DE2851928A1 - Verfahren zur vermehrung von rotavirus in vitro - Google Patents
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Verfahren zur Vermehrung von Rotavirus in vitro
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren
zur Vermehrung von Viren in vitro, um höhere Titer von Virusteilchen zu schaffen, und insbesondere betrifft die
Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Vermehrung von Rotavirus in vitro.
Es ist bereits bekannt, daß gewisse Viren nicht leicht in
technischem Maßstab gezüchtet werden können und beispielsweise Influenza-Virus lediglich in Eiern bis zu irgendeinem
annehmbaren Titer kultiviert werden kann. Rinder-Rotavirus ist ein anderes Lseispiel eines Virus, der in Zellkulturen
nicht leicht gezüchtet werden kann; der menschliche Rotavirus läßt sich andererseits überhaupt nicht in Zellkulturen
vermehren.
Rotavirusteilchen wurden zuerst im Stuhl von umherstreifenden
Kälbern entdeckt, wie dies von A. L. Pernelius et al. in Archiv für die Gesamte Virusforschung, 1972, 37.j 114-13O5
berichtet wurde und sie wurden wegen ihres radähnlichen Aussehens unter dem Elektronenmikroskop als Rotavirus bezeichnet,
dpäter wurde festgestellt, daß man Teilchen mit identischer
Morphologie in den Fäzes von anderen Spezies, beispielsweise Schweinen, Schafen und Menschen finden kann,
und daß sie invariabel von Gastroenteritis begleitet sind. Tatsächlich wird der Rotavirus als eine der hauptsächlich-
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sten Ursachen der Gastroenteritis bei Kindern angesehen,
insbesondere in den mehr unterentwickelten Ländern.
Zum derzeitigen Zeitpunkt ist die Kauptmethode, und im Falle
des menschlichen Rotavirus die einzige zufriedenstellende Methode zur Gewinnung ganzer Virenteilchen in irgendwelcher
Quantität, den Virus aus Fäzes zu isolieren. Eine derartige Isolierung wird gewöhnlich durch Zentrifugieren
bewirkt, jedoch kann sie auch eine Filtration einschließen. Wahlweise kann im Falle von Rinder-Rotavirus der Virus auf
Primärzellkulturen vermehrt werden; es wird angenommen, daß
die verwendeten Zelltypen Spezies-spezifisch sein sollten, das heißt, daß für Rinder-Virus primäre Kalbszellen, beispielsweise
Nierenzellen, verwendet werden sollten. Bis heute war es unmöglich, den menschlichen Rotavirus auf Zellkulturen
zu züchten. Jedoch haben J. S. Banatvala et al. (Lancet, 25. Oktober 1975, 821) eine spezialisierte Technik
entwickelt, wobei der Virus auf Schweinenierenzellen zentrifugiert wird. Dieses Verfahren umfaßt das Züchten der Zellkulturen
auf mikroskopischen Deckgläschen, die in Röhren mit flachem Boden enthalten sind, zu welchen Fäkalfiltrate
zugesetzt werden, gefolgt von einem Zentrifugieren des Rohrs. Dieses Verfahren führt zur Bildung von Viruskomponenten, wie
dies durch fluoreszierende Antikörper demonstriert wird, jedoch nicht zur Bildung des vollständigen infektiösen Virus.
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Von dera proteolytisciien Enzym Trypsin wurde berichtet, daß
es mehrere Wirkungen auf Zellkulturen und die Viruskultivierung ausübt; D. Cunningham und T. Ho (Proteases and Biological
Control, eds Reich et al.. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1975, 795-805) berichteten, daß Trypsin
die Teilung von Kückenzellen stimuliert, wenn es für einen Zeitraum von zumindest 2 Stunden zugegen ist. Im Jahre 1965
zeigen Spendlove und Schaffer (J. Bact., 89, 597), daß eine Znzymbehandlung die Ansteckungsfähigkeit von Reo-Virus
durch Spaltung der Oberflächenproteine des Virus erhöht.
Es wurde nun gefunden, daß durch Vermehrung des Virus des
Typs, der durch die Wirkung von proteolytischen Enzymen nicht inaktiviert wird, wie beispielsweise Rotavirus, in
vitro, in Zellkulturen in Gegenwart eines serumfreien Mediums, das ein proteolytisches Enzym enthält, eine erheblich
gesteigerte Menge an Virus gebildet wird. Demzufolge wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Vermehrung
von Rotavirus in vitro geschaffen, welches darin besteht, daß man den Virus in für den Virus aufnahmefähigen
Zellkulturen in Gegenwart eines serumfreien Mediums, das ein proteolytisches Enzym enthält, züchtet.
Der Rotavirus, mit welchem die Zellkultur zu infizieren ist, kann aus irgendeiner beliebigen klinischen Probe hergestellt
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werden, von der bekannt ist, daß sie eine Quelle für den Virus darstellt, und kann beispielsweise aus Fäkalmaterial
von Säugetieren, wie Rindviehs Schweinen, Schafen, Mäusen oder Menschen erhalten werden. Ein derartiges Fäkalmaterial
wird beispielsweise in einem geeigneten Puffer bei einem Ρττ-Wert zwischen 5 und 9 derart suspendiert, daß es eine
Suspension im Bereich von 5 bis 30 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 20 Gewichtsprozent bildet. Die Suspension
wird dann durch Zentrifugieren während eines Zeitraums bis zu 30 Minuten bei 1000 bis 10 000 g, vorzugsweise während
eines Zeitraums von 20 Minuten bei 5000 g geklärt. Die nach dem Zentrifugieren überstehende Flüssigkeit wird zuerst
durch ein Millex (Millipore)rFilter mit einer Porengröße im Bereich von 150 bis 0,45 um und anschließend durch einen
Filter mit einer Porengröße von 0,22 ym filtriert. Das erhaltene
Filtrat wurde als ausreichend rein zum Infizieren von Gewebekulturen gefunden.
Wahlweise und besonders bevorzugt kann der zu vermehrende Virus ein adaptierter Gewebekultur-Stamm sein, das heißt,
aufnahmefähige Zellen wurden mit dem geeigneten Virus infiziert
und der Virus anschließend in derartigen Kulturen periodisch Passagen unterworfen. Derartige adaptierte Gewebekultur-St
amme haben den Vorteil, daß sie leicht verfügbar sind, ohne daß klinische Proben zu reinigen sind, und daß
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sie passend abgeschwächt werden können, was sie zu einer besseren Quelle für eine mögliche Vakzine macht. Außerdem
sind derartige Stämme aussichtsreich für die Züchtung eines höheren Titers, und liefern demzufolge größere Mengen an
Virus.
Ein Zellkultur-Typ für die VirusVermehrung enthält Primärzellen
der homologen Spezies, und so werden beispielsweise im Falle von Rinder-Rotavirus, primäre Kalbsnierenzellen
für die Vermehrung verwendet. Jedoch besteht ein erheblich technischer Vorteil darin, eingeführte Zellinien für die
Vermehrung von Viren zu verwenden; bisher war dies bei Rotavirus
noch nicht möglich. Unter Verwendung der jetzt beschriebenen Methode kann Kalbs-Rotavirus vorteilhaft in
Gegenwart von Trypsin auf der menschlichen diploiden MRC-5-Zellinie,
der Affennieren-BSC-1-Zellinie, der Affennieren-LLC-I-iK2-Zellinie
oder auf Vero-Zellen vermehrt werden.
Sobald die für die Vermehrung des Virus ausgewählten Zellen in den Zustand des Zusanimenfließens bzw. des Zusammenwachsens
übergehen, muß das Serum enthaltende Medium, in welchem die Zellen gezüchtet werden, entfernt werden, da Serum und
proteolytische Enzyme Antagonisten sind; die Enzyme schädigen gewisse oerumkomponenten. Mach dem Waschen der Zellen
wird eine kleine Menge Virus, der in einem serumfreien Dau-
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ermedium zugegen ist, zu der Kultur zugegeben und man läßt
für einen Zeitraum von 15 bis 60 Minuten, vorzugsweise 30
Minuten, bei 35° bis 39° C3 vorzugsweise 37° C, adsorbieren.
Im Anschluß daran wird frisches Dauermedium für die Viruskultivierung
zu der Zellkultur zugegeben, das ein chemisch definiertes Medium, wie Eagles Minimal Essential Medium
oder Basal Medium, ader Medium 199 (vgl. J. F. Morgan, K. J.
Morton und R. C. Parker (1950), Proc. Exp. Biol. (N.Y.), T5,
1) sein kann. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden
derartige Medien nicht mit der üblichen Serummenge ergänzt, jedoch können sie gewünschtenfalls zur Regelung von
Kontamination, Antibiotika oder andere, nicht-proteinartige Additive enthalten.
Jedoch wird dem gemäß der vorliegenden Erfindung für Adsorption
und Aufrechterhaltung verwendeten Dauermedium ein proteolytisches Enzym, wie beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin,
Pankreatin, Pronase, Bromelain oder Subtilisin zugesetzt, das geeigneterweise in das Medium in einer Konzentration von 1,0 yg/ml bis 20 μg/ml, vorzugsweise 2,0 ug/ml bis
10 ug/ml inkorporiert wird. Die Kultur wird dann bei 35° bis 39° C, vorzugsweise bei 37° C während eines Zeitraums von
etwa 1 bis 3 Tagen, vorzugsweise 2 Tagen, inkubiert, nach welcher Zeit die Zellen sich von dem Träger abgelöst haben.
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Die Überprüfung der mit dem Virus infizierten Zellen im
Elektronenmikroskop zeigt, daß bei Viren, die in Gewebekulturen nicht wachsen, ein "Viruswachstum erfolgt war, und bei
solchen, die lediglich schlecht in Zellen wachsen, erhöhte Virustiter erzeugt worden waren.
Der Kauptvorteil dieses Vermehrensverfahrens besteht darin,
daß es das Wachstum von Rotavirus, der vorher nicht oder
schwierig in derartigen Systemen zu züchten war, in Gewebekultur unterstützt und auch große Mengen an herzustellendem
Virus in Zellen liefert, wo bisher lediglich kleine Mengen gezüchtet worden waren. Es werden daher große Antigenmengen
für die Immunisation und die Vervrendung in diagnostischen
Untersuchungen, wie beispielsweise Immunelektronenmikroskopie,
Immunodiffusion, Kämagglutination, Somplementbildunt,,
JjLISA und Radio immunoassay, verfügbar. Durch die Herstellung
von bisher nicht erzielbarer großer Mengen an Rotavirus kann es ermöglicht werden, ein Virusvakzin für die Verabreichung
an Säugetiere herzustellen. Die Rotavirus-Gastroenteritis verursacht den Tod einer beträchtlichen Anzahl junger Tiere
und deshalb ist die Entwicklung einer Vakzine gegen diese Krankheit von großer ökonomischer Bedeutung. Außer diesem
Verfahren sollte es möglich sein, den Virus in einer Menge und einer Reinheit herzustellen, geeignet für eine Vakzine
für die Verabreichung an Menschen, wodurch geholfen wird, die
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zahlreichen Todesfälle bei Kindern infolge einer Rotavirus-Gastroenteritis
zahlenmäßig zu verringern.
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermehrung von Rotavirus in vitro, bei welchem
man den Virus in für den Virus aufnahmefähigen Zellkulturen in Gegenwart eines serumfreien Mediums, das ein proteolytisches Enzym enthält, züchtet. Ein derartiges Verfahren begünstigt das Wachstum des Virus in Gewebekultur und liefert große Mengen an Antigen für die Immunisierung und für die
Verwendung in diagnostischen Untersuchungen.
man den Virus in für den Virus aufnahmefähigen Zellkulturen in Gegenwart eines serumfreien Mediums, das ein proteolytisches Enzym enthält, züchtet. Ein derartiges Verfahren begünstigt das Wachstum des Virus in Gewebekultur und liefert große Mengen an Antigen für die Immunisierung und für die
Verwendung in diagnostischen Untersuchungen.
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sieh
aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen sind, sondern lediglich der Erläuterung
dienen.
aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen sind, sondern lediglich der Erläuterung
dienen.
Mehrere Flaschen (150 ml) von im Zustand des Zusammenfliessens
bzw. Zusammenwachsens befindlichen Kulturen von primären Kalbsnierenzellen wurden dreimal mit Phosphat gepufferter
Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium, die jedoch 5000 internationale
Standardeinheiten Penicillin und 2500 internationale Standardeinheiten Streptomycin enthält, gewaschen. Die
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- /ίο -
Kulturen wurden schließlich getrocknet und 1 ml Kalbs-Rotavirus,
der an die Gewebekultur adaptiert war (d.h. bei seiner 6. Passage in primären Kalbsnierenzellen) und in einem
serumfreien Dauerniedium enthalten war, zugegeben und eine
Adsorption während eines Zeitraums von 0,5 Stunden bei 37 C ermöglicht, !lach diesem Zeitraum wurde serumfreies
Dauermedium zu den Kulturen zugegeben, das aus Eagles Basalmediurn
mit einem Gehalt von 5000 Internationalen Standardeinheiten Penicillin und 2500 Internationalen Standardeinheiten
Streptomycin und einer Endkonzentration von 0,1 %
Katriumbicarbonat war. Das Medium in der ersten Flasche
enthielt 1 V'C Trypsin, das zweite enthielt 5 μ^ Trypsin
und das dritte enthielt 10 \χ'Δ Trypsin, 1 Wu, 5 μg oder
-7.
10 μ^/ml kristallines Trypsin, aufgelöst in 10 ^ molarer
Chlorwasserstoff säure. Außerdem wurden x^ontrollkulturen angesetzt
> von denen ein üatz infizierte Zellen enthielt, die
in Abwesenheit von Trypsin gezüchtet worden waren und ein zweiter C'atz nichtinfizierte Zellen enthielt, die in Anwesenheit
von Trypsin gezüchtet worden waren. Alle Kulturen wurden bei 37° C inkubiert und in regelmäßigen Intervallen
auf das Auftreten des cytopathischen Effekts (CP£) überprüft.
Bei 48 Stunden war dac Aussehen der Zellen so, wie es in
eier Tabelle I gezeigt xvird, in welcher "+" = 25 % CPE und
909825/0688 - /ii -
• 43 ·
++++" = 100 % CPE bedeuten.
Tabelle I
Trypsin- Cytopathische Wirkung bei
menge nichtinfizierten Zellen infizierten Zellen
Kein Trypsin
1 Ug
5 Ug
10 Ug
1 Ug
5 Ug
10 Ug
Trotz der Tatsache, daß die Kontrollzellen mit den höheren
Trypsinmengen nicht überlebten, wurden alle mit dem Virus infizierten Kulturen im Elektronenmirkoskop überprüft. Dies
erfolgte durch Entfernen irgendwelcher zurückbleibender Zellen von dem Plastikträger und dem Ernten der Zellen plus
überstehende Lösung. Aliquote Teile der Viruskulturen ( 5 ml)
wurden dann 1 Stunde lang bei 10 000 g zentrifugiert und der so erhaltene Pellet für eine negative Anfärbung verwendet.
Die Beurteilung der so erhaltenen Präparate im Elektronenmikroskop war folgende:
909825/0686 " /12 "
-A-
Tabelle II
Trypsinmenge in ft , Tr.
mm,oin,iL Anwesende Virusmenge
Viruskultur
Kein Trpysin Annähernd 10 Teilchen/ml
1 pg Annähernd 10' Teilchen/ral
5 U£ Annähernd 10 Teilchen/ml
10 pg Annähernd 10^ Teilehen/ml
Es hat demzufolge den Anschein, daß eine erheblich gesteigerte Virusmenge mit diesem Verfahren erhalten wird, trotz
der Tatsache, daß die Trypsinmenge bei den höheren Werten die Zellen zum Absterben bringt.
Passage 1
Menschliche diploide MRC-5-Gewebekultur-Zellen wurden in
75 ml-Corning-Fläschchen in einem Wachstumsmedium, bestehend
aus Eagles Basalmedium mit einem Gehalt von 5000 Internationalen Standardeinheiten (IE) Penicillin, 2500 IE Streptomycin,
0,1 i Natriumbicarbonat und 10 % Fötal-Kalbsserum, 3 Tage
lang kultiviert, nach welcher Zeit die Zellen zusammenflos-
9G9825/068S
sen beziehungsweise zusammenwuchsen. Das Wachstumsmedium wurde
entfernt und die zusammengewachsenen bzw. zusammengeflossenen
Kulturen dreimal in PBS mit einem Gehalt von 5000 IE Penicillin und 2500 IE Streptomycin gewaschen. Die Kulturen
wurden schließlich getrocknet und 1 ml Gewebekultur-adaptierter Kalbs-Rotavirus (bei der 6. Passage in primären Kalbsnierenzellen)
zugegeben und dem Virus eine Adsorption während 1 Stunde bei 37° C ermöglicht. Danach wurden die Kulturen
mit serumfreien Medium (40 ml), enthaltend Eagles Basalmedium mit einem Gehalt von 5000 IE Penicillin, 2500 IE Streptomycin,
0,2 % Natriumbicarbonat plus 10 pg/ral kristallines
Trypsin in 10 ^ molarer Chlorwasserstoffsäure überschichtet
und 43 bis 72 Stunden bei 27° C inkubiert.
Nach 24 Stunden waren waren die Zellen vollständig von der
Piaschenoberflache abgelöst.
Passage 2
Die Suspension aus Passage 1 wurde nach 48 bis 72 Stunden
geerntet und als Impfmaterial für eine zweite Passage durch MRC-5-Zellen nach dem Verfahren für Passage 1 verwendet.
Passage 3
Die Zellernte aus Passage 2 wurde als Impfmaterial für eine
dritte Passage durch MRC-5-Zellen gemäß dem Verfahren für Passage 1 verwendet.
90982S/0G86 "
Die Elektronenmikroskopie durch negatives Färben zeigte hohe Titer von Rotavirus bei allen Passagespiegeln.
Kultivierung von Rotavirus in BSC-1-Zellinie (ATCC CCL 26)
BSC-1-Affenriierengewebekulturzellen wurden in 75 ml-Corning-Pläschchen
in einem Wachstumsmedium, bestehend aus Eagles Basalmedium mit einem Gehalt von 5000 Internationalen Standardeinheiten
(IE) Penicillin, 2500 IE Streptomycin, 0,1 % Natriumbicarbonat und 10 % Fötal-Kalbsserum während eines
Zeitraums von 3 Tagen kultiviert, nach welcher Zeit das Medium zusammengewachsen bzw. zusammengeflossen war. Das
Wachstumsmedium wurde entfernt und die zusammengewachsenen bzw. zusammengeflossenen Kulturen dreimal in PBS mit einem
Gehalt von 5000 IE Penicillin und 2500 IE Streptomycin gewaschen. Die Kulturen wurden schließlich getrocknet und 1 ml
Gewebekultur-adaptiertes-Kalbs-Rotavirus (bei der 6. Passage
in primären Kalbsnierenzellen) zugegeben und man ließ den Virus 1 Stunde lang bei 37° C adsorbieren. Nach diesem Zeitraum
wurden die Kulturen mit serumfreien Medium (40 ml), enthaltend Eagles Basalmedium mit einem Gehalt von 5000 IE Penicillin,
2500 IE Streptomycin, 0,2 % Natriumbicarbonat plus 10 pg/ml kristallines Trypsin in 10"^ molarer Chlorwasserstoff
überschichtet und 48 bis 72 Stunden lang bei 37° C inkubiert.
909825/0688 " /:L5 -
'% 2851328
Nach 24 Stunden waren die Zellen vollständig von der Flaschenoberfläche
abgelöst. Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung zeigte hohe Titer an Rotavirus.
Es wurde das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren mit der
Ausnahme verwendet, daß LLC-MK2 (ATCC CCL 7)-Affennierenzellen
für die BSC-1-Zellen eingesetzt wurden, mit dem
Ergebnis, daß hohe Titer an Rotavirus erzeugt wurden.
Ergebnis, daß hohe Titer an Rotavirus erzeugt wurden.
Das in Beispiel 3 angewandte Verfahren wurde mit der Ausname durchgeführt, daß Vero-Zellen (ATCC CCL 81) anstelle
der BSC-1-Zellen verwendet wurden, mit dem Ergebnis, daß
man hohe Titer an Rotavirus erhielt.
man hohe Titer an Rotavirus erhielt.
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Claims (1)
- DR. BESG DIPL-ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIRPATENTANWÄLTE Postfach 860245-8000 München 86."-."-■- 2B^ ^Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf und Partner, P.O.Box 860245, 8000 München 86 "Ihr Zeichen Unser Zeichen . Mauerkircherstraße 45, r, .-, , 4r.„nYourref. Ourref. C^ O ^)O gooo MÜNCHEN 80-5° · iOVe-iilDer 197"Anwaltsakte-Nr.; 29 656The ivellcoiue Foundation LiuiitedPatentansprüche1. Verfahren zur Vermehrung von Rotavirus in vitro 3 a a durch ^ekenn ze i c h η e t, äaß man den Virus in für den Virus aufnahmefähigen Zellkulturen in Gegenwart eines, serurufreien Mediums, das ein proteolytisches Enzym enthält, züchtet.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kenn-ζ e i ch η et, daß die für den Rotavirus aufnahmefähigen Zellkulturen hauptsächlich Kalbsnieren-Zellen, menschliche diploide IvIRC 5~Zellen3 Affennieren-BSC-l-Zellen, Affennieren-LLC-MK2-Zellen oder Vero-Zellen enthalten.ORIGINAL x/Ma 9098 25/068 6f (089) 988272 Telegramme: Bankkonten: Hypo-Bank München 4410122850988273 BERGSTAPFPATENT München (BLZ 70020011) Swift Code: HYPO DE MM988274 TELEX: Bayer: Vereinsbank München 453100 (BLZ 70020270) 983310 0524560BERGd Postscheck München 65343-808 (BLZ 70010080)• J·5. Verfahren nnch eineüi der Ansprüche 1 und 2, ei a d λ r ο xi gekennzeichnet;, daß das serumfreie i-ieciiu!.: ein chemisch definiertes Daueruediuni ist.^. Verfahren n? ch einem aer Ansprüche 1 bis 3, d a •i α ν c- ix ;.. e k ennseichnet, daß das proteolytiijche ,.,nayi:. "xrypsin. Chymofcrypsin, Pankreatin, Pronase, ^roiiielaln oaer k-ubtilisin ist.ij. Vc-rfc'-hren na.cn einem der Ansprüche 1 bis 43 dadurch je ken η zeichnet, daß das Enzym in deii. ;-iediui.i in einer i^onzentratiori iin Bereich von I3O ug/rnl bia ZO μ^/iiilj vorzufjöweise 2,0 p.j/ir.l bis 10 y^/Dl zu^ejen6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die uiit dem Virus infizierten Ztllkulturen bei Temperaturen im Bereich von 35° bis 39° C inkubiert werden.7. Verfahren nach Anspruch o, dadurch &ekenn zeichnet, claij die infizierten Zellkulturen während eines Zeitraums von 1 bis 3 Tagen inkubiert werden.BAD ORiQiNAL 909825/0688
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Free format text: SCHWABE, H., DIPL.-ING. SANDMAIR, K., DIPL.-CHEM. DR.JUR. DR.RER.NAT. MARX, L., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT., PAT.-ANWAELTE, 81677 MUENCHEN |