FI63060B - Foerfarande foeroekning av rotavirus in vitro i cellkulturer - Google Patents
Foerfarande foeroekning av rotavirus in vitro i cellkulturer Download PDFInfo
- Publication number
- FI63060B FI63060B FI783663A FI783663A FI63060B FI 63060 B FI63060 B FI 63060B FI 783663 A FI783663 A FI 783663A FI 783663 A FI783663 A FI 783663A FI 63060 B FI63060 B FI 63060B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- culture
- rotavirus
- cells
- virus
- cultures
- Prior art date
Links
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 title description 28
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 17
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 17
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 17
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 17
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 244000309466 calf Species 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 description 3
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010017913 Gastroenteritis rotavirus Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 229940124859 Rotavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2720/12364—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
- ..--1 „„ KU ULUTUSJULKAISU ,7« / λ
J&ST& B (11) UTLÄCGNI NGSSKRIFT 6 3 O 6 O
(§5) ?f·.tentti oydan<y 11 04 1933
Patent meddelat V * (51) Ky.ik.3/lnt.a.3 c 12 N 7/00 SUOMI —FINLAND (21) PiMfittlhtkemu* — Pat«ncvweknlng 703663 (22) H«k*ml*pllv· — Amtekninpdtf 30.11 »78 (Fl) (23) AUuiptlv·—GJMgh«tadif 30.11.78 (41) Tullut |ulklMlul — Bthrtc o*«Kll| 02.06.79
Patentti- ja rekisterihallitus (44) NfthtivUuiptnon jt kuitL|ulkaiwn pvm. — 31.12.82
Patent* och registerstyrelsen AmSkin utlafd oeh utUkrtfMn pubUnrad (32)(33)(31) Pyyde·*/ «uolluus—feglrd prtorlMt 01.12.77 2U.12.77 Englanti-England(GB) 5009^/77, 53906/77 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Road, London N.W.I.,
Englanti-England(GB) (72) June Dalziel Almeida, London, Englanti-England(GB) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä rotavirusten kasvattamiseksi in vitro soluviljelmissä -Förfarande förökning av rotavirus in vitro i cellkulturer Tämän keksinnön kohteena on menetelmä rotavirusten kasvattamiseksi in vitro viljelemällä viruksia viruksille herkissä solu-viljemissä.
Tiedetään, että tiettyjä viruksia ei voida helposti viljellä teollisessa mittakaavassa? esimerkiksi influenssavirus kasvaa vain tiettyyn tiitteriin asti munissa, Toinen esimerkki viruksesta, joka ei helposti kasva soluviljelmissä on härän rotavirus? toisaalta ihmisen rotavirus ei lisäänny lainkaan soluviljelmissä.
Rotavirukset löydettiin ensimmäisen kerran ripulia sairastavien vasikoiden lannasta (Fernelius, A.L, et ai,, Archiv fUr die Gesamte Virus-forschung, 1972, 37, 114-130), ja niille annettiin nimi rotavirus niiden elektronimikroskoopissa havaitun pyöränkal-taisen ulkonäön perusteella. Myöhemmin on todettu, että morfologisesta identtisiä hiukkasia voidaan löytää muiden lajien, kuten sikojen, lampaiden ja ihmisten ulosteista, ja että ne poikkeuksetta liittyvät mahasuolitulehdukseen. Rotavirusta onkin pidetty eräänä 63060 lasten mahasuolitulehduksen pääasiallisena aiheuttajana varsinkin kehitysmaissa.
Nykyisin yleisenä menetelmänä ja ihmisen rotavirusten ollessa kyseessä ainoana menetelmänä kokonaisten viruskappaleiden saamiseksi jonkinlaisina määrinä on niiden eristäminen ulosteista. Tällainen eristäminen suoritetaan tavallisesti linkoamalla, jolloin siihen mahdollisesti liittyy myös suodattaminen. Härän rotaviruksia voidaan kasvattaa primaarisilla soluviljelmillä, jolloin tulisi käyttää lajispesifisiä soluja, ts. härän viruksien ollessa kyseessä primaarisia vasikan soluja, esimerkiksi munuaissoluja, Tähän asti on todettu mahdottomaksi kasvattaa ihmisen rotavirusta soluviljelmillä. Banatvala, J.E, et ai, (Lancet, 25, lokakuuta 1975, 821) ovat kuitenkin kehittäneet menetelmän, jossa virus lingotaan sian munuais-soluille, Tässä menetelmässä soluviljelmiä kasvatetaan tasapohjaisissa putkissa olevilla peiteliuskoilla, joihin lisätään uloste-suodoksia, minkä jälkeen putket lingotaan. Tällä menetelmällä saadaan viruskomponentteja, kuten fluoresoivalla vasta-aineella voidaan osoittaa, muttei kokonaisia infektiokykyisiä viruksia,
Proteolyyttisellä entsyymillä, trypsiinillä on ilmoitettu olevan erilaisia vaikutuksia soluviljelmiin ja virusviljelmiin: Cunningham, D. ja Ho, T, (Proteases and Biological Control, eds.
Reich et ai,, Gold Spring Harbor Laboratory, New York, 1975, 795-805) ovat ilmoittaneet, että trypsiini edistää kananpojan solujen jakautumista, kun sitä on läsnä vähintään 2 tunnin ajan. Vuonna 1965 Spendlove ja Schaffer (J.Bact, 89, 597) osoittivat, että entsyymi-käsittely kohotti reo-viruksen infektiokykyä lohkaisemalla viruksen pinnan proteiinit.
Nyt on keksitty, että viljelemällä in vitro virustyyppiä, joka ei inaktivoidu proteolyyttisten entsyymien vaikutuksesta, kuten rotaviruksia soluviljelmissä seerumivapaan väliaineen läsnäollessa, joka sisältää proteolyyttistä entsyymiä, virusten tuotantoa saadaan huomattavasti kohotettua.
Tämän keksinnön mukaan esitetään siten menetelmä rotavirusten kasvattamiseksi in vitro siten, että virusten viljely suoritetaan seerumivapaan väliaineen läsnäollessa, joka sisältää proteolyyttistä entsyymiä, nimittäin trypsiiniä, kymotrypsiiniä, pankreatiinia, pronaasia, bromelaiinia tai subtilisiinia, konsentraationa 1,0-20 ^ig/ml, edullisesti 2,0^10 ^ig/ml.
63060
Soluviljelmän infektoimiseen käytetty rotavirus voidaan valmistaa mistä tahansa kliinisestä näytteestä, jonka tiedetään sisältävän viruksia, se voidaan esimerkiksi saada imettäväisten ulosteista, kuten nautakarjan, sikojen, lampaiden, hiirien tai ihmisten ulosteista. Tällainen ulosteaines suspendoidaan esimerkiksi sopivaan puskuriin, jonka pH on 5—9, suspension muodostamiseksi, joka sisältää suspendoitunutta ainetta 5—30 paino—%, edullisesti 20 paino-%. Sitten suspensio kirkastetaan linkoamalla aina 30 minuuttiin asti 1000-10000 g:ssä, edullisesti 20 minuuttia 5000 g:ssä. Saatu supernatantti suodatetaan ensin Millipore-suodattimella, jonka huokoskoko on 150-0,45 ^im, sitten suodattimena, jonka huokoskoko on 0,22 ^am.
Saatu suodos on riittävän puhdasta kudosviljelmien infektoimiseen.
Vaihtoehtoisesti ja edullisemmin kasvatettava virus on soluviljelmään adaptoitu kanta, ts. sensitiivinen soluviljelmä on infek-toitu sopivilla viruksilla ja virusta on sen jälkeen pasasoitu tällaisilla soluviljelmillä sarjaviljelyinä. Tällaisilla kudoksiin adaptoiduilla kannoilla on etuna se, että ne sopivat heti käytettäviksi ilman tarvetta kliinisten näytteiden puhdistamiseen ja että ne saadaan todennäköisesti heikennettyä ja siten sopivimmiksi mahdollisen rokotteen valmistukseen. Lisäksi tällaiset kannat todennäköisesti kasvavat korkeampaan tiitteriin, ja siten tuottavat suurempia virusmääriä.
Eräs virusten kasvattamiseen käytetty soluviljelmätyyppi käsittää homologisen lajin primaarisoluja, siis esimerkiksi härän rotaviruksen ollessa kyseessä käytetään kasvatukseen primaarisia vasikan munuaissoluja, Huomattavaa teknistä etua saavutetaan kuitenkin käytettäessä pysyviä solulinjoja virusten kasvatukseen? toistaiseksi tämä ei rotaviruksen suhteen ole ollut mahdollista. Käyttämällä edellä kuvattua menetelmää vasikan rotavirusta voidaan kasvattaa edullisesti trypsiinin läsnäollessa ihmisen diploidi MRC 5 solulinjalla, apinan munuaisen BSC-1 solulinjalla, apinan munuaisen LLC-MK2 solulinjalla tai Vero-soluilla,
Kun viruksen kasvatukseen valitut solut ovat muodostaneet yhtenäisen kasvuston, seerumia sisältävä väliaine, jolla solut kasvoivat, on poistettava, koska seerumi ja proteolyyttiset entsyymit ovat antagonisteja; entsyymi hajottaa tiettyjä seerumin komponentteja. Solujen pesun jälkeen pieni määrä virusta, joka on läsnä seerumi -vapaassa ylläpitoväliaineessa, lisätään viljelmään ja virusten 4 63060 annetaan adsorboitua 15-60 minuuttia, edullisesti 30 minuuttia 35-39°C:ssa, edullisesti 37°C:ssa, Tämän jälkeen lisätään tuoretta viljelyväliainetta virus-viljelyyn, Tämä väliaine voi olla koostumukseltaan tunnettu väliaine, kuten Eagles Minimal‘Essential Medium tai Basel Medium tai Medium 199 (katso; Morgan, J,Ft, Morton, H.J, ja Parker, R,C. (1950), Proc.Exp, Biol. (N, Y,), 73, 1), Esillä olevan keksinnön tarkoituksiin näitä väliaineita käytetään ilman niissä tavallisesti olevaa seerumia, mutta ne sisältävät mahdollisesti kontaminaation välttämiseksi antibiootteja tai mahdollisesti muita ei-proteiinilisä-aineita.
Esillä olevassa keksinnössä adsorptioon ja viljelyyn käytettävään väliaineeseen lisätään proteolyyttistä entsyymiä, kuten trypsiiniä, kymotrypsiiniä, pankreatiinia, bromelaiinia tai subtili-siinia, joita lisätään väliaineeseen pitoisuuksina 1,0 - 20^ig/ml, edullisesti 2,0 - 10^ig/ml. Viljelmää inkuboidaan sitten 35-39°C:ssa, edullisesti 37°C:ssa 1-3 vrk, edullisesti 2 vrk, minkä jälkeen solut ovat irronneet kantajasta.
Tutkittaessa viruksella infektoituja soluja elektronimikroskoopilla todetaan, että virukset, jotka eivät tavallisesti kasva kudosviljelmässä, ovat kasvaneet, ja että viruksilla, jotka kasvavat vain huonosti soluissa, on saatu suurempia virustiittereitä.
Pääasiallisena etuna tällä kasvatusmenetelmällä on, että se edistää rotaviruksen kasvua kudosviljelmässä, jossa se ei aikaisemmin kasvanut tai kasvo! huonosti, ja että sillä saadaan myös suuria määriä viruksia söluissa, joissa aikaisemmin saatiin vain pieniä määriä. Täten voidaan saada suuria määriä antigeeniä immunointiin ja diagnostisiin kokeisiin, kuten immuuni-elektronimikroskopiaan, immunodiffuusioon, hemagglutinaatioon, komplementin sitomiseen, ELISA- ja radioimmunokokeeseen. Tuottamalla suuria määriä rotavirus-ta, mihin ei aikaisemmin ole pystytty, on mahdollista valmistaa imettäväiselle annettavaa rotavirus-rokotetta. Rotaviruksen aiheuttama mahasuolitulehdus tappaa suuria määriä nuoria eläimiä, joten tämän taudin vastaisen rokotteen kehittäminen on taloudellisesti erittäin tärkeätä. Lisäksi tällä menetelmällä tulisi olla mahdollista tuottaa riittäviä määriä riittävän puhdasta virusta ihmisrokotteen valmistamiseen, jolloin voitaisiin vähentää lukuisia rotaviruksen aiheuttamasta mahasuolitulehduksista johtuvia lapsikuolemia, 5 63060
Keksintöä kuvataan lähemmin seuraavissa esimerkeissä.
Esimerkki 1
Useita pullollisia (150 ml) primaaristen vasikan munuais-solujen yhteenkasvaneita viljelmiä pestiin kolme kertaa fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka ei sisällä kalsiumia, mutta sisältää 5000 kansainvälistä standardiyksikköä (IU) penisilliiniä ja 2500 IU streptomysiiniä. Viljelmistä poistettiin pesu-liuos, ja niihin lisättiin 1 ml vasikan rotavirusta, joka oli adaptoitu kasvamaan kudosviljelmässä (saatu primaaristen vasikan munuaissolujen 6:nnesta sarjaviljelmästä), seerumivapaassa viljely-väliaineessa, ja viruksen annettiin adsorboitua 0,5 tuntia 37°C:ssa. Tämän jälkeen viljelmiin lisättiin seerumivapaata viljelyväliainetta, joka sisälsi Eagles Basal Medium'ia, jossa oli 5000 IU penisilliiniä ja 2500 IU streptomysiiniä, ja jonka lopullinen natriumbikarbo-naattinitoisuus oli 0,1 %. Ensimmäisessä pullossa oleva väliaine sisälsi 1 /ug trypsiiniä; toisessa pullossa oli 5 /ug trypsiiniä ja kolmannessa pullossa oli 10 ug trypsiiniä ( 1 jug, 5 AiU tai 10/ug/ ml kiteistä trypsiiniä 0,003-m HCl:ssä). Lisäksi valmistettiin kont-rolliviljelmät, joista yhdessä kasvatettiin infektoituja soluja ilman trypsiiniä ja toisessa infekoimattomia soluja trypsiinin läsnäollessa. Kaikkia viljelmiä inkuboitiin 37°C:ssa ja tutkittiin säännöllisin väliajoin sytopaattisen vaikutuksen (CPE) toteamiseksi.
48 tunnin kuluttua soluissa oli seuraavassa taulukossa esitetyt vaikutukset. Taulukossa 25 % CPE = + , 100 % CPE = ++++.
Trypsiinin Sytopaattinen vaikutus Sytopaattinen vaikutus määrä infektoimattornissa infektoiduissa soluissa soluissa
Ei trypsiiniä 1 ^g + + 5 yjg ++++ ++++ 10 ^ig ++++ ++++
Siitä huolimatta, että kontrollisolut, joissa oli suurempia trypsiiniroääriä, eivät jääneet henkiin, tutkittiin kaikki virus-infektoidut viljelmät elektronimikroskoopilla. Tämä tehtiin poistamalla kaikki jäljelle jääneet solut muovikantajalta ja ottamalla 6 6 3 0 6 0 talteen solut ja päälläoleva neste, Virusviljelmiä (5 ml) lingot-tiin sitten tunnin ajan 10 000 gjssä ja saatua pohjalla olevaa pellettiä käytettiin negatiivivärjäykseen, Elektronimikroskooppisesti saatiin seuraavat arviot virusmäärille:
Trypsiinin määrä s ... v virusviljelmlssä . . ,v Virusten määrä
Ei trypsiiniä Noin 10^ kpl/ml 1 ^ig Noin 10^ kpl/ml 5 ^ig Noin 10^ kpl/ml 10 ^ig Noin 10^ kpl/ml Näyttää siltä, että vaikka trypsiinillä suurempina pitoisuuksina onkin soluja tappava vaikutus, niin virusmäärä on kuitenkin kasvanut huomattavasti,
Esimerkki 2 - Rotaviruksen sarjavlljely MRC-5 solujinjassa
Viljely 1 MRC-5 ihmisen diploidikudosviljelmäsoluja (ATCC CCL 171) viljeltiin 75 ml:n Corning-pulloissa Eagles Basal Medium-viljely-väliaineessa, joka sisälsi 5000 IU penisilliiniä, 2500 IU streptomysiiniä, 0,1 % natriumbikarbonaattia ja 10 % vasikansikiön seerumia; 3 vrk viljelyn jälkeen soluviljelmä oli yhteenkasvanut, Kasvuväliaine poistettiin ja viljelmä pestiin kolme kertaa PBStllä, joka sisälsi 5000 IU penisilliiniä ja 2500 IU streptomysiiniä. Pesuneste poistettiin, ja viljelmiin lisättiin 1 ml kudosviljel-mässä kasvamaan adaptoitua vasikan rotavirusta (primaaristen vasikan munuaissolujen 6:nnesta sarjaviljelmästä), ja virus sai adsorboitua tunnin ajan 37°C:ssa, Tämän jälkeen viljelmät peitettiin seerumi-vapaalla Eagles Basal Medium-väliaineella (40 ml), joka sisälsi 5000 IU penisilliiniä, 2500 IU streptomysiiniä, 0,2 % natriumbikarbonaattia ja 10 ^ig/ml kiteistä trypsiiniä (valmistettu 0,003-m kloorivetyhappoon), ja viljelmää inkuboitiin 48-72 tuntia 37°C:ssa.
24 tunnin kuluttua solut olivat täysin irronneet pullon pinnasta.
Viljely^ 2
Viljelystä 1 saatu suspensio otettiin talteen 48-72 tunnin kuluttua ja käytettiin ymppinä toiseen viljelyyn MRC-5 soluissa noudattaen viljelyn 1 menetelmää.
7 6 30 6 0
Viljely 3
Viljelystä 2 saatua solusatoa käytettiin ymppinä kolmannessa viljelyssä MRC-5 soluissa noudattaen viljelyn 1 menetelmää.
Negatiivivärjäyksen elektronimikroskopiatutkimuksessa todettiin kaikissa viljelyvaiheissa korkeat rotavirustiitterit (kor- 6 9 kea rotavirustiitteri 10 infektiokykyistä rotavirusta ja 10 rotavirushiukkasta kaikkiaan).
Esimerkki 3-a Rotaviruksen viljely BSC-1 solulinjassa (ATCC CCL 26) BSC-1 apinan munuaiskudosviljelmää viljeltiin 75 ml:n Corning-pulloissa olevassa Eagles Basal Medium-kasvuvälineainees-sa, joka sisälsi 5000 IU penisilliiniä, 2500 IU streptomysiiniä, 0,1 % natriumkarbonaattia ja 10 % vasikansikiön seerumia, 3 vrk jälkeen solut olivat kasvaneet yhteen, Kasvuväliaine poistettiin, ja viljelmät pestiin kolme kertaa PBS:llä, joka sisälsi 5000 IU penisilliiniä ja 2500 IU streptomysiiniä. Viljelmistä poistettiin pesuneste, ja niihin lisättiin 1 ml kudosviljelmässä kasvamaan adoptoitua vasikan rotavirusta (primaaristen vasikan munuaissolu-jen 6:nnesta sarjaviljelmästä), ja virus sai adsorboitua tunnin ajan 37°C:ssa. Tämän jälkeen viljelmät peitettiin seerumivapaalla Eagles Basal Medium-väliaineella (40 ml), joka sisälsi 5000 IU penisilliiniä, 2500 IU streptomysiiniä, 0,2 % natriumbikarbonaattia ja 10 jag/ml kiteistä trypsiiniä (valmistettu 0,003-m kloori-vetyhappoon), ja niitä inkuboitiin 48-72 tuntia 37°C:ssa.
24 tunnin kuluttua solut olivat täysin irronneet pullon pinnasta. Negatiivivärjäyksen elektronimikroskooppitutkimuksessa todettiin korkeat rotavirustiitterit, b) Rotaviruksen viljely LLC-MK2 solulinjassa (ATCC CCL 7)
Toistettiin kohdan a) menetelmä muuten paitsi, että käytettiin BSC-1 solujen sijasta LLC-MK 2 (ATCC CCL 7) apinan mu-nuaissoluja. Tulokseksi saatiin korkeita rotavirustiittereitä.
c) Rotaviruksen ylljely Vero-solulinjassa (ATCC CCL 81)
Toistettiin kohdan a) menetelmä muuten paitsi, että käytettiin apinan munuaiskudoksen Vero-soluja (ATCCL 81) BSC-1 solujen sijasta. Tulokseksi saatiin korkeita rotavirustiittereitä.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB5009477 | 1977-12-01 | ||
| GB5009477 | 1977-12-01 | ||
| GB5390677 | 1977-12-24 | ||
| GB5390677 | 1977-12-24 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI783663A FI783663A (fi) | 1979-06-02 |
| FI63060B true FI63060B (fi) | 1982-12-31 |
| FI63060C FI63060C (fi) | 1983-04-11 |
Family
ID=26266615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI783663A FI63060C (fi) | 1977-12-01 | 1978-11-30 | Foerfarande foer foeroekning av rotavirus in vitro i sellkulturer |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4205131A (fi) |
| JP (1) | JPS5495789A (fi) |
| CH (1) | CH646194A5 (fi) |
| DE (1) | DE2851928A1 (fi) |
| DK (1) | DK152516C (fi) |
| FI (1) | FI63060C (fi) |
| FR (1) | FR2410675A1 (fi) |
| GB (1) | GB2009786A (fi) |
| NL (1) | NL191183C (fi) |
| SE (1) | SE445466B (fi) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE33164E (en) * | 1979-05-15 | 1990-02-13 | Mobay Corporation | Influenza vaccine production in liquid cell culture |
| US4500513A (en) * | 1979-05-15 | 1985-02-19 | Miles Laboratories, Inc. | Influenza vaccine production in liquid cell culture |
| US4624850A (en) * | 1984-02-09 | 1986-11-25 | Royal Children's Hospital Research Foundation | Live attenuated human rotavirus vaccine |
| US4636385A (en) * | 1985-02-15 | 1987-01-13 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Vaccine, method for its preparation, and use thereof in vaccinating humans against rotavirus infection |
| US5626851A (en) * | 1987-11-30 | 1997-05-06 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Rotavirus reassortant vaccine |
| US5147639A (en) * | 1990-06-19 | 1992-09-15 | Ambico, Inc. | Type-c rotavirus cultures and uses therefor |
| US5610049A (en) * | 1991-05-01 | 1997-03-11 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Human rotavirus HCR3A and method of growing said rotavirus |
| US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
| US5756341A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-26 | Immuno Ag | Method for controlling the infectivity of viruses |
| ATE429246T1 (de) * | 1994-11-10 | 2009-05-15 | Baxter Healthcare Sa | Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freiem kultur |
| US5698433A (en) * | 1994-11-10 | 1997-12-16 | Immuno Ag | Method for producing influenza virus and vaccine |
| US5753489A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| US6110724A (en) * | 1996-10-18 | 2000-08-29 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Rotavirus antigen, vaccine and diagnostic agent for rotavirus infections, and a method for producing the antigen |
| US6110461A (en) * | 1997-08-13 | 2000-08-29 | Oncolytics Biotech Inc. | Reovirus for the treatment of neoplasia |
| US6656719B1 (en) * | 1997-10-27 | 2003-12-02 | Merck & Co., Inc. | Serum-free, low-protein media for rotavirus vaccine production |
| FR2801900B1 (fr) * | 1999-12-03 | 2004-02-27 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Methode de production de cellules animales adherentes |
| US6830917B2 (en) | 2001-12-10 | 2004-12-14 | Baxter Healthcare S.A. | Method of isolation and purification of trypsin from pronase protease and use thereof |
| US20070190032A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-16 | Oncolytics Biotech Inc. | Use of Local Immune Suppression to Enhance Oncolytic Viral Therapy |
| GB2451216B (en) * | 2006-05-12 | 2011-05-04 | Bharat Biotech Int Ltd | A stabilised vaccine composition comprising a viral antigen, HSA and a hydrolysed protein |
| CN117070475B (zh) * | 2023-10-13 | 2023-12-29 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1539221A (en) * | 1976-09-30 | 1979-01-31 | Wellcome Found | Viral preparations |
-
1978
- 1978-11-29 SE SE7812283A patent/SE445466B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-11-30 FI FI783663A patent/FI63060C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-11-30 FR FR7833793A patent/FR2410675A1/fr active Granted
- 1978-11-30 DK DK542878A patent/DK152516C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-11-30 CH CH1226878A patent/CH646194A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-11-30 JP JP14855678A patent/JPS5495789A/ja active Granted
- 1978-11-30 US US05/965,045 patent/US4205131A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-11-30 NL NL7811763A patent/NL191183C/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-11-30 DE DE19782851928 patent/DE2851928A1/de active Granted
- 1978-11-30 GB GB7846602A patent/GB2009786A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK542878A (da) | 1979-06-02 |
| FR2410675A1 (fr) | 1979-06-29 |
| NL191183B (nl) | 1994-10-03 |
| JPS6150599B2 (fi) | 1986-11-05 |
| DE2851928A1 (de) | 1979-06-21 |
| DK152516B (da) | 1988-03-07 |
| SE7812283L (sv) | 1979-06-02 |
| FI63060C (fi) | 1983-04-11 |
| JPS5495789A (en) | 1979-07-28 |
| DE2851928C2 (fi) | 1987-06-04 |
| CH646194A5 (de) | 1984-11-15 |
| DK152516C (da) | 1988-08-01 |
| FR2410675B1 (fi) | 1983-12-16 |
| NL7811763A (nl) | 1979-06-06 |
| GB2009786A (en) | 1979-06-20 |
| US4205131A (en) | 1980-05-27 |
| FI783663A (fi) | 1979-06-02 |
| NL191183C (nl) | 1995-03-01 |
| SE445466B (sv) | 1986-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI63060B (fi) | Foerfarande foeroekning av rotavirus in vitro i cellkulturer | |
| KR100241221B1 (ko) | 돼지 불임 및 호흡기계 중후백신 및 그의 진단법 | |
| KR100374295B1 (ko) | 돼지생식및호흡증후군바이러스의생육방법과백신에서그의용도 | |
| PT623167E (pt) | Preparacao de antigenios e vacinas do virus da mistery disease e antigenios e vacinas produzidos para a prevencao desta doenca | |
| US3959466A (en) | Highly attenuated cytomegalovirus vaccine and production thereof | |
| Lee et al. | Pathogenesis of experimental Hantaan virus infection in laboratory rats | |
| Hasegawa et al. | Isolation of human rotaviruses in primary cultures of monkey kidney cells | |
| McNulty et al. | Cell culture studies with a cytopathic bovine rotavirus | |
| Visvesvara et al. | Culture and propagation of microsporidia | |
| Danner et al. | In vitro studies on Borna virus: I. The use of cell cultures for the demonstration, titration and production of Borna virus | |
| Blaškovič et al. | Experimental infection of weanling pigs with A/Swine influenza virus: 2. The shedding of virus by infected animals | |
| Witter et al. | Preliminary studies on cell cultures infected with Marek's disease agent | |
| Davis et al. | Characterization of persistent Modoc viral infections in Syrian hamsters | |
| CA2065847C (en) | Rotavirus reassortant vaccine | |
| Schumacher et al. | Markers for measles virus: II. Tissue culture properties | |
| AU660996B2 (en) | Human rotavirus HCR3, reassortants thereof and vaccine compositions containing them | |
| Bayyari et al. | Pathogenicity studies of an Arkansas variant infectious bursal disease virus | |
| JPH08188515A (ja) | 組織培養物において効能のあるトキソプラズマ ゴンデイ ブラデイゾイトワクチンの生産 | |
| Nuttall et al. | Poxvirus infection of the Manx shearwater (Puffinus puffinus) | |
| Mancini et al. | Cultivation of avian encephalomyelitis virus in vitro. 1. In chick embryo neuroglial cell culture | |
| Igarashi | A mutant of Chikungunya virus isolated from a line of Singh's Aedes albopictus cells by plaque formation on virus-sensitive cloned cells obtained from another Singh's A. albopictus cell line | |
| Murakami et al. | Primary isolation of cytopathic bovine rotaviruses on fetal rhesus monkey kidney cells | |
| RU2802251C1 (ru) | Вакцинная композиция для профилактики энзоотического аборта у овец | |
| JPH02295934A (ja) | イヌコロナウイルスワクチン | |
| CN115786276B (zh) | 牦牛轮状病毒分离株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: MALLINCKRODT VETERINARY, INC. |
|
| MA | Patent expired |
Owner name: MALLINCKRODT VETERINARY, INC. |