JP6335399B1 - リアソータントインフルエンザウイルス作出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.以下の工程を含む、第1のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を含むリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法:
1)第1のインフルエンザウイルス株に、初期感染能を有し、かつウイルス増殖性が喪失又は低下する照射量で紫外線を照射する工程;
2)宿主に、第1のインフルエンザウイルス株と第2のインフルエンザウイルス株を感染させる工程;
3)第1のインフルエンザウイルス株と第2のインフルエンザウイルス株が感染した宿主を培養して、培養物を得る工程;
4)工程3)において得られた培養物から、第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルスを失活させる工程;
5)工程4)の後に、リアソータントインフルエンザウイルスを回収する工程。
2.工程4)が、工程3)において得られた培養物に、第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質に対する抗体を接触させることを含む、前項1に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
3.工程4)が、工程3)において得られた培養物に、第2のインフルエンザウイルス株に対する抗血清を添加してインキュベートすることを含む、前項1に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
4.抗血清の最終希釈倍率2〜1000倍である、前項3に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
5.抗血清が感染血清である、前項3に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
6.工程2)において、第1のインフルエンザウイルス株を1×10−6〜10のmoiで宿主に接触させて感染させる、前項1〜5のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
7.工程2)において、第1のインフルエンザウイルス株を宿主に感染させた後に、第2のインフルエンザウイルス株を宿主に感染させる、前項1〜6のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
8.工程5)において、リアソータントインフルエンザウイルスから、目的のリアソータントインフルエンザウイルスを選択することを含む、前項1〜7のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
9.第2のインフルエンザウイルス株が、インフルエンザA型ウイルスH1N1亜型又はH3N2亜型である、前項1〜8のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
10.前項1〜9のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法により作出された、リアソータントインフルエンザウイルス。
11.第1のインフルエンザウイルス株由来の抗原性タンパク質を含み、第2のインフルエンザウイルス株のバックボーンタンパク質を含む、前項10に記載のリアソータントインフルエンザウイルス。
12.宿主が培養細胞である、前項1〜9のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
13.宿主が発育鶏卵である、前項1〜9のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
本工程では、第1のインフルエンザウイルス株に紫外線を照射し、不活化する。紫外線の照射量は、紫外線照射後の第1のインフルエンザウイルス株が宿主への初期感染能は有しているが、感染後のウイルス増殖性が喪失又は低下している程度であることが好ましい。感染後のウイルス増殖性の喪失又は低下とは、第1のインフルエンザウイルスを単独で宿主に感染させた際に、宿主内でのウイルスの増殖性が確認されない、又は紫外線照射を行っていない第1のインフルエンザウイルス株と比較してウイルス増殖性が低下していることを意味する。ウイルス増殖性は、ウイルス感染価、PFU(Plaque Forming Unit)等の公知の指標を用いて評価することができる。また、紫外線照射を行った後、第1のインフルエンザウイルス株を宿主に感染させる場合は、宿主への感染能、すなわち初期感染能を有している必要がある。初期感染能がある状態とは、宿主が培養細胞である場合、紫外線照射したウイルスによるCPE(cytopathic effect)が観察されることを意味する。本工程では、Spectrolinker XL−1000(Spectronics Corporation)のTime Modeにおいて1〜60秒間、好ましくは5〜50秒間、更に好ましくは10〜40秒間、更に好ましくは10〜30秒間紫外線照射を行った場合と同等の紫外線照射量を第1のインフルエンザウイルス株に照射することが好ましい。かかる紫外線照射のために用いる装置(紫外線強度、光源からの距離等は以下実施例記載)及び照射時間等の照射条件は一例であり、当該照射条件と同程度の紫外線照射量となるのであれば、これらの条件は適宜調整・変更が可能である。上記条件の紫外線照射量であれば、宿主への初期感染能を有しているが、ウイルス増殖性が喪失又は低下しているインフルエンザウイルスを効率良く得ることができるため好ましい。本発明においては、宿主への初期感染能を有したまま、第1のインフルエンザウイルス株のウイルス増殖性を喪失又は低下させることにより、宿主内での遺伝子組換え効率を向上させ得る。
第1のインフルエンザウイルス株と、第2のインフルエンザウイルス株の宿主への感染は、同時であっても良いし、同時でなくてもよい。好ましくは、第1のインフルエンザウイルス株を宿主に感染させた後、第2のインフルエンザウイルス株を感染させる。宿主へのインフルエンザウイルス株の感染は、宿主とインフルエンザウイルス株を接触させることにより行う。第1のインフルエンザウイルス株は、好ましくは1×10−6〜10のmoi、更に好ましくは0.001〜1のmoi、更に好ましくは0.1〜1のmoiで宿主に接触させることが好ましい。第2のインフルエンザウイルス株は、好ましくは0.001〜10のmoi、更に好ましくは0.01〜1のmoi、更に好ましくは0.1〜1のmoiで、宿主に接触させることが好ましい。従来は、宿主にインフルエンザウイルスを共感染させるには、高い濃度でウイルスを宿主に接触させて感染させる必要があった。しかしながら、本発明においては、低い濃度であってもインフルエンザウイルスが宿主に共感染し、遺伝子組換え体を効率良く作出可能である。なお、第1のインフルエンザウイルス株のmoiは、紫外線を照射する前の値である。インフルエンザウイルスの感染価(TCID50/mL)は、国立感染症研究所著「インフルエンザ診断マニュアル(第3版、平成26年9月)」の「Part IV」(以下「参考文献1」と称する)に開示される方法に従って確認でき、moiは感染価を細胞数で割ることにより算出できる。
本工程の培養により宿主内でインフルエンザウイルスがリアソートされる。宿主の培養条件、例えば培養温度等は、宿主内でインフルエンザウイルスが増殖可能な条件であればいかなる条件であってもよい。宿主が培養細胞である場合は、培養に用いる培地は液体培地が好ましい。液体培地にはしばしば動物由来の血清が添加されるが、動物由来の血清は目的のインフルエンザウイルスの増殖を阻害する因子を含む可能性が否定できないため、当該因子を含まない無血清培地を用いることがより好ましい。 無血清培地としては、イーグルMEM培地(日水製薬株式会社)、Opti PRO SFM(Thermo Fisher Scientific)、VP−SFM(Thermo Fisher Scientific)、EX−CELL MDCK(SAFC Biosciences)、UltraMDCK(Lonza)、ProVero 1(Lonza)、BalanCD MDCK(Irvine Scientific)等が例示される。培養時間は、好ましくは1〜5日間、更に好ましくは2〜3日間程度である。本工程においては、培養後に培養物が得られる。当該培養物中には、宿主内でリアソートされたリアソータントインフルエンザウイルス及び第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルスが含まれる。前記ウイルスは、宿主が発育鶏卵の場合は主に尿膜腔液中に含まれており、宿主が培養細胞の場合は主に培養上清に含まれる。
当該ウイルスの失活は、物理的手法、化学的手法、その他のいかなる手法を用いて達成してもよいが、好ましくは培養物中の第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルスに、当該抗原タンパク質に結合する中和抗体を接触させて処理することにより達成される。
本工程では、前記工程4)作出されたリアソータントインフルエンザウイルスを回収する。本工程において、回収されたリアソータントインフルエンザウイルスから、さらに目的のリアソータントインフルエンザウイルスを選択してもよい。目的のリアソータントインフルエンザウイルスはプラーク法により単離して、ゲノム分節を解析することにより選択できる。プラーク法及びゲノム分節の解析方法は、公知の手法を用いることができる。
抗原株に紫外線照射(以下、UV照射)を行わずに、生ウイルスを用いて、リアソータントインフルエンザウイルスの作出を行った。
第1のインフルエンザウイルス株(抗原株):A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09(以下「CA/7」と称する)
第2のインフルエンザウイルス株(ドナー株):A/茨城/N12232/2012(H3N2)(以下「IB/232」と称する)
抗ドナー株血清:ドナー株のフェレット感染血清(HI抗体価:1280)をRDE処理し、最終希釈倍率2倍にしたもの
1)グルタミン(4mM)、グルコース(4.6g/L)、炭酸水素ナトリウム(20mM)、0.1×TrypLE Selectを含有するイーグルMEM培地(以下「ウイルス培養用培地」と称する)を用いて、ドナー株及び抗原株の各インフルエンザウイルス溶液を調製した。ドナー株のインフルエンザウイルス溶液を、以下「ドナー株溶液」といい、抗原株の各インフルエンザウイルス溶液を「抗原株溶液」ということとする。上記ウイルス培養用培地を用いて105TCID50/mLのドナー株溶液と、104TCID50/mL、103TCID50/mL、102TCID50/mL、101TCID50/mLの抗原株溶液をそれぞれ調製した。なお、インフルエンザウイルス感染価(TCID50/mL)は、参考文献1に開示される方法に従って確認した。
2)25cm2フラスコで、MDCK細胞(国際寄託の受託番号NITE BP−02014で特定されるMDCK細胞)をコンフルエント(約5×106細胞/フラスコ)になるまで培養した。その後、培地を10mLのウイルス培養用培地に交換し、ドナー株溶液100μLと各濃度の抗原株溶液100μLを各々同時に接種した。
3)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
4)得られた培養物100μLと、抗ドナー株血清100μLを混合し、34℃にて1時間静置した。
5)新たな25cm2フラスコでMDCK細胞を培養し、培地を10mLのウイルス培養用培地で交換し、上記4)にて抗ドナー株血清にて処理した培養液200μL全量を接種した。
6)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
7)得られた培養物100μLに対し、上記4)〜6)の操作を再度繰り返した。
8)得られた培養物を遠心分離(9000rpm、5分間)し、上清を回収した。
9)遠心上清をウイルス培養用培地で103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍に希釈し、MDCK細胞をコンフルエントまで培養した6−wellプレートに100μL/wellで接種した。接種は2枚のプレートに対して行った。
10)34℃、5%CO2にて30分間培養した。
11)プラークアッセイと同様の方法で0.8%アガロース含有MEM培地(グルタミン(4mM)、0.1×TrypLE Select含有)を3mL/well重層した。安全キャビネット内で乾燥させた後、インキュベーター内での培養を開始した。
12)34℃、5%CO2にて3日間培養した。
13)1.0%アガロース含有MEM培地(ニュートラルレッド含有)を2mL/well重層し、安全キャビネット内で乾燥した。
14)新たな6−wellプレートでMDCK細胞を培養し、2mL/wellのウイルス培養用培地で培地を交換し、各wellにプラークを単離した。ピックアップはフィルター付の先切りチップを用いて行った。
15)34℃、5%CO2にて3日間培養した。
16)単離したプラークの培養液を遠心分離(9000rpm、5分間)し、上清を−80℃にて保存した。
上記2.において単離したプラークの培養上清からRNAを抽出し、逆転写をしてcDNAを合成し、定法に従ってPCRによりウイルスの全ゲノム分節を増幅して簡易精製した。これを検体として遺伝子配列解析を行い、各ゲノム分節がドナー株と抗原株のどちらに由来するかを判定した。
本参考例では抗原株のウイルス量が遺伝子組換え効率へ与える影響を検討した。なお、使用ウイルス及び使用抗血清は、参考例1と同様である。
1)ウイルス培養用培地を用いて、107TCID50/mLのドナー株溶液を調製するとともに、102TCID50/mL、107TCID50/mLの抗原株溶液をそれぞれ調製した。
2)25cm2フラスコでMDCK細胞(国際寄託の受託番号NITE BP−02014で特定されるMDCK細胞)をコンフルエント(約5×106細胞/フラスコ)になるまで培養し、培地を取り除き、抗原株溶液200μLを接種して、34℃、5%CO2にて1時間培養した。その後、ドナー株溶液200μLを接種して、ウイルス培養用培地を添加して全量を10mLとした。
3)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
4)得られた培養物100μLと抗ドナー株血清100μLを混合し、34℃にて1時間静置した。
5)新たな25cm2フラスコでMDCK細胞を培養し、10mLのウイルス培養用培地で培地交換し、上記4)にて抗ドナー株血清で処理した培養物200μL全量を接種した。
6)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
7)以後、参考例1の2.8)〜16)と同様にしてプラークを単離した。
参考例2の結果から、第1のインフルエンザウイルス株(抗原株)に不活化ウイルスを用いるために抗原株のUV不活化条件を検討した。インフルエンザウイルス株はCA/7を用いた。
1)106TCID50/mLのCA/7を調製し、3.5cmディッシュに2mLずつ分注した。
2)Spectrolinker XL−1000(Spectronics Corporation、UV管は254nm、8W×5本)の中に、1)のディッシュを入れ、ディッシュの蓋を外して、0〜120秒間のUV照射を行った。
3)定法に従って、各ディッシュの感染価測定を行った。
抗原株についてUV不活化処理を行い、混合感染時の抗原株の増殖を抑えた場合の、遺伝子組換え効率を確認した。
第1のインフルエンザウイルス株(抗原株):CA/7、A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)(以下「NC/20」と称する)
第2のインフルエンザウイルス株(ドナー株):IB/232
抗ドナー株血清は、参考例1と同様である。
1)ウイルス培養用培地を用いて、参考例1と同様に107TCID50/mLのドナー株溶液及び107TCID50/mLの抗原株溶液を調製した。
2)抗原株に対して、実施例1と同様の手法により、Spectrolinker XL−1000を用いて、10秒間UVを照射した。
3)25cm2フラスコにて、MDCK細胞(国際寄託の受託番号NITE BP−02014で特定されるMDCK細胞)をコンフルエント(約5×106細胞/フラスコ)になるまで培養し、培地を取り除き、抗原株溶液200μLを接種して、34℃、5%CO2にて1時間培養した。その後、ドナー株溶液200μLを接種してウイルス培養用培地を添加して、全量を10mLとした。
4)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
5)上記4)にて得られた培養物100μLと抗ドナー株血清100μLを混合し、34℃にて1時間静置した。
6)新たな25cm2フラスコにてMDCK細胞(国際寄託の受託番号NITE BP−02014で特定されるMDCK細胞)を培養し、10mLのウイルス培養用培地で培地交換し、上記5)にて抗ドナー株血清で処理した培養物200μL全量を接種した。
7)34℃、5%CO2にて2日間培養した。
8)得られた培養物の一部を遠心分離(9000rpm、5分間)し、上清を回収した。
9)遠心上清を、ウイルス培養用培地を用いて102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍に希釈し、MDCK細胞をコンフルエントまで培養した6−wellプレートに、100μL/well接種した。接種は2枚のプレートに対して行った。
10)以後、参考例1の2.10)〜16)と同様にしてプラークを単離した。
作出されたリアソータントインフルエンザウイルスを、MDCK細胞(国際寄託の受託番号NITE BP−02014で特定されるMDCK細胞)に感染させて培養し、増殖性を確認した。リアソータントインフルエンザウイルスを作出するために用いたドナー株はIB/232であり、抗原株はCA/7である。参考例1のウイルス培養用培地を用いて、34℃、5%CO2にて2日間培養した。ウイルス培養上清の感染価を参考文献1に開示される方法に従って、ウイルス増殖性を確認した。用いた3種のリアソータントインフルエンザウイルスR#1〜R#3の遺伝子解析結果を、以下の表5に示す。
第2のインフルエンザウイルス株(ドナー株)の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルス株を選択的に失活させうる抗体価を検討した。
第1のインフルエンザウイルス株(抗原株):CA/7
第2のインフルエンザウイルス株(ドナー株):IB/232
抗ドナー株血清:ドナー株のフェレット感染血清(HI抗体価:1280)をRDE処理し、初期希釈倍率を2倍にしたもの
1)実施例2の2.1)〜4)と同様の方法により、培養物を得た。
2)培養物の一部を使用して、感染価測定を行った。
3)最終希釈倍率が10倍、102倍、103倍、104倍になるよう生理食塩水で希釈した抗ドナー株血清100μLを、それぞれ培養物100μLと混合して34℃にて1時間静置した。
4)実施例2の2.6)〜9)と同様の方法にてリアソータントインフルエンザウイルスの作出を続け、プラークを単離した。
表中「I」はIB/232(ドナー株)由来であり、「C」はCA/7(抗原株)由来であることを意味する。
目的のリアソータントインフルエンザウイルスを作出するために必要な培養物のウイルス量を検討した。
第1のインフルエンザウイルス株(抗原株):CA/7
第2のインフルエンザウイルス株(ドナー株):IB/232
抗ドナー株血清:ドナー株のフェレット感染血清(HI抗体価:1280)をRDE処理し、最終希釈倍率を2倍にしたもの
1)実施例2の2.1)〜4)と同様の方法により、培養物を得た。
2)培養物の一部を使用して、感染価測定を行った。
3)ウイルス培養用培地を用いて10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍になるよう希釈した培養物100μLを、それぞれ抗ドナー株血清100μLと混合して34℃にて1時間静置した。
4)実施例2の2.6)〜9)と同様の方法にてリアソータントインフルエンザウイルスの作出を続け、プラークを単離した。ただし、104倍以上に培養物を希釈した条件についてはプラークが形成されず、その後の操作を行わなかった。
Claims (8)
- 以下の工程を含む、第1のインフルエンザウイルス株のヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)を含むリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法:
1)第1のインフルエンザウイルス株に、初期感染能を有し、かつウイルス増殖性が喪失又は低下する照射量で紫外線を照射する工程;
2)宿主に、第1のインフルエンザウイルス株を感染させた後に第2のインフルエンザウイルス株を感染させる工程;
3)第1のインフルエンザウイルス株と第2のインフルエンザウイルス株が感染した宿主を培養して、培養物を得る工程;
4)工程3)において得られた培養物から、第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルスを選択的に失活させる工程;
4−2)工程4)の培養物をさらに宿主に接触させ、感染した宿主を培養し、第1のインフルエンザウイルス株のHA及びNAを含む目的のリアソータントウイルスを選択的に増殖させる工程:
5)工程4−2)の後に、リアソータントインフルエンザウイルスを回収する工程。 - 工程4)の第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルスを選択的に失活させる工程が、工程3)において得られた培養物に、第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質に対する抗体を接触させることを含む、請求項1に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
- 工程4)の第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を有するインフルエンザウイルスを選択的に失活させる工程が、工程3)において得られた培養物に、第2のインフルエンザウイルス株に対する抗血清を添加することを含む、請求項1に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
- 抗血清の最終希釈倍率2〜1000倍である、請求項3に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
- 抗血清が感染血清である、請求項3に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
- 工程2)において、第1のインフルエンザウイルス株を1×10−6〜10のmoiで宿主に接触させて感染させる、請求項1〜5のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
- 工程5)において、リアソータントインフルエンザウイルスから、第1のインフルエンザウイルス株のHA及びNAを含み、第2のインフルエンザウイルス株の抗原タンパク質を含まない、目的のリアソータントインフルエンザウイルスを選択することを含む、請求項1〜6のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
- 第2のインフルエンザウイルス株が、インフルエンザA型ウイルスH1N1亜型又はH3N2亜型である、請求項1〜7のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザウイルスを作出する方法。
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改訂二版 ウイルス実験学 各論, JPN6017045791, 28 February 1982 (1982-02-28), pages p. 289-290, 321-323 * |
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