SE445466B - Sett att foroka rotavirus in vitro - Google Patents

Description

10 l5 20 25 30 35 7812283-5 2 Banatvala, J.E. et al, (Lancet, 25 oktober l975, 821) har emellertid utvecklat en specialiserad teknik, var- vid viruset centrifugeras på grisnjurceller. Denna metod omfattar odling av cellkulturer på täckglas.som finns i flatbottnade rör, till vilka sättes fekala filtrat, efterföljt av centrifugering av röret. Denna metod resulterar i framställningen av virala komponenter, vilket visas av fluorescent antikropp, men inte i fram- ställningen av fullständigt infektöst virus.

Det proteolytiska enzymet trypsin har rapporterats ha flera effekter på cellkulturer och virusodling; Cunningham, D. och Ho, T. (Proteases andBiological Control, eds Reich et al, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1975, 795-805) stimulerade delninaen av kycklingceller, om det var närvarande i ndnst 2 h. År 1965 visade Spendlove och Schaffer (J Bact., 89, 597) att enzymbehandling höjde infektiviteten hos reovirus genom klyvning av rapporterade att trypsin viruseü;ytproteiner.

Man har nu funnit att genom att föröka virus av den typ som inte inaktiveras av proteolytiska enzymers verkan, såsom rotavirus, in vitro i cellkulturer i när- varo av ett serumfritt medium, som innehåller ett proteo- lytiskt enzym, alstras en mycket ökad mängd av virus.

Enligt föreliggande uppfinning âstadkommes ett sätt att föröka rotavirus in vitro, vilket omfattar odling av viruset i cellkulturer som ärnotbxfliga för viruset i närvaro av ett serumfritt medium, vilket innehåller ett proteolytiskt enzym.

Rotaviruset, som cellkulturen skall infekteras med, kangmepareras från vilket som helst slag av kliniskt prov som är känt för att vara en källa för viruset, exempel- vis kan det erhållas ur fekalt material från sådana däggdjur som nötkreatur, grisar, fâr, möss eller männi- skor. Sâdant fekalt material suspenderas exempelvis i en lämplig buffert, vid ett pH-värde av mellan 5 och 9, för att bilda en suspension av från 5 till 30 vikt%, 10 15 20 25 30 35 7812283-5 3 företrädesvis ca 20 vikt%. Sedan klarnas suspensionen genom centrifugering under upp till 30 min, vid från 1000 till 10 000 g, företrädesvis under 20 min vid 5000 g.

Det överliggande skiktet som kvarstår efter centrifuge- ringen passeras först genom ett Millex (Millipor) filter med en porstorlek av 150 till 0,45 Pm och sedan genom ett filter med en porstorlek av 0,22 Pm. Man har funnit att det resulterande filtratet är tillräckligt rent för infektering av vävnadskulturer.

Alternativt och mera föredraget kan viruset som skall förökas vara av en vävnadskulturanpassad stam, dvs mot-" tagliga celler har infekterats med det lämpliga viruset, och viruset har därpå seriepasserats i sådana kulturer.

Sådana vävnadskulturanpassade stammar har den fördelen att de är lättillgängliga utan att de kliniska proverna behöver rengöras, och att de sannolikt försvagas, vilket gör dem till en bättre källa för ett potentiellt vaccin. Därtill är det troligt att sådana stammar växer till en högre titer, varigenom större mängder av virus åstadkommas.

En typ av cellkultur för förökning av viruset omfat- tar primära celler av den homologa arten; exempelvis ifråga om oxrotavirus användes primära kalvnjurceller för förökning. Ett avsevärt tekniskt framsteg är emeller- tid att utnyttja etablerade cellinjer för förökningen av virus; hittills har det inte varit möjligt för rota- virus.

Med användning av den här beskrivna metoden kan kalvrotavirus förökas med fördel vid närvaro av trypsin på human diploid-MRC 5-cellinje, apnjur-BSC-l-cellinje, apnjur-LLC-MK2-cellinje eller Vero-celler. När de för förökning av viruset valda cellerna har blivit samman- flytande måste det serumhaltiga mediet, i vilket cellerna odlats, avlägsnas, eftersom serum och proteolytiska en- zymer är antagonister. Enzymet bryter ner vissa serum- komponenter. Efter tvättning av cellerna sättes en liten mängd av virus, som finns i ett serumfritt underhålls- 7812283-5 10 15 20 25 30 35 4 medium, till kulturen och de får adsorberas under 15 till 60 min, företrädesvis 30 min, vid 35-39°C,företrädesvis 37°c.

Efter detta sättes färsktuppehållsmedium för virus- odling till cellkulturen, vilket medium kan vara ett kemiskt definierat medium såsom Eagles Minimal Essential Medium eller Basal Medium eller Medium 199 (se Morgan, ' J.F., Morton, H¿J. och Parker, R.C. (1950), Proc. Exp.

Biol. (N.Y.), lå, l). För föreliggande uppfinnings ända- ' mål utökas sådana media inte med den vanliga mängden av serum, men kan valfritt innehålla antibiotika, för att kontrollera kontamination, eller andra icke-proteinhal- tiga tillsatsmedel.

Det för adsorption och upprätthållande använda uppehållsmediet enligt föreliggande uppfinning utökas med ett proteolytiskt enzym såsom trypsin, kymotrypsin, pankreatin, pronas, bromelain eller subtilisin, vilka lämpligen kan införlivas i mediet i en koncentration av från 1,0 pg/ml till 20 pg/ml, företrädesvis 2,0 pg/ml till 10 pg/ml. Sedan inkuberas kulturen vid från 35°C till 39°C, företrädesvis 37°C,i från ca l till 3 dygn, företrädesvis 2 dygn, varefter cellerna har lossnat från tänmæn.

Undersökning av virusinfekterade celler i elektron- mikroskop visar att virustillväxt har förekommit med virus som inte växer i vävnadskultur, och med sådana virus som växer endast dåligt i celler har ökade titrar av virus alstrats.

Den huvudsakliga fördelen med detta förökningssätt är att det främjar tillväxten av sådana rotavirus i Vävnads- kulturer som tidigare inte kundeodlas eller somí-varit svåra att odla i sådana system, och åstadkommer även stora mängder av virus som kan alstras i celler, där hittills endast små mängder har-växt. Stora mängder av antigen blir därför tillgängliga för immunisering och för användning i diagnostiska tester såsom immunelektron- mikroskopi, immunodiffusion, hemagglutination, komple- 10 15 20 25 30 35 7812283-5 5 mentbindning, ELISA och radioimmunoanalys. Genom att alstra hittills ouppnåeligt stora mängder av rota- virus kan det vara möjligt att tillverka ett virus- vaccin för administrering åt däggdjur. Rotavirus-gastro- enterit förorsakar unga djurs död ibetydande antal, och därför är utvëfiïkliflgën av ett vaccin mot denna sjukdom av stor ekonomisk betydelse. Därtill torde det vara möj- ligt att med denna metod alstra virus i en mängd och renhet som är lämplig för ett vaccin för administrering åt människor och därigenom medverka till att minska - “ de talrika infantildödsfallen som beror på rotavirus- gastroenterit.

Ytterligare fördelar med föreliggande uppfinning kommer att framgå ur den följande beskrivningen av utföringsformer av uppfinningen, vilka utföringsformer emellertid inte på något sätt begränsa denna uppfin- ning.

EÉEMPEL l _ Flera flaskor (l5O ml) med sammanflytande kulturer av primära kalvnjurceller tvättades 3 ggr med fosfatbuffrad fysiologisk saltlösning (PBS) utan kalcium, men som inne- höll SOOO internationella standardenheter penicillin och 2500 internationella standardenheter streptomycin.

Kulturerna fick slutligen avrinna och 1 ml kalvrotavirus, som hade anpassats till Vävnadskultur (dvs vid dess 6:e passage i primära kalvnjurceller) och som fanns i serumfritt uppehållsmedium,tillsattes och fick adsor- beras i 0,5 h vid 37°C. Därefter sattes serumfritt uppehållsmedium till kulturerna, varvid medlet omfattade Eagles basal medium som innehöll 5000 internationella standardenheter penicillin och 2500 internationella standardenheter streptomycin samt en slutlig koncentra- tion av 0,1 % natriumvätekarbonat. Mediet i den första flaskan innehöll l pg trypsin, den andra innehöll 5 ug trypsin och den tredje innehöll l0Jpg trypsin; 1 pg, 5 Eg eller l0 pg/ml kristallin trypsin uppgjordes i 10 M klorvätesyra. Därtill uppgjordes kontrollkulturer, 7812283-5 6 varvid en sats omfattade infekterade celler som odlats i frånvaro. av trypsin och en andra sats omfattade oinfekterade celler som odlats i närvaro av trypsin.

Alla kulturer inkuberades vid 37°C och undersöktes vid 5 regelbundna intervaller för förekomst av cytopatisk effekt (CPE). _ Vid 48 h var cellernas utseende såsom visas i tabell l, där +=2S% CPE Och ++++=100% CPE. 10 TABELL l Mängd av Cytopatisk effekt i Cytopatisk effekt i trypsin oínfekterade celler infekterade celler 15 Inget trypsin - 1 pg + + 5 pg ff++ ++++ 10 pg. Hr nu nu nu .V ++++ 0. .. 0 . ++++ 20 _ Trots det faktum att kontrollcellerna med högre mängder av trypsin inte hade överlevt,undersöktes alla virusinfekterade kulturer i elektronmikroskop. Detta utfördes så att kvarvarande celler avlägsnades från plastunderlaget,och cellerna plus det överliggande 25 skíktet skördades. Prover av viruskulturerna (5 ml) centrifugerades sedan i l h vid 10 000 g,och den sålunda erhållna pelletten användes för negativ-färgning.

I tabell 2 visas värdering i elektronmikroskop av de sålunda erhållna preparaten. 7812283-5 A TÅàELr 2 Mängd av trypsin i viruskultur Närvarande mängd av virus inget trypsin ca 106 partiklar/ml 1 Fg ca lOš partiklar/ml 5 Pg ca lO partiklar/ml 1.0 H9 .... .Pa wàpaftiklêr/ml Det framgår således att, trots att mängden av trypsin vid de högre nivåerna är letala för cellerna, en mycket förhöjd mängd av virus har erhållits med detta förfarande. êešiseaëë§ss_ë2_z9§ayi§2§_i_ëB§:â:s§llinis Passage l MRC-5 humana diploid-vävnadskulturceller odlades i 75 ml granuleringsflaskor i ett näringsmedium som om- fattade Eagles Basal Medium, vilket innehöll SOOO inter- nationella standardenheter (ISU) penicillin, 2500 ISU, 0,1 % natriumvätekarbonat och 10 % fosterkalvserum, under 3 dygn, varefter de var sammanflytande. Närings- mediet avlägsnades och de sammanflytande kulturerna tvättades 3 ggr i PBS, som innehöll 5000 ISU penicillin och 2500 ISU-streptomycin. Kulturerna fick slutligen avrinna och l ml vävnadskulturanpassat kalvrotavirus (vid 6 passagen i primära kalvnjurceller) tillsattes, een viruset fick edserberae 1 1 h vid 37°c. Efter detta övertäcktes kulturerna med serumfritt medium (40 ml), som omfattade Eagles Basal Medium,vilket innehöll sooo :sn penieiilin, zsoo :su etreptemyein, 0,2 % natriumvåtekarbonat samt 10 pg/ml kristallint trypsin uppgjort i l0_3M klorvätesyra, samt inkuberades i 48-72 h vid 37°c.

Efter 24 h hade cellerna fullständigt lösgjorts från flaskytan. 7812283-5 10 15 20 25 30 äs Passage 2 I _Suspensionen från passage 1 skördades efter 48-72 h och användes som inokulum för en andra passage genom MRC-5-celler, varvid samma metod användes som för passage 1.

Passage 3 Cellskörden från passage 2 användes som inokulum - för en tredje passage genom MRC-S-celler, varvid samma metod användes som för passage l.

Elektronmikroskopi med negativ-färgning visade - höga titrar av rotavirus vid alla passage-nivåer.

EXEMQÉL 3 Qfilinsgayswfavirus i BSC-l-Celliaieiêïšêßêäišl BSC-l apnjurvävnadskulturceller odlades i 75 ml granuleringsflaskor i ett näringsmedium, som omfattade _ Eagles Basal Medium, vilket innehöll 5000 internationella standardenheter (ISU) penicillin, 2500 ISU, 0,1 % natriumvätekarbonat ocn 10 % fosterkalvserum, under 3 dygn, varefter de var sammanflytande. Näringsmediet avlägsnades_och de sammanflytande kulturerna tvättades 3 ggr i Pas, som :mehöii sooo :su penicciilin och zsoo :su strepm- mycin. Slutligen fick kulturerna avrinna och l ml Vävnads- kulturanpassat kalvrotavirus (vid 6 passagen i primära kalvnjurceller) tillsattes, och viruset fick adsorberas i l h vid 37°C. Efter detta täcktes kulturerna med serumfritt medium (40 ml), vilket omfattade Eagles Basal Medium, som.innehöll 5000 ISU penicillin, 2500 ISU streptomycin, 0,2 % natriumvätekarbonat samt 10 ug/ml kristallinztrypsin uppgjort i lO_3M klorvätesyra, och inkuberaaes i 48-12 h vid 31%.

Efter 24 h hade cellerna fullständigt frigjorts från flaskytan. Elektronmikroskopi med negativ-färgning visade höga titrar av rotavirus.

Det i exempel 3 angivna förfarandet följdes med undantag för att LLc - m2 (Afzcc ccL 7) apnjurcelier användes istället för BSC-l-celler, med resultatet 7812285-5 9 att höga titrar av rotavirus alstrades.

EXEMPEL 5 Det i exempel 3 använda förfarandet följdes med undantag för att Vero-celler (ATCC CCL 81) användes istället för BSC-l-celler, med den resulterande alstringen av höga titrar av rotavirus.

Claims (1)

1. lO 15 20 25 7812283-5 10 PATENTKRAV l. Sätt att föröka rotavirus in vitro, k ä n n e- t e c k n a t därav, att viruset odlas i cellkulturer som är mottagliga för viruset, i närvaro av ett serum- fritt medium, vilket innehåller ett proteolytiskt ' enzym. 2. därav, Sätt enligt kravet l, k ä n n e t e c k n a t att cellkulturerna som är mottagliga för rotar _ virus, omfattar primära kalvnjurceller, human diploid- MRC-5-celler, apnjur-BSC-1-celler, apnjur-LLC-MK2-celler eller Vero-celler.

   3. Sätt enligt kravet l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det serumfria mediet är ett kemiskt definierat uppeha11smedium{

   4. Sätt enligt något av de föregående kraven, _ k ä n n e t e c k n a t därav, att det proteolytiska enzymet är trypsin, kymotrypsin, pankreatin, ëronas, bromelain eller subtilisin.

   5. Sätt enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymet är när- varande i mediet i en koncentration av från 1,0 pg/ml till 20 pg/ml, företrädesvis 2,0 pg/ml till 10 pg/ml.

   6. Sätt enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att de med virus infek- terade cellkulturerna inkuberas vid från 35°C till 39°é. I

   7. Sätt enligt kravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att de infekterade cellkulturerna inkuberas 1 från l.till 3 dygn.