CN109312310B - 重配流感病毒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有两种以上流感病毒毒株的基因组节段的重配流感病毒的制备方法;具体而言,本发明提供一种重配流感病毒的制备方法,该重配流感病毒含有第一流感病毒毒株的抗原蛋白,该方法包括以下工序:1)对第一流感病毒毒株以使其具有初期感染能力且病毒增殖性丧失或降低的照射量照射紫外线的工序,2)使宿主感染第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的工序,3)对感染了第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的宿主进行培养并获得培养物的工序,4)在工序3)中获得的培养物中使具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒失活的工序,5)在工序4)之后回收重配流感病毒的工序。
Description
技术领域
本发明涉及一种重配流感病毒(reassortant influenza virus)的制备方法。
本申请要求日本申请号为特愿2016-140366的优先权,并引用于此作为参考。
背景技术
流感是每年于全世界流行的传染病,由流感病毒引起。流感病毒属于正粘病毒科,具有含脂质双层膜结构的包膜。流感病毒分为A型、B型以及C型三种,分别称为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒。一般流感病毒尤其多指A型或B型。A型、B型及C型的不同是基于构成病毒粒子的蛋白质中的、M1蛋白(基质蛋白)和NP蛋白(核蛋白)的抗原性不同。另外,即使同为A型或B型,由于包膜表面上的分子、即血球凝集素(血凝素,以下称为“HA”)和神经氨酸酶(以下称为“NA”)的抗原性不同,因此也被分为多个亚型和毒株。
流感病毒具有很高的抗原变异概率,产生新型流感病毒毒株。A型流感病毒根据其HA和NA的抗原性,分为十六种HA(H1~H16)亚型和九种NA(N1~N9)亚型。A型流感病毒的三种HA(H1、H2及H3)亚型是特别重要的病原体。A型流感病毒的H1N1亚型和H3N2亚型呈季节性传播,并引起人类感染。2003年,高致死性的禽流感病毒H5亚型作为人类病原体产生。2009年4月,H1N1亚型病毒作为新型流感病毒产生,并在人类社会中迅速蔓延开来。由于流感也可能引起大流行,因此对于流感疫苗需要在数量上得到确保。
在流感疫苗的制造中,使用利用鸡胚使流感病毒增殖的方法。另外,在培养细胞中使流感病毒增殖而进行制造的方法也正投入实际应用中。在流感病毒的增殖中利用鸡胚或培养细胞时,因流感病毒的亚型和毒株而导致病毒在宿主体内的增殖性降低这一情况成为问题。因此,尝试利用基因重组技术制备宿主体内的增殖性得到了提升的流感病毒的基因重组体。作为基因重组技术,可例举重配法和反向遗传学方法(以下称为“RG法”)。作为RG法的一种,可以举出下述方法:即,将用于提供病毒RNA(vRNA)的八种质粒(PolI质粒)和编码形成病毒粒子所必须的结构蛋白质的四种表达质粒(PolII质粒)合计十二种质粒同时导入细胞,从而制备流感病毒的基因重组体这一方法(非专利文献1)。但是,由于RG法是将多个质粒同时导入细胞,因此对于宿主细胞而言负担大。另外,由于制作各种质粒需要时间,因此存在难以迅速地进行基因重组体的制备这一问题。
在重配法的情况下,是对宿主共感染两种以上的流感病毒毒株,在增殖的过程中交换基因组节段,并进行重聚合,由此制备基因重组体(非专利文献2~4)。利用重配法的流感病毒基因重组体的制备,是将鸡蛋作为宿主而实施的。具体而言,通过使鸡胚混合感染PR8毒株等骨架病毒(backbone virus)毒株和流行毒株,而制备兼具高增殖性的骨架基因和流行毒株的抗原基因的基因重组体。但是,在利用鸡胚作为宿主的重配法中,存在并不一定能够制备出目标基因重组体这一问题。
在细胞培养流感疫苗的情况下,理想的是使用培养细胞中显现高增殖性的病毒种株(seed virus),并且要求有效地制备该病毒种株,以便疫苗的稳定供给。出于获得流感病毒的基因重组体的目的,正在研究使用培养细胞实施重配法。即使在使用了培养细胞的重配法中,也有可能不一定能制备出目标基因重组体。专利文献1中公开了下述情况:即,作为使用了培养细胞的重配法,使感染了两种流感病毒毒株的宿主接触可阻碍骨架毒株的HA和/或NA的转录和翻译的抑制因子,从而制备重配流感病毒。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:国际公开公报WO2011/145081号
【非专利文献】
非专利文献1:Neumann et al.,PNAS Vol.102,p.16825-16829(1999)
非专利文献2:PLoS Pathog.2015Oct;11(10):e1005204.
非专利文献3:J Virol.1976Oct;20(1):248-54.
非专利文献4:《病毒实验学分论》第二版1982年2月28日发行,出版商丸善株式会社p.321-325
发明内容
本发明的课题在于提供一种重配流感病毒的制备方法,其中,该重配流感病毒具有两种以上流感病毒毒株的基因组节段。另外,本发明的课题还在于使用该方法提供高增殖性的流感病毒。
本发明者们为了解决上述课题经过反复专心研究后发现:通过对第一流感病毒毒株照射紫外线使其丧失病毒复制能力、以及使用使具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒选择性失活的抗体,能够在早期有效地制备出目标重配流感病毒,从而完成了本发明。
本发明由以下方案构成。
1.一种重配流感病毒的制备方法,该重配流感病毒含有第一流感病毒毒株的抗原蛋白,该重配流感病毒的制备方法包括以下工序:
1)对第一流感病毒毒株以使其具有初期感染能力且病毒增殖性丧失或降低的照射量照射紫外线的工序;
2)使宿主感染第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的工序;
3)对感染了第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的宿主进行培养并获得培养物的工序;
4)在工序3)中获得的培养物中使具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒失活的工序;
5)在工序4)之后回收重配流感病毒的工序。
2.如前项1所述的重配流感病毒的制备方法,其中,工序4)包括使工序3)中获得的培养物接触针对第二流感病毒毒株的抗原蛋白的抗体。
3.如前项1所述的重配流感病毒的制备方法,其中,工序4)包括对工序3)中获得的培养物添加针对第二流感病毒毒株的抗血清并进行孵育。
4.如前项3所述的重配流感病毒的制备方法,其中,抗血清的最终稀释倍数为2倍~1000倍。
5.如前项3所述的重配流感病毒的制备方法,其中,抗血清为感染血清。
6.如前项1~5中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,在工序2)中,以moi为1×10-6~10使宿主接触第一流感病毒毒株并感染。
7.如前项1~6中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,在工序2)中,使宿主感染第一流感病毒毒株之后,再使宿主感染第二流感病毒毒株。
8.如前项1~7中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,在工序5)中包括从重配流感病毒中选择目标重配流感病毒。
9.如前项1~8中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,第二流感病毒毒株为A型流感病毒H1N1亚型或H3N2亚型。
10.一种重配流感病毒,是利用前项1~9中任一项所述的重配流感病毒的制备方法而制备的。
11.如前项10所述的重配流感病毒,其中,所述重配流感病毒含有源自第一流感病毒毒株的抗原蛋白,并含有第二流感病毒毒株的骨架蛋白。
12.如前项1~9中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,宿主为培养细胞。
13.如前项1~9中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,宿主为鸡胚。
(发明效果)
根据本发明的重配流感病毒的制备方法,能够在早期有效地制备出作为基因重组体的重配流感病毒。根据本发明的方法,能够在早期有效地制备出显现高增殖性的流感病毒。
附图说明
图1是表示对抗原毒株和目标重配流感病毒在培养细胞中的增殖性进行了确认后的结果的图(实施例3)。
具体实施方式
本发明为制备具有两种以上流感病毒毒株的基因组节段的重配流感病毒的方法。
流感病毒具有脂质双层膜结构的包膜。包膜的内层主要由基质蛋白和作为RNA与蛋白质的复合体的RNP(核糖核蛋白)组成。在外层上,所谓的表面蛋白、即流感NA蛋白和流感HA蛋白作为突起物而存在。流感病毒由PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及NS节段这8个基因组节段组成。HA和NA的基因组节段分别编码HA和NA的抗原蛋白,除此之外的PB2、PB1、PA、NP、M及NS节段这6个基因组节段编码骨架蛋白。
作为流感病毒的基因重组技术,可以列举出RG法和重配法。在RG法中,由于将多个质粒同时导入细胞,因此存在很多为了有效制备目标基因重组病毒的课题,如能够承受导入的细胞的选择或质粒制作、质粒与细胞的相容性等。另一方面,在重配法中,由于对宿主共感染流感病毒毒株,在增殖的过程中交换基因组节段,并进行重聚合,由此制备基因重组体,因此不利用质粒。因此,较之RG法,能够大幅削减制备基因重组病毒所需的成本和时间。
但是,现有的重配法中存在基因重组效率低这一重大课题。因此,未必就能够获得目标重配流感病毒。另一方面,专利文献1中记载了为了获得高增殖性的重配流感病毒而需要大约35天。即,与需要制作多个质粒的RG法相比,重配法虽然能够削减制备病毒所需的时间和成本,但是由于基因重组效率低,而导致可能会为了获得目标重配流感病毒而需要很长时间。
本发明者们考虑到:在现有的重配法中,在共感染细胞中增殖的流感病毒的基因组节段交换的控制不充分和/或目标流感病毒以外的不必要的病毒未被充分失活,是无法达到合适的基因重组效率的原因。经过专心研究后发现:通过对第一流感病毒毒株照射紫外线使其丧失病毒复制能力、以及使用针对第二流感病毒毒株的抗原蛋白的中和抗体,能够在早期有效地制备出重配流感病毒。进而发现:通过对第一流感病毒毒株以使其具有初期感染能力且病毒增殖性丧失或降低的照射量照射紫外线,能够控制病毒共感染时的宿主体内发生的基因组节段交换。更令人惊讶的是发现:通过使用感染血清而非重配法中通常所使用的免疫血清,能够使培养物中的具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒完全失活。另外发现:根据本发明的制备方法,基因重组效率得到提高,能够在早期制备出高增殖性的重配流感病毒。
在本发明获得的目标重配流感病毒中,编码HA和NA的基因组节段中的至少一个(优选至少编码HA的基因组节段)源自第一流感病毒毒株,除此之外的基因组节段中的至少一个(优选至少编码PB 1的基因组节段)源自第二流感病毒毒株。本发明的第一流感病毒毒株也称为抗原毒株,第二流感病毒毒株也称为供体毒株或者骨架毒株。以下,对本发明的制备方法中所包含的各工序进行说明。
工序1):对第一流感病毒毒株以使其具有初期感染能力且病毒增殖性丧失或降低的照射量照射紫外线的工序。
在本工序中,对第一流感病毒毒株照射紫外线并进行灭活。紫外线的照射量优选为下述程度:即,紫外线照射后的第一流感病毒毒株具有对宿主的初期感染能力,但感染后的病毒增殖性丧失或降低。感染后的病毒增殖性的丧失或降低是指:在已使宿主单独感染第一流感病毒时,未确认到宿主体内的病毒的增殖性、或者与未进行紫外线照射的第一流感病毒毒株相比病毒增殖性降低。病毒增殖性可使用病毒感染性滴度、PFU(PlaqueForming Unit:噬菌斑形成单位)等公知的指标进行评价。另外,在实施了紫外线照射后使宿主感染第一流感病毒毒株的情况下,必须具有对宿主的感染能力、即初期感染能力。所谓的具有初期感染能力的状态是指:在宿主为培养细胞的情况下,观察到由照射了紫外线后的病毒引起的CPE(cytopathic effect:致细胞病变效应)。在本工序中优选为:对第一流感病毒毒株照射与在Spectrolinker XL-1000(Spectronics Corporation)的Time Mode(时间模式)下实施了1秒~60秒紫外线照射时同等的紫外线照射量,优选与实施了5秒~50秒紫外线照射时同等的紫外线照射量,更优选与实施了10秒~40秒紫外线照射时同等的紫外线照射量,进一步优选与实施了10秒~30秒紫外线照射时同等的紫外线照射量。用于上述紫外线照射的装置(紫外线强度、与光源的距离等记载于以下实施例中)以及照射时间等照射条件为一例,只要为与该照射条件同等程度的紫外线照射量,则这些条件可进行适当调整或变更。因为若是上述条件的紫外线照射量,便能够有效地获得具有对宿主的初期感染能力但病毒增殖性丧失或降低的流感病毒,所以是理想的。在本发明中,通过在保持有对宿主的初期感染能力的状态下使第一流感病毒毒株的病毒增殖性丧失或降低,从而能够提高宿主体内的基因重组效率。
工序2):使宿主感染第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的工序。
第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株对宿主的感染既可以同时也可以不同时。优选使宿主感染第一流感病毒毒株之后,再使其感染第二流感病毒毒株。对宿主感染流感病毒毒株是通过使宿主和流感病毒毒株接触而进行。第一流感病毒毒株优选以moi(感染复数)为1×10-6~10、更优选以moi为0.001~1、进一步优选以moi为0.1~1的方式接触宿主。第二流感病毒毒株优选以moi为0.001~10、更优选以moi为0.01~1、进一步优选以moi为0.1~1的方式接触宿主。现有技术中,为了使宿主共感染流感病毒,必须在高浓度下使宿主接触病毒并感染。然而,在本发明中,即使在低浓度下,流感病毒也能够共感染宿主,并能够有效地制备出基因重组体。另外,第一流感病毒毒株的moi为照射紫外线之前的值。流感病毒的感染性滴度(TCID50/mL)可根据日本国立感染病研究所著《流感诊断指南(第3版、2014年9月)》的“Part IV”(以下称为“参考文献1”)中公开的方法进行确认,moi可通过以细胞数除感染性滴度而算出。
工序3):对感染了第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的宿主进行培养并获得培养物的工序。
通过本工序的培养,在宿主体内流感病毒被重配。例如培养温度等宿主的培养条件,只要是在宿主体内流感病毒能够增殖的条件,则任意条件均可。在宿主为培养细胞的情况下,培养所用的培养基优选为液体培养基。液体培养基中经常会添加动物血清,但由于无法否定动物血清中可能含有阻碍目标流感病毒增殖的因子,因此更为优选的是使用不含该因子的无血清培养基。作为无血清培养基,可例举出Eagle MEM培养基(日水制药株式会社)、Opti PRO SFM(Thermo Fisher Scientific)、VP-SFM(Thermo Fisher Scientific)、EX-CELL MDCK(SAFC Biosciences)、UltraMDCK(Lonza)、ProVero 1(Lonza)、BalanCD MDCK(Irvine Scientific)等。培养时间优选为1天~5天左右,更优选为2天~3天左右。本工序中,在培养后能够获得培养物。该培养物中包含在宿主体内被重配的重配流感病毒和具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒。在宿主为鸡胚的情况下,上述病毒主要包含在尿囊液中,在宿主为培养细胞的情况下,上述病毒主要包含在培养上清液中。
工序4):使上述工序3)中获得的培养物中的具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒选择性失活的工序。
该病毒的失活可以采用物理方法、化学方法以及其他任意的方法实现,但优选通过使培养物中的具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒接触与该抗原蛋白结合的中和抗体并进行处理而实现。
本工序中提供的培养物中的病毒量,能够以病毒感染性滴度(TCID50/mL)与用量(mL)之积进行表示。只要培养物中包含有目标重配流感病毒,则病毒量可以为任意值,但优选为102TCID50以上,更优选为103TCID50以上,进一步优选为104TCID50以上。只要在上述范围内,便能够在工序5)中分离目标重配病毒。另外,病毒量可利用公知的方法通过稀释或者浓缩进行适当调整。
中和抗体只要是与第二流感病毒毒株的抗原蛋白结合且不与第一流感病毒毒株的抗原蛋白结合的抗体即可,既可以是多克隆抗体,也可以是单克隆抗体。优选为与第二流感病毒毒株的抗原蛋白呈特异性结合的中和抗体。在某一实施方式中,能够使用含有与第二流感病毒毒株的抗原蛋白呈特异性结合的中和抗体的抗血清。通过在工序3)获得的培养物中添加该抗血清,能够使具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒和与该抗原蛋白呈特异性结合的中和抗体接触。
针对第二流感病毒毒株的抗血清既可以是免疫血清也可以是感染血清,优选的是选择感染血清。这些抗血清可利用公知的方法进行制备。免疫血清能够从自给药了源自第二流感病毒毒株的抗原的哺乳动物回收的血液中获得。抗血清例如是通过将源自第二流感病毒毒株的抗原作为免疫原给药予兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠等哺乳动物并进行免疫,由此而制备。作为给药方法,采用腹腔内注射、静脉注射、皮下注射等,根据情况不同也采用皮内注射。可重复数次加强免疫,并在最终免疫后第3天~第10天从自哺乳动物回收的血液中获得免疫血清。另外,感染血清能够从自感染了第二流感病毒毒株的哺乳动物回收的血液中获得。例如,使雪貂或小鼠等流感病毒感受性哺乳动物感染第二流感病毒。作为感染方法,采用喷雾接种或经鼻接种等方法。可在感染第10天~第14天以后进行哺乳动物的采血,获得感染血清。
对于获得的抗血清,优选通过例如RDE(Receptor Destroying Enzyme:受体破坏酶)处理、胰蛋白酶处理、高碘酸钾处理等公知的方法,使与源自第二流感病毒毒株的抗原呈非特异性的中和活性失活。抗血清优选以最终稀释倍数为2倍~1000倍、更优选以最终稀释倍数为4倍~10倍的浓度添加于培养物中。
优选事先测定中和抗体的抗体滴度。抗体滴度可通过例如颗粒凝集法(PA)、间接免疫荧光法(IFA)、免疫粘附血凝法(IAHA)、中和法(NT)、红细胞凝集抑制法(HI)、补体结合法(CF)、酶联免疫法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、乳胶凝集比浊法(LA)等公知的方法进行测定。在培养物的病毒感染性滴度为107TCID50/100μL~108TCID50/100μL的实施方式中,可使用以HI法测定的抗体滴度显示为10以上、优选为12.8以上、更优选为80以上、进一步优选为128以上的抗血清。只要在这个范围内,则存在于培养物中的第二流感病毒毒株的抗原蛋白与中和抗体便能够恰当地结合,从而能够有效地使具有该抗原蛋白的流感病毒失活。
接着,使宿主接触上述培养物和中和抗体的混合物,以工序3)所示的合适条件培养发生了感染的宿主,并使目标重配病毒选择性地增殖。在宿主为培养细胞的情况下,确认到由目标重配病毒引起的CPE(cytopathic effect:致细胞病变效应)。
工序5):回收目标重配流感病毒的工序。
在本工序中回收上述工序4)中制备出的重配流感病毒。在本工序中,也可以从已回收的重配流感病毒中进一步选择目标重配流感病毒。目标重配流感病毒可利用噬菌斑法分离并分析基因组节段,由此进行选择。噬菌斑法和基因组节段的分析方法可采用公知的方法。
根据本发明的制备方法,能够在现有技术一半以下的期间内获得目标重配流感病毒。在能够使用已有的中和抗体或抗血清的情况下,优选可在17天以内、更优选为15天以内、进一步优选为13天以内、最优选为10天以内获得目标重配流感病毒。在需要制备新的抗血清的情况下,优选可在24天以内、更优选为20天以内、进一步优选为16天以内、最优选为12天以内获得目标重配流感病毒。在流感大流行时等需要在早期取得疫苗的情况下,本发明的方法非常有用。
在本说明书中,利用基因重组效率表示流感病毒的基因重组体的制备容易度。基因重组效率表示:作为目标重配流感病毒的噬菌斑的克隆数相对于在重配制备实验中将噬菌斑分离后的全部克隆数的比例。重配制备实验是指:使宿主感染第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株并制备重配流感病毒的实验。根据本发明的制备方法,可使基因重组效率优选达到60%以上,更优选达到80%以上,进一步优选达到95%以上,最优选达到100%。
本发明的第一流感病毒毒株或第二流感病毒毒株并未特别限定,可根据目标重配流感病毒进行适当选择。例如,也可以从目前已知的所有亚型、以及将来分离、鉴定的亚型中进行选择。在A型流感病毒的情况下,可考虑包含各种HA亚型和NA亚型的组合的流感病毒。在B型流感病毒的情况下,可考虑包含维多利亚系和山形系的组合的流感病毒。
A型流感病毒的各亚型由于RNA基因组的变异性高,因此频繁产生新毒株。2009年4月流行于墨西哥而被认知后又在全世界流行的流感被称为新型流感、猪流感、大流行A型流感(H1N1)、swine flu、A/H1N1 pdm等。猪之间流行的病毒在农场等由猪直接传染给人后又在人类之间广泛传播的新型流感,与以前就存在的季节性苏联型A型流感、即流感A型病毒H1N1亚型(以下称为“H1N1亚型”)和香港型A型流感、即流感A型病毒H3N2亚型(以下称为“H3N2亚型”)被区别开来。另外,由于RNA基因组的变异性高,因此,即使在流感A型病毒的同一亚型中,根据分离的时期和地点,病毒毒株也存在区别。
本发明中所使用的流感病毒毒株,除了如上所述的从生物体分离出的流感病毒之外,也可以是为了能够适用于流感疫苗而实施了减毒化、鸡蛋增殖适应化、细胞培养增殖适应化、温度敏感性表型转化、粘膜给药适应化等改变而制备出的重组病毒。另外,作为用于实施改变的方法,可列举出对流感病毒的抗原部位或聚合酶部位等八条RNA节段导入变异的方法、通过低温传代制备弱毒病毒的方法、对病毒培养系统添加诱变剂的方法等。
本发明中的第二流感病毒毒株优选选择在所期望的宿主中增殖性出色的毒株。在宿主为鸡蛋的情况下,优选为H1N1亚型。作为H1N1亚型,可例举出A/PR/8/34(HIN1)等。另一方面,在宿主为培养细胞的情况下、尤其为MDCK细胞的情况下,优选为H3N2亚型。作为H3N2亚型,可例举出A/茨城/N12232/2012(H3N2)、A/广岛/52/2005(H3N2)、A/巴拿马/2007/99(H3N2)等。作为第一流感病毒毒株,只要使用具有目标抗原蛋白的毒株即可,并无特别限定。既可以是目前已分离、鉴定的毒株,也可以是将来被分离、鉴定的毒株,既可以是A型流感病毒,也可以是B型流感病毒。作为第一流感病毒毒株的具体例,可例举出A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09、A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)pdm09、A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/巴拿马/2007/99(H3N2)、A/怀俄明/3/2003(H3N2)、A/纽约/55/2004(H3N2)、A/广岛/52/2005(H3N2)、A/乌拉圭/716/2007(H3N2)、A/维多利亚/210/2009(H3N2)、A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/德克萨斯/50/2012(H3N2)、A/纽约/39/2012(H3N2)、A/瑞士/9715293/2013(H3N2)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/上海/2/2013(H7N9)、A/安徽/1/2013(H7N9)、B/山东/7/97、B/上海/361/2002、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/2008、B/威斯康星/1/2010、B/马萨诸塞/2/2012、B/普吉岛/3073/2013、B/德克萨斯/2/2013等,但并不限定于这些。
另外,根据本发明制备出的目标重配流感病毒可作为制造流感疫苗的病毒种株而使用。关于纯化目标重配流感病毒的工序,可使用公知的方法或今后开发的任意方法。
本发明的制备方法中所使用的宿主既可以是鸡胚,也可以是培养细胞。在使用鸡胚作为宿主的情况下,可使用无特定病原体(specific pathogen-free)(SPF)的鸡胚。
在本发明的制备方法中,在使用培养细胞作为宿主的情况下,培养细胞只要是流感病毒能够感染并复制的细胞,便可以为任意细胞。作为培养细胞,优选为哺乳动物细胞,可列举仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴子)以及狗的细胞,但并不限定于这些。更为具体而言,可列举出源自马丁达比(Madin-Darby)狗肾脏的MDCK细胞、源自非洲绿猴肾脏的Vero细胞等。本发明中的MDCK细胞,进一步具体而言为国际保藏的保藏编号为NITE BP-02014所确定的MDCK细胞。该细胞是2015年3月4日以保藏编号NITE P-02014提出国内委托保藏于日本独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程中心专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)后,由日本独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程中心专利微生物保藏中心基于布达佩斯条约提出移交为国际保藏。
(实施例)
为了帮助理解本发明,以下示出实施例和参照例对本发明具体地进行说明,但是本发明并不限定于本实施例和参照例。
(参照例1)使用了活病毒制备重配流感病毒
对抗原毒株不进行紫外线照射(以下称为“UV照射”),而使用活病毒进行了重配流感病毒的制备。
1.使用的病毒毒株、使用的抗血清
第一流感病毒毒株(抗原毒株):A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09(以下称为“CA/7”)
第二流感病毒毒株(供体毒株):A/茨城/N12232/2012(H3N2)(以下称为“IB/232”)
抗供体毒株血清:对供体毒株的雪貂感染血清(HI抗体滴度:1280)进行RDE处理,使最终稀释倍数为2倍。
2.制备重配流感病毒
1)使用含有谷氨酰胺(4mM)、葡萄糖(4.6g/L)、碳酸氢钠(20mM)、0.1×TrypLESelect的Eagle MEM培养基(以下称为“病毒培养用培养基”),调制了供体毒株和抗原毒株的各流感病毒溶液。以下,将供体毒株的流感病毒溶液称为“供体毒株溶液”,将抗原毒株的各流感病毒溶液称为“抗原毒株溶液”。使用上述病毒培养用培养基分别调制了105TCID50/mL的供体毒株溶液、以及104TCID50/mL、103TCID50/mL、102TCID50/mL、101TCID50/mL的抗原毒株溶液。另外,流感病毒感染性滴度(TCID50/mL)按照参考文献1中公开的方法进行了确认。
2)在25cm2的烧瓶中,将MDCK细胞(国际保藏的保藏编号为NITE BP-02014所确定的MDCK细胞)培养至汇合(约5×106细胞/烧瓶)。然后,将培养基更换为10mL的病毒培养用培养基,并分别同时接种了供体毒株溶液100μL和各浓度的抗原毒株溶液100μL。
3)在34℃、5%CO2下培养了两天。
4)将获得的培养物100μL和抗供体毒株血清100μL混合,并在34℃下静置了1小时。
5)在新的25cm2的烧瓶中培养MDCK细胞,并以10mL的病毒培养用培养基更换培养基,接种了上述4)中以抗供体毒株血清进行了处理后的全部培养液200μL。
6)在34℃、5%CO2下培养了两天。
7)对获得的培养物100μL再次重复上述4)~6)的操作。
8)将获得的培养物进行离心分离(9000rpm、5分钟),并回收了上清液。
9)将离心上清液以病毒培养用培养基稀释至103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍,并对将MDCK细胞培养至汇合的6孔板以100μL/孔进行了接种。对两块板进行了接种。
10)在34℃、5%CO2下培养了30分钟。
11)利用与噬菌斑测定(plaque assay)相同的方法将含有0.8%琼脂糖的MEM培养基(含有谷氨酰胺(4mM)、0.1×TrypLE Select)以3mL/孔叠层(overlay)。使其在生物安全柜内干燥之后,开始在培养箱内培养。
12)在34℃、5%CO2下培养了三天。
13)将含有1.0%琼脂糖的MEM培养基(含有中性红)以2mL/孔叠层,并在生物安全柜内进行了干燥。
14)利用新的6孔板培养MDCK细胞,并以2mL/孔的病毒培养用培养基更换培养基,对各孔分离了噬菌斑。使用带过滤器的尖端去除的Tip(枪头)进行了抽提。
15)在34℃、5%CO2下培养了三天。
16)将分离的噬菌斑的培养液进行离心分离(9000rpm、5分钟),并将上清液以-80℃进行保存。
3.基因分析
从上述2.中分离的噬菌斑的培养上清液中提取RNA,进行逆转录合成cDNA,并按照常规方法通过PCR(聚合酶链式反应)扩增病毒的全部基因组节段而进行了简易纯化。将这个作为检体进行基因序列分析,对各基因组节段源自供体毒株和抗原毒株的哪一者进行了判断。
将在感染102TCID50/mL或104TCID50mL的抗原毒株的条件下获得的噬菌斑的基因分析结果表示于以下的表1中。另外,在感染101TCID50/mL的抗原毒株的条件下,由于在上述2.6)之后细胞中未观察到CPE,因此不进行之后的操作。
[表1]
表中“I”是指源自IB/232(供体毒株),“C”是指源自CA/7(抗原毒株)。
在进行了分析的大部分噬菌斑中,基因组节段全部源自CA/7。感染102TCID50/mL的抗原毒株的条件下的NO.7噬菌斑、以及感染104TCID50/mL的抗原毒株的条件下的No.12噬菌斑,是仅PB1节段源自IB/232的重配流感病毒。在这两条件下,基因重组效率不足10%。另外,通过上述2.的方法获得分离的噬菌斑为止的期间约为12天。由这些结果可认为:在供体毒株和抗原毒株对宿主细胞的混合感染中,病毒量是重要的。另外,在感染101TCID50/mL的抗原毒株的宿主细胞中,即使在上述2.6)中培养至第5天也未观察到CPE,未发生病毒增殖。因此,可认为通过利用抗血清进行一次中和而充分抑制了供体毒株。
(参照例2)确认抗原毒株的病毒量对制备重配流感病毒的影响
在本参照例中研究了抗原毒株的病毒量对基因重组效率的影响。另外,使用的病毒和使用的抗血清与参照例1相同。
1.制备重配流感病毒
1)使用病毒培养用培养基调制107TCID50/mL的供体毒株溶液,同时,分别调制了102TCID50/mL、107TCID50/mL的抗原毒株溶液。
2)在25cm2的烧瓶中将MDCK细胞(国际保藏的保藏编号为NITE BP-02014所确定的MDCK细胞)培养至汇合(约5×106细胞/烧瓶),然后去除培养基,接种抗原毒株溶液200μL,在34℃、5%CO2下培养了1小时。然后,接种供体毒株溶液200μL,并添加病毒培养用培养基而使总量为10mL。
3)在34℃、5%CO2下培养了两天。
4)将获得的培养物100μL与抗供体毒株血清100μL混合,并在34℃下静置了1小时。
5)在新的25cm2的烧瓶中培养MDCK细胞,并以10mL的病毒培养用培养基更换培养基,接种了上述4)中以抗供体毒株血清进行了处理后的全部培养物200μL。
6)在34℃、5%CO2下培养了两天。
7)之后与参照例1的2.8)~16)同样地进行操作,将噬菌斑进行了分离。
另外,与参照例1同样地,对上述1.中分离的噬菌斑进行了基因分析。
将获得的噬菌斑的基因分析结果表示于以下的表2中。
[表2]
表中“I”是指源自IB/232(供体毒株),“C”是指源自CA/7(抗原毒株)。
在感染了102TCID50/mL的抗原毒株的情况下,进行了分析的噬菌斑中所有基因组节段均源自CA/7。另一方面,在感染了107TCID50/mL的抗原毒株的情况下的No.5、No.10噬菌斑中,PB1节段源自IB/232,确认到重配流感病毒的制备。在No.4、No.6、以及No.8噬菌斑中,由于无法分离单一的噬菌斑,因此混合存在PB1节段源自IB/232和源自CA/7的情况,但在噬菌斑的一部分中确认到重配流感病毒的制备。通过将抗原毒株设定为高浓度,基因重组效率提升至40%左右,确认到容易制备重配流感病毒。获得噬菌斑为止的期间约为10天。另外,启示了在活病毒彼此混合感染的情况下难以抑制抗原毒株的增殖。
(实施例1)研究对病毒毒株照射UV的条件
根据参照例2的结果,为了使用灭活病毒作为第一流感病毒毒株(抗原毒株),而研究了抗原毒株的UV灭活条件。流感病毒毒株使用了CA/7。
1.UV照射实验
1)调制106TCID50/mL的CA/7,并在3.5cm平皿中各分注(dispense)了2mL。
2)在Spectrolinker XL-1000(Spectronics Corporation、UV管为254nm、8W×5根)中放入1)的平皿,并取下平皿的盖子,进行了0秒~120秒的UV照射。
3)按照常规方法,进行了各平皿的感染性滴度测定。
将感染性滴度测定的结果表示于表3中。
[表3]
通过UV照射处理,能够将抗原毒株的病毒的感染性滴度控制在检测极限以下。为了维持抗原毒株对宿主细胞的初期感染能力,考虑UV照射时间优选短的。另外,进行了10秒的UV照射时的照射量为500J/m2~1000J/m2左右。
(实施例2)制备重配流感病毒
确认了对抗原毒株实施UV灭活处理并抑制了混合感染时的抗原毒株的增殖的情况下的基因重组效率。
1.使用的病毒、使用的抗血清
第一流感病毒毒株(抗原毒株):CA/7、A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)(以下称为“NC/20”)
第二流感病毒毒株(供体毒株):IB/232
抗供体毒株血清与参照例1相同。
2.制备重配流感病毒
1)使用病毒培养用培养基,与参照例1同样地调制了107TCID50/mL的供体毒株溶液和107TCID50/mL的抗原毒株溶液。
2)通过与实施例1相同的方法,使用Spectrolinker XL-1000对抗原毒株照射了10秒UV。
3)在25cm2的烧瓶中将MDCK细胞(国际保藏的保藏编号为NITE BP-02014所确定的MDCK细胞)培养至汇合(约5×106细胞/烧瓶),然后去除培养基,接种抗原毒株溶液200μL,在34℃、5%CO2下培养了1小时。然后,接种供体毒株溶液200μL并添加病毒培养用培养基,而使总量为10mL。
4)在34℃、5%CO2下培养了两天。
5)将上述4)中获得的培养物100μL与抗供体毒株血清100μL混合,并在34℃下静置了1小时。
6)在新的25cm2的烧瓶中培养MDCK细胞(国际保藏的保藏编号为NITE BP-02014所确定的MDCK细胞),并以10mL的病毒培养用培养基更换培养基,接种了上述5)中以抗供体毒株血清进行了处理后的全部培养物200μL。
7)在34℃、5%CO2下培养了两天。
8)将获得的培养物的一部分进行离心分离(9000rpm、5分钟),并回收了上清液。
9)使用病毒培养用培养基将离心上清液稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍,并对将MDCK细胞培养至汇合的6孔板以100μL/孔进行了接种。对两块板进行了接种。
10)之后,与参照例1的2.10)~16)同样地进行操作,将噬菌斑进行了分离。
另外,与参照例1同样地,对上述2.中分离的噬菌斑进行了基因分析。
将获得的噬菌斑的基因分析结果表示于以下的表4中。
[表4]
表中“I”是指源自IB/232(供体毒株),“C”是指源自CA/7(抗原毒株),“N”是指源自NC/20(抗原毒株)。
确认到进行了分析的所有噬菌斑均为重配流感病毒。大部分的重配流感病毒是源自供体毒株的节段和源自抗原毒株的节段的比例为6:2或5:3的重配流感病毒。在混合感染IB/232和CA/7的情况下,5:3的重配流感病毒中存在多个M节段源自CA/7的噬菌斑。另外,在抗原毒株为NC/20时的NO.8噬菌斑中,由于无法分离单一的噬菌斑,因此NP节段和M节段中混合存在源自IB/232和源自NC/20的节段。但是,在噬菌斑的分析结果中,PB2节段、PB1节段以及PA节段仅源自IB/232,HA节段、NA节段以及NS节段仅源自NC/20,因此启示了:同时分离的多个噬菌斑均为重配流感病毒。通过以最佳条件对抗原毒株进行UV灭活处理,基因重组效率提升至100%。另外,获得噬菌斑为止的期间约为9天~10天。
(实施例3)确认重配流感病毒的增殖性
使MDCK细胞(国际保藏的保藏编号为NITE BP-02014所确定的MDCK细胞)感染制备出的重配流感病毒并进行培养,确认了增殖性。为了制备重配流感病毒而使用的供体毒株是IB/232,抗原毒株是CA/7。使用参照例1的病毒培养用培养基,在34℃、5%CO2下培养了两天。病毒培养上清液的感染性滴度按照参考文献1中公开的方法,确认了病毒增殖性。将所使用的三种重配流感病毒R#1~R#3的基因分析结果表示于以下的表5中。
[表5]
表中的“I”是指源自IB/232(供体毒株),“C”是指源自CA/7(抗原毒株)。
结果表示于图1。与原来的抗原毒株CA/7相比,重配流感病毒R#1~R#3显示出高感染性滴度。因此,启示了:与CA/7相比,R#1~R#3在MDCK细胞中的增殖性高。
(实施例4)抗体滴度引起的基因重组效率的变动
对能够使具有第二流感病毒毒株(供体毒株)的抗原蛋白的流感病毒毒株选择性失活的抗体滴度进行了研究。
1.使用的病毒、使用的抗血清
第一流感病毒毒株(抗原毒株):CA/7
第二流感病毒毒株(供体毒株):IB/232
抗供体毒株血清:对供体毒株的雪貂感染血清(HI抗体滴度:1280)进行RDE处理,使初始稀释倍数为2倍。
2.制备重配流感病毒
1)利用与实施例2的2.1)~4)相同的方法,获得了培养物。
2)使用培养物的一部分,进行了感染性滴度测定。
3)将以最终稀释倍数变为10倍、102倍、103倍、104倍的方式利用生理盐水进行了稀释后的抗供体毒株血清100μL分别与培养物100μL混合,并在34℃下静置了1小时。
4)利用与实施例2的2.6)~9)相同的方法继续进行重配流感病毒的制备,并将噬菌斑进行了分离。
另外,与参照例1同样地,对上述2.中分离的噬菌斑进行了基因分析。
将获得的噬菌斑的基因分析结果表示于以下的表6中。
[表6]
表中“I”是指源自IB/232(供体毒株),“C”是指源自CA/7(抗原毒株)。
培养物的感染性滴度为107.57TCID50/100μL。在利用具有128以上HI抗体滴度的抗供体毒株血清处理了该培养物的情况下,进行了分析的所有噬菌斑均为重配流感病毒。另一方面,在利用具有12.8以下HI抗体滴度的抗供体毒株血清处理了该培养物的情况下,大部分的HA节段和NA节段源自供体毒株,确认了无法使具有供体毒株的抗原蛋白的流感病毒毒株选择性失活。
(实施例5)培养物的病毒量的容许下限值
对为了制备目标重配流感病毒而所需的培养物的病毒量进行了研究。
1.使用的病毒、使用的抗血清
第一流感病毒毒株(抗原毒株):CA/7
第二流感病毒毒株(供体毒株):IB/232
抗供体毒株血清:对供体毒株的雪貂感染血清(HI抗体滴度:1280)进行RDE处理,使最终稀释倍数为2倍。
2.制备重配流感病毒
1)利用与实施例2的2.1)~4)相同的方法,获得了培养物。
2)使用培养物的一部分,进行了感染性滴度测定。
3)将以病毒培养用培养基稀释至10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍的培养物100μL分别与抗供体毒株血清100μL混合,并在34℃下静置了1小时。
4)利用与实施例2的2.6)~9)相同的方法继续进行重配流感病毒的制备,并将噬菌斑进行了分离。但是,在将培养物稀释至104倍以上的条件下未形成噬菌斑,不进行之后的操作。
另外,与参照例1同样地,对上述2.中分离的噬菌斑进行了基因分析。
将获得的噬菌斑的基因分析结果表示于以下的表7中。
[表7]
表中的“I”是指源自IB/232(供体毒株),“C”是指源自CA/7(抗原毒株)。
未稀释的培养物的感染性滴度为107.57TCID50/100μL。在培养物中的病毒量为104.57TCID50以上的情况下,确认到噬菌斑的形成。另一方面,在培养物中的病毒量为103.57TCID50以下的情况下,未确认到噬菌斑的形成。在形成了噬菌斑的条件下,进行了分析的所有噬菌斑均为重配流感病毒。
(产业上的可利用性)
如以上的详细叙述,根据本发明的重配流感病毒的制备方法,能够在早期有效地制备出作为基因重组体的重配流感病毒。根据本发明的方法,能够在早期有效地制备出显现高增殖性的流感病毒,因此能够迅速地制备流感疫苗制造用的病毒种株。
Claims (6)
1.一种重配流感病毒的制备方法,该重配流感病毒含有第一流感病毒毒株的抗原蛋白,所述重配流感病毒的制备方法包括以下工序:
1)对第一流感病毒毒株以使其具有初期感染能力且病毒增殖性丧失或降低的照射量照射紫外线的工序;
2)使宿主感染第一流感病毒毒株之后使宿主感染第二流感病毒毒株的工序;3)对感染了第一流感病毒毒株和第二流感病毒毒株的宿主进行培养并获得培养物的工序;
4)在工序3)中获得的培养物中使具有第二流感病毒毒株的抗原蛋白的流感病毒失活的工序;
其中,对工序3)中获得的培养物添加针对第二流感病毒毒株的抗血清并进行孵育;抗血清为感染血清;
5)在工序4)之后回收重配流感病毒的工序。
2.如权利要求1所述的重配流感病毒的制备方法,其中,
工序4)包括使工序3)中获得的培养物接触针对第二流感病毒毒株的抗原蛋白的抗体。
3.如权利要求1所述的重配流感病毒的制备方法,其中,抗血清的最终稀释倍数为2倍~1000倍。
4.如权利要求1~3中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,
在工序2)中,以moi为1×10-6~10使宿主接触第一流感病毒毒株并感染。
5.如权利要求1~4中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,
在工序5)中包括从重配流感病毒中选择目标重配流感病毒。
6.如权利要求1~5中任一项所述的重配流感病毒的制备方法,其中,
第二流感病毒毒株为A型流感病毒H1N1亚型或H3N2亚型。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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