KR102477492B1 - 리소턴트 인플루엔자 바이러스 작출 방법 - Google Patents
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Abstract
2종 이상의 인플루엔자 바이러스 주의 게놈 분절을 가진 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법을 제공한다. 이하의 공정을 포함하는, 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 포함하는 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법에 따른다.
1) 제1의 인플루엔자 바이러스 주에, 초기 감염능을 가지며, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하는 조사량으로 자외선을 조사하는 공정;
2) 숙주에, 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시키는 공정;
3) 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주가 감염된 숙주를 배양하여 배양물을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 배양물로부터 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 실활시키는 공정;
5) 공정 4)의 후에, 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 회수하는 공정.
1) 제1의 인플루엔자 바이러스 주에, 초기 감염능을 가지며, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하는 조사량으로 자외선을 조사하는 공정;
2) 숙주에, 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시키는 공정;
3) 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주가 감염된 숙주를 배양하여 배양물을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 배양물로부터 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 실활시키는 공정;
5) 공정 4)의 후에, 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 회수하는 공정.
Description
본 발명은 리소턴트 인플루엔자 바이러스 작출 방법에 관한 것이다.
본 출원은, 참조에 의해 여기에 원용되는 곳의 일본 출원 특허 2016-140366 호 우선권을 청구한다.
인플루엔자는 매년 세계적으로 유행하는 전염병이며, 인플루엔자 바이러스에 의해 발생한다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소 바이러스과에 속하여, 지질 이중막 구조를 가진 엔벨로프가 있다. A형, B형 및 C형의 3속으로 분류되며, 각각 인플루엔자 A형 바이러스, 인플루엔자 B형 바이러스, 인플루엔자 C형 바이러스라고 한다. 일반적으로 인플루엔자 바이러스는, 특히 A형 또는 B형을 말하는 경우가 많다. A형, B형 및 C형의 차이는, 바이러스 입자를 구성하는 단백질 중 M1 단백질 및 NP 단백질의 항원성의 차이에 근거한다. 또한, 동일한 A형과 B형이여도 엔벨로프의 표면 상의 분자인 적혈구 응집소(헤마글루티닌, 이하 「HA」라 칭함)나 뉴라미니다아제(이하 「NA」라 칭함)의 항원성의 차이로부터, 여러 아형과 주로 분류된다.
인플루엔자 바이러스는 항원 변화를 높은 확률로 받아, 신형의 인플루엔자 바이러스 주를 새로 만들어낸다. A형 인플루엔자 바이러스는 이들의 HA 및 NA 항원성에 따라 16종의 HA(H1 ~ H16) 아형과 9종의 NA (N1 ~ N9) 아형으로 분류된다. A형 인플루엔자 바이러스 3종의 HA(H1, H2 및 H3) 아형은 특히 중요한 병원체이다. A형 인플루엔자 바이러스의 H1N1 아형과 H3N2 아형은 계절적으로 퍼져 인간 감염을 일으키고 있다. 2003년에는, 치사성이 높은 트리 유래의 인플루엔자 바이러스 H5 아형이 인간 병원체로 발생하였다. 2009년 4월에는, 신형의 인플루엔자 바이러스로서 H1N1 아형 바이러스가 발생, 인간 집단에서 급속히 확산하고 있다. 인플루엔자는 판데믹의 우려도 있기 때문에, 인플루엔자 백신에는 양적인 확보가 요구되고 있다.
인플루엔자 백신의 제조에는, 발육 계란을 이용하여 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 방법이 이용되고있다. 또한, 배양 세포에서 인플루엔자 바이러스를 증식시켜 제조하는 방법도 실용화되고 있다. 인플루엔자 바이러스의 증식에 발육 계란이나 배양 세포를 이용하는 경우, 인플루엔자 바이러스의 아형과 주에 따라 숙주에서 바이러스의 증식성이 저하되는 것이 문제가 되고 있다. 그래서 유전자 재조합 기술에 의해 숙주에서 증식성이 향상한 인플루엔자 바이러스의 유전자 재조합체를 작출하는 시도가 이루어지고 있다. 유전자 재조합 기술로는, 리소트(Reassort)법이나 리버스 제네틱스법 (이하 「RG 법」이라 칭함)이 예시된다. RG 법의 하나로서, 바이러스 RNA(vRNA)를 공급하기 위한 8 종류의 플라스미드(PolI 플라스미드)와, 바이러스 입자를 형성하는데 필요한 구조 단백질을 코드하는 4 종류의 플라스미드(PolII 플라스미드)의 총 12 종류의 플라스미드를 동시에 세포에 도입하여, 인플루엔자 바이러스의 유전자 재조합체를 작출하는 방법을 들 수 있다(비특허 문헌 1). 그러나, RG 법은, 여러 종류의 플라스미드를 동시에 세포에 도입하기 위해, 숙주 세포에게 부담이 크다. 또한, 각종 플라스미드 제조에 시간이 필요하기 때문에, 신속한 유전자 재조합체 작출이 어렵다는 문제가 있다.
리소트법은, 숙주에 2종 이상의 인플루엔자 바이러스 주를 함께 감염하여, 증식의 과정에서 게놈 분절이 교체되고, 재집합을 함으로써, 유전자 재조합체가 작출된다(비특허 문헌 2 ~ 4). 리소트법에 의한 인플루엔자 바이러스 유전자 재조합체의 작출은, 계란을 숙주로 하여 이루어지고 있다. 구체적으로는, PR8 주 등의 중추 바이러스 주와 유행 주를 발육 계란에 혼합 감염시킴으로써, 높은 증식성 백본 유전자와 유행 주 항원 유전자를 겸비하여 유전자 재조합체를 작출한다. 그러나, 발육 계란을 숙주로 이용한 리소트법에는, 반드시 목적의 유전자 재조합체가 작출 수 없다는 문제가 있다.
세포 배양 인플루엔자 백신에서는, 배양 세포에서 높은 증식성을 나타내는 종자 바이러스를 사용하는 것이 바람직하며, 백신의 안정적 공급을 위해서는 해당 종자 바이러스를 효율적으로 작출하는 것이 요구되고 있다. 인플루엔자 바이러스의 유전자 재조합체를 얻는 목적으로, 배양 세포를 이용하여 리소트법을 수행하는 것이 검토되고 있다. 배양 세포를 이용한 리소트법에서도 반드시 목적의 유전자 재조합체가 작출 수 없는 것으로 우려되고 있다. 특허문헌 1에는, 배양 세포를 이용한 리소트법으로서, 2종의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시킨 숙주에, 백본 주의 HA 및/또는 NA의 전사나 번역을 저해할 수 있는 저해 인자를 접촉시켜, 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 것이 개시되어 있다.
Neumann et al. , PNAS Vol. 102, p. 16825-16829 (1999)
PLoS Pathog. 2015 Oct; 11 (10) : e1005204.
J Virol. 1976 Oct; 20 (1) : 248-54.
「바이러스 실험학 각론」 제2판 1982년 2월 28일 발행, 발행소 마루젠 주회사 p. 321-325
본 발명은, 2종 이상의 인플루엔자 바이러스 주의 게놈 분절을 가진 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 해당 방법을 이용하여 증식성이 높은 인플루엔자 바이러스를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 제1의 인플루엔자 바이러스 주에 자외선을 조사하여 바이러스 복제 기능을 상실시키는 것, 및 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 선택적으로 실활시키는 항체를 이용하는 것으로, 조기에 더 효율적으로 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 즉 이하로 이루어진다.
1. 이하의 공정을 포함하는 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 포함하는 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법:
1) 제1의 인플루엔자 바이러스 주에, 초기 감염능을 가지며, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하는 조사량으로 자외선을 조사하는 공정;
2) 숙주에, 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시키는 공정;
3) 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주가 감염된 숙주를 배양하여 배양물을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 배양물로부터 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 실활시키는 공정;
5) 공정 4)의 후에, 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 회수하는 공정.
2. 공정 4)는 공정 3)에서 얻어진 배양물에 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 대한 항체를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 1항에 기재된 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
3. 공정 4)는 공정 3)에서 얻어진 배양물에 제2의 인플루엔자 바이러스 주에 대한 항혈청을 첨가하여 인큐베이트하는 것을 포함하는, 상기 1항에 기재된 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
4. 항혈청의 최종 희석 배율 2 ~ 1000 배인, 상기 3항에 기재된 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
5. 항혈청이 감염 혈청인, 상기 3항에 기재된 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
6. 공정 2)에서, 제1의 인플루엔자 바이러스 주를 1 × 10-6 ~ 10의 moi로 숙주에 접촉시켜 감염시키는, 상기 1 ~ 5항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
7. 공정 2)에서, 제1의 인플루엔자 바이러스 주를 숙주에 감염시킨 후, 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 숙주에 감염시키는, 상기 1 ~ 6항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
8. 공정 5)에서, 리소턴트 인플루엔자 바이러스로부터, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 선택하는 것을 포함하는, 상기 1 ~ 7항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
9. 제2의 인플루엔자 바이러스 주가, 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형 또는 H3N2 아형인, 상기 1 ~ 8항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
10. 상기 1 ~ 9항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법에 의해 작출된 리소턴트 인플루엔자 바이러스.
11. 제1의 인플루엔자 바이러스 주 유래의 항원성 단백질을 포함하고, 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 백본 단백질을 포함하는 상기 10항에 기재된 리소턴트 인플루엔자 바이러스.
12. 숙주가 배양 세포인, 상기 1 ~ 9항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
13. 숙주가 발육 계란인, 상기 1 ~ 9항 중 어느 한 항에 기재의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법.
본 발명의 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출 방법에 의하면, 조기에 더욱 효율적으로 유전자 재조합체인 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출가능하게 된다. 본 발명의 방법에 의하면, 높은 증식성을 나타내는 인플루엔자 바이러스를 조기에 더욱 효율적으로 작출할 수 있다.
도 1은 항원주 및 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 배양 세포의 증식을 확인한 결과를 나타낸 도이다.(실시예 3)
본 발명은 2종 이상의 인플루엔자 바이러스 주의 게놈 분절을 가진 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 방법이다.
인플루엔자 바이러스는, 지질 이중막 구조의 엔벨로프를 가진다. 엔벨로프의 내층은 주로 매트릭스 단백질 및 RNA와 단백질의 복합체인 RNP로 구성된다. 외층에는 이른바 표면 단백질인 인플루엔자 NA 단백질 및 인플루엔자 HA 단백질이 돌기 물로서 존재한다. 인플루엔자 바이러스는 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS 분절의 8개의 게놈 분절로 구성된다. HA 및 NA의 게놈 분절은 각각 HA 및 NA 항원 단백질을 코드하고, 이 외의 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 분절의 6개 게놈 분절은 백본의 단백질을 코드하고 있다.
인플루엔자 바이러스의 유전자 재조합 기술로서, RG법이나 리소트법을 들 수있다. RG법에서는 여러 플라스미드를 동시에 세포에 도입하기 위해, 도입에 견딜 수 있는 세포의 선택과 플라스미드 제조, 플라스미드와 세포의 상성 등, 목적의 유전자 재조합 바이러스를 효율적으로 작출하기 위한 과제가 많다 . 한편, 리소트법은 숙주에 인플루엔자 바이러스 주를 함께 감염하여, 증식 과정에서 게놈 분절이 교환되고, 재집합하는 것으로 유전자 재조합체를 작출하기 위해, 플라스미드를 이용하지 않는다. 따라서 유전자 재조합 바이러스 작출에 소요되는 비용과 시간을 RG 법보다 크게 줄일 수 있다.
그러나, 기존의 리소트법에는, 유전자 재조합 효율이 낮다는 큰 과제가 존재한다. 따라서, 반드시 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있는 것은 아니다. 한편, 특허문헌 1에서는 높은 증식성 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 얻기 위해 약 35일이 소요하는 것이 기재되어 있다. 즉 리소트 방법은, 여러 플라스미드의 제조를 필요로 하는 RG법과 비교하여, 바이러스 작출에 소요되는 시간이나 비용을 줄일 수 있으나, 유전자 재조합 효율의 낮음에 기인하여, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 얻기 위해서는 장기간을 요하는 것이 우려된다.
본 발명자들은, 종래의 리소트 법에서는, 공감염 세포 안에서 증식하는 인플루엔자 바이러스의 게놈 분절 교환의 제어가 불충분한 것 및/또는 목적의 인플루엔자 바이러스 이외의 불필요한 바이러스가 충분히 실활되지 않은 것이, 적절한 유전자 재조합 효율이 달성되지 않는 원인이라고 생각하였다. 예의 검토한 결과, 제1의 인플루엔자 바이러스 주에 자외선을 조사하여 바이러스 복제 기능을 상실시키는 것 및 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 대한 중화 항체를 이용하는 것으로, 조기에 더욱 효율적으로 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출할 수 있음을 발견하였다. 또한, 초기 감염능을 가지며, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하는 조사량으로 자외선을 제1의 인플루엔자 바이러스 주에 조사하는 것으로, 바이러스 공감염시의 숙주 내에서 일어나는 게놈 분절 교환을 제어하고 있는 것을 발견하였다. 더욱 놀라운 것은, 리소트 법에서 일반적으로 사용되는 면역 혈청이 아닌 감염 혈청을 사용하여 배양중인 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 완전히 불활성화시킬 수있는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 작출 방법에 따라 유전자 재조합 효율을 향상시키고 높은 증식성 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 조기에 작출할 수 있는 것을 발견하였다.
본 발명에서 얻어지는, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스는, HA 및 NA를 코딩하는 게놈 분절의 적어도 하나(바람직하게는, 적어도 HA를 코딩하는 게놈 분절)가, 제1의 인플루엔자 바이러스 주에 유래하며, 그 이외의 게놈 분절의 적어도 하나(바람직하게는, 적어도 PB1을 코딩하는 게놈 분절)가, 제2의 인플루엔자 바이러스 주에 유래하고 있는 것이다. 본 발명의 제1의 인플루엔자 바이러스 주는 항원 주라고도 하며, 제2의 인플루엔자 바이러스 주는 도너 주 또는 백본 주라고도 불린다. 이하, 본 발명의 작출 방법의 각 공정에 대해 설명한다.
공정 1) 제1의 인플루엔자 바이러스 주에, 초기 감염능을 가지며, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하는 조사량으로 자외선을 조사하는 공정.
본 공정에서는 제1의 인플루엔자 바이러스 주에 자외선을 조사하여, 불활화한다. 자외선의 조사량은, 자외선 조사 후의 제1의 인플루엔자 바이러스 주가 숙주로의 초기 감염능은 가지고 있으나, 감염 후의 바이러스 증식성이 상실 또는 저하 하여 있는 정도인 것이 바람직하다. 감염 후의 바이러스 증식성의 상실 또는 저하는, 제1의 인플루엔자 바이러스를 단독으로 숙주에 감염시킨 경우에, 숙주 내에의 바이러스의 증식성이 확인되지 않거나 또는 자외선 조사를 하지 않은 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 비교하여 바이러스 증식성이 저하하여 있다는 것을 의미한다. 바이러스 증식성은, 바이러스 감염가, PFU(Plaque Forming Unit) 등의 공지의 지표를 이용하여 평가할 수 있다. 또한, 자외선 조사를 실시한 후, 제1의 인플루엔자 바이러스 주를 숙주에 감염시키는 경우에는, 숙주에의 감염능, 즉 초기 감염능을 가지고 있을 필요가 있다. 초기 감염능이 있는 상태로는, 숙주가 배양 세포인 경우, 자외선 조사한 바이러스에 의한 CPE(cytopathic effect)가 관찰되는 것을 의미한다. 본 공정에서는, Spectrolinker XL-1000(Spectronics Corporation)의 Time Mode에서 1 ~ 60 초, 바람직하게는 5 ~ 50 초 동안, 더욱 바람직하게는 10 ~ 40 초 동안, 더욱 바람직하게는 10 ~ 30 초간 자외선 조사를 실시했을 경우와 동등한 자외선 조사량을 제1의 인플루엔자 바이러스 주에 조사하는 것이 바람직하다. 소요 자외선 조사를 위해 이용하는 장치(자외선 강도, 광원으로부터의 거리 등은 이하 실시예 기재) 및 조사 시간 등의 조사 조건은 일례이며, 해당 조사 조건과 동일한 정도의 자외선 조사량이 되는 경우, 이러한 조건은 적절히 조정·변경이 가능하다. 상기 조건의 자외선 조사량이면, 숙주에의 초기 감염능을 가지고 있지만, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하고 있는 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 얻을 수 있기 때문에 바람직하다. 본 발명에서는 숙주의 초기 감염능을 가진 채, 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 바이러스 증식성을 상실 또는 저하시킴으로써 숙주 내에서 유전자 재조합 효율을 향상시킬 수 있다.
공정 2) 숙주에, 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시키는 공정.
제1의 인플루엔자 바이러스 주와, 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 숙주에의 감염은, 동시어도 좋고, 동시가 아니어도 좋다. 바람직하게는, 제1의 인플루엔자 바이러스 주를 숙주에 감염시킨 후, 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시킨다. 숙주에의 인플루엔자 바이러스 주의 감염은, 숙주와 인플루엔자 바이러스 주를 접촉시킴으로써 한다. 제1의 인플루엔자 바이러스 주는, 바람직하게는 1 × 10 -6 ~ 10 moi, 더욱 바람직하게는 0.001 ~ 1 moi, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 1 moi로 숙주에 접촉시키는 것이 바람직하다. 제2의 인플루엔자 바이러스 주는, 바람직하게는 0.001 ~ 10 moi, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 1 moi, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 1 moi로 숙주에 접촉시키는 것이 바람직하다. 종래는, 숙주에 인플루엔자 바이러스를 공감염시키는 경우, 높은 농도에서 바이러스를 숙주에 접촉시켜 감염시킬 필요가 있었다. 그러나, 본 발명에서는 낮은 농도에도 인플루엔자 바이러스가 숙주에 공감염하며, 유전자 재조합체를 효율적으로 작출 가능하다. 또한, 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 moi는 자외선을 조사하기 전에 값이다. 인플루엔자 바이러스 감염가 (TCID50/mL)은 국립 감염증 연구소의 「인플루엔자 진단 메뉴얼(제3판, 2014년 9 월)」의 「Part IV」(이하, 「참고 문헌 1 」이라 함)에 개시된 방법에 따라 확인할 수 있으며, moi 감염가를 세포 수로 나누어 산출할 수 있다.
공정 3) 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주가 감염된 숙주를 배양하여 배양물을 얻는 공정.
본 공정의 배양하여 숙주 내에서 인플루엔자 바이러스가 리소트된다. 숙주의 배양 조건, 예를 들면, 배양 온도 등은 숙주 내에서 인플루엔자 바이러스가 증식할 수 있는 조건이라면 어떠한 조건이여도 좋다. 숙주가 배양 세포인 경우는, 배양에 사용되는 배지는 액체 배지가 바람직하다. 액체 배지에 종종 동물 유래의 혈청이 첨가되나, 동물 유래의 혈청은 목적의 인플루엔자 바이러스의 증식을 저해하는 인자를 포함하는 가능성을 부정할 수 없도록 해당 인자를 포함하지 않는 무혈청 배지를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 혈청 배지로는 이글 MEM 배지(닛스이 제약 주식회사), Opti PRO SFM(Thermo Fisher Scientific), VP-SFM(Thermo Fisher Scientific), EX-CELL MDCK(SAFC Biosciences), UltraMDCK(Lonza), ProVero 1 (Lonza), BalanCD MDCK(Irvine Scientific) 등이 예시된다. 배양 시간은 바람직하게는 1 ~ 5일, 더욱 바람직하게는 2 ~ 3일 정도이다. 본 공정에서는, 배양 후에 배양물이 얻어진다. 해당 배양물 중에는, 숙주 내에서 리소트된 리소턴트 인플루엔자 바이러스 및 제2 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스가 포함된다. 상기 바이러스는 숙주가 발육 계란의 경우는 주로 요막강액 중에 포함되며, 숙주가 배양 세포의 경우는 주로 배양 상청에 포함된다.
공정 4) 상기 공정 3)에서 얻어진 배양물 중의 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 선택적으로 실활시키는 공정.
해당 바이러스의 실활은, 물리적 방법, 화학적 방법, 기타 어떠한 방법을 이용하여 달성될 수 있으나, 바람직하게는 배양물 중의 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스에, 해당 항원 단백질에 결합하는 중화 항체를 접촉시켜 처리함으로써 달성된다.
본 공정에 제공하는 배양물 중의 바이러스 양은, 바이러스 감염가(TCID50/mL)와 용량(mL)의 곱으로 나타낼 수 있다. 배양물 중에 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스가 포함되어 있으면, 바이러스 양은 어떠한 값도 좋지만, 바람직하게는 10 2 TCID50 이상, 보다 바람직하게는 103 TCID50 이상, 보다 바람직하게는 104 TCID50 이상인 것이 바람직하다. 소요 범위 내이면, 공정 5)에서 목적하는 리소턴트 바이러스를 단리할 수 있다. 또한, 바이러스 양은 공지의 방법에 의한 희석 또는 농축에 의해 적절히 조정할 수 있다.
중화 항체는, 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 결합하고, 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 결합하지 않는 것이면 좋고, 폴리클로 날 항체이어도 모노클로날 항체이어도 좋다. 바람직하게는 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 중화 항체인 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 중화 항체를 포함하는 항혈청을 사용할 수 있다. 공정 3)에서 얻어진 배양물에, 해당 항혈청을 첨가함으로써 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스 및 해당 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 중화 항체와 접촉시킬 수 있다.
제2의 인플루엔자 바이러스 주에 대한 항혈청은, 면역 혈청도 감염 혈청도 좋지만, 바람직하게는 감염 혈청이 선택된다. 이러한 항혈청은 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 면역 혈청은, 제2의 인플루엔자 바이러스 주 유래 항원을 투여한 동물에서 회수한 혈액으로부터 얻을 수 있다. 항혈청은, 예를 들면, 토끼, 염소, 양, 마우스, 렛트 등의 포유 동물에, 제2의 인플루엔자 바이러스 주 유래 항원을 면역원으로 투여하여 면역한 것으로 제조된다. 투여 방법으로는, 복강 내 주사, 정맥 주사, 피하 주사 등이 채용되며, 경우에 따라 피내 주사도 채용된다. 추가 면역을 여러번 반복하여, 최종 면역 후 3 ~ 10일째에 포유 동물에서 회수한 혈액에서 면역 혈청을 얻을 수 있다. 또한, 감염된 혈청은 제2의 인플루엔자 바이러스 주에 감염된 포유 동물에서 회수한 혈액으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 페럿과 마우스 등의 인플루엔자 바이러스 감수성의 포유 동물에 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시킨다. 감염 방법으로는, 분무 접종이나 비강 접종 등의 방법이 사용된다. 감염 10 ~ 14일째 이후에 포유 동물의 채혈을 실시하여, 감염 혈청을 얻을 수 있다.
얻어진 항혈청은, 예를 들면, RDE(Receptor Destroying Enzyme) 처리, 트립신 처리, 과요오드산 칼륨 처리 등의 공지의 방법에 의해, 제2의 인플루엔자 바이러스 주 유래 항원에 특이적인 중화 활성을 실활시켜 두는 것이 바람직하다. 항혈청은 최종 희석 배율로서, 바람직하게는 2 ~ 1000배, 더욱 바람직하게는 4 ~ 10배로 되는 농도로, 배양물에 첨가하는 것이 바람직하다.
중화 항체의 항체가는 사전에 측정되는 것이 바람직하다. 항체가는, 예를 들면, 입자 응집법(PA), 간접 형광 항체법(IFA), 면역 부착 적혈구 응집법(IAHA), 중화법(NT), 적혈구 응집 억제법(HI), 보체 결합법 (CF), 효소 면역법(EIA), 방사 면역 측정법(RIA), 화학 발광 면역 측정법(CLIA), 라텍스 응집 비 탁법(LA) 등의 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다. 배양물의 바이러스 감염가가 107 ~ 108 TCID50/100 μL인 실시예에서는, HI법으로 측정한 항체가가 10 이상, 바람직하게는 12.8 이상, 보다 바람직하게는 80 이상, 더욱 바람직하게는 128 이상을 나타내는 항혈청을 사용할 수 있다. 소요 범위 내라면, 배양물 중에 존재하는 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질과 중화 항체가 적합하게 결합하여 해당 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 실활할 수 있다.
이어서, 상기 배양물과 중화 항체의 혼합물을 숙주에 접촉시키고, 감염된 숙주를 공정 3)에 나타낸 바람직한 조건에서 배양하여, 목적의 리소턴트 바이러스를 선택적으로 증식시킨다. 숙주가 배양 세포인 경우에는, 목적의 리소턴트 바이러스에 기인하는 CPE(cytopathic effect)가 확인된다.
공정 5) 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 회수하는 공정.
본 공정에서는, 상기 공정 4) 작출된 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 회수한다. 본 공정에 있어서, 회수된 리소턴트 인플루엔자 바이러스로부터, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 선택해도 좋다. 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스는 플라크법에 의해 단리하여, 게놈 분절을 분석하는 것에 의해 선택할 수 있다. 플라크법 및 게놈 분절의 분석 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 작출 방법에 의하면, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 종래 기술의 절반 이하의 기간으로 얻을 수 있다. 기존의 중화 항체 또는 항혈청을 사용할 수 있는 경우, 바람직하게는 17일 이하, 보다 바람직하게는 15일 이하, 더욱 바람직하게는 13일 이하, 가장 바람직하게는 10일 이하로 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스 얻을 수 있다. 새로운 항혈청의 제조가 필요한 경우, 바람직하게는 24일 이하, 보다 바람직하게는 20일 이하, 더욱 바람직하게는 16일 이하, 가장 바람직하게는 12일 이하로 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있다. 펜더믹 시기 등, 조기에 백신을 입수할 필요가 있는 경우, 본 발명의 방법은 매우 유용하다.
본 명세서에서, 인플루엔자 바이러스의 유전자 재조합체의 작출의 용이성을, 유전자 재조합 효율로 나타낸다. 유전자 재조합 효율로는, 리소턴트 작출 실험에서 플라크를 단리한 전체 클론 수에 대하여, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스 인 플라크 클론의 비율을 나타낸다. 리소턴트 작출 실험은, 숙주에 대하여 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시켜, 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 실험을 의미한다. 본 발명의 작출 방법에 의하면 유전자 재조합 효율이 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%를 달성할 수 있다.
본 발명의 제1의 인플루엔자 바이러스 주 또는 제2의 인플루엔자 바이러스 주는, 특히 한정되는 것이 아니며, 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 현재 알려진 모든 아형, 및 미래 단리, 동정 된 아형 중에서 선택할 수 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 경우, 다양한 HA 아형과 NA 아형과의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스가 고려될 수 있다. B형 인플루엔자 바이러스의 경우 빅토리아 계통과 산형 계통과의 조합을 포함하는 인플루엔자 바이러스가 고려될 수 있다.
A형 인플루엔자 바이러스의 각 아형은, RNA 게놈 변이성이 높기 때문에, 새로운 주가 자주 발생하고 있다. 2009년 4월에 멕시코에서의 유행이 인지된 후, 세계적으로 유행하였다고 하는 인플루엔자는 신형 인플루엔자, 돼지 인플루엔자, 펜더믹 인플루엔자 A(H1N1), swine flu, A/H1N1 pdm 등으로 불리우고 있다. 돼지 사이에서 유행했던 바이러스가, 농장 등에서 돼지로부터 사람으로 직접 감염하여, 그 후 인간의 사이에 퍼지게된 신형 인플루엔자는, 종전부터 존재하고 있는 계절성의 A 소련형 인플루엔자인 인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 아형(이하 「H1N1 아형」이라 칭함)과, A 홍콩형 인플루엔자인 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형(이하 「H3N2 아형」라 칭함)는 구별된다. 또한, RNA 게놈 변이성이 높다는 점에서 인플루엔자 A 형 바이러스의 동일한 아형 중에서도, 단리된 시기와 장소에 따라 바이러스 주를 구분하고 있다.
본 발명에 사용되는 인플루엔자 바이러스 주는, 상술한 바와 같은 생체로부터 분리된 인플루엔자 바이러스의 기타, 인플루엔자 백신에 적용 가능하도록, 약독화, 계란 증식 적합화, 세포 배양 증식 적합화, 온도 감수성 표현 형질화, 점막 투여 적합화 등의 개변을 가하여 작출된 재조합 바이러스이어도 좋다. 또한, 개변하기 위한 수단으로서, 인플루엔자 바이러스의 항원 부위나 효소 부위 등의 8개의 RNA 분절에 변이를 도입하는 방법과 저온 계대에 의해 약독 바이러스를 작출하는 방법, 바이러스 배양계에의 변이 유발제를 첨가하는 것에 의한 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 제2의 인플루엔자 바이러스 주는, 소망의 숙주에 있어서 증식성이 우수한 주를 선택하는 것이 바람직하다. 숙주가 계란인 경우는 H1N1 아형인 것이 바람직하다. H1N1 아형으로는 A/푸에르토리코/8/34(H1N1) 등이 예시된다. 한편, 숙주가 배양 세포인 경우, 특히 MDCK 세포인 경우는 H3N2 아형인 것이 바람직하다. H3N2 아형으로는 A/이바라키/N12232/2012(H3N2), A/히로시마/52/2005(H3N2), A/파나마/2007/99(H3N2) 등이 예시된다. 제1의 인플루엔자 바이러스 주로서는, 목적의 항원 단백질을 가지는 주를 이용하면 좋으며, 특히 한정되지 않는다. 현재 단리, 동정되어 있는 주여도, 미래 단리, 동정된 주도 좋고, A형 인플루엔자 바이러스도 B형 인플루엔자 바이러스도 좋다. 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 구체적인 예로는, A/캘리포니아/7/2009(H1N1) pdm09, A/캘리포니아/4/2009(H1N1) pdm09, A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1), A/솔로몬제도/3/2006(H1N1), A/브리즈번/59/2007(H1N1), A/파나마/2007/99(H3N2), A/와이오밍/3/2003(H3N2), A/뉴욕/55/2004 (H3N2), A/히로시마/52/2005(H3N2), A/우루과이/716/2007(H3N2), A/빅토리아/210/2009(H3N2), A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/텍사스/50/2012(H3N2), A/뉴욕/39/20 12 (H3N2), A/스위스/9715293/2013(H3N2), A/베트남/1194/2004(H5N1), A/인도네시아/5/2005(H5N1), A/안후이/1/2005(H5N1), A/상해/2/2013(H7N9), A/안후이/1/2013(H7N9), B/산/7/97, B/상하이/361/2002, B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/브리즈번/60/2008, B/위스콘신/1/2010, B/매사추세츠/2/2012, B/푸켓/3073/2013, B/텍사스/2/2013 등이 예시되지만, 여기에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 의해 작출된 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스는, 인플루엔자 백신 제조의 종자 바이러스로 사용할 수 있다. 목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 정제하는 공정은 공지의 방법 또는 향후 개발될 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 작출 방법에 사용되는 숙주는, 발육 계란도, 배양 세포도 좋다. 발육 계란을 숙주로 사용하는 경우, 특정 병원체 제거(specific pathogen-free) (SPF) 부화 계란을 사용할 수 있다.
본 발명의 작출 방법에 있어서, 배양 세포를 숙주로 사용하는 경우, 배양 세포는 인플루엔자 바이러스가 감염되어 복제 가능한 것이면 어떤 것이라도 좋다. 배양 세포로는 포유 동물 세포가 바람직하고, 햄스터, 소, 영장류(인간과 원숭이 포함) 및 개 세포가 예시될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는, 마딘-더비(Madin-Darby) 개 신장에서 유래한 MDCK 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래 Vero 세포 등이 예시될 수 있다. 본 발명에서 MDCK 세포는, 더 구체적으로는, 국제 기탁의 수탁 번호 NITE BP-02014로 특정된 MDCK 세포이다. 소요 세포는, 독립 행정법인 제품평가기술 기반 기구 생명공학센터 특허 미생물 기탁센터(우편 번호 292-0818 일본 지바현 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8)에 2015년 3월 4일에 위탁 번호 NITE P-02014로 국내 기탁된 후, 독립 행정법인 제품평가기술 기반 기구 생명공학센터 특허 미생물 기탁센터에서 부다페스트 조약에 의해 국제 기탁으로 이관 청구되었다.
[실시예]
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 이하에 실시예 및 참고예를 나타내어 구체적으로 본 발명을 설명하나, 본 발명은 본 실시예 및 실시예에 한정되지 않는다.
(참고예 1) 생 바이러스를 이용한 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출
항원주에 자외선 조사(이하, UV 조사)를 실시하지 않고, 생 바이러스를 이용하여 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출을 하였다.
1. 사용 바이러스 주, 사용 항혈청
제1의 인플루엔자 바이러스 주(항원 주): A/캘리포니아/7/2009(H1N1) pdm09 (이하「CA/7」이라 함)
제2의 인플루엔자 바이러스 주(도너 주): A/이바라키/N12232/2012(H3N2)(이하 「IB/232」이라 함)
항도너 주 혈청: 도너 주의 페럿 감염 혈청(HI 항체: 1280)를 RDE 처리하고 최종 희석 배율 2 배로 한 것
2. 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출
1) 글루타민(4 mM), 포도당(4.6 g/L), 탄산수소나트륨(20 mM), 0.1 × TrypLE Select를 함유하는 이글 MEM 배지(이하 「바이러스 배양용 배지」라고 함)를 이용하여 도너 주 및 항원 주의 각 인플루엔자 바이러스 용액을 제조하였다. 도너 주의 인플루엔자 바이러스 용액을 이하 「도너 주 용액」이라고 하고, 항원 주의 각 인플루엔자 바이러스 용액을 「항원 주 용액」라고 한다. 상기 바이러스 배양용 배지를 이용하여 105 TCID50/mL 기증자 주 용액 및 104 TCID50/mL, 103 TCID50/mL, 102 TCID50/mL, 101 TCID50/mL의 항원 주 용액을 각각 제조하였다. 또한, 인플루엔자 바이러스 감염가(TCID50/mL)는 참고문헌 1에 개시된 방법에 따라 확인하였다.
2) 25 cm2 플라스크에서, MDCK 세포(국제 기탁의 수탁 번호 NITE BP-02014에 특정된 MDCK 세포)를 컨플루언트(약 5 × 106 세포/플라스크)가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 배지를 10 mL의 바이러스 배양용 배지로 교환하고, 도너 주 용액 100 μL과 각 농도의 항원 주 용액 100 μL를 각각 동시에 접종하였다.
3) 34℃ , 5% CO2에서 2 일간 배양하였다.
4) 얻어진 배양물 100 μL와, 항도너 주 혈청 100 μL를 혼합하여, 34℃에서 1시간 정치하였다.
5) 새로운 25 cm2 플라스크에서 MDCK 세포를 배양하여, 배지를 10mL의 바이러스 배양용 배지로 교환하고, 상기 4)에서 항도너 주 혈청에서 처리한 배양액 200 μL 전량을 접종하였다.
6) 34℃ , 5% CO2 에서 2일간 배양하였다.
7) 얻어진 배양물 100 μL에 대해, 상기 4) ~ 6)의 조작을 다시 반복하였다.
8) 얻어진 배양물을 원심 분리(9000 rpm, 5 분)하여 상청을 회수하였다.
9) 원심 상청을 바이러스 배양용 배지에서 103 배, 104 배, 105 배, 106 배, 107 배, 108 배로 희석하고, MDCK 세포를 컨플루언트까지 배양한 6-well 플레이트에 100 μL/well로 접종하였다. 접종은 2매의 플레이트에 대해 하였다.
10) 34℃ , 5% CO2 에서 30분간 배양 하였다.
11) 플라크 분석과 동일한 방법으로 0.8% 아가로오스 함유 MEM 배지(글루타민(4 mM), 0.1 × TrypLE Select 함유)을 3 mL/well 중층하였다. 안전 캐비닛 내에서 건조시킨 후, 인큐베이터 내에서 배양을 시작하였다.
12) 34℃ , 5% CO2 에서 3일간 배양 하였다.
13) 1.0% 아가로오스 함유 MEM 배지(뉴트럴 레드 함유)을 2 mL/well 중층하고 안전 캐비닛에서 건조하였다.
14) 새로운 6-well 플레이트에서 MDCK 세포를 배양하여, 2 mL/well의 바이러스 배양용 배지로 배지를 교환하고, 각 well에 플라크를 단리하였다. 픽업은 필터 부착의 선절단 칩을 이용하여 수행하였다.
15) 334℃ , 5% CO2 에서 3일간 배양 하였다.
16) 단리한 플라크의 배양액을 원심분리(9000 rpm, 5 분)하여 상청액을 -80℃ 에서 보관하였다.
3. 유전자 분석
상기 2. 에서 단리된 플라크의 배양 상청으로부터 RNA를 추출하여, 역전사를 하여 cDNA를 합성하고, 정법에 따라 PCR에 의해 바이러스의 전체 게놈 분절을 증폭하여 간이 정제하였다. 이를 검체로 하여 유전자 배열 분석한 후, 각 게놈 분절이 도너 주와 항원 주 중 유래하는지를 판정하였다.
102 TCID50/mL 또는 104 TCID50/mL의 항원 주를 감염시키는 조건에서 얻어진 플라크의 유전자 분석 결과를 이하의 표 1에 나타내었다. 또한, 101 TCID50/mL의 항원 주를 감염시킨 조건은, 상기 2. 6) 이상으로, 세포에 CPE가 관찰되지 않았기 때문에 후속 작업을 하지 않았다.
[표 1]
표 중 「I」는 IB/232 (도너 주) 유래이며, 「C」는 CA/7 (항원 주) 유래인 것을 의미한다.
분석한 대부분의 플라크는, 게놈 분절의 전체가 CA/7 유래하였다. 102 TCID 50/mL의 항원 주를 감염시키는 조건의 7 번째의 플라크 및, 104 TCID50/mL의 항원 주를 감염시키는 조건의 12 번째 플라크는, PB1 분절에만, IB/232 유래로 하는 리소턴트 인플루엔자 바이러스였다. 두 조건에서, 유전자 재조합 효율은 10% 미만이었다. 또한, 상기 2.의 수법으로 단리 플라크를 얻을 때까지의 기간은 약 12일이었다. 이러한 결과로부터, 도너 주와 항원 주의 숙주 세포에의 혼합 감염에는, 바이러스 양이 중요하다고 생각되었다. 또한, 101 TCID50/mL의 항원 주를 감염시킨 것으로는, 상기 2.6)에서 배양 5 일째가 되어도 CPE가 관찰되지 않고 바이러스 증식이 일어나지 않았다. 따라서 도너 주는 항혈청에 의한 1회 중화로 충분히 억제된 것으로 생각되었다.
(참고예 2) 항원 주의 바이러스 양에 의한 리소턴트 인플루엔자 바이러스 작출에의 영향의 확인
본 참고예에서는 항원 주의 바이러스 양이 유전자 재조합 효율에 미치는 영향을 검토하였다. 또한, 사용 바이러스 및 사용 항혈청은, 참고예 1과 동일하다.
1. 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출
1) 바이러스 배양용 배지를 이용하여, 107 TCID50/mL의 도너 주 용액을 제조하는 것과 함께, 102 TCID50/mL, 107 TCID50/mL의 항원 주 용액을 각각 준비하였다.
2) 25 cm2 플라스크에 MDCK 세포(국제 기탁의 수탁 번호 NITE BP-02014에 명시된 MDCK 세포)를 컨플루언트(약 5 × 106 세포/플라스크)가 될 때까지 배양하여, 배지를 제거하고, 항원 주 용액 200 μL를 접종하여, 34℃ , 5% CO2 에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후, 도너 주 용액 200 μL를 접종하여, 바이러스 배양용 배지를 첨가하여 전량을 10 mL로 하였다.
3) 34℃ , 5% CO2 에서 2 일간 배양하였다.
4) 얻어진 배양물 100 μL 및 항도너 주 혈청 100 μL를 혼합하여, 34℃ 에서 1시간 정치하였다.
5) 새로운 25 cm2 플라스크에 MDCK 세포를 배양하고, 10 mL의 바이러스 배양 용 배지로 배지 교환하고, 상기 4)에서 항도너 주 혈청으로 처리한 배양물 200 μL 전량을 접종하였다.
6) 34℃ , 5% CO2 에서 2 일간 배양하였다.
7) 이후, 참고예 1의 2.8) ~ 16)과 동일하게 플라크를 단리하였다.
또한, 참고예 1과 동일하게 하여, 상기 1. 에서 단리된 플라크의 유전자 분석을 실시하였다.
얻어진 플라크의 유전자 분석 결과를, 이하의 표 2에 나타내었다.
[표 2]
표 중 「I」는 IB/232 (도너 주) 유래이며, 「C」는 CA/7 (항원 주) 유래 인 것을 의미한다.
102 TCID50/mL의 항원 주를 감염시킨 경우, 분석한 플라크에서 게놈 분절의 전체가 CA/7 유래하였다. 한편, 107 TCID50/mL의 항원 주를 감염시킨 경우의 5 번째, 10 번째의 플라크에 관해서는, PB1 분절이 IB/232 유래이며, 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출을 확인하였다. 4 번째, 6 번째 및 8 번째의 플라크에 관해서는, 단일의 플라크를 단리할 수 있지 않았기 때문에 PB1 분절이 IB/232 유래의 것과, CA/7 유래의 것이 혼재하고 있었지만, 플라크의 일부에 있어서 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출을 확인하였다. 항원 주를 고농도로 한 것으로, 유전자 재조합 효율은 40% 정도까지 향상하며, 리소턴트 인플루엔자 바이러스가 작출되기 쉬운 것으로 확인됐다. 플라크를 얻을 때까지의 기간은 약 10일이었다. 또한, 생 바이러스끼리의 혼합 감염에는, 항원 주의 증식을 억제하는 것이 어렵다는 것이 시사되었다.
(실시예 1) 바이러스 주에의 UV 조사 조건의 검토
참고예 2의 결과로부터, 제1의 인플루엔자 바이러스 주(항원 주)에 불활화 바이러스를 사용하기 위해서 항원 주의 UV 불활화 조건을 검토하였다. 인플루엔자 바이러스 주를 CA/7을 사용하였다.
1. UV 조사 실험
1) 106 TCID50/mL의 CA/7을 제조하고, 3.5 cm 디쉬에 2 mL 씩 분주하였다.
2) Spectrolinker XL-1000(Spectronics Corporation, UV 관은 254 nm, 8W × 5 개)의 안에, 1)의 디쉬를 넣고, 디쉬의 뚜껑을 분리하여, 0 ~ 120 초간의 UV 조사를 실시하였다.
3) 정법에 따라, 각 디쉬의 감염가 측정을 실시하였다.
감염가 측정 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
UV 조사 처리에 의해, 항원 주의 바이러스 감염가가 검출 한계 이하로 억제된다. 항원 주에 의한 숙주 세포에의 초기 감염 능력을 유지하기 위해서는, UV 조사 시간은 짧은 것이 바람직하다고 생각된다. 또한, 10초 동안 UV 조사했을 때의 조사량은 500 ~ 1000 J/m2 정도이다.
(실시예 2) 리소턴트 인플루엔자 바이러스 작출
항원 주에 대하여 UV 불활화 처리를 하여, 혼합 감염시 항원 주의 증식을 억제한 경우의, 유전자 재조합 효율을 확인하였다.
1. 사용 바이러스, 사용 항혈청
제1의 인플루엔자 바이러스 주(항원 주): CA/7 A/뉴칼레도니아/20/99 (H1N1) (이하 「NC/20」이라 함)
제2의 인플루엔자 바이러스 주(도너 주): IB/232 항도너 주 혈청은 참고예 1과 동일하다.
2. 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출
1) 바이러스 배양용 배지를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 107 TCID50/mL 도너 주 용액 및 107 TCID50/mL의 항원 주 용액을 제조하였다.
2) 항원 주에 대하여, 실시예 1과 동일한 수단에 의해, Spectrolinker XL-1000을 이용하여, 10초간 UV를 조사하였다.
3) 25 cm2 플라스크에서, MDCK 세포(국제 기탁의 수탁 번호 NITE BP-02014에 명시된 MDCK 세포)를 컨플루언트(약 5 × 106 세포/플라스크)가 될 때까지 배양하여, 배지를 제거하고, 항원 주 용액 200 μL를 접종하여, 34℃ , 5% CO2 에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후, 도너 주 용액 200 μL를 접종하여 바이러스 배양용 배지를 첨가하여 전량을 10 mL로 하였다.
4) 34℃, 5% CO2 에서 2 일간 배양하였다.
5) 상기 4)에서 얻어진 배양물 100 μL 및 항도너 주 혈청 100 μL를 혼합하여, 34℃ 에서 1 시간 정치하였다.
6) 새로운 25 cm2 플라스크에서 MDCK 세포(국제 기탁의 수탁 번호 NITE BP-02014에 명시된 MDCK 세포)를 배양하고, 10 mL의 바이러스 배양용 배지로 배지 교환하고, 상기 5)에서 항도너 주 혈청으로 처리한 배양물 200 μL 전량을 접종하였다.
7) 34℃, 5% CO2 에서 2 일간 배양하였다.
8) 얻어진 배양물의 일부를 원심 분리(9000 rpm, 5 분)하여, 상청을 회수하였다.
9) 원심 상청을, 바이러스 배양용 배지를 이용하여 102 배 103 배, 104 배, 105 배, 106 배, 107 배로 희석하고, MDCK 세포를 컨플루언트까지 배양한 6- well 플레이트에 100 μL/well 접종하였다. 접종은 2매의 플레이트에 대하여 수행하였다.
10) 이후, 참고예 1의 2.10) ~ 16)과 동일하게 플라크를 단리하였다.
또한, 참고예 1과 동일하게 하여, 상기 2. 에서 단리된 플라크의 유전자 분석을 실시하였다.
얻어진 플라크의 유전자 분석 결과를, 이하의 표 4에 나타내었다.
[표 4]
표 중 「I」는 IB/232(도너 주) 유래이며, 「C」는 CA/7 (항원 주) 유래이며, 「N」은 NC/20 (항원 주) 유래인 것을 의미한다.
분석한 전체의 플라크가 리소턴트 인플루엔자 바이러스임을 확인하였다. 대부분의 리소턴트 인플루엔자 바이러스는, 도너 주 유래의 분절과 항원 주 유래의 분절의 비율이 6 : 2 또는 5 : 3 의 리소턴트 인플루엔자 바이러스였다. IB/232 및 CA/7의 혼합 감염의 경우는 5 : 3 리소턴트 인플루엔자 바이러스에 있어서, M 분절을 CA/7 유래하는 플라크가 복수 존재하였다. 또한, 항원 주 NC/20의 경우의 8 번째 플라크에는, 단일 플라크를 단리할 수 있지 않았기 때문에 NP 분절 및 M 분절에서 IB/232 유래와 NC/20 유래의 것이 혼재하고 있었다. 그러나 플라크의 분석 결과에는 PB2 분절, PB1 분절 및 PA 분절이 IB/232 유래 뿐이며, HA 분절, NA 분절 및 NS 분절이 NC/20 유래 뿐인 것으로부터, 동시에 단리된 복수의 플라크는, 모두 리소턴트 인플루엔자 바이러스인 것이 시사되었다. 항원 주에의 UV 불활화 처리를 최적의 조건에서 실시하는 것으로, 유전자 재조합 효율이 100%까지 증가하였다. 또한 플라크를 얻을 때까지의 기간은 약 9 ~ 10 일이었다.
(실시예 3) 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 증식성 확인
작출된 리소턴트 인플루엔자 바이러스를, MDCK 세포(국제 기탁의 수탁 번호 NITE BP-02014에 명시된 MDCK 세포)에 감염시켜 배양하여 증식성을 확인하였다. 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하기 위하여 이용한 도너 주는 IB/232이며, 항원 주는 CA/7이다. 참고예 1의 바이러스 배양용 배지를 이용하여 34℃ , 5% CO2 에서 2 일간 배양하였다. 바이러스 배양 상청의 감염가를 참고 문헌 1에 개시된 방법에 따라 바이러스 증식을 확인하였다. 이용한 3 종의 리소턴트 인플루엔자 바이러스 R # 1 내지 R # 3의 유전자 분석 결과를, 이하의 표 5에 나타낸다.
[표 5]
표 중 「I」는 IB/232 (도너 주) 유래이며, 「C」는 CA/7 (항원 주) 유래인 것을 의미한다.
결과를 도 1에 나타낸다. 원래의 항원 주 CA/7과 비교하여, 리소턴트 인플루엔자 바이러스 R # 1 ~ R # 3는 고감염가를 보여주었다. 따라서, R # 1 ~ R # 3는, CA/7과 비교하여, MDCK 세포에서 증식성이 높은 것이 시사되었다.
(실시예 4) 항체에 의한 유전자 재조합 효율의 변동
제2의 인플루엔자 바이러스 주(도너 주)의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스 주를 선택적으로 불활화시킬 수 있는 항체를 검토하였다.
1.사용 바이러스, 사용 항혈청
제1의 인플루엔자 바이러스 주 (항원 주): CA/7
제2의 인플루엔자 바이러스 주 (도너 주) : IB/232
항도너 주 혈청 : 도너 주의 페럿 감염 혈청 (HI 항체 : 1280)를 RDE 처리하여, 초기 희석 배율을 2 배로 한 것
2. 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출
1) 실시예 2의 2.1) ~ 4)와 동일한 방법으로 배양물을 얻었다.
2) 배양물의 일부를 사용하여, 감염가 측정을 실시하였다.
3) 최종 희석 배율이 10 배, 102 배 103 배, 104 배가 되도록 생리 식염수로 희석한 항도너 주 혈청 100 μL를, 각각 배양 100 μL와 혼합하여, 34℃ 에서 1 시간 정치하였다.
4) 실시예 2의 2.6) ~ 9)와 같은 방법으로 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출을 계속하여, 플라크를 단리하였다.
또한, 참고예 1과 동일하게 하여 상기 2. 에서 단리된 플라크의 유전자 분석을 실시하였다.
얻어진 플라크의 유전자 분석 결과를, 이하의 표 6에 나타내었다.
[표 6]
표 중 「I」는 IB/232 (도너 주) 유래이며, 「C」는 CA/7 (항원 주) 유래 인 것을 의미한다.
배양물의 감염가는 107.57 TCID50/100 μL였다. 이 배양물을, 128 이상의 HI 항체를 가지는 항도너 주 혈청으로 처리한 경우에 있어서, 분석된 전체의 플라크가 리소턴트 인플루엔자 바이러스였다. 한편, 12.8 이하의 HI 항체를 가지는 항도너 주 혈청으로 처리한 경우는, 대부분의 HA 분절 및 NA 분절이 도너 주 유래의 것으로 되며, 도너 주의 항원 단백질을 가지는 인플루엔자 바이러스 주를 선택적으로 에 실활할 수 없다는 것을 확인하였다.
(실시예 5) 배양물의 바이러스 양의 허용 하한값
목적의 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하기 위해 필요한 배양물의 바이러스 양을 검토하였다.
1. 사용 바이러스, 사용 항혈청
제1의 인플루엔자 바이러스 주 (항원 주): CA/7
제2의 인플루엔자 바이러스 주 (도너 주): IB/232
항 도너 주 혈청 : 도너 주의 페럿 감염 혈청(HI 항체 : 1280)를 RDE 처리하여 최종 희석 배율을 2 배로 한 것
2. 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출
1) 실시예 2의 2.1) ~ 4)와 동일한 방법으로 배양물을 얻었다.
2) 배양물의 일부를 사용하여, 감염가 측정을 실시하였다.
3) 바이러스 배양용 배지를 이용하여 10배, 102 배 103 배, 104 배, 105 배, 106 배, 107 배, 108 배가 되도록 희석한 배양물 100 μL를, 각 항 도너 주 혈청 100 μL와 혼합하여 34℃ 에서 1시간 정치하였다.
4) 실시예 2의 2.6) ~ 9)와 같은 방법으로 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출을 계속하여, 플라크를 단리하였다. 단, 104 배 이상에 배양물을 희석한 조건에 관해서는 플라크가 형성되지 않고, 그 후의 작업을 하지 않았다.
또한, 참고예 1과 동일하게 하여 상기 2. 에서 단리된 플라크의 유전자 분석을 실시하였다.
얻어진 플라크의 유전자 분석 결과를, 이하의 표 7에 나타내었다.
[표 7]
표 중 「I」는 IB/232 (도너 주) 유래이며, 「C」는 CA/7 (항원 주) 유래 인 것을 의미한다.
미희석의 배양물 감염가는 107.57 TCID50/100 μL였다. 배양물 중의 바이러스 양이 104.57 TCID50 이상인 경우, 플라크 형성을 확인하였다. 한편, 배양물 중의 바이러스 양이 103.57 TCID50 이하인 경우, 플라크 형성은 확인되지 않았다. 플라크가 형성되는 조건은 분석된 전체의 플라크가 리소턴트 인플루엔자 바이러스였다.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명의 리소턴트 인플루엔자 바이러스의 작출 방법에 의하면, 조기에 더욱 효율적으로 유전자 재조합체인 리소턴트 인플루엔자 바이러스를 작출하는 것이 가능해진다. 본 발명의 방법에 의하면, 고증식성을 나타내는 인플루엔자 바이러스를 조기에 더욱 효율적으로 작출할 수 있기 때문에 인플루엔자 백신 제조용 종자 바이러스가 빠르게 작출 가능해진다.
Claims (11)
- 이하의 공정을 포함하는 제1의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질로서, 헤마글루티닌(Hemaglutinine, HA) 또는 뉴라미니다제(Neuraminidase, NA)를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법:
1) 제1의 인플루엔자 바이러스 주에, 감염능을 가지며, 바이러스 증식성이 상실 또는 저하하는 조사량으로 자외선을 조사하는 공정;
2) MDCK 세포(Madin-Darby canine kidney cell)에, 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 감염시키는 공정;
3) 제1의 인플루엔자 바이러스 주와 제2의 인플루엔자 바이러스 주가 감염된 MDCK 세포를 배양하여 배양물을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 배양물로부터 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질로서, 헤마글루티닌(Hemaglutinine, HA) 또는 뉴라미니다제(Neuraminidase, NA)를 가지는 인플루엔자 바이러스를 실활시키는 공정;
5) 공정 4)의 후에, 재조합 인플루엔자 바이러스를 회수하는 공정.
- 제1항에 있어서,
상기 공정 4)는 공정 3)에서 얻어진 배양물에, 제2의 인플루엔자 바이러스 주의 항원 단백질에 대한 항체를 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 공정 4)는 공정 3)에서 얻어진 배양물에 제2의 인플루엔자 바이러스 주에 대한 항혈청을 첨가하여 인큐베이트하는 것을 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
- 삭제
- 제3항에 있어서,
상기 항혈청은 제 2 인플루엔자 바이러스주에 감염된 포유류로부터 회수한 혈액으로부터 취득한 감염 혈청인 것을 특징으로 하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공정 2)에 있어서, 제1의 인플루엔자 바이러스 주를 1 × 10-6 ~ 10 moi로 MDCK 세포에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공정 2)에 있어서, 제1의 인플루엔자 바이러스 주를 MDCK 세포에 감염시킨 후, 제2의 인플루엔자 바이러스 주를 숙주에 감염시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공정 5)에 있어서, 재조합 인플루엔자 바이러스로부터, 목적의 재조합 인플루엔자 바이러스를 선택하는 것을 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2의 인플루엔자 바이러스 주는 인플루엔자 A 형 바이러스 H1N1 아형 또는 H3N2 아형인 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법. - 삭제
- 삭제
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