与宿主接触，并在工序A)-2所示的适宜条件下对所感染的宿主进行培养，使目标的重配病毒选择性地增殖。在宿主为培养细胞的情况下，确认到起因于目标的重配病毒的CPE(cyto pathic effect)。可以通过对基因组片段进行分析而更准确地选择出流感病毒(Y)。基因组片段的分析方法可以使用公知的方法。
工序(B)：使宿主感染流感病毒(1)和在上述工序(A)中制备的流感病毒(Y)并进行共培养，制备重配流感病毒，并从该重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的工序。
工序(B)-1：流感病毒(1)的钝化工序
与工序(A)-1同样地，在制备重配流感病毒之前，对流感病毒(1)进行具有病毒初期感染能力、且使病毒增殖性丧失或降低的处理。照射紫外线，对流感病毒进行钝化。使病毒增殖性丧失或降低的处理条件可以参照工序(A)-1的条件。
工序(B)-2：重配流感病毒的制备工序
可以通过使宿主感染流感病毒(Y)和上述照射了紫外线的流感病毒(1)并进行共培养来制备流感病毒(1)和流感病毒(Y)的重配流感病毒。共培养条件可以参照工序(A)-2的条件。
通过使宿主与流感病毒接触来进行流感病毒对宿主的感染。优选以1×10-6～10moi使流感病毒(1)与宿主接触，更优选为0.001～1moi，进一步优选为0.1～1moi。优选以0.001～10moi使流感病毒(Y)与宿主接触，更优选为0.01～1moi，进一步优选为0.1～1moi。以往，为了使宿主共感染流感病毒，需要使高浓度的流感病毒与宿主接触而使其感染。但是，在本发明中，即使是低浓度的流感病毒，也能够共感染宿主，从而高效地制备基因重组体。
对感染了流感病毒(1)和流感病毒(Y)的宿主进行培养而得到培养物。培养条件可以参照工序(A)-2的条件。
工序(B)-3：流感病毒(X)的选择工序
通过从培养物中的重配流感病毒中使含有抗原蛋白质(y)的流感病毒失活来实现从在工序(B)-2中制备的重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)。具体而言，通过利用与抗原蛋白质(y)反应的抗体对在工序(B)-2中制备的重配流感病毒进行处理来实现包含抗原蛋白质(y)的流感病毒的失活。也可以利用抗体对上述得到的培养物本身进行处理。抗体只要是与抗原蛋白质(y)反应的抗体即可，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。作为抗体，可以使用针对流感病毒(Y)的抗血清。作为最终稀释倍率，优选以2～1000倍、更优选为4～10倍的浓度将抗血清添加在培养物中。如果在该浓度的范围内，则与流感病毒(Y)的抗原蛋白质适宜地发生反应，从而有效地使具有该抗原蛋白质的重配流感病毒失活。此外，可以通过与针对流感病毒(2)的抗血清同样的方法来制备并获得针对流感病毒(Y)的抗血清。
利用与抗原蛋白质(y)反应的抗体对包含在工序(B)-2中制备的重配流感病毒的培养物进行处理，并回收使包含抗原蛋白质(y)的流感病毒失活的重配流感病毒，由此能够回收目标流感病毒(X)。具体而言，使上述培养物与中和抗体的混合物与宿主接触，并在工序A)-2所示的适宜条件下对所感染的宿主进行培养，使目标的重配病毒选择性地增殖。在宿主为培养细胞的情况下，确认到起因于目标的重配病毒的CPE(cyto pathic effect)。可以通过对基因组片段进行分析而更准确地选择出流感病毒(X)。基因组片段的分析方法可以使用公知的方法。
在本发明的制备方法中，流感病毒的失活是指抑制了该流感病毒的增殖性的状态。增殖性的抑制是指，使通过以噬斑法、TCID50法为代表的、通常的感染效价测定法测定的病毒的感染效价降低至检测极限以下、且在以适当的基质对该病毒进行培养的情况下，在培养2～3天左右感染效价仍为检测极限以下的状态。作为抑制增殖性的手段，没有特别限定，可以通过利用与该病毒的反应的抗体进行处理来实现。
在本说明书中，以基因重组效率来表示流感病毒的基因重组体的制备容易度。基因重组效率表示作为流感病毒(X)的噬斑的克隆数相对于在重配病毒制备实验中对噬斑进行分离后的总克隆数的比例。重配病毒制备实验是指使宿主感染两种流感病毒来制备重配流感病毒的实验。根据本发明的制备方法，基因重组效率可以优选为60％以上，更优选为80％以上，进一步优选为95％以上，最优选为达到100％。
对本发明的流感病毒(1)、(2)或(3)没有特别限定，可以根据目标的重配流感病毒而适当地选择。例如，可以从当前已知的所有的亚型以及将来分离、鉴定的亚型中选择。在为甲型流感病毒的情况下，可以考虑包含各种HA亚型和NA亚型的组合的流感病毒。在为乙型流感病毒的情况下，可以考虑包含维多利亚系和山形系的组合的流感病毒。
甲型流感病毒的各亚型的RNA基因组的突变性较高，因此频繁地产生新的株。在2009年4月确认在墨西哥的流行之后，被认为在世界范围内已流行过的流感被称为新型流感、猪流感、大流行性甲型流感(H1N1)、swine flu、A/H1N1pdm等。在猪之间流行的病毒在农场等中从猪直接感染给人类、之后在人类之间传播的新型流感区别于以往存在的作为季节性的甲型苏联型流感的甲型流感病毒H1N1亚型(以下称为“H1N1亚型”)、作为甲型香港型流感的甲型流感病毒H3N2亚型(以下称为“H3N2亚型”)。另外，由于RNA基因组的突变性较高，因此即便在甲型流感病毒的相同亚型中，病毒也根据分离的时期、场所而有所区别。
关于乙型流感病毒，虽然持续不可逆的抗原突变，但是与甲型流感病毒中的突变相比较慢，流行周期为2年左右。乙型流感病毒在1940年纽约的流行中首次分离以来，时常反复流行，还记录到由其导致的死亡率的上升。已确认仅在人类之间感染，不存在亚型，仅存在山形系和维多利亚系这两个系。
在本说明书中，作为病毒(1)、(2)或(3)，可以是当前分离、鉴定的株，也可以是将来分离、鉴定的株，可以是甲型，也可以是乙型。例如，作为当前分离鉴定的株，甲型流感病毒根据其HA以及NA的抗原性而分类为16种HA(H1～H16)亚型以及9种NA(N1～N9)亚型。
作为流感病毒(1)，只要是包含所期望的抗原蛋白质(x)的株即可，没有特别限定。例如，可以使用作为疫苗株而选定的株。具体而言，例如可列举为作为平成27年度的株而选定的甲型株(A/加利福尼亚/7/2009(X-179A)(H1N1)pdm09、A/瑞士/9715293/2013(NIB-88)(H3N2))、乙型株(B/普吉岛/3073/2013(山形系)、B/德克萨斯/2/2013(维多利亚系)。另外，也可以使用今后选定的所有株。
对于流感病毒(2)以及(3)，优选为具有与各抗原性蛋白质(y)、(x’)的条件一致的抗原蛋白质的流感病毒、且具有与本发明的目的一致的主链蛋白质。尤其是，为了将通过本发明的方法制备的流感病毒(X)作为流感疫苗用的种子病毒来使用，期望流感病毒(X)在所期望的宿主中具有增殖性。尤其是对于流感病毒(2)，优选具有在所期望的宿主中增殖性优异的主链蛋白质。具体而言，在宿主为鸡胚的情况下，优选为H1N1亚型。作为H1N1亚型，可举例示出为A/波多黎各/8/34(H1N1)等。另一方面，在宿主为培养细胞的情况下，尤其是MDCK细胞的情况下，优选为H3N2亚型。作为H3N2亚型，可举例示出为A/茨城/N12232/2012(H3N2)、A/广岛/52/2005(H3N2)、A/巴拿马/2007/99(H3N2)等。
作为流感病毒(1)或(3)，使用具有目标抗原蛋白质的株即可，没有特别限定。可以是当前分离、鉴定的株，也可以是将来分离、鉴定的株，可以是甲型流感病毒，也可以是乙型流感病毒。作为流感病毒(1)、(2)或(3)的具体例，可举例示出为A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09、A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)pdm09、A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/巴拿马/2007/99(H3N2)、A/怀俄明/3/2003(H3N2)、A/纽约/55/2004(H3N2)、A/广岛/52/2005(H3N2)、A/乌拉圭/716/2007(H3N2)、A/维多利亚/210/2009(H3N2)、A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/德克萨斯/50/2012(H3N2)、A/纽约/39/2012(H3N2)、A/瑞士/9715293/2013(H3N2)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/上海/2/2013(H7N9)、A/安徽/1/2013(H7N9)、B/山东/7/97、B/上海/361/2002、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/2008、B/威斯康星/1/2010、B/马萨诸塞/2/2012、B/普吉岛/3073/2013、B/德克萨斯/2/2013等，但并不限定于此。
本发明所使用的流感病毒除了上述那样的从生物体分离的流感病毒之外，还可以是为了能够应用于流感疫苗而施加减毒化、鸡胚增殖适合化、细胞培养增殖适合化、温度敏感性显性化、粘膜给药适合化等的改变而制备的基因重组病毒。另外，作为用于施加改变的手段，可列举为在流感病毒的抗原部位、聚合酶部位等的八个RNA片段中导入突变的方法、通过低温传代来制备减毒病毒的方法、通过向病毒培养体系添加突变诱发剂来实现的方法等。
在本发明中，在两个流感病毒具有类似的抗原性的情况下，表述为具有类似的抗原性。“具有类似的抗原性”一般表示该病毒的抗原蛋白质彼此在遗传上的差异较小。抗原性的类似，一般可以通过基于HI试验或中和试验的抗原性分析来进行调查。具体而言，当从感染了第一病毒的动物或使用该病毒而获得了免疫的动物得到的抗血清的同质抗体效价与针对第二病毒的抗体效价为2倍差以内、且从感染了第二病毒的动物或使用该病毒而获得了免疫的动物得到的抗血清的同质抗体效价与针对第一病毒的抗体效价为2倍差以内时，判定为第一病毒和第二病毒具有类似的抗原性。在近年的H3N2亚型的病毒的抗原性分析中，对于通过该方法进行比较的抗体效价为4倍差以内的病毒彼此，有时也判定为具有类似的抗原性。
在本发明的制备方法中使用的宿主可以是发育鸡胚，也可以是培养细胞。在使用发育鸡胚作为宿主的情况下，可以使用无特定病原体(specific pathogen-free)(SPF)孵化鸡胚。
在本发明的制备方法中，在使用培养细胞作为宿主的情况下，培养细胞只要是能够感染流感病毒并进行复制的细胞，则可以是任何细胞。作为培养细胞，优选为哺乳动物细胞，可举例示出为仓鼠、牛、灵长类(包括人以及猴子)以及狗的细胞，但并不限定于此。更具体而言，可举例示出为来源于马丁达比狗肾脏的MDCK细胞、来源于非洲绿猴肾脏的Vero细胞等。更具体而言，本发明中的MDCK细胞是由国际保藏的保藏编号NITE BP-02014确定的MDCK细胞。该细胞在平成27年3月4日以保藏编号NITE P-02014国内保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术中心专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)之后，通过独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术中心专利微生物保藏中心基于布达佩斯条约的请求移交国际保藏。
本发明还涉及通过本发明的重配流感病毒的制备方法而制备的重配流感病毒。通过本发明的制备方法制备的重配流感病毒包含来源于抗原株流感病毒和供体株流感病毒的至少两种流感病毒的蛋白质。上述抗原株流感病毒和供体株流感病毒有时具有类似的抗原性。这样，尤其是在抗原株流感病毒和供体株流感病毒具有类似的抗原性的情况下，可以应用本发明的阶段性的重配病毒制备方法。
通过本发明的制备方法制备的重配流感病毒能够作为流感疫苗的种子病毒使用。对于提纯重配流感病毒的工序，可以使用公知的方法或今后开发的任意方法。
实施例
为了帮助理解本发明，以下示出实施例以及参考例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于本实施例以及参考例。
(实施例1)基于重配法的流感病毒(X)的制备
在本实施例中，对使用了流感病毒(1)～(3)的、基于两阶段重配法的流感病毒(X)的制备方法进行说明。首先，使用流感病毒(2)作为供体株并使用流感病毒(3)作为抗原株来制备重配流感病毒，并选择流感病毒(Y)作为重组供体株。接着，使用上述重组供体株并使用流感病毒(1)作为抗原株来制备流感病毒(X)。以下，对于各流感病毒，记载为株(1)、株(2)、株(3)、株(Y)以及株(X)。
1、用于制备株(X)的材料
a)使用病毒
将株(1)～(3)以及株(Y)的使用病毒示于表1。株(Y)是使用株(2)作为供体株并使用株(3)作为抗原株而制备重配流感病毒并选择出的株。
表1使用病毒株
Figure BDA0002388717450000151
b)病毒培养用培养基
使用含有碳酸氢钠(20mM)、0.1×TrypLE Select的Eagle’s MEM培养基。
作为宿主细胞，使用由国际保藏的保藏编号NITE BP-02014确定的MDCK细胞。在本实施例中，以下也简称为“MDCK细胞”。
将供体株或者具有与供体株类似的抗原性的流感病毒的培养液制备为107～108TCID50/mL左右的浓度，取其6mL通过喷雾器进行喷雾使雪貂感染。在感染后的第14天，进行麻醉下的心脏采血，将采集的血液在常温下静置1小时，在36℃下静置1小时，再在4℃下静置24小时。之后，以约700×g，在室温下进行10分钟的离心分离，回收上清液作为雪貂感染血清。将该雪貂感染血清与等量的RDE(II)“生研”(Denka生研)混合，最终稀释倍率为2倍，在37℃下静置18～20小时之后，在56℃下静置1小时对RDE进行钝化，将其用作抗供体株血清。
2、株(X)的制备
1)首先，通过制备株(X)之前的第一阶段的重配法来制备株(Y)。作为用于制备株(Y)的供体株而使用株(2)，作为抗原株使用株(3)。使用病毒培养用培养基，分别制备107TCID50/mL的供体株(2)溶液和107TCID50/mL的抗原株(3)溶液。按照参考文献1所公开的方法来确认流感病毒浓度(感染效价：TCID50/mL)。
2)在3.5cm的培养皿中分别分注2mL的抗原株(3)溶液。将1)的培养皿放入Spectrolinker XL-1000(Spectronics Corporation，UV管为254nm，8W×5根)中，取下培养皿的盖，进行500J/m2的UV照射。
3)在25cm2的烧瓶中，对MDCK细胞进行培养直至汇合(约5×106细胞/烧瓶)，去除培养基并接种200μL在2)中进行UV照射后的抗原株，在34℃、5％CO2下培养30分钟。之后，添加10mL的病毒培养用培养基，并接种200μL的供体株(2)溶液。
4)在34℃、5％CO2下培养2天。
5)将100μL的所得到的混合培养液和100μL的抗株(2)血清混合，在34℃下静置1小时。
6)在新的25cm2的烧瓶中对MDCK细胞进行培养，用10mL的病毒培养用培养基更换培养基，接种在上述5)中由抗株(2)血清处理过的培养液200μL总量。
7)在34℃、5％CO2下培养2天。
8)对所得到的培养液进行离心分离(约8000×g、5分钟)，并回收上清液。
9)将离心上清液用病毒培养用培养基稀释至103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，以100μL/孔接种至将MDCK细胞培养至汇合的6孔板上。针对两个板进行接种。
10)在34℃、5％CO2下培养30分钟。
11)层叠3mL/孔的含有0.8％琼脂糖的MEM培养基(含有谷氨酰胺(4mM)、0.1×TrypLE Select)。在安全柜内进行干燥后，开始温育器内的培养。
12)在34℃、5％CO2下培养3天。
13)层叠2mL/孔的含有1.0％琼脂糖的MEM培养基(含有中性红)，在安全柜内进行干燥。
14)在新的6孔板上对MDCK细胞进行培养，用2mL/孔的病毒培养用培养基更换培养基，将噬斑分离在各孔中，作为株(Y)。
15)在34℃、5％CO2下培养3天。
16)对分离出的噬斑的培养液进行离心分离(约8000×g、5分钟)，以-80℃对上清液进行保存。将所得到的噬斑的培养上清液作为株(Y)培养液，提取出病毒RNA并进行基因分析。
17)接着，通过第二阶段的重配法来制备作为本发明的目标产物的株(X)。作为供体株使用株(Y)，作为抗原株使用株(1)，抗供体株血清为抗株(3)血清，除此以外，通过与上述所示的制备株(Y)的情况下相同的方法得到噬斑，制备噬斑的培养上清液作为株(X)。
(试验例1)基因分析结果
针对在实施例1中制备的基于两阶段重配法的流感病毒(X)分别进行基因分析。对于以表1的A～D的四种组合制备的流感病毒(X)，分别将三个克隆作为基因分析对象。在基因分析中，从分离的各噬斑的培养上清液中提取出RNA，并进行逆转录而合成cDNA，按照常规方法通过PCR扩增病毒的全基因组片段，进行简易提纯。将其作为检体进行基因序列分析，判定各基因组片段来源于供体株和抗原株中的哪一个。
将噬斑的基因分析结果示于以下的表2。下述的结果是，已确认全部的形成噬斑的流感病毒(X)为重配流感病毒。已确认，对HA以及多数的NA进行编码的基因组片段来源于株(1)，除此以外的基因组片段中的至少一个来源于株(Y)。
表2株(X)的基因分析结果
Figure BDA0002388717450000181
A:抗原，B：主链
(试验例2)感染效价测定
将所得到的重配流感病毒(X)中的几个和用作母株的流感病毒(1)接种到在75cm2的烧瓶中培养至汇合的MDCK细胞中。以moi＝0.001左右进行病毒接种，在34℃、5％CO2下培养3天之后，采集培养上清液来进行感染效价的测定。
将感染效价的测定结果示于以下的表3。WT表示野生型(Wild Type)。在所制备的重配流感病毒(X)中，存在显示出比母株病毒(表中的Backbone为WT的病毒)高的感染效价的病毒。
表3感染效价测定结果
Figure BDA0002388717450000182
产业上的可利用性
如以上详述的那样，根据本发明的重配流感病毒的制备方法，能够高效地制备作为配置有所期望的基因组片段的基因重组体的重配流感病毒。根据本发明的方法，由于能够短时间且高效地制备显示出高增殖性的流感病毒，因此能够迅速地制备流感疫苗用的种子病毒。

Claims (9)

1.一种包含抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的制备方法，是重配流感病毒的制备方法，其特征在于，使用以下所示的(1)～(3)的至少三种流感病毒、且包含以下的工序(A)和工序(B)的至少两个阶段的重配工序：
(1)包含抗原蛋白质(x)的第一流感病毒；
(2)具有与(1)的流感病毒类似的抗原性的抗原蛋白质(x’)的第二流感病毒；
(3)具有与(1)的流感病毒不同的抗原性的抗原蛋白质(y)的第三流感病毒：
工序(A)是使宿主感染流感病毒(2)和流感病毒(3)并进行共培养来制备重配流感病毒并从该重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)的工序；
工序(B)是使宿主感染流感病毒(1)和在所述工序(A)中制备的流感病毒(Y)并进行共培养来制备重配流感病毒并从该重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的工序。
2.根据权利要求1所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述制备方法包含在所述工序(A)中的对流感病毒(2)和流感病毒(3)进行共培养之前，对流感病毒(3)进行使其具有初期感染能力、且使病毒增殖性丧失或降低的处理的工序。
3.根据权利要求1或2所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述制备方法包含在所述工序(B)中的对流感病毒(1)和流感病毒(Y)进行共培养之前，对流感病毒(1)进行使其具有初期感染能力、且使病毒增殖性丧失或降低的处理的工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述工序(A)中的选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)的工序包含使与抗原蛋白(x’)反应的抗体接触的工序。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，所述工序(B)中的选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)的工序包含使与抗原蛋白(y)反应的抗体接触的工序。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，在所述工序(A)中，包含从重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(y)的流感病毒(Y)。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的流感病毒(X)的制备方法，其中，在所述工序(B)中，包含从重配流感病毒中选择具有抗原蛋白质(x)的流感病毒(X)。
8.一种流感病毒(X)，其通过权利要求1～7中任一项所述的制备方法来制备。
9.一种重配流感病毒，其特征在于，包含来源于抗原株流感病毒和供体株流感病毒的至少两种流感病毒的蛋白质、且所述抗原株流感病毒和供体株流感病毒具有类似的抗原性。
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