JP3158157B2 - 無蛋白培養における生物製剤の製造法 - Google Patents

無蛋白培養における生物製剤の製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、高増殖再集合体および弱毒ウイルスの製造
を含む、継代を必要としない比較的高収量の、実質的に
あらゆるインフルエンザウイルスを含む種々のウイルス
を増殖させるための方法に関する。さらに、本発明はそ
れらウイルスからのワクチンの製造法を提供する。本発
明は多様なウイルスの培養を支持することができる細胞
バイオマスにも関する。本発明は該細胞バイオマスを使
用することによるウイルス、ウイルス抗原、および組換
え蛋白の製造にも関する。
発明の背景 効率的なワクチン製造にはウイルスが大量に増殖し、
宿主系から高収量で産生されることが必要である。異な
るタイプのウイルスは許容される収量を得るために異な
る増殖条件を必要とする。したがって、ウイルスが増殖
する宿主は大いに重要である。ウイルスタイプの機能と
して、ウイルスは一次組織培養細胞、樹立細胞系、また
はニワトリの有胚卵のような有胚卵中で増殖してよい。
ウイルス株が増殖する培養条件も、ウイルス株の許容
される高収量を達成するために大いに重要である。した
がって、所望のウイルス株の収量を最大にするには、所
望のウイルス株の産生に有利な環境を得るために、宿主
系と培養条件の両方を特に適合させなければならない。
したがって、種々のウイルス株の許容される高収量を達
成するために、数多くの異なるウイルスに最適な増殖条
件を提供する系が必要である。多くのウイルスは非常に
特異的な宿主系に限定されており、そのいくつかはウイ
ルス産生にとって非常に効率が悪い。
ウイルス宿主系として用いる哺乳動物細胞のいくつか
はウイルスを高収量で産生するが、そのような細胞は腫
瘍誘発特性を有するため、それらをワクチン製造に使用
する上で規制的制約がある。事実、世界保健機構（WH
O）の適用ガイドラインはウイルスワクチン製造用に２
〜３の細胞系しか認められていないことを示している。
培養液に加える動物またはヒト供給源由来の蛋白添加物
および／または細胞培養中の血清を使用することから生
じる問題（すなわち、バッチの違いによる品質および組
成物の差、およびマイコプラズマ、ウイルス、またはBS
E物質が混入する危険性はよく知られている。一般に、
血清、またはアルブミン、トランスフェリン、もしくは
インスリンのような血清由来物質は、培養およびそれか
ら製造される生物学的生成物に混入しうる望ましくない
物質を含有するかも知れない。さらに、ヒト血清由来添
加物は、血清によって伝染し得る肝炎やHIVのようなす
べての既知のウイルスについて検査する必要がある。ウ
シ血清およびウシ血清由来生成物、例えば、トリプシン
にはBSE混入の危険性がある。さらに、すべての血清由
来生成物にはさらに未知の物質が混入している危険性が
ある。したがって、血清または他の血清由来化合物を必
要としない培養条件および効率的な宿主系を得るために
多くの試みがなされている。
時間の経過と共に、多くのウイルスがその血清型を変
化させる。ウイルスの血清型のあらゆる変化に対応し
て、新たなウイルス血清型に対する免疫を誘導するため
にワクチンを変える必要がある。特定の新たなウイルス
血清型に対するワクチンによってもたらされる防護効率
を維持するために、その新たな血清型に対する免疫をも
たらす新規ワクチンを製造する必要がある。新規ワクチ
ンを製造するには新たなウイルス株を増殖させなければ
ならない。多くのウイルス、特にインフルエンザウイル
スは血清型が非常に急速に変化するため、その培養系は
ビリオンを含むウイルス抗原を、そのウイルスの感染シ
ーズン中にワクチンが製造できる十分な速さで大量に製
造できなければならない。
多くの場合、新しいウイルス株の最適増殖条件はそれ
らの前のものを増殖させるのに用いる条件と異なる。し
たがって、新しいウイルス株の最適な増殖に必要なもの
を得るために容易に調整しうる培養系が強く望まれてい
る。さらに、新しい株の高生産量を得ることの要求とい
った実際的な動機から、インフルエンザのようなウイル
スの大規模生産に応用可能な方法が強く望まれる。
血清型を頻繁に変化させるウイルスの１つの典型的な
例はインフルエンザウイルスである。インフルエンザは
ヒトの主要な呼吸器病であり、それにより毎年数千人が
死亡している。
インフルエンザウイルスには大きく３つのタイプ、Ａ
型、Ｂ型、およびＣ型がある。これらのタイプはそれら
の内部蛋白間の血清学的交差反応性がないことによって
定義される。さらに、インフルエンザＡ型ウイルスは、
それらの糖蛋白、血球凝集素（HA）およびノイラミニダ
ーゼ（NA）蛋白の抗原性の違いに基づいてサブタイプに
分類される。ヒトは主としてインフルエンザＡ、Ｂ、お
よびＣ型ウイルスの感染によって生じる疾患に感受性で
ある。
現在、ヒトにおけるインフルエンザ感染の最も重要な
原因はＢ型、およびインフルエンザＡ型のサブタイプH1
N1およびH3N2によるものである。したがって、Ｂ型およ
びインフルエンザＡ型のサブタイプH1N1およびH3N2の抗
原は、本発明のインフルエンザワクチン内に一般的に組
み入れられる抗原である。現在利用可能なワクチンの防
御率は75〜90％の範囲である。
インフルエンザHA抗原はウイルスに対する宿主の防御
的免疫応答の主な標的である。有効なインフルエンザワ
クチンの開発における問題の１つは、HA蛋白をコードす
る遺伝子の突然変異率が高いため、その抗原性が頻繁に
変化することによって生じる。したがって、有効なワク
チンを製造するために、最近のインフルエンザ分離株か
ら新しいワクチンを製造しなければならないことが多
い。
新しいウイルス分離株を回収する通常の方法には、咽
頭スワブまたは同様の供給源を回収し、次いで、ニワト
リ有胚卵中で分離株を培養することが含まれる。卵中で
の初期培養は困難かも知れないが、ウイルスはその卵宿
主に適応し、卵中でウイルスの大規模生産が可能であ
る。
インフルエンザワクチンの通常の製造法には、常にニ
ワトリ有胚卵中でのウイルスの増殖が含まれてきた。次
に、この方法で増殖したウイルスを用いて、弱毒生ウイ
ルス、死全ウイルス、またはサブユニットワクチンが製
造される。しかしながら、ニワトリ有胚卵を含む、イン
フルエンザワクチンを製造するための通常の方法論は、
１週間に数千個もの卵を取り扱うことを含め、非常にや
っかいである。通常の操作では、卵を明かりに透かして
検査し、殻を殺菌し、各卵の尿膜腔内に少量のウイルス
を注射により接種しなければならない。次に、注射され
た卵を33〜37℃で48〜72時間インキュベーションし、再
度明かりに透かして検査し、一夜冷蔵し、次いで開けて
尿膜液を採取する。次に、採取した液を濾過および／ま
たは遠心して不純物を除した後、さらに精製処理を行
う。次に、確実に卵蛋白を含まないようにするために、
徹底的に精製する必要がある（Requirements For Inact
ivated Influenza Vaccine,World Health Organization
Technical Report Series,384（1966））。
通常のニワトリ胚操作では、インフルエンザワクチン
１用量を製造するのに１〜２個の卵が必要である。した
がって、ワクチン100万用量を製造するには100万個以上
の卵胚を処理する必要がある。要するに、インフルエン
ザウイルスワクチンの通常の製造法には、自動化が困難
な、したがって集約的な労働を要し、時間がかかり、高
価であり、汚染が生じる多くの工程が含まれる。したが
って、集約的な労働が必要でなく、製造する用量あたり
の必要な生物組織が少なくて済み、汚染されにくい方法
が求められている。
インフルエンザウイルスワクチンを製造するために、
一次ニワトリ胚細胞（「CEC」）または樹立哺乳動物細
胞系を用いる標準的組織培養技術を適応させる試みが数
多くなされている。これらの試みは、数多くのウイルス
株が通常の培養中では複製されないために成功しなかっ
た。いくつかの株では、Madin−Darbyイヌ腎（DMCK）系
のような樹立哺乳動物細胞系を用いることで複製がより
うまくいった。それにもかかわらず、多くのウイルス株
はMDCK系中で複製されないであろう。さらに、ヒト用ワ
クチンの製造に潜在的発癌性を有する細胞を使用するこ
とに関連して副作用が生じる恐れがあるため、この目的
に、高度に形質転換された細胞系であるMDCKを用いるこ
とは除外されてきた。
一次組織培養または樹立細胞系で多くのインフルエン
ザ株を増殖させる上での主な困難さの１つとして、宿主
細胞中でインフルエンザ血球凝集素が蛋白分解により開
裂して活性化する必要があることが挙げられる。該ウイ
ルスHA0前駆体のHA1およびHA2サブフラグメントへの開
裂は、ウイルスが新たな細胞に感染するのに必要な工程
である。したがって、宿主細胞中の新しいウイルス粒子
が新しい細胞に感染することができるビリオンに変換す
るには開裂が必要である。開裂は、統合HA0膜蛋白が感
染細胞の小胞体から原形質膜に輸送される間に起きるこ
とが知られている。輸送過程で、血球凝集素は、前駆体
HAの、アミノ末端フラグメントHA1とカルボキシ末端HA2
への酵素分解的開裂を含む、一連の共−および後−翻訳
修飾を受ける。
インフルエンザビリオンが開裂または非開裂いずれか
のHA糖蛋白を含むことがわかっているという事実は、開
裂がウイルスの組立と感染細胞からの放出に必ずしも必
要でないことを示している。しかし、HAの開裂は新しい
宿主細胞の感染開始に特に必要である。
非開裂HAは細胞表面のノイラミン酸含有レセプターへ
のウイルスの吸着に関与し得ることが知られているが、
感染サイクルの次の工程である融合には関与できない。
開裂によるHA2の疎水性アミノ末端の暴露は、それが標
的細胞内に挿入され、それによりウイルスと標的細胞膜
との間にブリッジを形成するのを可能にするために必要
である。この後に、２つの膜の融合とウイルスの標的細
胞への侵入が起きる。
血球凝集素の蛋白分解的活性化は、多くの酵素、およ
びプロインスリン、プロゲスチン、ならびにプロオピオ
メラノコルチンのようなホルモン前駆体を用いて観察さ
れたパターンに従う。これにはトリプシン様エンドプロ
テアーゼによるアルギニン残基の開裂が含まれる。利用
可能な証拠は、エンドプロテアーゼがカルシウム依存性
で、最適pHが中性である細胞内プロテアーゼであること
を示唆する。しかしながら、これらの観察結果の他は、
この細胞内酵素の性状についてはほとんどわかっていな
い（Klenkらの、「The Molecular Biology of Influenz
a Virus Pathogenicity」、Adv.Virus Res.,34:247−28
1（1988））。
活性化プロテアーゼは細胞酵素であるため、感染細胞
のタイプによってインフルエンザ血球凝集素が開裂され
るかどうかが決定される。哺乳動物インフルエンザウイ
ルスおよび非病原性トリインフルエンザウイルスの血球
凝集素は限られた数の細胞タイプの蛋白分解的開裂にの
み感受性である。一方、H5〜H7サブタイプ間の病原性ト
リウイルスの血球凝集素は、広範囲の種々の宿主細胞に
存在するプロテアーゼによって開裂される。したがっ
て、ウイルスの病原性特性に対応し得る血球凝集素開裂
能の違いによって宿主範囲に違いが生じる。
開裂能の違いは血球凝集素の開裂部位のアミノ酸配列
の違いによる。配列分析から、非病原性トリおよびすべ
ての哺乳動物インフルエンザウイルスの血球凝集素分子
のHA1およびHA2フラグメントが単一アルギニンによって
結合していることがわかっている。反対に、病原性トリ
株は共通の特徴であるリジン−アルギニンまたはアルギ
ニン−アルギニンを有する開裂部位に数個の塩基性アミ
ノ酸配列を有する。すべてのインフルエンザウイルスの
血球凝集素は、該塩基性アミノ酸の除去を生じる同じ一
般的メカニズムによって開裂する。
広範囲のインフルエンザウイルス株の開裂に不可欠な
プロテアーゼ活性は有胚卵および全ニワトリ胚に相当す
る細胞凝集物中で利用可能である。しかしながら、ニワ
トリ胚から調製した通常のCEC培養では全ニワトリ胚の
プロテアーゼ活性の一部しか得られないため、限られた
範囲のインフルエンザウイルス株しか複製されない。CE
C培養を調製するための標準的方法には、頭部および内
部臓器の回収と、複数のトリプシン処理工程が含まれ
る。これらの方法は、特に、多くのインフルエンザ株が
複製されることが知られている、脳、心臓、肺、肝臓、
および腎細胞の減少を生じる（Scholtissekらの、「Mul
tiplication of Influenza A Viruses with Cleavage a
nd Non−cleavable Hemagglutinin in Chicken Embry M
embranes or Organes,and Cell Cultures Derived Ther
efrom」、J.Gen.Virol.,69,2155−2164（1988））。し
たがって、標準的方法では主に繊維芽細胞からなる高度
に選択された細胞ポピュレーションを生じるため、この
方法が支持しうるウイルス株は制限される。
インフルエンザウイルス産生を改善する試みが以前に
なされてきた。例えば、標準細胞培養中の多くのインフ
ルエンザＡ株の限られた複製は、組織培養液にトリプシ
ンを加えることによって改善されることが報告されてい
る。例えば、トリプシンの添加によりCEC培養中で増殖
した種々の株の感染性は有意に増加する（Lazarowitzら
の、「Enhancement of the Infectivity of Influenza
and ViIruses by Proteolytic Cleavage of the Hemagg
lutinin Polypeptide」、Virology,68:440−454（197
5））。さらに、Stieneke−Grberら（「Influenza Vi
rus Hemagglutinin with Multibasic Site is Activate
d by Furin,a Subtilisin−like Endoprotease」、EMBO
J.,11:2407−2414（1992））は、MDBK細胞中のHA活性
化酵素がフリン様プロテアーゼであることを確認した。
そのような酵素はヒトおよびマウス組織から分離され、
真核細胞サブチリシン様エンドプロテアーゼのニューフ
ァミリーを構成する。
他のワクチン製造法を開発する別の試みがなされてき
た。米国特許第4,783,411号（Gabliks）は金魚細胞培養
でインフルエンザワクチンを製造する方法について考察
している。その樹立後にGabliks培養に感染させるため
のウイルス粒子がニワトリ胚培養または感染CD−１株マ
ウスから得られた。該ウイルスをそのような金魚細胞培
養で少なくとも２回継代し、生ワクチンとして使用して
よい弱毒ウイルスが得られる。
米国特許第4,500,513号（Brownら）は、トリプシン、
キモトリプシン、またはカルボキシペプチダーゼのよう
な蛋白加水分解酵素が部分感染培養と共にインキュベー
ションされ、さらにウイルスに感染した細胞の割合を増
加させ、確実に最大細胞変性効果が得られる液体細胞培
養または細胞単層培養からワクチンを製造するための非
修飾ウイルス粒子を製造することを開示している。ウイ
ルスの回収は、最大細胞変性効果を有するウイルスの増
殖期の時点で行われる。しかしながら、Brownのすべて
の実施例は、ヒトワクチンの製造に利用できないイヌ腎
細胞系について記載している。Brownらの方法における
ウイルスの最大細胞変性効果により、ウイルス収量は１
回のウイルス複製のみに限られる。さらに、Brownはウ
イルスゲノムの操作も培養条件の最適化も開示していな
い。したがって、Brownの方法は、対応するワクチンの
効率的な製造に必要なウイルスの大規模な製造に応用で
きない。
米国特許第4,205,131号（Almeida）は、蛋白分解酵素
のトリプシンを含む無血清培地の存在下で、細胞培養中
でロタウイルスを増殖させる方法を開示している。より
高レベルのトリプシンの細胞に対する致死効果により、
BrownのようにAlmeidaのウイルス収量は１回の複製で産
生される収量に限定される。
より最近、別の研究者らが細胞系培養中でのインフル
エンザウイルスの産生を試みている。例えば、Katzら
（J.Infect.Dis.160:191−98（1989））はMDCK細胞と有
胚卵の羊膜腔におけるインフルエンザの増殖特性を比較
している。KatzはMDCK細胞から得られるインフルエンザ
の力価が有胚卵のそれと比べたとき有望であることを見
いだした。しかしながら、MDCK細胞を使用するには問題
がある。例えば、MDCK細胞はヒト用ワクチンを製造する
ための許可された細胞系ではない。さらに、Katzの方法
はMDCK細胞系中でウイルスを複数回、連続的に継代する
必要があるため、費用がかかり、さらに重要なことは時
間がかかる。
Kaverinら（J.Virol.69:2700−03（1995））は、血清
含有培地で増殖したVERO細胞中でのインフルエンザウイ
ルスの増殖を試みている（VERO細胞は世界保健機構によ
り一般的なワクチン製造用として許可されている）。
しかし、KaverinはVERO細胞中でのインフルエンザウ
イルスの増殖において困難にぶつかり、その困難を明ら
かにVERO細胞から放出される因子によって生じる培養細
胞中のトリプシン活性の低下と結びつけた。Kaverin
は、繰り返してトリプシンを加えることと、VERO細胞中
でウイルスを連続的に継代することによってこの問題に
対処した。VERO細胞中で10代継代後にのみ、Kaverinは
有胚卵およびMDCK細胞を用いて得られたのと同じ高さの
力価を得た。Govorkovaら（J.Infect.Dis.172:250−53
（1995））も同様の結果を得た。
しかしながら、KaverinもGovorkovaも血清を含有する
培地を使用する問題には対処しなかった。一般的に血清
含有培地はバッチごとの一貫性を欠き、ウイルスの産生
および精製工程を面倒にする望ましくない夾雑物を含ん
でいる。この夾雑物には、重大な安全上の問題を生じ得
るBVDV、Bluetongueウイルス、プリオン、もしくはBSE
のような夾雑ウイルス、および／または免疫原性蛋白が
含まれる。
先行技術文献では無血清培地を用いるウイルスの増殖
も試みられている（EP115442、U.S.4,525,349、U.S.4,6
64,912参照）。これらの方法では、最初に宿主細胞を血
清含有培地で増殖させ、各ウイルスで感染させる直前に
血清含有培地を無血清培地に交換する。
VERO細胞はMFSS2のような無血清培地での増殖に適応
している（Mertenらの、Cytotech.14:47−59（199
4））。MDSS2は増殖因子を欠くが、まだかなりの非血清
蛋白が存在している（30〜40mg蛋白/mL）（Mertenら
の、Biologicals 23:185−89（1995））。したがって、
MDSS2には、血清含有蛋白のような他の血清含有培地に
関連する問題が全くないわけではない。
ウイルスおよびその抗原、およびウイルスベースの発
現系中で組換え蛋白を産生するための安全で有効な方法
が絶えず求められている。さらに、容易に利用可能な物
質を用い、連続継代によりウイルスを特定細胞基質に適
応させるといった時間のかかる操作を最小限に止めた、
適用できる規制基準にかない、多くの種々のウイルスお
よびウイルス株、特に通常の方法では効率的に増殖でき
ないそれらに適合し得るウイルス増殖法が求められてい
る。
発明の要約 本発明の目的は、細胞培養からウイルスを高収量で生
産する方法と、ウイルスからのワクチン製造法を提供す
ることである。
本発明は、最小限のヒトの操作によりCECまたはVERO
細胞のような、脊椎動物細胞から持続的かつ連続的にウ
イルスを生産する方法を提供することも目的とする。
本発明の別の目的は、外因性物質で増強することによ
り培養中のウイルス活性を最適化する方法を提供するこ
とである。
さら本発明の別の目的は、すべてのタイプの細胞生成
物、すなわち、ウイルスや組換え蛋白、または他の細胞
生成物を、種々の生成物の特定の要求に容易に適合する
ことができる柔軟な系中で高収量で産生する方法を提供
することである。
さらに本発明の目的は多くの種々のウイルスの増殖を
支持する細胞バイオマスを提供することである。
さらに本発明の別の目的は、ウイルス、ウイルス抗
原、または組換えウイルスを含むウイルスによって産生
される蛋白のような生物学的生成物を製造するための、
夾雑蛋白のない細胞バイオマスを提供することである。
さらに本発明の目的は、細胞培養から全ウイルスを含
むウイルス抗原を効率的に産生する方法、ならびにその
ウイルスまたはウイルス抗原由来のワクチンを製造する
方法を提供することである。
さらに本発明の別の目的は、培養液由来の夾雑蛋白を
含まない組換え蛋白を製造する方法を提供することであ
る。
これらおよび他の目的に従って、本発明は、VERO細胞
のような脊椎動物細胞培養を得、（血清および非血清蛋
白を含まない）無蛋白培地中のみで細胞を増殖させ、こ
の培養にウイルスを感染させ、ウイルスを感染させた細
胞培養をインキュベーションして、培地中でウイルスを
増殖させ、ウイルス含有培地を生産する工程を含むウイ
ルスの生産方法を提供する。この方法の修飾には、脊椎
動物細胞の培養を得る工程後と細胞を感染させる工程前
に、無蛋白培地中で脊椎動物細胞を少なくとも６世代、
好ましくは少なくとも12世代、より好ましくは少なくと
も18世代、またはさらにより好ましくは少なくとも24世
代増殖させることが含まれる。
本発明の別の局面は、（ａ）無蛋白培地中で単に培養
された脊椎動物細胞培養を得、（ｂ）該培養にウイルス
を感染させ、（ｃ）ウイルスを感染させたこの細胞培養
をインキュベーションしてウイルスを増殖させる工程を
含む、ウイルスを含むウイルス抗原の製造法を提供する
ことである。好ましくは、該ウイルスは複数の連続継代
を行うことなく該培養中で増殖する。ウイルスは、オル
ソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レオウイ
ルス科、ピコルナウイルス科、フラビウイルス科、アレ
ナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス
科、およびアデノウイルス科のウイルスのようなあらゆ
るタイプの動物ウイルスであり得る。好ましいウイルス
にはポリオウイルス、HAV、TBEV、黄熱ウイルス、風疹
ウイルス、HCV、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RS
ウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、
フニンウイルス、レオウイルス３型、アデノウイルス１
型〜47型、HSV1、HSV2、CMV、VZV、EBV、ロタウイル
ス、およびワクシニアウイルスが含まれる。より好まし
いウイルスには、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣのよ
うなインフルエンザウイルスである。ウイルスの増殖に
用いる細胞には、VERO細胞、CV−１細胞、LLC−MK2細
胞、MDCK細胞、MDBK、WI−38、およびMRC−５細胞が含
まれる。好ましくは該細胞は細胞バイオマス中のVERO細
胞である。
本発明の別の局面では、この方法には、さらに（ｄ）
工程（ｃ）の細胞培養の一部を取り出し、（ｅ）工程
（ｄ）の部分を、ウイルスの活性化を増強する少なくと
も１つの物質と接触させ、（ｆ）工程（ｅ）の部分に、
該物質のあらゆる細胞毒性作用を阻害するかまたは減弱
させる少なくとも１つの化合物を加え、（ｇ）この培養
に工程（ｆ）の部分を戻すことが含まれる。好ましくは
該ウイルスの活性化を促す物質はプロテアーゼである。
ウイルスの活性化を増強する物質は、ウイルスと宿主細
胞膜の融合をもたらす糖蛋白を開裂させるプロテアーゼ
であることが好ましい。増殖するウイルスがインフルエ
ンザである場合、プロテアーゼはインフルエンザ血球凝
集素を開裂させる。好ましくは、該プロテアーゼは、プ
ロナーゼ、サーモリシン、サブチリシンＡ、または組換
えプロテアーゼのような原核生物供給源由来である。
本発明の別の局面において、細胞バイオマスがウイル
スを連続継代をすることなく脊椎動物細胞で持続的に増
殖させるものである。無蛋白条件下のみで培養した該細
胞を含む細胞バイオマスを提供する。細胞バイオマスは
無蛋白培地中の担体上で細胞を増殖させることにより得
ることができる。
さらに本発明の別の局面において、（ａ）担体および
無蛋白培地を含む容器中、全くの無蛋白条件下で細胞を
増殖させ、細胞を該担体上で増殖させ、該担体に吸着し
たバイオマスを形成し、（ｂ）細胞バイオマスと担体
を、細胞バイオマスを担体から分離させる物質と接触さ
せる工程を含む細胞バイオマスの製造法を提供する。好
ましくは該物質はプロテアーゼである。プロテアーゼ
は、サーモリシン、サブチリシンＡ、またはプロナーゼ
のような原核生物から誘導されることが好ましい。
まだ本発明の別の局面において、（ａ）無蛋白培地中
のみで脊椎動物細胞培養を増殖させ、（ｂ）この培養に
ウイルスを感染させ、（ｃ）ウイルスを感染させた細胞
培養をインキュベーションし、（ｄ）脊椎動物細胞中で
所望の表現型を有するウイルス株を選択し、（ｅ）工程
（ｄ）からドナーウイルスを分離する工程を含む、オル
ソミクソウイルスのような分節化（segmented）ウイル
スからドナーウイルスを作製し、再集合体ウイルスを作
製する方法を提供する。好ましくは、該ウイルスはイン
フルエンザウイルスであり、所望の表現型は高収量表現
型または弱毒有毒表現型である。工程（ｃ）のウイルス
は、感染哺乳動物の喉スワブから分離された、野生型イ
ンフルエンザウイルス、高収量ドナーインフルエンザウ
イルス、再集合体インフルエンザウイルス、温度感受性
インフルエンザウイルス、低温順化インフルエンザウイ
ルス、弱毒インフルエンザウイルス、およびニワトリ有
胚卵またはインフルエンザウイルス株に適応した細胞培
養で継代したウイルスを含み得る。ウイルスを増殖させ
るための細胞には、VERO細胞、CV−１細胞、LLC−MK2細
胞、MDCK細胞、MDBK細胞、WI−38、およびMRC−５細胞
が含まれ得る。本発明によって得ることができる好まし
いドナーウイルスとして、VERO細胞中で高収量表現型を
有するA/Orth/17/95（H1N1）が挙げられる。
さらに本発明の別の局面において、（ａ）無蛋白培地
中の脊椎動物細胞培養を、高収量および／または弱毒有
毒表現型のような所望の表現型を有する第１オルソミク
ソウイルスおよび現在のワクチン株の少なくとも１つの
抗原決定基を有する第２オルソミクソウイルスと共培養
し、工程（ａ）の脊椎動物細胞培養をインキュベーショ
ンして該ウイルスおよび該ウイルスの再集合体を増殖さ
せ、（ｃ）該共感染培養から、第１オルソミクソウイル
スの、高収量および／または弱毒有毒表現型といった所
望の表現型、および第２オルソミクソウイルスの少なく
とも１つの抗原決定基を含む再集合体ウイルスを選択す
る工程を含む再集合体オルソミクソウイルスの製造法を
提供する。好ましくは該オルソミクソウイルスはインフ
ルエンザウイルスである。
工程（ｃ）には、第１オルソミクソウイルスの抗原決
定基と結合するが、第２オルソミクソウイルスの抗原決
定基には結合しない抗体を使用することができる。第２
オルソミクソウイルスをウイルス製造用に選定すること
が好ましい。
好ましい態様において、該再集合体オルソミクソウイ
ルスはVERO細胞のバイオマスから製造される。
さらに本発明の別の局面では、ドナーウイルスの抗原
決定基と結合するが、ワクチン製造用に選定されたウイ
ルスの抗原決定基とは結合しない、ワクチン製造用の再
集合体ウイルスを選択するための抗体を提供する。好ま
しくは、該抗体はドナーウイルスの血球凝集素およびノ
イラミニダーゼのような外表面糖蛋白と結合する。
本発明は、ウイルス含有培地の部分を取り出し、該部
分を、ウイルスの活性化が生じるのに十分な時間該活性
化を増強する少なくとも１つの物質と接触させ、次い
で、阻害または弱毒化が生じるのに十分な時間少なくと
も１またはそれ以上の物質のあらゆる細胞毒性効果を阻
害または減弱させる１またはそれ以上の化合物を取り出
した部分に加え、次いで該部分を細胞培養に戻す工程を
使用することによりウイルスを含むウイルス抗原の改良
された製造法をも提供する。本発明に用いるのに適した
脊椎動物細胞には、ニワトリ胚培養細胞、VERO細胞、CV
−１細胞、LLC−MK2細胞、MDCK細胞、およびMDBK細胞、
ならびに多数の細胞タイプを含む脊椎動物細胞凝集物が
含まれる。
本発明によって製造されるウイルスを含むウイルス抗
原には、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス
科、およびレオウイルス科の抗原が含まれ、好ましくは
インフルエンザウイルスである。該ウイルスの活性化を
増強する物質は、インフルエンザ血球凝集素を開裂させ
るプロテアーゼのようなウイルスと宿主細胞膜の融合を
もたらす糖蛋白を開裂させるプロテアーゼであることが
好ましい。適切なプロテアーゼはトリプシンファミリー
およびサブチリシン様酵素ファミリーからなる群から選
ばれてよい。より具体的には、該プロテアーゼはトリプ
シン、キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サ
ブチリシンＡ、エラスターゼ、ペプシン、パンクレアチ
ン、カルボキシペプチダーゼ、およびフリンからなる群
から選ばれてよい。より好ましいプロテアーゼはプロナ
ーゼ、サブチリシンＡ、またはサーモリシンのような原
核生物供給源由来のプロテアーゼである。
本発明の方法は、容器中でウイルスの活性化を増強す
る物質かまたは担体上に固定化された物質を有すること
もできる。
ある具体的態様では、インフルエンザウイルスには糖
蛋白の開裂部位を修飾するかまたは新しい開裂部位を作
製するための変更がなされた。この方法をインフルエン
ザウイルスに適用する場合、インフルエンザウイルスの
血球凝集素をアミノ酸KKRKKRの開裂部位を含むように変
化させることが好ましい。本発明は、ダイズトリプシン
インヒビター、卵トリプシンインヒビター、およびアプ
ロチニンのような活性化物質のあらゆる細胞毒性効果を
阻害、減弱、または除去する化合物を使用することも含
むことができる。好ましくは、該インヒビターは容器中
に供給されるかまたは担体上に固定される。
本発明の方法は、培養の増殖、感染、および活性化レ
ベルをモニターし、増殖、感染、および活性化レベルを
最大にするために培養条件を変更し、培養からウイルス
を回収し、次いで回収したウイルスを用いてワクチンを
製造する工程を含むこともできる。さらに、本発明の方
法は、上記の方法により得られるワクチンを動物に投与
することによるインフルエンザウイルス感染の治療また
は予防法を提供する。
本発明の方法は、脊椎動物細胞の細胞培養を提供し、
無蛋白培地中で細胞を増殖させ、細胞培養をウイルスに
感染させ、ウイルスに感染した細胞培養をインキュベー
ションして培地中でウイルスを増殖させてウイルス含有
培地を生産し、ウイルス含有培地の部分を取り出し、該
部分をウイルスの活性化を増強する少なくとも１つの物
質と接触させ、該部分に、ウイルスの活性化を増強する
１またはそれ以上の物質の細胞毒性効果を阻害、減弱、
または除去する少なくとも１つの化合物を加え、取り出
したウイルス含有培地の部分を細胞培養および培地に戻
す工程を含む、ウイルスを含むウイルス抗原の生産を増
強または最適化する工程を含むこともできる。
本発明の方法には、供給、増殖、感染、およびインキ
ュベーション工程が所望により第１容器中で実施され、
接触および添加工程が第２容器中で実施され、さらに、
供給、増殖、感染、インキュベーション、取り出し、接
触、添加、および戻す工程を閉じられたサイクルなどの
中で行うことができるように第１および第２容器が環状
（ループ）に接続されることも含まれる得る。本発明の
範囲内の他の選択肢には、供給、増殖、感染、およびイ
ンキュベーション工程が第１容器中で実施され、接触工
程が第２容器中で実施され、添加工程が第３容器中で実
施されることが含まれる（ここで、所望により、第１容
器、第２容器、および第３容器はすべての工程がバッチ
単位でかまたはサイクル的といった方法で行うことがで
きるように環状に接続される）。
本発明は種々のタイプの脊椎動物細胞を用いて実施す
ることができる。例えば、本発明の方法の脊椎動物細胞
は多くの細胞種、またはニワトリ胚細胞培養、VERO細
胞、CV−１細胞、LLC−MK2細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、
WI−38およびMRC−５細胞から選ばれる細胞種を含んで
いてよい。
本発明の好ましい形において、ウイルスはインフルエ
ンザウイルスであってよく、感染細胞は無蛋白培地中の
出発物質から増殖したVERO細胞である。トリプシン、キ
モトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サブチリシ
ンＡ、エラスターゼ、ペプシン、パンクレアチン、カル
ボキシペプチダーゼ、およびフリンからなる群から選ば
れるトリプシンファミリーまたはサブチリシン様酵素か
ら選ばれる１またはそれ以上のプロテアーゼであり得る
インフルエンザ血球凝集素を開裂させるプロテアーゼの
ような、ウイルスを活性化するための物質が加えられ
る。
本発明の方法には、培養の増殖、感染、および活性化
レベルをモニターし、培養条件を変化させて細胞および
ウイルスの増殖、感染、および活性化レベルを最大に
し、培養からウイルスを回収し、回収したウイルスを用
いてワクチンを製造し、本方法により得られるワクチン
を動物に投与することによりインフルエンザウイルス感
染を治療および予防する工程も含まれ得る。
本発明の方法には、第１容器に培養中の細胞を供給
し、第２容器に培養細胞の部分を移し、所望の生成物の
製造を最適化するために１またはそれ以上の物質を加え
て、第２容器で該細胞の部分を活性化し、第３容器に培
養細胞の部分を移し、第３容器中の培養細胞の部分に化
合物を加えて１またはそれ以上の外因性物質の細胞毒性
効果を減弱させる工程を含む、１またはそれ以上の培養
細胞生成物の製造を最適化する工程も含み得る（ここ
で、第１、第２、および第３容器は環状ループ系などに
接続され、第１容器に培養細胞の部分が戻される）。本
方法は、該培養中に実質的にすべての細胞を含み得る培
養の部分を処理し、細胞の増殖および産生するための最
適条件を提供する培養液中で細胞およびウイルスを培養
するためのバッチまたは連続的製造法も提供する。
本発明の方法には、脊椎動物細胞の培養を得、無蛋白
培養中で細胞を増殖させ、ウイルスの活性化に関与する
蛋白中に修飾された開裂部位（ここで、修飾された開裂
部位は脊椎動物細胞培養中の開裂酵素に対するウイルス
の感受性を増加させる）を有するウイルスに該培養を感
染させ、該ウイルスを感染させた細胞培養をインキュベ
ーションして、ウイルスを増殖させ、ウイルスを含む培
地を製造する工程を含む、ウイルスの活性化に関与する
蛋白を発現するウイルスの感染性を調節（例えば増大）
することも含まれる。本方法は、ウイルスがその血球凝
集素の開裂部位を修飾するかまたは血球凝集素の新しい
開裂部位、好ましくはKKRKKRなどを作製するように変化
させたインフルエンザウイルスであり、該脊椎動物細胞
がニワトリ胚培養細胞、VERO細胞、CV−１細胞、LLC−M
K2細胞、MDCK細胞、およびMDBK細胞、ならびに多様な細
胞種を含む脊椎動物細胞凝集物である場合に特に有用で
ある。
ウイルスの感染性の増大に関する本発明の局面には、
ウイルスを含む培地の部分を取り出し、該部分を、該ウ
イルスの活性化を増強する少なくとも１つの物質と接触
させ、このウイルス含有部分に、ウイルスの活性化を増
強する少なくとも１またはそれ以上の物質の細胞毒性効
果を阻害、減弱、または除去する少なくとも１つの化合
物を加え、細胞培養および培地に取り出した部分を戻す
工程が含まれてもよい。ウイルスの活性化を増大させる
好ましい物質は、ウイルスの活性化に関与する蛋白を活
性化するプロテアーゼ、例えば、好ましくはトリプシ
ン、キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、サブ
チリシンＡ、エラスターゼ、ペプシン、パンクレアチ
ン、カルボキシペプチダーゼ、およびフリンからなる群
から選ばれるトリプシンファミリーまたはサブチリシン
様酵素ファミリーから選ばれるプロテアーゼを含むイン
フルエンザ血球凝集素を開裂させるプロテアーゼであ
る。より好ましいプロテアーゼはプロナーゼ、サブチリ
シンＡ、またはサーモリシンのような原核生物供給源由
来のプロテアーゼである。
さらに本発明の別の局面では、ヒト供給源またはブ
タ、ウシ、ヒツジ、およびニワトリ（卵）のような動物
供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白のよう
な培養液由来の夾雑蛋白を含まない培養ウイルスを提供
する。
さらに本発明の別の局面では、ヒト供給源またはブ
タ、ウシ、ヒツジ、およびニワトリ（卵）のような動物
供給源由来の蛋白、または病原性物質である蛋白のよう
な培養液由来の夾雑蛋白を含まないウイルス抗原を提供
する。ウイルスまたはウイルス抗原はTBEV、HAV、HSV、
パルボウイルス、またはインフルエンザウイルス由来で
あることが好ましい。
本発明の別の局面では、ヒト供給源またはブタ、ウ
シ、ヒツジ、およびニワトリ（卵）のような動物供給源
由来の蛋白、または病原性物質である蛋白のような培養
液由来の夾雑蛋白を含まないウイルス抗原を含むワクチ
ンを提供する。該ウイルスは弱毒ウイルスであり得る
か、または不活化されてもよい。好ましくは、該ワクチ
ンはウイルス抗原に加えて、医薬的に許容される担体を
含む。該ワクチンは非経口的または経口的に哺乳動物に
適用することができる。該ウイルス抗原は、好ましくは
ウイルス感染から哺乳動物を予防するかまたは治療する
ためのワクチンを製造するために使用される。
本発明のさらに別の局面では、（ａ）無蛋白培地中の
みで培養した脊椎動物細胞培養を得、（ｂ）該細胞培養
を、組換え蛋白を発現するウイルスベクターで感染さ
せ、（ｃ）該ウイルスベクターを感染させた該感染細胞
培養をインキュベーションして該ウイルスを増殖させ、
（ｄ）該組換え蛋白を回収する工程を含む組換え蛋白の
製造法を提供する。該ウイルスベクターは好ましくはワ
クシニアウイルスである。該ウイルスベクターによって
発現される組換え蛋白は、ウイルス蛋白、細菌蛋白、お
よび血液因子からなる群から選ばれる。
好ましい態様の詳細な説明 本発明は、ウイルス、ウイルス抗原、またはウイルス
発現ベクターから誘導される組換え蛋白のような生物学
的生成物を産生するための新しい系を提供する。新しい
方法論は、望ましくない夾雑物に関して安全性が高い生
物学的生成物を大規模に製造するのに使用可能な脊椎動
物細胞バイオマスを製造するために開発された。本発明
の「細胞バイオマス」は、血清蛋白が欠如していること
を含む無蛋白条件下で培養された脊椎動物細胞が含まれ
る。無蛋白環境から得られる細胞を使用することにより
ウイルスを細胞で連続継代する必要がなくなる。
本明細書で用いている用語「無蛋白」は、該状況にお
いて蛋白、血清、非血清蛋白などがないことを表す。例
えば、「無蛋白」培地は蛋白を含まないであろうし、DM
EMまたはDMEM HAM'S F12のような最小基礎培地から作製
することができる。「無蛋白」培養は無血清培地中で増
殖した細胞を含み、「無蛋白」条件は無蛋白培地中で細
胞を増殖させることを示すであろう。そのような培養は
細胞由来の蛋白および所望により特に加えられたあらゆ
る蛋白を含むであろう。したがって、細胞の無蛋白培養
において、該培養は細胞由来蛋白および加えられたあら
ゆる蛋白のような所望の蛋白を含むであろうが、MDSS2
中の蛋白のような蛋白含有培地由来の望ましくない蛋白
は含まないであろう。
好ましくは、該細胞は最初のアンプルから無蛋白条件
下のみで細胞バイオマスに成長する。培養液は好ましく
は合成最小培地ならびに酵母エキス、ならびにα−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデ
キストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ジ−メ
チル−β−シクロデキストリン、またはトリ−メチル−
β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンの
誘導体からなる。好ましくは、血清含有培地中で培養さ
れていてもよい細胞コレクションまたは他の供給源由来
の細胞系を入手した後、該細胞系は、完全に蛋白を含ま
ず、ウイルスが高収量であることを保証するのに十分な
多くの世代、無蛋白増殖条件下で維持される。したがっ
て、本発明の方法では、ウイルスに感染させる前に、無
蛋白培養条件下における哺乳動物細胞の増殖は、複数世
代、好ましくは少なくとも６世代、より好ましくは少な
くとも12世代、さらにより好ましくは少なくとも18世
代、さらにより好ましくは少なくとも24世代行われる。
本発明は、無蛋白条件下で最初のアンプルまたは細胞
系から大規模の細胞バイオマスに増殖する細胞バイオマ
スをも提供する。細胞バイオマスには、驚くべきことに
蛋白含有培地で増殖した細胞より高密度を達成する担体
に吸着した細胞を含む培養中の細胞および細胞凝集物が
含まれる。本発明の細胞バイオマスは無蛋白培養条件へ
のいかなる順化期も必要としない。ATCCまたはWHOのよ
うな細胞コレクションから得られる細胞は血清含有培地
中で得られるが、いかなる順化処理も行うことなく速や
かに無蛋白条件に移すことができる。
本発明の細胞バイオマスを用いることにより細胞が適
応性を欠くことによる時間の損失がないため、先行技術
よりも大きな改善が得られる。感染前に増殖させる必要
がある細胞バイオマスの世代数は、血清存在下で増殖す
る細胞培養において必要とされる数より多くない。通常
100〜約300世代の、多世代にわたり細胞を増殖させ後、
ある形質転換細胞系は発癌性となる。したがって、本発
明は、高価な継代培養が必要なために生じる発癌性の危
険性を避ける利点を有する継代方法または培養液由来の
あらゆる夾雑化合物を有しない細胞バイオマスを提供す
る利点を兼ね備えている。
さらに、本発明の系は血清含有培養液中で増殖した細
胞に比べて驚くほど細胞密度が増加した細胞バイオマス
を提供する。高細胞密度の細胞バイオマスにより生物学
的生成物のためのより経済的製造方法が提供される。
本発明の好ましい態様において、細胞は、微小担体の
ような種々の不溶性基質を含む担体上で増殖する。微小
担体に吸着した細胞を含む細胞バイオマスは大規模発酵
系に用いられる。微小担体に吸着した細胞は担体上で多
層になって増殖し、該細胞は無蛋白培養条件下で担体か
ら剥がれない。このことは、先行技術文献は支持担体か
ら細胞が剥がれ、次いで凝集塊および細胞凝集物が形成
されることを報告していることから顕著で予測されなか
った知見である。
本発明の細胞バイオマスを製造するのに使用する適切
な脊椎動物細胞はVERO、CV−１、LLC−MK−２、MDCK、M
DBK、MRC−５、およびWI−38からなる群から選ばれる細
胞を含む固定依存性細胞である。細胞バイオマスの細胞
は、担体に直接または間接的に結合する。ガラス、架橋
デキストラン、ゼラチン、または合成物質は該担体用の
物質として十分に適するものと考えられる。粒子直径が
100μｍ〜3000μｍの範囲内である微小担体は本発明の
目的に非常に効果的であると考えられる。
微小担体は平滑な表面または多孔構造を有してよい。本
発明の好ましい態様では、細胞バイオマスはアフリカミ
ドリザル腎細胞系、好ましくはVERO細胞系から誘導され
る。
本発明の細胞バイオマスはヒト供給源、またはブタ、
ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはニワトリ（卵）のような動
物供給源由来の蛋白を含まない、安価な合成培地を使用
することによって得られる。本発明に使用する培地は、
安全基準に関して高品質であることが保証される。さら
に、本発明は微小担体1gあたりの細胞密度の増加をもた
らす。本発明は生物学的生成物の生産効率の増大をもた
らす。さらに、微小担体量を減らすことが該生産過程に
おいて必要である。
さらなる局面において、本発明の細胞バイオマスは種
々のウイルス、およびある好ましい態様ではインフルエ
ンザウイルスのすべてのタイプおよび株の効率的なウイ
ルス生産と高収量の生産をもたらす。本発明は、同じウ
イルスが感染した血清含有細胞培養と同様またははるか
に高い収量をもたらす細胞バイオマスでの細胞増殖をも
たらす。驚くべきことに、インフルエンザＡ、Ｂ、およ
びＣのような先行技術文献の細胞培養中で増殖しなかっ
たウイルスが、本発明の細胞バイオマスでは効率的なウ
イルスの複製と増殖を示す。さらに、血清由来細胞培養
で増殖しなかったウイルス、特にインフルエンザウイル
スは、本発明の細胞バイオマスでは増殖する。通常の細
胞培養では増殖しなかったウイルスでは本発明の細胞バ
イオマスを用いると効率的なウイルス生産が行われたこ
とは予期しがたいことであった。
本発明の細胞バイオマスは細胞培養の大規模生産用の
安価で操作しやすい系を提供する。さらに、本系は、血
清含有条件下で細胞生産が保証できない場合でも、いつ
でも細胞系に対して同じ増殖計画を用いることができ
る。得られるバイオマスは少なくとも500Lの大規模発酵
系に使用可能である。該バイオマスの柔軟性によりこの
システムはウイルス、ウイルス抗原、または組換え生成
物の生産に適用することができる。
さらに、本系を、ワクチンや医薬生成物のような生物
学的生成物の生産に使用する場合、培地由来の夾雑物を
除去するための精製工程を減らすかまたは除外すること
ができる。血清成分が細胞培養中で産生された蛋白、ウ
イルス、またはウイルス抗原に吸着されることは当該分
野でよく知られている。蛋白成分を含まない培地を用い
て細胞バイオマスを製造することにより、時間のかかる
精製工程を避けることができる。さらに、BSE、ウシ下
痢ウイルス、またはブルータングウイルスのような考え
られる夾雑物質を不活化するために行う処理は時として
非常にきびしく、したがって、得られる生成物の生物活
性に望ましくない影響を与える。本発明の細胞バイオマ
スは、培養液由来の夾雑物質を欠く生物学的生成物を生
産することができる。
本発明の細胞バイオマスを使用して得られる生物学的
生成物はより精製し易く、培養液または培養液添加物由
来の潜在的病原物質に関してより安全である。
本発明の細胞バイオマスは安全な生物製剤を生産する
ための安全で品質の保証された細胞培養系を提供する基
準を満たすための最も経済的な方法を示す。
本発明は、最初の脊椎動物細胞系または一次細胞培養
を提供し、細胞系または培養を無蛋白培地中で培養する
ことによりマスター細胞バンクを作製する工程を含む細
胞バイオマスの製造法も提供する。最初の細胞系はヒト
に適用するのに使用する生物製剤を製造するのに許容さ
れる細胞系を提供するAmerican Type Culture Collecti
on（「ATCC」）、WHO、またはあらゆる研究所から得る
ことができる。最初の細胞系は生物学的生成物を大規模
に生産するためにWHOが示したすべての基準を満たす新
しい細胞系であってもよい。最初の細胞系は、さらに無
蛋白培地に適応させる必要なしに無蛋白培地中で培養さ
れる。二次培養法は、プロナーゼ、サーモリシン、また
はサブチリシンＡのような原核生物供給源由来のプロテ
アーゼを用いる他は、通常の血清含有条件で用いられる
方法と同様の方法で行うことができる。したがって、本
発明の細胞バイオマスはトリプシンのような真核生物の
プロテアーゼを使用することによる危険性に関して安全
である。
あるウイルスは増殖するために活性化工程を必要とす
る。このウイルスにはインフルエンザウイルスＡ、Ｂ、
およびＣのようなオルソミクソウイルス科ファミリーの
ウイルス、パラインフルエンザウイルス１、２、３、お
よび４型やニューカッスル病ウイルスのようなパラミク
ソウイルス科ファミリーのウイルス、またはレオウイル
ス科ファミリーのウイルス、例えばロタウイルスＡ、
Ｂ、およびＣ型が含まれる。これらウイルスの活性化に
は蛋白分解開裂反応が含まれる。
インフルエンザウイルスの増殖にあたっては、真核細
胞供給源由来のプロテアーゼの代わりに、プロナーゼ、
サーモリシン、またはサブチリシンＡのような原核生物
供給源由来のプロテアーゼを用いて活性化を行うことが
好ましい。該方法には、無蛋白培地中でさらに増殖させ
ることによりマスター細胞バンクから実施細胞バンクを
製造する工程も含まれ得る。
本発明には、先に詳述した細胞バイオマスを提供し、
細胞バイオマスにウイルスを感染させ、ウイルスを感染
させた該バイオマスを無蛋白条件下でインキュベーショ
ンする工程も含まれ得る。好ましくは、細胞バイオマス
は無蛋白培地中で数代にわたって増殖させた細胞から誘
導される。該バイオマスの適切な脊椎動物細胞は、VER
O、CV−１、LLC−MK−２、MDCK、MDBK、MRC−５、およ
びWI−38からなる群から選ばれる細胞を含む固定依存性
細胞、好ましくはアフリカミドリザル腎細胞系由来の、
最も好ましくはVERO細胞系由来の該細胞が含まれる。無
蛋白培地を用いる以外は標準的条件下で、細胞バイオマ
スをウイルスと感染させ、該ウイルスを感染させた細胞
バイオマスを培養する。細胞の増殖、感染、およびウイ
ルスの生産を定期的にモニターする。モニターは自動ま
たは他の方法で行うことができ、モニターした結果を用
いて該産生方法を調節することができる。
細胞バイオマスをウイルスで感染およびインキュベー
ションすることにより、ウイルス含有上清および／また
はウイルスおよびウイルス抗原を含む細胞バイオマス細
胞培養を含む細胞培養を得る。使用するウイルスの性状
に応じて、産生されるウイルス粒子は細胞培養上清中に
みいだされ、そして／または細胞バイオマスと結合して
いる。
溶解性ウイルスの例にはインフルエンザウイルスおよ
びワクシニアウイルスが含まれ、非溶解性ウイルスの例
にはTBEVが含まれる。
感染および増殖時において、細胞によって産生された
すべてのウイルス粒子が上清に放出されるわけではな
い。これら粒子はむしろ、まだ細胞バイオマスの細胞と
結合している。したがって、細胞培養は上清中にウイル
ス粒子と、細胞バイオマスと結合した完全なウイルス粒
子およびウイルス蛋白を含む。ウイルス収量を増大させ
るために、上清からのウイルス粒子を回収し、細胞バイ
オマスと結合したウイルスおよび／またはウイルス抗原
を分離する。細胞バイオマスの細胞中にみいだされるウ
イルスは溶解により細胞から放出される。細胞は、細胞
を界面活性剤、加熱処理、超音波処理、フレンチプレ
ス、または他の細胞溶解法を用いて処理するような通常
の方法によって溶解させることができる。細胞から放出
されたウイルスは回収され、濃縮され、精製される。
まだ細胞バイオマスまたは細胞断片と結合しているウ
イルス抗原は、当該分野で知られた化学的または機械的
方法によって細胞または細胞断片から抽出することがで
きる。これらの方法には、細胞または細胞断片、特に膜
からウイルス抗原を放出させるのに適切な界面活性剤に
よる処理、または超音波処理が含まれる。次に、細胞バ
イオマスから分離された、ウイルスを含むウイルス抗原
は、さらにショ糖勾配による分配、クロマトグラフィー
カラムへの吸着、洗浄、および精製ウイルスまたはウイ
ルス抗原の溶出を含む精製工程にかけることができる。
使用するクロマトグラフィーカラムはイオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ま
たはサイズ濾過クロマトグラフィーから選ばれる。
さらに、本発明には細胞バイオマスからウイルスを分
離し、上清からウイルスを回収し、ウイルスを精製し、
次いでこのウイルスを用いてワクチンを製造する工程も
含まれ得る。本発明には細胞バイオマスの細胞から細胞
内ウイルスを放出させ、ウイルスを分離精製し、このウ
イルスからワクチンを製造する工程も含まれ得る。さら
に、本発明には、細胞バイオマスの細胞または細胞断片
と結合したウイルス抗原を抽出し、細胞バイオマスから
ウイルス抗原を分離し、ウイルス抗原を分離し、該抗原
を精製し、この抗原でワクチンを製造する工程が含まれ
得る。
本発明の方法は、細胞バイオマス、およびすべての工
程が種々のウイルスと細胞バイオマスとの接近性が増大
した無蛋白条件下ですべての工程が行われる生成物の生
産方法、および該細胞バイオマスからウイルスおよびウ
イルス抗原を得るための改良された方法を組み合わせる
ことができる。本方法によれば、この細胞バイオマスと
生産方法を用いて最大ウイルスおよびウイルス抗原収量
が得られる。
本発明の好ましい態様では、該細胞バイオマスはVER
O、CV−１、またはLLC−MK2細胞から得られ、該ウイル
スはインフルエンザウイルス、TBEV、HSV、HAV、CMV、
またはワクシニアウイルスである。
本発明に使用することができるウイルスの例として
は、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、
レオウイルス科、ピコルナウイルス科、フラビウイルス
科、アレナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックス
ウイルス科、およびアデノウイルス科のウイルスファミ
リーからなる群のウイルス、好ましくはポリオウイル
ス、HAV、TBEV、黄熱ウイルス、風疹ウイルス、HCV、ム
ンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、インフル
エンザウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、レ
オウイルス３型、アデノウイルス１〜47型、HSV1、HSV
2、CMV、VZV、EBV、ロタウイルス、およびワクシニアウ
イルスが挙げられる。
転写および翻訳エレメントの制御下で発現される外来
核酸を含む組換えウイルスベクターも本発明に従って増
殖させることができる。ウイルスベクターはアデノウイ
ルスベクター、またはポックスウイルスベクター、好ま
しくはワクシニアウイルスベクターであり得る。ウイル
スベクター中に挿入される外来核酸はウイルス蛋白、好
ましくは抗原、細菌蛋白、および血液因子のような組換
え蛋白をコードし得る。好ましいウイルス抗原はgp160
またはgp120のようなHIVのウイルス蛋白、HBsAg、preS
2、またはpreS1のようなHBVのウイルス蛋白、HCVのウイ
ルス蛋白、パルボウイルスのウイルス蛋白、HAVのウイ
ルス蛋白、prM/MまたはＥのようなTBEVのウイルス蛋
白、HAまたはNAのようなインフルエンザウイルスのウイ
ルス蛋白である。好ましい細胞抗原はBorrelia、Pseudo
monas、およびHaemophilus influenzaeから選ばれる細
菌抗原である。好ましい血液因子には第II因子、第Ｖ因
子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第Ｘ因子、第X
III因子、プロテインＣ、プロテインＳ、フォン・ウィ
ルブランド因子、およびアンチトロンビンIIIが含まれ
る。
本発明の好ましい態様において、細胞バイオマスはVE
RO、CV−１、またはLLC−MK2細胞から得られ、ウイルス
はインフルエンザウイルスである。無蛋白条件下で数代
にわたって増殖した細胞から得られる細胞バイオマスを
使用することは先行技術文献には開示されていなかっ
た。本発明を用いることにより、VERO、CV−１、または
LLC−MK2のような細胞系におけるインフルエンザウイル
スのすべての株を生産することが可能となった。驚くべ
きことに、インフルエンザ株は本発明の細胞バイオマス
で増殖するが、通常の血清含有細胞培養ではほどんどま
たは全く増殖しないことがわかった。
上記のごとく、インフルエンザウイルスの感染性はし
ばしば活性化工程に依存する。インフルエンザウイルス
の活性化は、インフルエンザ血球凝集素（HA）を開裂さ
せる細胞プロテアーゼ活性により生じる。多くのインフ
ルエンザ株が本発明の細胞バイオマスで増殖するが、通
常の細胞培養では増殖しないことがわかったので、本発
明の細胞バイオマスは、インフルエンザウイルスの感染
性を増大させるが、通常の細胞培養では利用できない活
性プロテアーゼを提供する。プロテアーゼのような活性
化物質は、本発明の細胞バイオマスと共に用いることが
できる。活性化は、サブチリシンＡ、プロナーゼ、また
はサーモリシンのような原核生物供給源由来の外来プロ
テアーゼ、または組換え技術によって産生されるプロテ
アーゼを加えることにより達成することができる。
さらに、本発明は、培養細胞が通常耐える濃度よりは
るかに高い濃度でプロテアーゼを使用することによりHA
活性化レベルをさらに増大させるために提供される。こ
の感染性の増大は「増強ループ（loop）」を用いること
によって達成され、それにより本発明に従って培養およ
び感染した細胞を含む細胞発酵器からのウイルス含有培
地、細胞、またはその両方の部分は、サブチリシンＡま
たはプロナーゼのような１またはそれ以上のプロテアー
ゼを含む容器またはカラムに定期的または連続的に取り
出される。一定のインキュベーション時間後、取り出し
た培地、細胞、またはその両方をプロテアーゼ活性を阻
害する物質を含む容器に移し、次いで該培地を細胞含有
発酵器に戻す。本発明の局面において、増強ループは、
特定の蛋白またはウイルスの産生を増加させるような細
胞増殖パラメーターまたは結果の最適化にも適用でき
る。
本発明の別の局面では、培養液由来の夾雑化合物を含
まないウイルスが提供される。
本発明の別の好ましい態様では、培養液由来の夾雑化
合物を含まないウイルス抗原が提供される。これらの夾
雑化合物にはヒト供給源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、
ヤギ、またはニワトリ（卵）のような動物供給源由来の
もの、または病原性物質である蛋白が含まれる。
ウイルスの生産に使用される細胞バイオマスは無蛋白
条件下で増殖し、原核生物供給源由来のプロテアーゼと
共に継代および二次培養される細胞から得られる。感染
およびウイルス生産過程では、該バイオマス生産過程で
用いる以外の添加物を使用しない。これにより本方法
は、生産過程から得られる生物学的生成物がヒト供給
源、またはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはニワトリ
（卵）のような動物供給源由来のあらゆる夾雑化合物、
または病原性物質である蛋白を含まないことを保証す
る。
本発明の別の局面では、ヒト供給源、またはブタ、ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、またはニワトリ（卵）のような動物
供給源由来のあらゆる夾雑化合物を含まないウイルスま
たはウイルス抗原を含むウイルスワクチンを提供する。
このウイルスは減毒ウイルスであり得るかまたは不活化
されてよい。ウイルス抗原はウイルス感染を治療および
予防するためのワクチンを製造するのに使用される。ワ
クチン製造用の好ましいウイルス抗原はTBEV、HAV、HS
V、またはインフルエンザウイルス由来のウイルス抗原
である。
本発明は、最終的に増殖した変異体を調節することも
可能である。例えば、ニワトリ有胚卵中で普通に生産さ
れるインフルエンザワクチンウイルスは感染患者由来の
最初のウイルスを完全には複製しない。卵でのウイルス
の生産ではウイルス増殖時の多様な突然変異が蓄積され
るだけでなく、哺乳動物ポピュレーションでは決して生
じないかも知れない卵特異的変異体も選択される。これ
がいくつかのインフルエンザウイルスワクチンの効果が
乏しい主な理由の１つである。
本発明は、インフルエンザウイルス株を感染哺乳動物
細胞から直接脊椎動物細胞培養に移し、ニワトリ有胚卵
中で行われる方法の欠点を排除しながらウイルスを高収
量で増殖させる効率的な方法を提供する。本発明では、
最新のインフルエンザ伝染病のウイルス株に対する適切
な抗原性を含まない卵特異的変異体が選択される危険性
も排除され、ワクチン製造における卵物質夾雑物に付随
する危険性も排除される。
本発明の方法のある重要な局面は、高収量で生産され
得るウイルス株に柔軟性があることである。特に、本発
明はこれまで知られていなかった高収量であらゆるタイ
プのインフルエンザウイルスを生産する方法を提供す
る。本発明は、すでに存在するあらゆるインフルエンザ
株、または将来生じるかも知れないインフルエンザ株に
有用である。本発明が提供する方法はインフルエンザウ
イルスの考えられるあらゆる要求に適応可能である。
ある好ましい態様において、本発明が提供する方法に
は、ウイルス含有培養液の「治療部分」を培養容器から
定期的または連続的に取り出して「増強ループ」に入
れ、次いで該治療部分を培養容器に戻すことが含まれ
る。増強ループでは、該治療部分はウイルスの感染性を
増大させる１またはそれ以上の物質で暴露される。用語
「物質」は、プロテアーゼの断片、相同体、類似体、突
然変異蛋白、疑似物、およびプロ酵素を含む天然または
合成起源のプロテアーゼを表す。通常蛋白分解開裂によ
り活性化をもたらし得る他の化合物も本発明の範囲に含
まれ、したがって「物質」である。例えば、トリプシン
やサブチリシンＡのようなウイルスの活性化を増強する
高濃度のプロテアーゼは、治療部分中に導入することが
できる。次いで、プロテアーゼを中和、阻害、または除
去し、治療部分を培養容器に戻すことができる。したが
って、培養に対するプロテアーゼの望ましくない効果を
低下または除去しながら、ウイルスに対するプロテアー
ゼの望ましい効果が得られる。その結果、本発明の方法
は、容易に大規模生産速度を拡大することができるウイ
ルスの高収量生産をもたらす。今まで、大きな発酵容器
で反復洗浄によりプロテアーゼの除去を行うことは事実
上不可能であったため、ウイルスの活性化にプロテアー
ゼを使用する方法はウイルスの大規模生産に応用できな
かった。
本発明の局面において、「増強ループ」では、細胞に
対するプロテアーゼの毒性効果を実質的に除去しなが
ら、培養中の細胞が通常耐える濃度よりはるかに高濃度
の蛋白分解酵素を使用し、ウイルスの活性化（例えば、
HAの開裂）レベルを増大させることができる。この有利
な局面は、細胞発酵容器からウイルス含有培地の部分
を、カラム、チューブ、パイプ、マニホールド、反応フ
ラスコ、または他のタイプの第２容器のような第２の場
所に取り出し、その中で、プロテアーゼまたはウイルス
の活性化を増強する物質と接触させる系を用いることに
よって達成される。ウイルスを活性化するのに十分な期
間インキュベーションした後、取り出した部分を、カラ
ム、チューブ、パイプ、マニホールド、反応フラスコ、
または他のタイプの第２容器のような第３の場所に移
し、その中で、ウイルスの活性化を増強する物質または
プロテアーゼの細胞毒性効果を阻害または減弱させるプ
ロテアーゼインヒビターまたは化合物と接触させる。ウ
イルスの活性化を増強する物質またはプロテアーゼの細
胞毒性効果を阻害または減弱させるのに十分な期間イン
キュベーションした後、取り出した部分を細胞発酵容器
に戻す。
本発明には、標準的方法論では活性化することができ
ない新しいウイルス株の効果的な生産を保証するため
に、トリプシンまたは他の蛋白分解酵素に対するウイル
ス株の感受性を変化させる局面も含まれる。クレームし
た本発明の特異的な概念は本発明以前には認識されてい
なかった。
本発明の増強ループの局面では、さらに、高濃度の外
因性酵素を用いて無蛋白脊椎動物細胞系およびCEC培養
中のウイルス活性化を増強することができる。具体的に
は、感染細胞およびウイルスを含む培地をインキュベー
ションした後、プロテアーゼまたは他の酵素を、プロテ
アーゼと結合し得る固定化抗体のような使用する酵素の
インヒビターまたはプロテアーゼインヒビターによって
時々中和または除去される。本発明のこの局面では、よ
り低濃度のトリプシンを用いる他の方法に比べて活性化
の程度が高く、また本方法ではトリプシンが一定間隔で
中和または除去されるバッチによる生産と単回回収では
なく連続的なウイルスの生産と回収が行える。最も重要
なことは、本発明はインフルエンザおよび他のウイルス
を高収量で産生するための大規模発酵に容易に拡大する
ことができる方法を提供する。
インフルエンザウイルスのすべての株を含むすべての
タイプのウイルスを高収量で製造するために、本発明は
脊椎動物細胞で効率的にウイルスを生産する方法を提供
する。主としてインフルエンザウイルスを高収量で生産
するために計画された本発明の方法は、プロテアーゼの
ような、細胞宿主に有害な物質を必要とするあらゆるウ
イルスを高収量で生産するのに使用することができる。
活性化工程に必要なウイルスの例には、インフルエン
ザウイルスＡ、Ｂ、およびＣのようなオルソミクソウイ
ルス科ファミリーのウイルス、パラインフルエンザウイ
ルス１、２、３、および４型もしくはニューカッスル病
ウイルスのようなパラミクソウイルス科ファミリーのウ
イルス、および例えば、ロタウイルスＡ、Ｂ、およびＣ
型のようなレオウイルス科ファミリーのウイルスがあ
る。
ウイルスの生産レベルをさらに増強するために、本発
明者らは、所望により、ウイルス生産細胞培養を１また
はそれ以上の物質で処理することにより、インフルエン
ザ血球凝集素を開裂させ、新たに生産されたウイルスを
感染性にする方法を提供する。
本発明のある局面では、プロテアーゼによるインフル
エンザ血球凝集素の開裂は、宿主細胞の一次培養および
ウイルスによる宿主細胞の感染と物理的に分けられる。
これにより、先行技術文献に記載されているよりはるか
に高いプロテアーゼ濃度にすることができる。プロテア
ーゼが一次培養中の培地の一部であった先行技術文献で
は、細胞処理または宿主細胞の増殖速度に対する毒性作
用を最小にするためにプロテアーゼ濃度を低く保つ必要
がある。その結果、血球凝集素の蛋白分解開裂によるイ
ンフルエンザウイルスの活性化は完全でなく、非感染性
ウイルス粒子が培養中に維持された。この問題に対処す
るための先行技術文献の方法としては、ニワトリ有胚卵
中でインフルエンザウイルスを増殖させることが含まれ
る。しかしながら、この技術には、夾雑物が混入しやす
い多くの厳しい作業工程があるため多くの不都合があ
る。
本発明では、ウイルスが少なくとも１回複製される時
間の間宿主細胞をウイルスと共にインキュベーションし
た後、１またはそれ以上のプロテアーゼを加える。本発
明のある局面では、ウイルスのプロテアーゼによる活性
化は、プロテアーゼの細胞毒性作用を排除または最小限
にしながら、ウイルスと活性化プロテアーゼの接触を促
すカラム、パイプ、チューブ、コイル、または他の容器
であり得る「活性化容器」を使用することにより、一次
培養容器から取り出した場所で生じる。したがって、新
しい創造的な方法は、インフルエンザHA開裂のようなウ
イルスの活性化レベルをさらに増大させるために、培養
細胞が通常耐えうる濃度よりはるかに高い濃度でサブチ
リシンＡのようなプロテアーゼを使用することができる
方法を提供する。
該ループの活性化容器中で、感染細胞、ウイルス、お
よび１またはそれ以上のプロテアーゼを含む培地をイン
キュベーションした後、プロテアーゼインヒビターなど
によってプロテアーゼを不活化または除去する。本発明
のある局面では、この中和工程は一次培養容器と活性化
容器の両方とは別の場所で生じる。
プロテアーゼを効率的に不活化した後、活性化ウイル
スは、宿主細胞の増殖に伴うプロテアーゼの望ましくな
い干渉なしに培養過程に戻すことができる。この局面に
より本発明はウイルスの連続的産生および回収のための
好都合かつ効率的な方法を提供する。
本発明の増強ループの局面は、あらゆるタイプのウイ
ルスおよびあらゆるタイプの細胞生成物の生産に適応可
能である。本発明の増強ループ系では細胞増殖および合
成速度のパラメーターを独立して最適化することができ
る。したがって、該増強ループ系は、ウイルスまたは別
の細胞生成物、例えば組換え蛋白の効率的な合成速度
を、これが効率的でないと一次培養の細胞過程に毒性ま
たは有害である活性化工程に必要とするすべての場合に
使用可能である。
発酵、活性化、および不活化工程が物理的に分かれて
いるため、そのように分かれていなければ通常の細胞培
養系において細胞が耐えないであろう化学的または物理
的条件下で活性化および不活化工程を行うことができ
る。その結果、本発明の活性化工程はより効率的であり
生産速度が非常に増加する。通常の細胞培養系において
細胞が耐える条件は、化学的または物理的性質のもの、
すなわち、細胞に有害な濃度が必要とされる物質、およ
びある長さの時間存在すると細胞に有害である温度また
は圧力のような物理的条件である。
本発明により高収量で産生されるインフルエンザウイ
ルスは、多様な起源のものであってよい。それらは感染
哺乳動物、好ましくはヒトの咽頭スワブから直接分離さ
れた野生型インフルエンザウイルスであってよい。例え
ば、本発明の方法のある局面では、インフルエンザウイ
ルスのあらゆる株に感染したヒトからの咽頭スワブを希
釈し、本発明によって提供される無蛋白脊椎動物細胞に
直接接種するのに用いる。さらに、本発明により高収量
で生産することができるインフルエンザウイルスは、無
蛋白脊椎動物細胞の接種前に、あらかじめ宿主細胞で継
代された野生型インフルエンザウイルスであってよい。
継代はニワトリ有胚卵または脊椎動物培養細胞、例えば
VERO、MDCK、MDBK、LLC−MK2、もしくはCV−１細胞、初
代ニワトリ胚細胞系、または種々の細胞タイプを含む、
例えば脊椎動物胚由来の細胞凝集物中で行ってよい。
さらに、インフルエンザウイルスは、高収量または弱
毒有毒表現型のウイルスのような、再集合体インフルエ
ンザウイルスまたはドナーインフルエンザウイルスであ
ってよい。本発明によれば、弱毒有毒ウイルスには、温
度感受性または低温順化インフルエンザウイルス株が含
まれる。
本発明のある特定の態様では、無蛋白脊椎動物培養細
胞はVERO細胞である。VERO細胞はヒト医学に使用される
ワクチンを製造するために登録されているいくつかの細
胞系の１つであり、好都合である。したがって、ヒトを
免疫するのに使用するワクチンを製造するVERO細胞を使
用するにあたってさらに承認を得る必要はない。しかし
ながら、本発明以前は、インフルエンザウイルスの生産
にVERO細胞を使用する試みは、収量が許容できないほど
低いか、または蛋白含有培地の使用と、多くの継代が必
要であった。
本発明のある態様において、ウイルスワクチンを最終
的に製造するために増殖させるウイルスは、再集合体オ
ルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイル
スである。再集合は分節（segmented）ウイルス、例え
ばインフルエンザウイルスの特異的特徴である。宿主細
胞の二重感染、すなわち、宿主細胞に少なくとも２株の
インフルエンザウイルスのような分節ウイルスが感染す
ると、１つの単一宿主細胞中で２つの感染ウイルス由来
の部分（分節）の混合物が生産される。ウイルスの組立
て時には、理論的にこれらの部分のすべての組み合わせ
が可能である。
したがって、ウイルス子孫のいくつかは、最初の感染
ウイルスの１つと同一であり、他の子孫は新しい組み合
わせ、すなわち「再集合体」である。所望の再集合体
は、望ましくない特性を有するウイルスを抑制または排
除することによって好ましい活性を特異的に選択するこ
とができる。抑制または排除は、望ましくない抗原に対
する適切な抗体を用いて達成することができる。
先行技術文献において再集合体を得るための方法が示
されている（Kilbourne,E.D.の、Plotkin S.A.およびMo
rtimer,E.A.編、Vaccines,1994中、参照）。簡単には、
ワクチンを製造するためのインフルエンザウイルス株お
よびドナーインフルエンザウイルスを用いて、ニワトリ
胚尿膜嚢に同時に感染させる。先行技術文献に記載の技
術を、卵中で数回継代したドナーウイルスに用いる。重
要なことは、先行技術文献では再集合を生じる過程は卵
中で生じる。これは卵特異的ウイルス変異体を選択する
上で不都合である。卵特異的ウイルス変異体は、必ずし
もヒトからヒトへとポピュレーション中で伝搬するイン
フルエンザ変異体の抗原性をすべて示すわけではない。
したがって、卵特異的ウイルス変異体を選択した再集合
体ウイルスを用いて開発したワクチンの免疫性の効果は
低下するかも知れない。
先行技術文献に関連する問題は、本発明では避けるこ
とが可能である。本発明のドナーウイルスは、好ましく
は外表面抗原性以外の再集合体に対する特性を与えるウ
イルスである。ドナー特性は高収量表現型、弱毒有毒表
現型、または他の所望の表現型に関連する特性であって
よい。したがって、ドナーウイルスは、ワクチンが望ま
れるインフルエンザウイルスの外抗原特性をまねるかま
たはそれに似る再集合体ウイルスの能力と逆行性に干渉
することなく再集合体ウイルスに所望の特性を提供す
る。
ドナーウイルスの外表面抗原に対して抑制性の抗体を
用いて、所望のウイルスの抗原特性がドナーウイルスの
所望の特性と結合している再集合体を選択する。例え
ば、「高収量ドナーインフルエンザウイルス」は再集合
体インフルエンザウイルスを生産するのに用いるのが好
ましいウイルスの１つである。本発明はそのような高収
量ドナーインフルエンザウイルスの製造法を提供する。
具体的には、脊椎動物細胞培養は、ウイルスに感染させ
る前に、細胞培養を少なくとも１世代、好ましくは少な
くとも６細胞世代、より好ましくは少なくとも12細胞世
代、さらに好ましくは18細胞世代、さらに好ましくは少
なくとも18細胞世代、さらに好ましくは少なくとも24細
胞世代無蛋白条件に順化させた、好ましくは哺乳動物細
胞、例えば、VERO、CV−１、LLC−MK2、MDCK、またはMD
BK細胞を提供する。この培養に野生型インフルエンザウ
イルスを感染させる。
野生型インフルエンザウイルスは、インフルエンザウ
イルスを感染させた哺乳動物、好ましくはヒトから直接
分離してよい。本発明は、例えば、感染哺乳動物から咽
頭スワブを採取して希釈し、脊椎動物細胞の無蛋白培養
に直接感染させる工程を含む方法による、野生型インフ
ルエンザウイルスの直接分離法を提供する。さらに、野
生型インフルエンザウイルスは、本発明に従って無蛋白
脊椎動物細胞培養中で増殖させる前に、ニワトリ有胚卵
または哺乳動物培養細胞、例えば、VERO細胞、MDCK細
胞、または種々の細胞タイプを含む細胞凝集物（例えば
脊椎動物胚由来）中で継代されてよい。
次に、野生型ウイルスはその起源に関わらず脊椎動物
細胞培養とインキュベーションされる。細胞は最もよく
増殖するインフルエンザウイルス株のために選ぶことが
できる。この最もよく増殖するインフルエンザ株は、当
該分野で知られた方法に従って分離および精製され、さ
らに本発明の局面により提供される、再集合体インフル
エンザウイルスのすべてのタイプのための親株または
「高収量インフルエンザドナーウイルス」となる。本発
明の顕著な局面は、高収量ドナーインフルエンザウイル
スが脊椎動物培養細胞中で高収量で増幅させるためによ
く順化していることである。本発明の特定の態様におい
て、高収量ドナーインフルエンザウイルスはVERO細胞中
で高収量増幅されるために完全に順化している。
例えば、ある詳細な態様において、本発明は脊椎動物
細胞に完全に順化し、卵物質と接触したことがない高収
量ドナーインフルエンザウイルスを提供する。例えば、
実施例11に示すように、ある高収量ドナーインフルエン
ザウイルス株はA/Orth/17/95（H1N1）である。A/Orth/1
7/95（H1N1）は、無蛋白培地中でVERO細胞上で、1994/1
995シーズンのインフルエンザウイルス株に感染したヒ
ト患者の咽頭スワブから直接継代された。A/Orth/17/95
（H1N1）は、VERO宿主細胞に完全に順化しており、VERO
細胞中で高収量のウイルスおよびウイルス抗原が得られ
る。重要なことはA/Orth/17/95（H1N1）株はニワトリ卵
物質と決して接触したことがない（すなわち、この株は
卵物質を100％持っていない）。さらに本発明の株の利
点は、該株が哺乳動物細胞系中で高収量増幅するために
選ばれたものであり、卵特異的もしくは卵胚特異的適応
性のために選ばれたものではないという事実である。
高収量ドナーインフルエンザウイルスの外表面抗原と
結合する抗体を生じさせるために、さらに本発明は高収
量ドナーインフルエンザウイルスの外表面抗原を分離
し、この分離した抗原を哺乳動物細胞に投与することを
含む方法を提供する。インフルエンザウイルスの外表面
抗原の分離には、ブロメリンによるウイルスエンベロー
プからの該抗原の開裂が用いられる。本発明によれば、
該外表面抗原は高収量ドナーインフルエンザウイルスの
糖蛋白血球凝集素およびノイラミニダーゼである。
さらに、本発明は高収量ドナーインフルエンザウイル
スの外表面糖蛋白と結合する抗体を提供する。ある特定
の態様において、この抗体は高収量ドナーインフルエン
ザウイルスA/Orth/17/95（H1N1）の外表面糖蛋白、血球
凝集素、およびノイラミニダーゼと結合する。本発明の
ある態様は、再集合体オルソミクソウイルス、好ましく
はインフルエンザウイルスを生産することである。
本発明による再集合体のある製造法は以下の通りであ
る。最初に、ウイルスに感染させる前に、少なくとも１
世代、好ましくは少なくとも６細胞世代、より好ましく
は少なくとも12細胞世代、さらに好ましくは18細胞世
代、さらに好ましくは少なくとも18細胞世代、さらに好
ましくは少なくとも24細胞世代無蛋白条件に順化させ
た、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、
VERO、CV−１、LLC−MK2、MDCK、またはMDBK細胞培養が
提供される。この培養は２つの異なるインフルエンザウ
イルス株、インフルエンザウイルス株（Ｉ）および（I
I）で共感染される。
説明すると、インフルエンザウイルス株（II）はワク
チン製造用に選定されたインフルエンザウイルス株であ
る。ウイルス株（II）の外表面糖蛋白はワクチン中に含
まれることが望ましい抗原である。典型的にはインフル
エンザウイルス株（II）はシーズン毎に変化してよい。
WHOは、インフルエンザ株は各シーズン用のワクチンを
生産するために選定することと決定している。選定され
たワクチンは現在インフルエンザ伝染病を引き起こして
いるウイルスの外表面抗原を有していなければならない
ため、このウイルスはワクチン製造業者が自由に選ぶこ
とはできない。
典型的には、野生型インフルエンザウイルス株は高収
量での製造に抵抗する。製造業者は生ウイルスワクチン
として使用するために弱毒有毒ウイルスを使用すること
を好むことが多い。したがって、代わりとして、高収量
に加えてまたは弱毒有毒性を有するドナーインフルエン
ザウイルスを用いて再集合体ウイルスを作製することが
できる。
したがって、本発明は、ワクチンを開発すべきウイル
スの所望の抗原性を保持しながら、高収量を得ることが
でき、そして／または弱毒有毒性を有するウイルスを得
るための方法を提供する。本発明の方法は、卵またはニ
ワトリ胚中での生成物では生じる望ましくない抗原性お
よび夾雑物を有しない再集合体ウイルスをもたらす。
本発明では、インフルエンザウイルス再集合体を製造
するために脊椎動物細胞無蛋白培養が提供される。この
細胞培養の、インフルエンザウイルス株（Ｉ）および
（II）による共感染後に、この培養をインキュベーショ
ンし、２種類の異なるインフルエンザウイルス株のそれ
ぞれおよびこれらウイルスのすべてのタイプの再集合体
を増殖させる。次に、所望の再集合体インフルエンザウ
イルス株を選択する。所望の再集合体インフルエンザウ
イルス株を選択するために、選択用の特異抗体を使用す
る（Kilbourne EDの、Plotkin SAおよびMortimer EA
編、Vaccines（199）中、参照）。
選択用特異抗体はドナーウイルスの外表面糖蛋白、典
型的には血球凝集素およびノイラミニダーゼに対するも
のである。選択用特異抗体は数増殖周期にわたり培地中
に加えられる。最初のドナーウイルスの同じ子孫または
該ドナーウイルスの血球凝集素および／またはノイラミ
ニダーゼを保持する再集合体上の外表面糖蛋白であるド
ナーウイルスの外表面糖蛋白と結合することにより、こ
れら抗体は所望しないウイルス株の増幅を抑制する。し
たがって、ワクチン製造用に選定されたインフルエンザ
ウイルスの外表面抗原を保有するウイルスのみを増殖さ
せることができる。
抑制抗体を含む幾度かの増殖周期において、所望の再
集合体は強く豊富化され、分離することができる。次
に、分離された再集合体は本発明に従って増殖させるこ
とができ、この再集合体からワクチンが製造されよう。
本発明のある態様において、再集合体インフルエンザ
ウイルスを生産するのに用いられるインフルエンザウイ
ルス株（Ｉ）は高収量ドナーインフルエンザウイルスで
ある。そのような高収量ドナーおよび高収量ドナーイン
フルエンザウイルスそれ自身の製造法は本発明によって
提供される。再集合体の高収量表現型は複数の継代によ
って選ばれる。選ばれた再集合体はウイルス株（II）に
よって提供される外表面糖蛋白をコードしている遺伝子
部分、およびウイルス株（Ｉ）の高収量表現型に関与す
るすべての遺伝子部分を保持している。選択的圧下にな
い部分は２つのウイルス株のいずれに由来するものであ
ってもよい。
ある態様において、再集合体インフルエンザウイルス
を生産するのに使用するインフルエンザウイルス（Ｉ）
は、弱毒有毒インフルエンザウイルスである。弱毒有毒
インフルエンザウイルスの生産は、当該分野で知られて
いる。ワクチン製造用に選定されたインフルエンザウイ
ルス株の外表面抗原を有する再集合体ウイルスを製造す
るには、「弱毒マスター株」が望ましい。弱毒マスター
株は、試験によりヒトにおいて弱毒化されていることが
示されており、外表面糖蛋白をコードしている遺伝子部
分以外の遺伝子部分を与えることにより再集合体にこの
弱毒特性を移すことができる株である。インフルエンザ
ウイルス株（Ｉ）として使用可能な弱毒マスター株は好
ましくは低温順化または温度感受性ウイルス突然変異体
である。
選択された再集合体はウイルス株（II）によって提供
される外表面糖蛋白をコードしている遺伝子部分、およ
びウイルス株（Ｉ）の弱毒表現型の決定基に含まれる遺
伝子部分を保持している。これらの特徴のいずれにも関
連していない部分はウイルス株（Ｉ）またはウイルス株
（II）から誘導することができる。
ワクチン製造用に選定されたインフルエンザウイルス
株の外表面抗原を保持している再集合体インフルエンザ
ウイルス、およびドナーインフルエンザウイルスの弱毒
表現型は、生インフルエンザウイルスワクチン、すなわ
ち、ヒトまたは他の哺乳動物に投与する前に不活化する
必要がないワクチンウイルスを製造するのに用いること
ができる。
本発明はワクチン製造用に選定されたインフルエンザ
ウイルスの外表面抗原を保持し、適切なドナーウイルス
株から誘導された高収量または弱毒表現型を有する再集
合体インフルエンザウイルスを提供する。すべての再集
合体ウイルスは本発明の方法によって増殖させることが
できる。
本発明の再集合体ウイルスの特定の態様において、該
ウイルスはワクチン製造用に選定されたウイルスの血球
凝集素およびノイラミニダーゼ、および高収量ドナーウ
イルスの高収量表現型を保持するインフルエンザウイル
スである。例えば、本発明のこの局面の特定の態様は、
高収量ドナーウイルスがA/Orth/17/95（H1N1）である場
合に達成される。
本発明の別の態様では、再集合体ウイルスはワクチン
製造用に選定されたウイルスの血球凝集素およびノイラ
ミニダーゼ、および弱毒マスターウイルス株の弱毒表現
型を有するインフルエンザウイルスである。この局面の
より特定の態様において、弱毒マスターウイルス株は温
度感受性突然変異体インフルエンザウイルス株である。
本局面のさらに別の特定の態様において、弱毒マスター
ウイルス株は低温順化インフルエンザウイルス株であ
る。本局面の再集合体インフルエンザウイルスを用いて
生ウイルスワクチンを製造することができる。
別の好ましい態様において、感染ヒトまたは他の哺乳
動物から直接誘導されたウイルスは、本発明の脊椎動物
細胞培養、すなわち、あらかじめ無蛋白増殖条件に適応
している培養中で増殖する。さらなる特定の態様におい
て、感染哺乳動物、好ましくはヒトから直接誘導される
ウイルスは感染哺乳動物から直接得られ、本発明の脊椎
動物細胞培養、すなわち、無蛋白増殖条件にあらかじめ
順化させた培養と接触させられる。
インフルエンザタイプウイルスが最近感染した哺乳動
物から得られる場合は、そのようなウイルスは現在の伝
染病を引き起こしているものと思われ、したがって、ワ
クチン製造用に選定されるウイルス株であろう。
インフルエンザウイルスのニワトリ卵選択サブボピュ
レーションは哺乳動物細胞培養中で増殖した同じ供給源
由来のウイルスとは抗原的に異なることが記載されてい
る（Schildらの、1983、Nature303:706−709）。哺乳動
物細胞培養を用い、本発明に記載の方法に従って最近感
染した哺乳動物由来のインフルエンザウイルス株の生産
により、感染哺乳動物から直接得られるインフルエンザ
ウイルスと同一または非常に同様な抗原特性を示す均一
なインフルエンザウイルス子孫が得られる。したがっ
て、本発明は、多数の継代後でも、依然としてウイルス
の最初の抗原特性を保持しながら、宿主細胞変異体の選
択を排除する方法を提供する。
製造過程において、対象ウイルスを特定の宿主細胞に
順化させることが望ましいかも知れない。順化したウイ
ルスの血球凝集素（HA）の開裂能を変えることにより順
化を達成することができる。特定ウイルス株のHAの開裂
能の変更は、既知の部位指向性突然変異誘発およびPCR
技術によって生じることができる。本発明でこれらの技
術を用いることにより、実質的にあらゆるインフルエン
ザウイルス株を、酵素活性に感受性であるように修飾す
ることができる。これは血球凝集素の天然の免疫プロフ
ィールを維持しながら行うことができる。したがって、
本発明の方法論により、すべてのタイプのインフルエン
ザウイルスを高力価で大規模生産することができる。
本発明のある局面において、インフルエンザウイルス
を修飾し、血球凝集素中に、修飾された、好ましくはよ
り効率的な開裂部位を作製する。そのような調節された
開裂部位は好ましくはKKRKKRなど、すなわち、塩基性ア
ミノ酸であるリジン、リジン、アルギニン、リジン、リ
ジン、アルギニンである。調節された開裂部位は、あら
ゆるタイプのインフルエンザウイルスの天然に生じる血
球凝集素開裂部位を置換するために本発明にしたがって
計画される。好ましい（すなわち「マスター」）開裂部
位KKRKKRは、Veyらの、Virology,188:408−13（1992）
に記載のごとくプロテアーゼを認識するためのコンセン
サス配列、Ｒ−Ｘ−K/R−Ｒにしたがって計画される。
したがって、本発明には、他の方法論では活性化させ
ることができない株が生じる場合は、トリプシンのよう
なプロテアーゼに対するウイルス株の感受性を変化させ
るという有利な局面が含まれる。インフルエンザの場合
は、相違を示す開裂能を決定するHAのいくつかの構造的
特性があるが、その鍵となる因子は開裂部位のアミノ酸
配列である。開裂に対する血球凝集素の感受性はこの分
子の固定された特性ではない。本発明は、血球凝集素を
有利に変化させ、利用可能なプロテアーゼによる開裂に
対するその感受性を保証する。
具体的には、血球凝集素を変化させ、新規宿主細胞に
対象ウイルスを順化させることができる。新規宿主細胞
タイプ中で順化したウイルスの血球凝集素の開裂能は、
開裂部位に密接した単一のアミノ酸置換によって得るこ
とができる場合がある。したがって、特定ウイルス株の
HAの開裂能の変化は既知の部位指向性突然変異誘発およ
びPCR技術によって生じることができる。本発明におい
てこれらの技術を使用することによって、実質的にあら
ゆるインフルエンザウイルス株を酵素活性に感受性であ
るように修飾することができる。これは血球凝集素の天
然の免疫プロフィールを維持しながら行うことができ
る。したがって、本発明の方法論により、すべてのタイ
プのインフルエンザウイルスを高力価で大規模生産する
ことができる。
本発明までは、ウイルス株自身が効率的な開裂部位を
供給した場合にのみインフルエンザウイルスを高収量で
増殖させることが可能であった。本発明によって提供さ
れるような血球凝集素開裂部位の修飾により、あらゆる
タイプのインフルエンザウイルスを脊椎動物細胞培養中
で高収量で増殖させることができる。この結果、ある時
間に得られるポピュレーション中に存在するすべてのイ
ンフルエンザ株に有効なワクチンを製造することができ
る。
本発明のある局面によれば、インフルエンザウイルス
の高収量生産は、HA活性化、すなわちウイルスの活性化
のレベルを増加させ、本発明に従って培養し、感染させ
た細胞を含む細胞発酵器からのウイルス含有培地をトリ
プシンのような１またはそれ以上のプロテアーゼを含む
容器に連続的に取り出す増強ループ系を使用することに
よって達成することができる。ある時間インキュベーシ
ョンした後、この培地をプロテアーゼ活性を阻害または
除去する物質を含む容器に移し、次いで最終的に該培地
を細胞含有発酵器に戻す。
ある態様において、本発明は非常に有利な特性を特徴
とするインフルエンザウイルスの製造法を提供する。特
に、本方法ではインフルエンザウイルスを高収量で生産
することができ、以前の方法よりはるかに高濃度でプロ
テアーゼを使用することができ、その結果、インフルエ
ンザウイルスのすべての株を含むウイルスの効率的な活
性化が可能である。さらに、本発明の柔軟性により、そ
の増強ループの局面はインフルエンザのあらゆる血清型
および他のウイルスに対する生産条件の容易な適応を可
能にする。
さらに、インフルエンザ血球凝集素のような活性化に
関与する蛋白の開裂部位の修飾に関する局面に利点があ
り、これにより通常の方法では低収量でしか培養するこ
とができないウイルスの収量を実質的に増加させること
ができる。本発明の方法のさらなる利点は、それにより
得られる、実質的に卵蛋白を含まないインフルエンザウ
イルスの生成物に関する。さらに、本発明のインフルエ
ンザウイルス生産法は、他の細胞培養法に比べてはるか
に高いウイルス力価をもたらす。また、本発明は、試験
したすべてのヒトインフルエンザウイルス株を、有胚卵
を使用する際の不都合なしに有胚卵で得られるのに近い
レベルに増殖させることができる方法を提供する。最後
に、本発明の方法では、ウイルス生産を大規模発酵器に
拡大することにより高生産効率を達成することができ
る。
本発明の利点を以下の実施例に例示する。実施例は本
発明の例示のためのものであって、本発明の範囲を限定
するものではない。以下の実施例および表において、B/
MassachusettsはB/Massachusetts/71を表し、またB/Pan
amaはB/Panama/45/90を、B/YamagataはB/Yamagata/16/8
8を、BrazilはA/Brazil/11/78（H1N1）を、California
はA/California/10/78（H1N1）を、Singapore6はA/Sing
apore/6/86（H1N1）を、TaiwanはA/Taiwan/1/86（H1N
1）を、Texas36はA/Texas/36/91（H1N1）を、USSRはA/U
SSR/90/77（H1N1）を、A2 SingaporeはA/Singapore/1/5
7（H2N2）を、BeijingはA/Beijing/353/89（H3N2）を、
GuizhoはA/Guizho/54/89を、HonkongはA/Hongkong/1/68
（H3N2）を、Hongkong5はA/Hongkong/5/83（H3N2）を、
Shanghai16はA/Shanghai/16/98（H3N2）を、TexasはA/T
exas/1/77（H3N2）を、VictoriaはA/Victoria/3/75（H3
N2）を表す。
実施例１ 有胚卵およびプロテアーゼ含有または不含スピナー溶媒
によって生産される種々のインフルエンザ株から得られ
る血球凝集素価 表１に記載のインフルエンザ株は、ニワトリ有胚卵ま
たはCECスピナー培養いずれかの感染に使用された。
CECスピナー培養凝集物は、WO91//09937に開示のごと
くニワトリ卵から分離された胚を機械的に破砕すること
によって産生した。バイオマス培養100mLを作製するに
は２個の有胚卵が必要である。CECスピナー培養100mL
を、インフルエンザウイルス含有尿膜液1mLで感染させ
た。感染後速やかにプロテアーゼを加えた。
トリプシン（Seromed）またはサブリチシンＡ（Fa.No
vo）をそれぞれ20mU/mLおよび３μg/mLの濃度で培地に
加えた。CECスピナー培養を、毎日培地容量の半分（50m
L）を除去しながら３〜４日間インキュベーションし
た。プロテアーゼ含有または不含新鮮培地を終量100mL
となるように培養に加えた。４日間インキュベーション
し、ウイルス含有培地を毎日回収した後、プールした細
胞培養液をまとめてHA価を測定した。HA価はHirstの「T
he Agglutination of Red Cells by Allantoic Fluid o
f Chick Embryos Infected with Influenza Virus」、S
cience,94:22−23（1941）、およびBarrettらの、「Vir
uses」、Methods of Immunological Analysis中、Massy
eff R.F.、Albert W.H.、およびStaines N.A.編、第２
巻、VCH Weinheim,116−132（1993）の記載に従って測
定した。
10〜11日齢の有胚卵を、ウイルス含有尿膜液200μL/
卵で感染させた。感染卵は、Bernettの、「Influenza V
irus Infections of the Chick Embryo by the Amnioti
c Route」、Austral.J.Exp.Biol.Med.Sci.,18:353−360
（1940）の記載に従って37℃で２〜３日間インキュベー
ションした。卵を開け、記述のごとくHA価を測定した。
表１は有胚卵とプロテアーゼ含有または不含スピナー
培養によって生産した種々のインフルエンザ株から得ら
れる血球凝集素価を比較している。データは本発明に従
ったプロテアーゼの添加とCECスピナー培養の使用によ
りほとんどの株の収量が、すべて他の培養法に伴う不都
合なしに、有排卵培養中で増殖したウイルス株の収量に
近いレベルまで増加することを示している。
実施例２ 有胚卵およびCECバイオマス培養によって生産された種
々のインフルエンザ株から得られるウイルス収量 有胚卵およびバイオマスCECスピナー培養に表２およ
び実施例１に記載の種々のインフルエンザウイルス株を
感染させた。
有胚卵は最大7mLの尿膜液を産生し、これを接種72時
間後に回収する。バイオマス溶媒100mLを作製するには
２個の有胚卵が必要である。48および72時間後に培養容
量の半分を、また96時間後に全量を回収することにより
96時間にわたってウイルス含有培地200mLを収集する。
バイオマス培養から回収されたウイルス抗原は、接種卵
からそれが最大7mLであったのに対し、100mL/卵であっ
た（容量で14倍の増加）。この因子を考慮すると、本発
明の方法は有胚卵法に比べて高いウイルス抗原収量をも
たらす。これについては表２に計算値を例示している。
表２は有胚卵によって生産された種々のインフルエン
ザ株と本発明により生産されたそれから得られるウイル
ス収量を比較している。HA価は既述のごとく卵１個から
得られるバイオマススピナー培養100mLおよび尿膜液7mL
/卵について計算された。すなわち、表２中のデータは
実施例１の結果から計算されたプロテアーゼ含有または
不含CECスピナー培養における卵１個あたりの全ウイル
ス収量を表す。使用したインフルエンザ株に応じて、バ
イオマススピナー培養法は有胚卵で得られる収量に比べ
てウイルス抗原が約２〜14倍増加する。プロテアーゼを
加えずに感染バイオマススピナー培養をインキュベーシ
ョンするとＢ−Panama、Brazil、USSR、およびTexas36
について卵で得られるウイルス収量に近いウイルス収量
に達し、この収量はプロテアーゼによって増加させるこ
とができなかった。他のすべてのインフルエンザウイル
ス株のウイルス収量はプロテアーゼを加えることにより
増加した。すなわち、バイオマス細胞培養の内因性プロ
テアーゼ含有量の不足は、ウイルス血球凝集素を活性化
するためにプロテアーゼを外因性に加えることにより克
服することができる。
実施例３ CEC発酵器培養におけるインフルエンザウイルス生産の
大規模化 100mLスピナー培養を自動化2L発酵器に大規模化し
た。2L発酵器のバイオマス細胞培養に、37℃で連続的に
培地交換しながら、HA価６〜８のインフルエンザウイル
ス含有尿膜液2mLを接種した。
大規模発酵器培養を用いる本発明の方法では、増強ル
ープ系中でトリプシン活性化を用い、所望のウイルス含
有培地の部分を発酵器からトリプシンまたはあらゆる他
の必要なプロテアーゼを含む容器に連続的に取り出す。
濃度それぞれ20mU/mLおよび30μg/mLのトリプシンまた
はサブチリシンＡを含む容器中で、ウイルスを約１時間
にわたり活性化させる。次に、トリプシン活性化ウイル
スを含む培地を、残留するトリプシン活性を中和するの
に十分な濃度のダイズトリプシンインヒビター（Sigm
a）を含む容器に約１時間注ぎ込む。次に、中和された
トリプシンとウイルスを含む培地を、さらに複製サイク
ルを行うために発酵器に戻す。発酵器からバイオマス細
胞培養液を連続的に取り出し、新鮮培養液を加えること
により、96時間の間にウイルス含有培地４〜5Lが得られ
た。本発明の方法では、通常の方法（高濃度のプロテア
ーゼは細胞培養およびウイルスと長期間にわたってイン
キュベーションするとそれらに有害な作用を示すと思わ
れる）で可能と思われるよりはるかに高濃度のトリプシ
ンを用いてウイルスを活性化することができる。
表３はウイルスCalifornia株に応用した、増強ループ
系を用いてトリプシンにより活性化し、次いでトリプシ
ンインヒビターを用いることができる方法の利点を示し
ている。
実施例４ MDCK細胞培養、標準的CEC培養、およびCECバイオマス凝
集物におけるインフルエンザウイルスのHA価の比較 有胚卵、CEC発酵器培養、CECおよびMDCK単層培養に表
４に記載のインフルエンザウイルス株を感染させた。有
胚卵の感染は実施例１の記載に従い、実施例３に記載の
発酵器培養を用いて実施した。
一次ニワトリ胚細胞はMayrらの、Arch.ges.Virusfors
ch.,10:72−102（1961）の記載に従って増殖させ、HA価
が６〜８単位のインフルエンザウイルス含有尿膜液に感
染させた。
MDCK細胞の連続細胞系を単層で増殖させ、HA価が６〜
８単位のインフルエンザウイルス含有尿膜液に感染させ
た。インキュベーションは最大細胞変性効果（cpe）が
発現するまでか、または最大72時間行い、HA価を既述の
ごとく測定した。
これらのデータは、本発明の方法では、CEC単層培養
または他の細胞培養法に比べてCEC発酵器培養において
試験したすべてのウイルスで高収量が得られることを示
している。表４は、トリプシンおよびサブチリシンＡの
存在および非存在下におけるMDCK細胞培養、標準的CEC
培養、およびCECバイオマス凝集物中のインフルエンザ
Ａの種々の株およびあるＢ株について得られるHA価を比
較している。MDCK培養においてわずかに高い力価を得る
ことができるが、この細胞はヒトワクチン製造用として
許可されていない。トリプシンまたはサブチリシンによ
るCalifornia、Singapore6、Hongkong、Hongkong5、お
よびBeijingの活性化は、標準的CEC培養、またはMDCK培
養で活性化するかまたは活性化せずに得られる力価より
高い力価をもたらす。
実施例５ インフルエンザウイルスワクチンで免疫した後の抗体応
答 インフルエンザA H1N1株Brazilを既述のごとく有胚卵
中で増殖させ、尿膜液を回収し、プールし、−20℃で凍
結させた。該株を既述のごとくCECバイオマス発酵器培
養中でも増殖した。組織培養液上清は100,000M.W.カッ
トオフフィルターを用いる限外濾過により濃縮し、この
物質および有胚細胞由来の尿膜液を20％ショ糖クッショ
ン上で超遠心にかけて精製した。ウイルスペレットを緩
衝剤に再懸濁し、15分間のU.V./プソラレン処理（10μg
/mL酸塩４−アミノエチルトリオキサレン、U.V.強度20m
W/cm2）によって不活性した。次に、抗原調製物を希釈
し、濃度20μg/mLとし、アジュバントとしてAl（OH）３
を加えた。
次に、マウス10匹のグループを容量10μｇの抗原で免
疫し、４週間後に同用量でブースターをかけた。ブース
ター注射の２週間後、動物を屠殺し、表５に示すごとく
血清HAI価およびELISA価を測定した。
これらのデータは、標準的卵技術または本発明の方法
によって増殖したBrazil株で免疫することにより生じた
HAIおよびELISA抗体価と有意差がないことを示してい
る。
実施例６ ウシ胎児血清を含む通常の培地およびトリプシン存在ま
たは非存在下の無蛋白培地中のVERO単層培養における種
々のインフルエンザ株のHA価の比較 通常のVERO細胞および無蛋白VERO細胞に表６に記載の
インフルエンザウイルス株を感染させた。VERO細胞の連
続的細胞系は、５％ウシ胎児血清を含む通常のDMEM培地
（ダルベッコイーグル培地）または無蛋白DMEM培地いず
れか中で単層で増殖した。細胞を、HA価６〜８単位のイ
ンフルエンザウイルス含有尿膜液に感染させた。最大細
胞変性効果が発現するまでか、または最大72時間インキ
ュベーションし、既述のごとくHA価を測定した。感染後
培地にトリプシンを添加しないかまたは0.002％トリプ
シン（Seromed）を添加した。表６にまとめたデータ
は、いくつかのウイルス株では５％FCSを含む培地にト
リプシンを加えることにより低収量でウイルスが生産さ
れる。しかしながら、重要なことは、トリプシンと共に
無蛋白培地を使用することにより試験したすべてのウイ
ルス株は高収量で生産されることである。
実施例７ 有胚卵、無蛋白VERO単層培養、およびトリプシン存在お
よび非存在下の無蛋白VERO発酵器培養中の種々のインフ
ルエンザウイルスについて得られるHA価の比較 有胚卵、無蛋白VERO単層培養、および無蛋白VERO発酵
器培養に表７に記載のインフルエンザウイルス株を感染
させた。有胚卵の感染は実施例１の記載に従い、実施例
３に記載の発酵器培養を用いて実施した。無蛋白VERO細
胞の連続細胞系を単層で増殖させ、HA価が６〜８単位の
インフルエンザウイルス含有尿膜液に感染させた。イン
キュベーションは最大細胞変性効果（cpe）が発現する
までか、または最大72時間行い、HA価を既述のごとく測
定した。
表７にまとめたデータは、無蛋白VERO細胞中で増殖し
た種々のウイルス株は有胚卵中で増殖したウイルス株の
HA価に近づくことを示している。
実施例８ 血清存在下または無蛋白条件下で培養したCV−１および
LLC−MK2細胞中の種々のインフルエンザ株について得ら
れたHA価の比較 表に示すように、CV−１細胞およびLLC−MK2細胞を、
無蛋白条件下（PF）または５％ウシ胎児血清存在下（FC
S）の蛋白含有条件下で単層として増殖させた。HA価６
〜８の、ウイルス含有尿膜液に細胞を感染させた。イン
フルエンザウイルス株は表に示した。HA価に対するトリ
プシンの影響を証明するために、すべての実験を、表８
に示すようにトリプシン非存在下、または0.002％トリ
プシン存在下で行った。実験は実施例６に記載のごとく
行った。
表８にまとめたデータは、両細胞系（CV−１およびLL
C−MK）とも、無蛋白条件下およびトリプシン存在下で
最大HA価が得られることを示している。
実施例９ 血清存在下または無蛋白条件下で培養したMDCK細胞中の
種々のインフルエンザ株について得られたHA価の比較 表９に示すように、MDCK細胞を無蛋白条件下（PF）ま
たは５％ウシ胎児血清存在下（FCS）の蛋白含有条件下
で単層として増殖させた。HA価６〜８のインフルエンザ
ウイルス含有尿膜液に細胞を感染させた。インフルエン
ザウイルス株は表９に示した。HA価に対するトリプシン
の影響を証明するために、すべての実験を、表９に示す
ようにトリプシン非存在下、または0.002％トリプシン
存在下で行った。実験は実施例６に記載のごとく行っ
た。
表９にまとめたデータは、CV−１細胞およびLLC−MK2
細胞の場合と同様に、無蛋白条件下およびトリプシン存
在下で最大HA価が得られることを示している。
実施例10 インフルエンザA/Hongkong/1/68ウイルス株HA開裂部位
の「マスター開裂部位」KKRKKRへの変更 インフルエンザA/Hongkong/1/68を、ニワトリ有胚卵
中で増殖させ、抗体精製し、溶解させ、次いでウイルス
RNAを標準的部位指向性突然変異誘発方法論に従って調
製した（Enamiらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3802
−3805（1990）。このウイルスRNAを逆転写させ、HAの
末端非コードおよび保存領域と相補的なプライマーを用
いるPCRを行った。この領域の保存により、５′−プラ
イマー（配列1:5′−ATGATGTCTAGAAGCAAAAGCAGGGGATAAT
TC−３′）および３′−プライマー（配列2:5′−ATGAT
GCTGCAGTTTAGTGAGGGTTAATAGTAGTAACAAGGGTGTTTT−
３′）を、広範囲のインフルエンザウイルス株に使用す
ることができる。さらにクローニングするために、５′
−プライマーはXba I制限部位を有し、３′−プライマ
ーはPst I制限部位を有し、さらに３′−プライマーはT
3−プロモーター配列を有した。適切な制限酵素（Xba I
およびPst I）を用いて制限部位をトリミングした後、H
A cDNAをpUC19（New Englnad BioLabs）の複数のクロー
ニング領域のXba IおよびPst I部位中にサブクローン
し、pUC19−HAベクターを得た。部位指向性突然変異誘
発はPaleseら（WO91/03552）の記載に従って実施した。
インフルエンザA/Hongkong/1/68のHA開裂部位を「マ
スター開裂部位」に突然変異させるために、使用した
３′−プライマーの配列は（配列3:5′−ATGATGAGGCCTC
TTTTTTTTCTCTTTTTCTCTGGTACATTCCGCA−３′）（ここ
で、ヌクレオチド配列TCT TTT TTT TCT CTT TTTは、最
初の開裂部位のKQTRと置換する所望のアミノ酸配列KKRK
KRをコードする配列AAA AAG AGA AAA AAA AGA−３′の
逆相補配列である）であった。このヌクレオチド配列の
上流の３′−プライマーは、それをHA cDNAの３′−部
分に融合させるStu I制御部位を持っていた。５′−プ
ライマー（配列１）は上記のクローニングで使用した
５′−プライマーと同じであり、インフルエンザA/Hong
kong/1/68、およびXba I制御部位を有するその５′−末
端にいかなる突然変異も有していなかった。
PCR−生成物を分離し、適切な制限酵素（Xba Iおよび
Stu I）を用いてトリミングした。インフルエンザA/Hon
gkong/1/68のHA cDNAを保持するpUC19−HAベクターも制
限酵素Xba IおよびStu Iで消化し、PCR−生成物に対応
するpUC19−HAの部分を除去した。この部分の代わり
に、トリミングしたPCR−生成物をプラスミド中に連結
した。Stu I制限部位はインフルエンザA/Hongkong/1/68
のHA配列中に天然に生じる。突然変異誘発がうまく行わ
れたことを確認するために、PCR−生成物を保持するpUC
19−HAベクター中に挿入されたPCR−生成物をKsp632Iで
消化して直線化し、T3−プロモーターから転写し、アミ
ノ酸配列KKRKKRの変化したHA開裂部位を有するインフル
エンザA/Hongkong/1/68のHA部分を表すネガティブ鎖RNA
を得た。Luytjesらの、「Amplification,Expression,an
d Packaging of a Foreign Gene by Influenza Viru
s」,Cell,59:1107−13（1989）に従ってリボヌクレオ蛋
白（RNP）トランスフェクション系を用い、KKRKKR HA開
裂部位を有するインフルエンザA/Hongkong/1/68をMDCK
細胞中で増殖した。Paleseらの方法とは反対に、選択は
自動的により効率的な開裂部位を好むので、非選択系が
必要であった。さらに、HA開裂部位以外は２つのタイプ
のウイルスに違いはなかったため、この２つのウイルス
（最初のものおよび突然変異体）は同じ血清型に属し
た。修飾インフルエンザウイルス株インフルエンザA/Ho
ngkong/1/68中のマスター開裂部位の存在はApplied Bio
systems 373 DNA Sequencerを用いるヌクレオチド配列
決定により確認された。
これらのデータは、標準的卵技術または本発明の方法
により増殖したBrazil株で免疫して生じたHA IおよびEL
ISA抗体に有意差はみられなかったことを示している。
実施例11 高収量ドナーインフルエンザウイルス株A/Hongkong/17/
95（H1N1）の構築 急性インフルエンザ感染症のすべての症状を示す患者
から咽頭スワブを得た。咽頭スワブをPBS（pH7.2）2mL
で希釈し、振とうさせて鼻細胞物質を除去した。種々の
量の本溶液を用い、単層で増殖した無蛋白VERO細胞の連
続細胞系に感染させた。３日後、ウイルスを新たな無蛋
白単層VERO細胞に接種した。これを３回接種した。次
に、１つの単一ウイルス株が豊富化されていることがわ
かった。その高収量表現型を血球凝集素アッセイにより
測定し、また、その抗原特性を血球凝集素阻害アッセイ
によって測定した。
このインフルエンザウイルス株はインフルエンザA/Or
th/17/95（H1N1）と名付けられ、ウイルス再集合体の生
産に使用される高収量ドナー株となった。この株は、そ
の高収量表現型を維持しながら研究所で広範に継代され
ている。
インフルエンザA/Orth/17/95の血球凝集素およびノイ
ラミニダーゼは精製ウイルスをブロメリンで処理し、シ
ョ糖勾配沈殿法で精製することにより精製された。次
に、インフルエンザA/Orth/17/95の２つの糖蛋白に対す
るモノクローナル抗体およびヤギポリクローナル抗血清
を製造した。
実施例12 高収量ドナーウイルスとしてA/Orth/17/95（H1N1）株を
用いる高収量再集合体インフルエンザウイルスの構築 無蛋白単層VERO細胞を、種々に希釈した高収量ドナー
ウイルスインフルエンザA/Orth/17/95およびWHOが1995/
1996シーズンのワクチン製造用に推奨しているインフル
エンザウイルスA/Johannesburg/33/95（H3N2）と共感染
させた。最高のHA価を有する子孫を、インフルエンザA/
Orth/17/95の外表面糖蛋白、血球凝集素、およびノイラ
ミニダーゼに対すポリクローナル抗体で処理した。次に
そのウイルス子孫を限られた希釈で継代した。該ポリク
ローナル抗体存在下の継代をさらに２回繰り返した。次
に、抗体なしに継代を１回行った。この４回目の継代を
分析し、インフルエンザA/Orth/17/95の抗原決定基とは
明らかに異なるが、インフルエンザウイルスA/Johannes
burg/33/94（H3N2）の抗原決定基とは同じである再集合
体ウイルスの抗原決定基を決定した。再集合体ウイルス
の外表面上のA/Johannesburg/33/94の血球凝集素（HA）
およびノイラミニダーゼ（NA）の存在は、この特異的ウ
イルス株のHAおよびNAに対するポリクローナル抗血清を
用いる赤血球凝集阻害アッセイにより測定された。
実施例13 無蛋白VERO細胞の生産 ATCC（ATCC CCL81）から得られるアンプルから部分標
本を得、無蛋白培地に接種した。培地で細胞を４周期増
殖させた後、さらに使用するために保存する、実施用細
胞バンクを得た。
ローラーボトルを用いて、実施用細胞バンクから無蛋
白VERO細胞を４周期後に2.5x108/ボトルの密度に増殖さ
せた。16個のそのようなボトルからの細胞を12L発酵器
に移した。プロナーゼ（濃度0.1mg/108細胞）を用いて
継代し、その支持体から細胞を剥離させた。
発酵器培養を３回継代して細胞4x1012個を得た。次に
これらの細胞を各ウイルスに感染させた。
ウイルスの増殖は以下の実施例に記載されている。ウ
イルス増殖後、ふるい（200メッシュ）を用いて微小担
体を除去し、30,500gで遠心して細胞および細胞断片を
除去した。限外濾過（NMWI、200k）によりウイルスを調
製した。
無蛋白培地でVERO細胞を培養することにより血清含有
培地中でVERO細胞を培養するより高い細胞密度が得られ
る。150L発酵器中で無蛋白条件下で７日間発酵すると細
胞2.2x109個/Lが得られるが、2.5％FCS含有培地中での
同等の培養では細胞1.8x109個/Lが得られる。ここで得
られた数字はそれぞれ５回の個々の実験の平均値を示し
ている。
実施例14 無蛋白VERO細胞中のTBEウイルスおよびワクシニアウイ
ルスの生産 無蛋白VERO細胞または通常のVERO細胞を900cm2ローラ
ーボトル中で増殖させた。無蛋白VERO細胞は実施例13に
記載の培地中の無蛋白条件下に保ち、通常のVERO細胞を
2.5％FCSを加えた同じ培地で増殖させた。細胞密度2.8
−3x108個のVERO細胞に、TBEウイルス（0.05pfu/細胞）
または種々の組換えワクシニアウイルス株（0.1TCID50/
細胞）を接種した。使用した組換えワクシニアウイルス
は、HIV gp160遺伝子を有するvgp160MN（EP561034）、
ヒト第II因子cDNAを有するvPTI（F II）（EP561034）、
ヒト第IX因子cDNAを有するF IX＃５（EP561034）、およ
びT7−プロモーターの制御下でHIV env遺伝子を有するV
PE−５（Barrettらの、Aids Res.Human Retrovir.5:159
（1989））であった。
TBEVの増殖はELISAによって測定し、組換えワクシニ
アウイルスの収量はTCID50/mLを測定することにより測
定した。表10に示す結果は、明らかに、血清含有培地中
に増殖した通常のVERO細胞だでなく無蛋白VERO細胞でも
TBEVおよび組換えワクシニアウイルスが増殖し得ること
を示してる。組換えワクシニアウイルスF IX＃５の場
合、無蛋白VERO細胞における収量は通常のVERO細胞培養
に比べ増加した。
実施例15 有胚卵中で種々のインフルエンザウイルス株から得られ
るHA価と原核生物プロテアーゼのサブチリシンＡ（30μ
g/mL）およびプロナーゼ（0.1mg/108細胞）を含む無蛋
白VERO細胞中で得られる各力価の比較 無蛋白VERO細胞を実施例13に記載のごとく生産した。
細胞をHA価６〜８のインフルエンザウイルス含有尿膜液
で感染させた。最大細胞変性効果が発現するまでか、ま
たは最大72時間インキュベーションし、既述に従ってHA
価を測定した。表11にまとめたデータは、原核生物プロ
テアーゼのサブチリシンＡまたはプロナーゼの存在下で
無蛋白VERO細胞を増殖させることにより得られるインフ
ルエンザウイルスの収量は有胚卵中で得られる収量に達
する。
実施例16 無蛋白VERO細胞および通常のVERO細胞培養を用いて得ら
れるヘルペスシンプレッスクウイルス（HSV−１）収量
の比較 感染前に５％FCSおよび感染後に１％FCSを含有する培
地中でインキュベーションした無蛋白VERO細胞または通
常のVERO細胞を、0.1、0.05、または0.001TCID50/細胞
でHSV−１で感染させた。感染細胞が90〜100％細胞変性
効果を示した時に、感染細胞からの培地上清を回収し
た。
実施例17 増強ループ系中の無蛋白VERO細胞中におけるロタウイル
スの大規模生産 ロタウイルスは幼い子供および動物、特に子ブタにお
ける重篤な胃腸炎の最も重要な原因である。より大きな
子供および大人における感染および病気も普通に生じ
る。ロタウイルスについてはEstes MKおよびKapikian A
ZおよびChanock RMの、Fieldsら編、VIROLOGY,Vol.2中
（Raven Press NY）に総説されている。
ロタウイルスは内および外殻を有するエンベロープを
持たないウイルスである。該カプシッドは少なくとも８
つの異なる変異体が存在する血球凝集素様ポリペプチド
（VP4）を含んでいる。インフルエンザウイルス同様
に、ロタウイルスは培養細胞中で増幅するために蛋白分
解酵素を必要とする。トリプシンのような蛋白分解酵素
はVP4の開裂によって感染性を増強する。さらに、効率
的なウイルスの活性化に必要なプロテアーゼ濃度は高
く、著しい細胞毒性効果がみられた。インフルエンザウ
イルスおよびロタウイルスは頻繁に血清型が変化する点
でも共通している。したがって、最近のウイルス分離株
に頻繁に切り換えるのに耐える強力なウイルス製造系が
求められている。このためには本発明が提供するような
柔軟性のある系が必要である。発酵および活性化工程を
物理的に分離することにより、活性化を種々の血清型の
要求に具体的に適応させることができる。
ロタウイルスを大規模で生産するために、無蛋白VERO
細胞のバイオマス細胞培養の2L発酵器にヒトロタウイル
スＣ型0.5mLを接種し、37℃で連続的に培地交換しなが
ら増殖させた。活性化において無感染性ウイルスを活性
化するために、所望のウイルスを含む培地の部分を細胞
培養容器から濃度50μg/mLのプロナーゼを含む活性化容
器に連続的に取り出した。ここで、約１時間にわたりウ
イルスを活性化した。次に、プロナーゼで活性化された
ウイルスを含む培地を、残留プロナーゼ活性を中和する
のに十分な濃度のダイズトリプシンインヒビターを含む
容器に約１時間注ぎ込んだ。次に、中和されたプロナー
ゼとウイルスを含む培地を、別の回の複製を行うために
細胞培養容器に戻した。発酵器からバイオマス細胞培養
液を連続的に取り出し、新鮮培養液を加えることによ
り、３日間の期間中にウイルス含有培地5Lを得た。本発
明の方法は、そのような長期間のインキュベーションを
行う際に、高濃度のプロテアーゼが細胞培養に細胞変性
効果を示すことによりウイルス生産に影響を及ぼす通常
の方法で可能な濃度よりはるかに高濃度のプロナーゼを
用いてウイルスを活性化することができる。
本発明の好ましい態様を示す説明、表、および実施例
は例示するためのものであって、本発明を限定すること
を意図したものではない。本発明の精神および範囲内の
種々の変化および修飾は本明細書の記載から当業者に明
らかとなるであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ (31)優先権主張番号 ４８７，０４６ (32)優先日 平成７年６月７日(1995．6．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ４８７，２２２ (32)優先日 平成７年６月７日(1995．6．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ムント，ヴォルフガング オーストリア、アー−1080ヴィーン、フ ロリアニガッセ57／１／２／６番 (72)発明者 ドルナー，フリードリッヒ オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペ ーターリニガッセ17番 (56)参考文献 特開 昭61−47186（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−95789（ＪＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ，1993，Ｖｏｌ. 17，Ｎｏ．９，ｐ．885−895 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 7/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）株化細胞系のサル腎細胞培養を得、 （ｂ）該細胞が無蛋白培地に適合できるように、該細胞
    を無蛋白培地中で１世代以上増殖させ、 （ｃ）工程（ｂ）の培養に、オルソミクソウイルス科か
    らなる群から選ばれるウイルスを感染させ、 （ｄ）該ウイルスを感染させた細胞培養を該培地中でイ
    ンキュベーションして該ウイルスを増殖させ、該ウイル
    ス抗原を製造する工程を含むウイルス抗原の製造方法。
  2. 【請求項２】工程（ｂ）において、該細胞が該培地中で
    少なくとも６世代増殖するものである請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】該ウイルスがインフルエンザウイルスＡ、
    ＢまたはＣである請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】インフルエンザウイルスが血球凝集素中に
    開裂部位KKRKKRを含むように修飾されている請求項３に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】該サル腎細胞がVERO細胞、CV−１細胞、お
    よびLLC−MK2細胞からなる群から選ばれるものである請
    求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】該サル腎細胞培養がVERO細胞の細胞バイオ
    マスである請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】該ウイルスの活性化を増強するプロテアー
    ゼが細胞または細胞バイオマスの培養に加えられる請求
    項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】該プロテアーゼが原核細胞供給源由来であ
    る請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】該プロテアーゼがプロナーゼ、サーモリシ
    ン、およびサブチリシンＡまたはその機能性誘導体から
    なる群から選ばれるものである請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】該活性化を増強する該物質が容器中にあ
    るかまたは担体上に固定されているものである請求項９
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】（ｄ）工程（ｃ）の培養の部分を取り出
    し、 （ｅ）工程（ｄ）の培養の該部分を該ウイルスの活性化
    を増強するプロテアーゼと接触させ、 （ｆ）工程（ｅ）の該部分に、プロテアーゼのあらゆる
    細胞毒性作用を阻害するかまたは減弱させる少なくとも
    １つの化合物を加え、 （ｇ）工程（ｆ）の該部分を該培養に戻す工程を含む請
    求項１〜10のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】プロテアーゼのあらゆる細胞毒性作用を
    阻害するかまたは減弱させる該化合物がダイズトリプシ
    ンインヒビター、卵トリプシンインヒビター、およびア
    プロチニンからなる群から選ばれるものである請求項11
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】プロテアーゼの細胞毒性作用を阻害する
    かまたは減弱させる化合物が容器中にあるかまたは担体
    上に固定化されているものである請求項12に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】工程（ａ）−（ｄ）が第１容器中で行わ
    れ、工程（ｅ）−（ｆ）が第２容器中で行われるもので
    ある請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】第１容器および第２容器が、工程（ａ）
    −（ｇ）を環状で行い得るようにループに接続されてい
    るものである請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】工程（ａ）−（ｄ）が第１容器中で行わ
    れ、工程（ｅ）が第２容器中で行われ、工程（ｆ）が第
    ３容器中で行われるものである請求項11に記載の方法。
  17. 【請求項１７】第１容器、第２容器、および第３容器が
    工程（ａ）−（ｇ）を環状で行い得るようにループに接
    続されているものである請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】工程（ａ）−（ｇ）がバッチで行われる
    ものである請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】さらに、（ｈ）該培養の増殖、感染、お
    よび活性化レベルをモニターし、（ｉ）増殖、感染、お
    よび活性化レベルを最大にするように該培養の条件を変
    える工程を含む請求項11に記載の方法。
  20. 【請求項２０】さらに（ｊ）該培養から該ウイルスを回
    収する工程を含む請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】さらに（ｋ）該回収されたウイルスを用
    いてワクチンを製造する工程を含む請求項20に記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】（ａ）株化細胞系のサル腎細胞培養を増
    殖させ、 （ｂ）該細胞が無蛋白培地に適合できるように、該細胞
    を無蛋白培地中で１世代以上増殖させ、 （ｃ）工程（ｂ）の細胞培養にオルソミクソウイルスを
    感染させ、 （ｄ）該オルソミクソウイルスに感染させた該細胞培養
    を培養し、 （ｅ）所望の表現型を有するオルソミクソウイルス株を
    選択し、 （ｆ）工程（ｅ）からドナーオルソミクソウイルスを単
    離する工程を含む再結合体ウイルスを作製するためのド
    ナーオルソミクソウイルスの製造方法。
  23. 【請求項２３】所望の表現型が高収量表現型または弱毒
    有毒表現型である請求項22に記載のウイルス製造法。
  24. 【請求項２４】該ウイルスが弱毒インフルエンザウイル
    ス、低温順化インフルエンザウイルス、温度感受性イン
    フルエンザウイルス、再結合体インフルエンザウイル
    ス、高収量ドナーインフルエンザウイルス、感染哺乳動
    物の咽頭スワブから分離された野生型インフルエンザウ
    イルス、およびニワトリ有胚卵またはインフルエンザウ
    イルス亜株に順化した細胞培養で継代されたウイルスか
    らなる群から選ばれるものである請求項22に記載のウイ
    ルス製造法。
  25. 【請求項２５】該細胞がVERO細胞、CV−１細胞、および
    LLC−MK2細胞からなる群から選ばれるものである請求項
    22に記載の方法。
  26. 【請求項２６】（ａ）株化細胞系のサル腎細胞培養を、
    高収量表現型を有する第１オルソミクソウイルスおよび
    少なくとも１つの抗原決定基を有する第２オルソミクソ
    ウイルスに共感染させ、 （ｂ）該細胞が無蛋白培地に適合できるように、該細胞
    を無蛋白培地中で１世代以上増殖させ、 （ｃ）工程（ｂ）の細胞培養をインキュベーションして
    該ウイルスおよび該ウイルスの再結合体を増殖させ、 （ｄ）該共感染培養から、該第１オルソミクソウイルス
    の高収量表現型および該第２オルソミクソウイルスの少
    なくとも１つの抗原決定基を含む再結合体ウイルスを選
    択する工程を含む再結合体オルソミクソウイルスの製造
    法。
  27. 【請求項２７】該オルソミクソウイルス系のウイルスが
    インフルエンザウイルスである請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】工程（ｃ）が、該第１ウイルスの抗原決
    定基と結合するが該第２ウイルスの抗原決定基には結合
    しない抗体を使用するものである請求項26に記載の方
    法。
  29. 【請求項２９】該第２オルソミクソウイルスがワクチン
    製造用に選定されたものである請求項26に記載の方法。
  30. 【請求項３０】該サル腎細胞培養がVERO細胞のバイオマ
    スである請求項26に記載の方法。
  31. 【請求項３１】（ａ）株化細胞系のサル腎細胞培養を、
    弱毒有毒表現型を有する第１オルソミクソウイルスおよ
    び少なくとも１つの抗原決定基を有する第２オルソミク
    ソウイルスに共感染させ、 （ｂ）該細胞が無蛋白培地に適合できるように、該細胞
    を無蛋白培地中で１世代以上増殖させ、 （ｃ）工程（ｂ）の細胞培養をインキュベーションして
    該ウイルスおよび該ウイルスの再結合体を増殖させ、 （ｄ）該共感染培養から、該第１オルソミクソウイルス
    の弱毒有毒表現型および該第２オルソミクソウイルスの
    少なくとも１つの抗原決定基を含む再結合体ウイルスを
    選択する工程を含む再結合体オルソミクソウイルスの製
    造法。
  32. 【請求項３２】該オルソミクソウイルス系のウイルスが
    インフルエンザウイルスである請求項31に記載の方法。
  33. 【請求項３３】工程（ｃ）が、該第１ウイルスの抗原決
    定基と結合するが該第２ウイルスの抗原決定基には結合
    しない抗体を使用するものである請求項31に記載の方
    法。
  34. 【請求項３４】該第２オルソミクソウイルスがワクチン
    製造用に選定されたものである請求項31に記載の方法。
  35. 【請求項３５】該サル腎細胞培養がVERO細胞のバイオマ
    スである請求項31に記載の方法。
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