DE2057544B2 - Impfstoff gegen ein neonatales Kälberdiarrhoevirus, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung - Google Patents
Impfstoff gegen ein neonatales Kälberdiarrhoevirus, Verfahren zu seiner Herstellung und seine VerwendungInfo
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Description
Neonatale Kälberdiarrhoe, auch Kälberruhr oder τ,
Kälberenteritis genannt, ist eine schwere, ansteckende Krankheit neugeborener Kälber. In zahlreichen Veröffentlichungen
wird behauptet, daß Escherichia coli die Ursache der neonatalen Kälberdiarrhoe sei. Diese
Krankheit kann aber mit E. coli, das aus Kälbern mit (,»
neonataler Käberdiarrhoe isoliert wurde, nicht exakt reproduziert werden. Weilerhin kommen Smith und
H a 11 s, J. Path, and Bact., Bd. 93 (1967), S. 499-529 zu
dem Schluß, daß E. coli in 120 von 127 epidemiologisch beziehungslosen Fällen von Kälberdiarrhoe h-,
in verschiedenen Teilen der Welt, bei denen die Kälber mit Kolostrum gefüttert wurden, keine ursächliche
Rollo gespielt habe.
Vor kurzem haben S. A. Mebus u. Milarb., University
of Nebraska Research Bulletin 233, März 1969 gezeigt, daß die neonatale Kälberdiarrhoe durch ein
spezifisches Virus verursacht wird. Die exakte experimentelle Reproduktion der Krankheit, die diesen Befund
bestätigte, gelang zuerst dadurch, daß Kotausstriche von auf der Weide lebenden Kälbern mit
neonataler Kälberdiarrhoe mittels einer Duodenalsonde in eine neugeborenes Kalb, das nach der Geburt
sofort abgesondert wurde und kein Kolostrum erhalten hatte, inokuliert wurden. Bei diesem Kalb trat
15 Stunden nach der Inokulation die neonatale Kälberdiarrhoe auf. Kotausstrische dieses Kalbs wurden
mittels einer Duodenalsonde in ein durch Hysterectomie geborenes Kalb, das kein Kolostrum erhalten hatte, inokuliert.
Kotausstriche dieses ebenfalls erkrankten Kalbs wurden in ähnlicher Weise in ein weiteres durch
Hysterectomie geborenes Kalb, das kein Kolostrum erhalten hatte, inokuliert. Die dritten, vierten und fünften
Viruspassagen wurden unter Verwendung bakterienfreier Fäkalfiltratc durchgeführt, die mittels
Duodenalsonden in Kälber inokuliert wurden. Drei E. colifreie Kälber in einer Isolierslation wurden oral mit
baktejienfreien Fäkalfiltraten der sechsten Viruspassage
inokuliert. Diese Kälber, bei denen ebenfalls die neonataie
Kälberdiarrhoe auftrat, blieben während der ganzen Krankheitszeil frei von E. coli. Eine siebte
Viruspassage in einem Kalb unter Verwendung von Faeces eines der genannten E. colifreien Kälber verursachte
16 Stunden nach der Inokulation die neonatale Kälberdiarrhoe. Teile des Dünndarms des letztgenannten
Kalbs wurden nach der Viruspassage dem Immunfluoreszenztest (vgl. C. A. Mebus u. Mitarb.,
a. a. O.) unterworfen. Die Epithelzellen der ViIIi zeigten
starke Fluoreszenz. Das Erregervirus wurde ferner mittels Immunfluoreszenz der Kotausstriche von auf der
Weide lebenden Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe nachgewiesen. Damit ist zweifelsfrei sichergestellt,
daß die neonatale Kälberdiarrhoe durch ein Virus verursacht wird.
Aus der US-PS 3 293 129 ist ein Impfslofrgegcn Rinderdiarrhoevirus
bekannt. Dieses Virus ist auch in M. Rolle, A. Mayr, »Mikrobiologie und allgemeine
Seuchenlehre« (1966), S. 718-720 beschrieben. Das Rinderdiarrhoevirus (BDV) ist ein RNS-Virus mit
einer Größe von etwa 40 ma. Es ist empfindlich gegen Ether, Chloroform, Trypsin und Formalin. MgCI2 bewirkt
keine Hitze-Stabilisierung. Es werden hauptsächlich Kälber im Alter von 3 bis 12 Monaten befallen.
S. Hermodsson und Z. Dimer beschrieben in »Nature«, Bd. 194 (1962), S. 893 und 894 das Rinderdiarrhoevirus.
Die Angaben stimmen mit denen von M. Rolle und A. Mayr a. a. O. überein. Die Größe
des Virus belrägt etwa 40 m;i und seine Sedimenlationskonstante
80-90 Svedberg-Einheiten.
A. L. Fernelius hat im »Archiv Tür die gesamte Virusforschung«, Bd. 25 (1968), S. 211-218 über die
Charakterisierung des Rinderdiarrhoevirus berichtet. Es handelt sich bei diesen Viren um Viren, deren
Hüllmembran Lipide enthält. Die Dichte des NADL-Stammes von BDV betrügt 1,15.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff gegen das Kälberdiarrhoevirus zur Verfügung
zu stellen, mit dem die neonalale Kälberdiarrhoe wirksam bekämpft werden kann. Diese Aufgabe wird durch
die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den vorstehenden Patentansprüchen gel-ennzeichncten Gegenstand.
Mit Hilfe des Impfstoffs der Erfindung gelingt es, die Anzahl der Fälle von neonataler Kälberdiarrhoe und
die damit verbundene Mortalität der Kälber beträchtlich zu verringern.
Die für die Herstellung des Impfstoffs der Erfindung ·>
eingesetzte Virusart ist das neonatale Kälberdiarrhoevirus (NCDV). Dieses Virus wurde von C. A. Mebus
u. Mitarb. 1968 entdeckt und als Erreger der neonatalen Kälberdiarrhoe nachgewiesen (vgl. University of Nebraska,
Research Bulletin 233, März 1969). Der Nach- i<> weis des Virus gelang im Epithel der Dünndarmzotten
(ViIIi) mittels Immunfluoreszenz. Dieses virale Antigen wurde seinerseits aus den Faeces von zwei experimentell
mit NCDV infizierten, E. coli-freien Kälbern gewonnen. Fluoreszierende Stellen waren auch in ι
> den Faeces von experimentell infizierten und normal erkrankten Kälbern vorhanden. In dieser Druckschrift
ist auch die Gewinnung des Virus und seine Identifizierung unter dem Elektronenmikroskop beschrieben.
Das Virus hat eine Größe von etwa 65 m;x. Ferner 2u
ist in dieser Druckschrift beschrieben, daß keine Immunfluoreszenz
beobachtet wurde, wenn die infizierten Epithelzellen mit BDV-Konjugat beschickt wurden.
Weitere Untersuchungen über das NCDV wurden A. B. Welch in Can. J. Comp. Med., Bd. 35 (1971), r,
S. 195-202 veröffentlicht. Welch bestätigt, daß das NCDV eine Größe von etwa 64 my. und eine Dichte,
gemessen im Dichtegradienten, von 1,359 besitzt. Aufgrund der Morphologie und einiger chemischer
Eigenschaften scheint das Virus reovirusartig zu sein, jo
im Gegensatz zu dem BDV ist das NCDV ein unbehüljtes
Virus, da keine Reduktion des Titers von mit Äther oder Trichlortrifluoräthan behandelten
Viruspräparaten beobachtet werden konnte.
NCDV ist bei pH 3 und 50' C beständig, wogegen BDV r,
unter diesen Bedingungen empfindlich ist. Auf das von C. A. M ebus u. Mitarb, a. a. O. gefundene Fehlen
der Kreuzreaktion von NCDV mit BDV-Konjugat wurde bereits verwiesen. Dieser Befund wird nochmals
in einer Veröffentlichung von C. A. M e b u s u. Mitarb, au
in »Proceedings of the VI. International Conference on Cattle Diseases, American Association of Bovine
Practitioners« (1971), S. 442-446 bestätigt.
Auch das klinische und pathologisch-anatomische Bild der BDV-und NCDV-Infektionen von C. A. Mebus ·τ>
u. Mitarb, im Research Bulletin 233 und der Veröffentlichung von C. A. Mebus u. Mitarb, in »Proceedings
of the VI. International Conference on Cattle Diseases« und der Beschreibung der BDV-Infektion
von G. Lambert und A. L. Fernelius, Canad. J. -,o
Comp. Med., Bd. 32 (1968), S. 440-446 hervorgeht. BDV wurde in den verschiedensten Organen, einschließlich
Blut, Milz, Lymphknoten und Rectum sowie in den Lungen und Nieren gefunden. Demgegenüber
wurde NCDV in den meisten dieser Organe -,-, nicht gefunden. Es kommt vorwiegend im Dünndarm
vor. Im übrigen existieren noch weitere Unterschiede in der Pathologie der durch die beiden Viren hervorgerufenen
Infektionen.
In der Praxis wird das Verfahren der Erfindung im wi
allgemeinen folgendermaßen durchgeführt:
Zur Herstellung des Impfstoffs werden Kotausstriehe infizierter Kälber verwendet. Vorzugsweise benutzt
man Faeces von Kälbern, die vorher mit einem baklerienfreien Filtral von Faeces inokuliert wurden, in hi
denen das Virus mit Hilfe der Immunfluoreszenz oder elcktroncnmikroskopisch nachgewiesen wurde.
Der Virustiler der gesammeilen Faeces kann durch Passagen in einem oder mehreren Kälbern erhöht werden.
Dadurch wird die anschließende Vermehrung des Virus in Zellkulturen erleichtert. Falls das ursprüngliche
aus den Faeces erhaltene Virus sich gut auf ZeII-kulturen ohne weitere Passagen in einem oder
mehreren Kälbern vermehrt, kann dieses virushaltige Material direkt verwendet werden.
Die gesammelten Faeces werden mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung verdünnt,
das Gemisch wird etwa 30 Minuten bei 1000g zentrifugiert,
und der Überstand wird durch ein Bakterienfilter filtriert. Das so erhaltene virushaltige Filtrat
wird zur nachfolgenden Abschwächung der Virulenz des Virus durch Passagen in Zellkulturen verwendet.
Die in einem Nährmedium gewachsene Zellkultur wird mit einer serumfreien Salzlösung gewaschen.
Man gibt das virushaltige Filtrat entweder direkt auf die Zellkultur, der man nach einer gewissen Adsorptionszeit
ein Nährmedium zusetzt, oder man vermischt das virushaltige Filtrat zuerst mit dem Nährmedium
und gibt diese Mischung anschließend zur Zellkultur. Die Zellkultur wird bei einer Temperatur von 25 bis
40 C, vorzugsweise von 30 bis 37 C, inkubiert. Die Viruspassagen können stationär oder in Roller-Kulturen
durchgeführt werden. Man läßt das Virus in der Zellkultur so lange sich vermehren, bis ein deutlicher
cytopathischer Effekt (cpE) eintritt. Der Grad der Infektion wird zusätzlich mit Hilfe der Immunfluoreszenz
verfolgt. Der cpE entwickelt sich innerhalb von 2 bis 10 Tagen, und das virushaltige Medium wird
dann zur weiteren Passage in ein anderes Gefäß mit Zellkultur gegeben.
Wenn das Virus durch weitere Passagen in Zell kulturen genügend attenuiert ist, wird es in Zellkulturen
vermehrt. Man gibt das virushaltige Medium entweder direkt auf die Zellkultur, der man nach einer gewissen
Adsorptionszeit ein vorzugsweise serumfreies Nährmedium zusetzt, oder man vermischt das virushaltige
Medium zuerst mit dem vorzugsweise serumfreien Nährmedium und gibt diese Mischung anschließend
zur Zellkultur. Die Zellen werden bei Temperaturen von 25 bis 40 ' , vorzugsweise von 30 bis 37 C, so lange
inkubiert, bis ein ausreichender Virustiter, zum Beispiel mindestens l05KID50(kulturinfektiöseDosis)/ml,
erhalten wird. Das im Impfstoff enthaltene Virus kann gewünschtenfalls inaktiviert werden. Der Impfstoff
kann gegebenenfalls zur Erhöhung der Antigenität mit einem Adjuvans versetzt und gegebenenfalls lyophilisicrt
werden.
Zur Durchführung der Viruspassagen in Zellkulturen kann eine Vielzahl von Primärzellkulturen und Permanentzellkulturen
verwendet werden, z. B. primäre fötale Rindernieren-, -lungcn- oder -schilddrüsenzellen,
primäre Schweineniercnzcllcn, primäre fötale Rindcrzellen aus dem Plexus chorioidei, primäre
Lammniercnzellcn, Zellstämrnc aus Rindernieren (BK 1 A), aus embryonaler Rindertrachea (EBTr:
ATCC Nr. CCL 44), aus Nieren von Babyhamstern (BIIK21; ATCC Nr. CCL 10), aus Hundenieren
(MDCK; ATCC Nr. CCL 22), aus Grünaffcnnicren
(VERO; ATCC Nr. CCL 81), aus .Schweinenieren (PK-15; ATCC Nr. CCL H), aus (ST: erhältlich vom
National Animal Disease Laboratory, Ames, Iowa) und aus dem Inlcslinum von menschlichen Embryonen
(HI), Hela-Zcllen und LLC-MK2 (ATCC Nr. CCL 6,
2 und 7) aus menschlichen Embryonen. Vorzugsweise werden /ur Durchführung der Viruspassagen Rinderund
Schweinc/ellen verwendet. Die genannten /eil-
kulturen gestatten alle die Vermehrung des Virus. Die Primärzellkulturen werden aus Organen gesunder
Tiere nach Standardmethoden hergestellt. Die Permancntzcllkulturen
sind entweder aus öffentlichen Hinterlegungsstellen erhältlich oder kennen nach bekannten
Methoden hergestellt werden.
Das Nährmedium darf keine Verbindungen enthalten, die das Wachstum des Virus hemmen; ansonsten
ist die Auswahl des Nährmediums nicht kritisch für das Verfahren der Erfindung. Vorzugsweise wird ein
serumfreies Nährmedium verwendet. Es können z. B. Earles oder Hanks' Salzlösungen, die 0,5% Laclalbumin,
0,1% Hefeextrakt, Penicillin und Streptomycin enthalten, oder Earles oder Hanks' Base 199, die 0,5%
Lactalbumin-hydrolysat, Penicillin und Streptomycin enthält, verwendet werden.
Die Bekämpfung der neonatalen Kälberdiarrhoe kann mit dem Impfstoff der Erfindung entweder durch
Vakzination der trächtigen Kühe oder durch direkte Vakzination der neugeborenen Kälber erfolgen. Der
jeweilige Verwendungszweck erfordert Modifizierungen des Impfstoffs. Die entsprechenden Impfstoffe werden
nachstehend mit Kuh- bzw. mit Kälberimpfstoff bezeichnet.
Zur Herstellung des Kuhimpfstoffs genügt eine relativ niedrige Anzahl von Viruspassagen, vorausgesetzt,
daß mindestens 85% der Zellen der infizierten Zellkultur eine spezifische Fluoreszenz zeigen. Das im
Kuhimpfstoff enthaltene Virus kann nach bekannten Methoden inaktiviert werden. Der Kuhimpfstoff kann
zur Erhöhung der Antigenität mit einem der bekannten Adjuvantia, z. B. Safloröl, Freunds inkomplettes Adjuvans,
Alginat oder Aluminiumhydroxid, versetzt werden. Der Virustiter des KuhimpfstolTs soll mindestens
105 KID5o/ml betragen.
Als Kälberimpfstoff wird ein stark attenuierter LebendimpfstoiT verwendet. Die Herstellung dieses
Impfstoffs erfordert bis zu etwa 200 Viruspassagen. Die Zahl der notwendigen Viruspassagen ergibt sich daraus,
daß der in das Duodenum eines neugeborenen, ohne Kolostrum ernährten Kalbs inokulierte Impfstoff aus
einer bestimmten Viruspassage keine neonatale Kälberdiarrhoe verursacht und diese Krankheit verhindert,
wenn das Kalb hinterher mit einem bakterienfreien, virulentes Virus enthaltenden Fäkalfiltrat inokuliert
wird.
Der Kälberimpfstoff kann in der unmittelbar entstehenden
flüssigen Form verwendet werden, er kann aber auch lyophilisiert und vor Gebrauch in einem
Lösungsmedium, zum Beispiel in sterilem Wasser, aufgelöst werden.
Der Kuhimpfstoff wird der trächtigen Kuh 60 bis 90 Tage vor dem Kalben parenteral, vorzugsweise subkutan
oder intramuskulär, verabreicht, während der Kälberimpfstoff den Kälbern kurz nach der Geburt,
das heißt, bevor sie dem virulenten Virus ausgesetzt sind, gegeben wird.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Aus 8 bis 9 Monate alten Rinderfölcn nach bekannten
Methoden hergestellte primäre fötale Rinderlungcnzellen,
werden in einem Nährmedium aus Earlcschcr Salzlösung mit Laetalbuminhydrolysat und 10%
Kälbcrscrum in Roux-Flaschcn gezüchtet. Vor der Inokulation wird der /.cllrascn zwei- oder dreimal mit
Hanks" Salzlösung gewaschen. Der /cllrascn wird mit
einem bakierienfreicn virushulligcn Fiikalfillrat, das
durch eine oder mehrere Passagen in Kälbern erhalten wurde, inokuliert. Nach zweistündiger Adsorption des
Virus bei einer Temperatur von 37 C, wobei man das Gefäß alle 30 Minuten zur erneuten Verteilung des
Innkuiums schüttelt, wird da.? Gemisch mit einem Nährmedium versetzt, das aus Earlescher Salzlösung,
0,5% Lactalbumin, 0,1% Hefeextrakt, Penicillin und Streptomycin besteht. Die Zellen werden anschließend
bei einer Temperatur von 37 {.' inkubiert, bis der Zellrasen
einen cytopathischen Effekt zeigt oder spezifisch fluoresziert.
Wenn 85 bis 100% des Zellrasens fluoreszieren, wird das Inkubationsgut durch Einfrieren und Auftauen geerntet.
Das Volumen wird in einer Ultrazentrifuge um 50% vermindert. Das Zell-Flüssigkeitsgemisch wird bei
-60% aufbewahrt.
Zur Wirksamkeitsprüfung des Impfstoffs wird das Zell-Flüssigkeitsgemisch aufgetaut und sowohl allein
als auch mit einer gleichen Menge Safloröl als Adjuvans vermischt getestet. Der Impfstoff wird trächtigen
Kühen 60 Tage vordem Kalben intramuskulär injiziert.
Acht Kühen wird die beschriebene virushaltige Zellkulturflüssigkeil ohne Adjuvans, sieben Kühen dieselbe
Menge virushaltiger Zellkulturflüssigkeit, vermischt mit einer ebenso großen Menge Adjuvans, und
sechs Kühen werden 5 ml Adjuvans, vermischt mit 5 ml einer Virussuspension aus Faeces von Versuchs-Kälbern
mit neonataler Kälberdiarrhoe (vgl. C. A. Mebus u. Mitarb., University of Nebraska Research
Bulletin 233, März 1969), injiziert. Neununddreißig Kühe erhalten keinen Impfstoff und dienen als Kontrolle.
Die Kühe werden zum Kalben auf eine Viehfarm gebracht, auf der die neonatale Kälberdiarrhoe
während mehrerer Jahre immer wieder auftrat und zum beschriebenen Zeitpunkt ebenfalls vorlag. Die Wirksamkeit
des Impfstoffs wird dadurch bestimmt, daß das Nichtauftreten bzw. das Auftreten der neonatalen
Diarrhöe bei den geborenen Kälbern registriert wird und im letzteren Fall die Faeces dieser Kälber mit
Hilfe der Immunfluoreszenz auf die Anwesenheit des Virus untersucht werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle
I zusammengefaßt.
Wirksamkeil verschiedener Kälbcrdiarrhoc-Impfstoffe
| Impfstoff | Anzahl | Anzahl | Anzahl |
| träch | ge | diarrhoc- | |
| tiger | borener | tischer | |
| Kühe | Kälber | Kälber | |
| Virushaltige ZcII- | 8 | 8 | 7 (87,5%) |
| kulturflüssigkeil | |||
| Virushaltige ZeIl- | 7 | 7 | 3 (42,8%) |
| kulturflüssigkcit | |||
| + Adjuvans | |||
| Fäkal virus-Suspension | 6 | 6 | 4 (66,6%) |
| + Adjuvans | |||
| Kein Impfstoff | 39 | 39 | 39(100%) |
| (Kontrolle) |
/\lle Kontroll-Külber erkrankten an neonalaler Kälberdiarrhoe:
sieben von acht Kälbern, die von den mil virushaliiger Zellkulturflüssigkeil gcimpl'len Kühen abstammen,
erkrankten an neonalaler Kälberdiarrhoe: vier von sechs Kälbern, die von den mit dem Gemisch
aus der Fäkalvirus-Suspension und dem Adjuvans geimpften Kühen abstammen, erkrankten an neonataler
Kälberdiarrhoe, und drei von sieben Kälbern, die von den mit dem Gemisch aus der virushaltigen Zellkulturflüssigkeit
und dem Adjuvans geimpften Kühen abstammen, erkrankten an neonataler Kälberdiarrhoe.
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß alle Impfstoffe selbst angesichts einer schweren, möglicherweise unvermeidbaren
Infektionsgefahr Wirksamkeit besitzen. Die besten Ergebnisse werden bei Verwendung der Impfstoffe
aus der virushaltigen Zellkulturflüssigkeit und einem Adjuvans erzielt.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird die Wertbemessung des Impfstoffs aus dem Gemisch der ZeIlkulturflUssigkeit
und einem Adjuvans in einer Milch-Viehherde durchgeführt, in der schwere neonatale
Kälberdiarrhoe während zwei Jahren aufgetreten war und in der das Virus mit Hilfe der Immunfluoreszenz
nachgewiesen wurde. Für den Versuch werden trächtige Kühe so ausgewählt, daß pro Woche fünf
geimpfte Kühe zum Kalben kommen. Die Impfungen werden 30 bis 90 Tage vor dem Kalben entweder
einmal oder 30 Tage später nochmals durchgeführt. Das Kolostrum der geimpften Kühe wird bis 5 Tage
nach dem Kalben gesammelt und bis zu 13 Tage alten Kälbern gefüttert. Die Milch der geimpften Kühe wird
6 bis 10 Tage nach dem Kalben gesammelt und 14 bis 28 Tage alten Kälbern gefüttert. Der beschriebene
Versuch erlaubt sowohl die Abschätzung der zur Erzielung eines Impfschutzes erforderlichen Zeit zwi- jo
sehen Impfung und dem Kalben als auch die Abschätzung der Wirkung einer zweimaligen Impfung. Die
Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Wirksamkeitsprüfung des Impfstoffs im Feldversuch
Art der Versuchsgruppe
Morbidität
Anzahl prozentual
253 Kälber von 2mal geimpften 69 27,3%
Rindern
180 Kälber von ungeimpften 87 48,3%
Kontrolltieren bzw. lmal '5
geimpften Rindern
Wenn sichergestellt wäre, daß alle neugeborenen Kälber so früh wie möglich nach der Geburt mit dem
Kolostrum geimpfter Kühe gefüttert wurden, könnte =0
eine weitere Verbesserung der Ergebnisse erhalten werden. Im beschriebenen Experiment vergingen aus
unvermeidlichen Gründen bis zu 12 Stunden, bevor einige Kälber gefüttert wurden. Einige Kälber können
deshalb schon mit dem Virus der neonatalen Kälberdiarrhoc
infiziert sein, bevor sie das Kolostrum erhalten.
in den beschriebenen Experimenten wurde keine nachteilige Wirkung des Impfstoffs auf die geimpften
Tiere beobachtet. h)
U c i s ρ i c I 2
Andere Impfstoffe zur Impfung trächtiger Kühe werden durch Passagicrung des Virus hergestellt, das,
gegebenenfalls durch vorhergehende Passagen in Kai- h>
bcrn, auf die Züchtung in Primärzcllkulturcn oder Permanentzcllkullurcn aus Organen von Rindern,
Schweinen oder anderer Herkunft adaptiert wurde.
Zur Herstellung des Impfstoffs sind so viele Viruspassagen notwendig, bis 85 bis 100% der Zellkultur
eine positive Immunfluoreszenz zeigen.
Ein Impfstoff zur direkten Immunisierung von Kälbern wird gemäß Beispiel I durch 37 Passagen des
Virus in ΡΚ-15-Zellen (ATCC Nr. CCL 33) hergestellt.
Die Bebrütung erfolgt stationär.
Andere Kälberimpfstoffe können durch Passagen des Virus hergestellt werden, das gegebenenfalls durch
vorhergehende Passagen in Kälbern, auf die Züchtung in Primärzellkulturen oder Permanentzellkulturen
aus Organen von Rindern, Schweinen oder anderer Herkunft adaptiert wurde. Die Anzahl der zur Herstellung
der Impfstoffe notwendigen Passagen wird bestimmt, indem Proben auf ihre infektiösen Eigenschaften
und auf ihre Antigenität geprüft werden.
10 ml Kotausstrich natürlich erkrankter Kälber mit neonataler Kälberdiarrhoe werden gesammelt und
rasch eingefroren. Die Faeces werden mit Hilfe der Immunfluoreszenz oder elelronenmikroskopisch auf
Virus untersucht. Die virushaltigen Faeces werden mit dem dreifachen Volumen phosphatgepufferter physiologischer
Kochsalzlösung verdünnt, das Gemisch wird zentrifugiert und der Überstand nacheinander durch
Bakterienfilter mit Porengrößen von 5 μ, 1 μ und 0,5 μ filtriert. 30 ml des Filtrats werden in das Duodenum
eines Kalbs inokuliert. Anstelle dieses Filtrats können auch Faeces direkt inokuliert werden. Bei beginnender
Diarrhöe werden die Faeces dieses Kalbs gesammelt und in der beschriebenen Weise behandelt. Anschließend
werden zwei oder mehrere Passagen in Kälbern durchgeführt. Nach jeder dieser Passagen wird ein
Filtrat hergestellt und auf Rindernieren- oder -lungen-Primärzellenkulturen inokuliert. In diesen Zellkulturen
werden bis zu vier Viruspassagen stationär oder in Roller-Kultur durchgeführt. Anschließend werden die
Zellkulturen auf einen cytopathischen Effekt geprüft und mit Hilfe der Immunfluoreszenz untersucht. Verläuft
die Prüfung auf das Virus positiv, so werden weitere Passagen in Zellkulturen durchgeführt; kann
kein Virus nachgewiesen werden, so werden die Zellkulturen verworfen.
Es werden 40 Viruspassagen bei 37 C in ΡΚ-15-Zellen durchgeführt. Anschließend werden 135 weitere Viruspassagen
bei 37 C in primären Kälbernierenzellen durchgeführt. Vor der Inokulation werden die Zellkulturen
dreimal mit Hanks1 Salzlösung gewaschen. Die ersten Viruspassagen in Kälbernierenzellkulturen
werden durchgeführt, indem alle drei bis vier Tage ein 225 ml fassendes, die Zellkultur enthaltendes Gefäß
mit 1 ml virushaltiger Zellkulturflüssigkeit inokuliert wird. Vor der Zugabe des Nährmediums wird das
Virus bei den ersten Viruspassagen 2 Stunden, bei den späteren Viruspassagen I Stunde an der Zellkultur adsorbiert.
Etwa nach der 70. Viruspassagc in Kälbernierenzellkulturen wird das Virus jeden Tag auf eine
neue Zellkultur inokuliert. Von der hundertzwanzigslcn
Viruspassagc an wird auf die Adsorption des Virus verzichtet. Die Kälbernierenzellkulturen werden cc-
waschen, mit Nährmedium versetzt und mit virushaltiger Zellkulturflüssigkeit inokuliert.
Von der 40. bis zur 135. Viruspassage in Kälbemierenzellkulturen
wird 5 Tage nach der Inokulation Zellkulturflüssigkeit entnommen. Diese Zellkulturflüssigkeit
wird mit derselben Menge Safloröl als Adjuvans versetzt und der erhaltene Impfstoff zur Impfung
trächtiger Kühe verwendet. Gegenüber einer Kontrollgruppe war das Auftreten der neonatalen Kälberdiharrhoe
bei den von den geimpften Kühen abstammenden Kälbern auf etwa 50% verringert, und die
Mortalität ging auf annähernd Null zurück.
Es werden 40 Viruspassagen bei 37 C in PK-15-Zellen,
85 Viruspassagen bei 37 C und 17 Viruspassagen bei 31 C in primäre Kälbernierenzellkulturen
durchgeführt. 12 ml der erhaltenen Zellkulturflüssigkeit werden in das Duodenum eines durch Kaiserschnitt
geborenen, ohne Kolostrum ernährten Kalbs inokuliert. Dieses erkrankte nicht an neonataler Kälberdiarrhoe.
Feaces von natürlich erkrankten Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe werden gemäß Beispiel 5 behandelt.
Anschließend werden zwei Viruspassagen in
Kälbern durchgeführt, wobei die virushaltigen Fäkalfiltrate
in das Duodenum dieser Kälber inokuliert werden. Anschließend werden Viruspassagen in Roller-Kulturen
von primären Kälbernierenzellen durchgeführt. Die 3. bis 163. Viruspassage wird bei 37 C
stationär durchgeführt. Mit dem aus der erhaltenen virushaltigen Zellkulturflüssigkeit und einem Adjuvans
hergestellten Impfstoff werden trächtige Kühe geimpft. Gegenüber einer Kontrollgruppe war das Auftreten der
ίο neonatalen Kälberdiarrhoe bei den von den geimpften
Kühen abstammenden Kälbern wesentlich verringert und darüber hinaus ein wirksamer Schutz gegen die
durch die neonatale Kälberdiarrhoe bedingte Mortalität gegeben.
Es werden 1 bis 4 Viruspassagen durchgeführt, indem Faeces von Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe
in das Duodenum von Kälbern inokuliert werden. Anschließend werden Viruspassagen in Ferkelhodenzellkulturen
durchgeführt. Die virushaltige Zellkulturflüssigkeit kann als Impfstoff verwendet werden,
wenn sie nach Inokulation in das Duodenum von Kälbern keine neonatale Kälberdiarrhoe mehr hervorruft.
Claims (7)
- Patentansprüche:I. Impfstoff gegen ein neonatales Kälberdiarrhoevirus, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Isolieren des Virus aus den Faeces von mit neonatalem Kälberdiarrhoevirus infizierten Kälbern, gegebenenfalls Erhöhen des Virustiters in einem oder mehreren Kälbern, Abschwächen des Virus durch Passagen in Zellkulturen, Vermehren des so erhaltenen, nicht mehr pathogenen, jedoch immunogenen Virus in Zellkulturen, Ernten und Aularbeiten der Zellkulturen, gewünschtenfalls Inaktivieren des im so erhaltenen Impfstoff enthaltenen Virus, gegebenenfalls Versetzen des Impfstoffs mit einem Adjuvans und gegebenenfalls Lyophilisieren hergestellt worden ist.
- 2. Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise aus den Faeces von mit neonatalem Kälberdiarrhoevirus infizierten Kaibern das Virus isoliert, gegebenenfalls den Virustiter durch Passagen in einem oder mehreren Kälbern erhöht, das Virus durch Passagen in Zellkulturen so weit abschwächt, daß das Virus Immunität induziert, aber nicht mehr pathogen ist, das abgeschwächte Virus in Zellkulturen so weit vermehrt, bis mindestens 85% eine spezifische Immunfluoreszens zeigen, sodenn die Zellkulturen in an sich bekannter Weise erntet und aufarbeitet, das im so erhaltenen Impfstoff enthaltene Virus gewümschtenfalls inaktiviert, den Impfstoff gegebenenfalls mit einem Adjuvans versetzt und gegebenenfalls lyophilisiert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bis zu etwa 200 Viruspassagen bei einer Inkubationstemperatur von 25 bis 40 C durchführt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Viruspassagen bei einer Inkubationstemperaturvon30bis37 CinSchweinenieren- oder Kälbernierenzellkulturen durchführt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Viruspassagen bei einer Inkubationstemperatur von 30 bis 37 C in Primärkulturen von Kälbernierenzellen durchführt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Viruspassagen in Ferkelhodenzellkulturen durchführt.
- 7. Verwendung des Impfstoffs gemäß Anspruch 1 bei der Bekämpfung von neonataler Kälberdiarrhoe.2»
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Legal Events
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |